Rongeurs

Une souris qui perd plus de 20 % de son poids, ou atteint un score de 3 sur la grille clinique, est mise à mort avant la fin du protocole. 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue juste après une prise de sang dans le cœur sous anesthésie. Selon les combinaisons testées, elles reçoivent, éveillées, de la doxorubicine trois fois dans la veine, jusqu'à 20 injections de malonate dans l'abdomen en quatre semaines ou des inhibiteurs de BRAF et MEK par gavage, et passent jusqu'à quatre échocardiographies sous anesthésie. Le porteur écrit que "L'objectif même du projet est de travailler sur la toxicité des chimiothérapies" sur le cœur, et attend douleur, perte de poids, inactivité et stress. Les combinaisons étudiées "pourraient fortement modifier" les traitements en cancérologie selon lui, et la protection du cœur qu'il espère montrer reste au conditionnel.

Objectifs

Un grand nombre de traitements utilisés en oncologie sont cardiotoxiques et peuvent aboutir à l’émergence de maladies cardiovasculaires (MCV). Celles-ci peuvent contraindre le corps médical à diminuer voire arrêter le traitement de patients et sont à l’origine de nombreux décès à court et moyen termes. L’amélioration remarquable de la prise en charge thérapeutique de certains cancers a permis une augmentation significative des chances de survie de ces patients. Cela a conduit, pour certains cancers, à ce que les décès liés à la maladie soient dépassés par les décès causés par la cardiotoxicité des traitements. Pour ce projet, nous nous intéresserons à différentes chimiothérapies particulièrement cardiotoxiques utilisées dans de nombreux cancers (leucémies aigues myéloïdes (LAM), pancréas, sein et mélanome). Depuis quelques années, de nombreuses combinaisons thérapeutiques à base de chimiothérapies et d’inhibiteurs métaboliques ont passés le cap des essais cliniques, en particulier dans le cadre des LAM. Ces combinaisons prometteuses semblent permettre une sensibilisation des cellules cancéreuses aux traitements antitumoraux. En parallèle, la recherche sur l’insuffisance cardiaque et les MCV à aussi progressé dans la caractérisation des dépendances métaboliques liés à ces pathologies. Dernièrement, des approches d’inhibition de certaines enzymes du métabolisme ont permis d’obtenir une amélioration des capacités cardiaques dans plusieurs modèles de pathologies aigues ou chroniques. Ce projet a aussi pour objectif de dresser une carte métabolique de la réponse du tissu cardiaque aux traitements antitumoraux afin d’en détailler les dépendances précises. L’objectif final de ce projet est de déceler les dépendances métaboliques communes des cellules cancéreuses et cardiaques afin de sensibiliser les premières au traitement et de protéger les secondes. Pour cela, il est important de comprendre et d’identifier les mécanismes mis en jeux afin de rendre plus favorables la balance bénéfices/risques des traitements antitumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet mêlant la cardiologie à la cancérologie aura plusieurs objectifs susceptibles de bénéficier à long terme aux patients atteints par ces maladies. Dans un premier temps, ce projet a un intérêt fondamental de par la description et la compréhension du métabolisme cardiaque dans le cadre de l’utilisation de ces thérapies cardiotoxiques. Ces traitements entrainent des mécanismes de toxicité pour les cellules cardiaques connues mais dont on ne sait quasiment rien en termes de perturbation du métabolisme. En décrivant les modulations et régulations du métabolisme des cellules cardiaques nous pourrons aussi mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’émergence de stress (induit ou non par une chimiothérapie) pouvant aboutir à une insuffisance cardiaque. Deuxièmement, nous étudierons les effets bénéfiques potentiels des combinaisons thérapeutiques associant chimio²thérapies et inhibiteur métabolique. Ces nouvelles associations de molécules thérapeutiques sont actuellement très étudiées et pourraient fortement modifier les schémas thérapeutiques utilisés en oncologie. Si à travers ce projet nous pourrions montrer un potentiel bénéfice de cardioprotection, nous appuierions alors l’utilisation de ces combinaisons et accélèrerions possiblement leur utilisation en routine. En effet, la validation in vivo de nos hypothèses pourrait bénéficier à de nombreux domaines de la recherche médicale comme en cancérologie ou en cardiologie.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront manipulées de la même manière et uniquement pour des interventions d'intensité légère à modérée (IV, IP, gavage et echocardiographie) de leurs vivant. Un prélèvement de sang sera effectué en terminal, directement suivi par la mise à mort des souris. En détail : - IV = 3 fois par souris vigiles (traitement doxorubicine), durée de 1 à 2 minutes par souris - IP = maximum 20 fois par souris vigiles (traitement malonate de 4 semaines), durée de moins de 1 minute par souris - OG = 3 fois par souris vigiles (traitement inhibiteurs BRAF et MEK), durée de 1 minute par souris - Echocardiographie = maximum 4 fois par souris anesthésiées, durée de 10 minutes par souris environs - Ponction de sang = une seule fois en terminal, durée de 2 à 5 min par souris sous antalgique et anesthésiées - Euthanasie = une seule fois en terminal, durée 1-3 secondes par souris sous antalgique et anesthésiées.

Impact sur les animaux

L’objectif même du projet est de travailler sur la toxicité des chimiothérapies et de leurs combinaisons sur le cœur. Il y aura donc des évènements indésirables, que nous chercherons à réduire à travers l’utilisation des inhibiteurs métaboliques. Ces évènements indésirables, suivis grâce à un scoring rigoureux des souris, peuvent prendre la forme de douleur, de perte de poids, d’inactivité, de stress à la suite des traitement chimiothérapeutiques. Toutefois, les doses de chimiothérapies nécessaires pour obtenir ces résultats sont maintenant bien connues et permettent d’éviter les effets secondaires non voulus en cours d’expérience. Les inhibiteurs utilisés le sont déjà dans de nombreuses publications récentes aux concentrations choisies. Les souris seront uniquement manipulées pour l’injection des traitements et pour la ponction intracardiaque en terminal ; en suivant les recommandations détaillées dans les procédures expérimentales. Pour chaque expérience, nous ferons un suivi quotidien des souris avec un scoring rigoureux permettant de mesurer l’état de santé global des souris. Pour cela, chaque signe clinique sera noté selon l'échelle suivante : (aspect du poil [score 1], posture courbée [score 2], défaut de mobilité [score 3]) et la mesure du poids (perte de poids 20% [score 3]) observés et quantifiés quotidiennement serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant l’efficacité du traitement et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer un point limite : score≥ 3 et/ou perte de poids > 20% au-delà duquel les animaux seront euthanasiés même avant la fin du protocole expérimental.

Devenir

La mise à mort des souris est necessaire pour obtenir les résultats voulu pour ce projet. Un grand nombre d'organe seront prélevés à la suite de l'euthanasie pour étudier les mécanismes déclanché par les traitement anticancéreux qui pêuvent être toxiques.

Remplacement

Une phase in vitro d’expérimentation a eu lieu avant d’envisager les expériences in vivo. Ces expériences, même si partielles, sont prometteuses et nous motivent à poursuivre nos hypothèses grâce à l’utilisation de modèle murin de cardiopathie induite par des chimiothérapies. Les modèles murins permettent d’avoir un niveau de preuve supérieur de par la complexité d’un organisme vivant en comparaison d’une culture cellulaire maintenue en vie en flasque plastique. Les données que nous mesurerons par échocardiographie sur les souris ne sont pas remplaçables et nécessaires pour démontrer une amélioration des fonctions contractiles du cœur après traitements.

Réduction

Pour chaque combinaison, nous utiliserons un nombre limité de souris (192 au total). Ce nombre reste pourtant élevé de part le domaine de recherche auquel nous appartenons, la cardiologie. En effet, les mesures fonctionnelles faites en échocardiographie nécessitent un nombre assez élevé de souris pour obtenir des résultats robustes et significatifs (8 souris par groupe). En effet, les variations fonctionnelles des paramètres cardiaques mesurés en échocardiographie sont légères (+/-10% parfois) mais ont des conséquences fortes sur l’organisme et peuvent entrainer la mort. Ce nombre de souris necessaire au bon déroulement du projet à été calculé avec l'utilisation d'un logiciel de calcul de cohorte et en utilisant des paramètres rigoureux et des tests statistiques utilisés aussi en clinique. Notre projet vise à étudier l’ajout d’inhibiteurs métaboliques à des traitement chimiothérapeutiques cardiotoxiques. Ces combinaisons sont utilisées dans différents projets d’autres équipes avec qui nous sommes en collaboration. Nous chercherons à mettre en commun certaines expériences pour réduire le nombre de souris engagées dans ce projet. Nous utiliserons au maximum chaque souris et réduirons le nombre de manipulation au strict nécessaire. Chaque souris apportera des données d’échocardiographie, d’histologie mais aussi une analyse complète du sérum et une extraction des cardiomyocytes après traitements. Pour les souris xénogreffées avec des cellules cancéreuses, nous récupérerons aussi les organes touchés par la maladie. Ces analyses s’ajouterons aux expériences initialement prévues par nos équipes collaboratives, permettant d’extraire le plus de données possibles à partir d’un nombre limité de souris.

Raffinement

L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les souris sont hébergées dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Des lanières de papier cartonné sont ajoutées pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les cages possèdent des dômes transparents dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées en rouge de manière à apaiser les animaux. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris C57Bl6 (168), une souche très étudiée en cardiologie et idéale pour l’étude des cancers de par l’existence de modèles in vivo utilisés couramment. Ces modèles xénogréffés seront uniquement généré dans la zootechnie des équipes collaboratives. Nous utiliserons uniquement des souris C57Bl6 adultes de 8 à 10 semaines. Ces souris présentent toutes les caractéristiques nécéssaires à l'étude des fonction cardiaque chez l'adulte et ne necessitent pas d'hébergement longue durée que l'on pourrait avoir pour l'étude de souris agées.

1 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et 980 d'entre elles reçoivent, éveillées, deux injections : un produit qui déclenche une inflammation, puis un candidat médicament. Ce produit, qui agit sur le récepteur TLR4, peut provoquer une perte de poids, une chute de la pression sanguine et des atteintes des reins et du foie, et les souris passent d'abord cinq jours d'habituation à la contention. Une première phase, 440 souris injectées et 100 témoins, vise à caler la dose et le moment de l'inflammation, avant le test des candidats. Le porteur vise des maladies chroniques, la maladie de Crohn, la maladie d'Alzheimer ou des maladies de peau, à partir d'une inflammation aiguë provoquée chez la souris, et le médicament espéré "pourrait être envisagé" seul ou associé à d'autres.

Objectifs

L’inflammation est une réponse de l’organisme face à une menace d’origine exterieure ou intérieure. Il s’agit d’une réaction transitoire mais peut dans certains cas, durer des mois ou des années et donner lieu à une inflammation dit chronique. Dans le cas des maladies inflammatoires dites chroniques, la balance entre l’inflammation et la reconstitution d’une équilibre immunologique est perturbée et peut conduire à des réactions disproportionées de l’organisme. Les traitements actuels sont insuffisants ou inexistants dans certains cas, ce qui rend difficile la prise en charge des patients et impacte leur qualité de vie. De nouvelles cibles sont en cours d’étude pour agir sur la réponse inflammatoire exagérée liée à l’activation de l’inflammation via les facteurs microbiens ou endogènes. Il a été montré que le récépteur TLR4 estimpliqué dans le déclenchement de la réponse inflammatoire et au développement de ces maladies inflammatoires chroniques. Les études menées dans le cadre de ce projet s’appuyent sur le ciblage et l’interaction de ce récepteur avec les candidats médicaments développés dans notre laboratoire pour leur effet anti-inflammatoire. Ce projet repose sur deux objectifs. Le premier objectif est de reproduire chez l’animal un contexte inflammatoire similaire à ce qu’il se passe chez l’homme. L’inflammation est induite chez la souris par l’administration d’un produit qui va agir spécifiquement sur ce récepteur TLR4 et déclencher ainsi une réponse inflammatoire. Le second objectif est de démontrer les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments administrés chez ce même animal pour lequel l’inflammation a été provoquée. Les candidats médicaments vont reconnaitre spécifiquement le récepteur comme cible sur laquelle agir. L’interaction entre le candidat et la cible permettra de bloquer la réponse inflammatoire et inhiber ainsi les symptômes qui y sont liés. La finalité de ce projet est de démontrer l’efficacité de candidats médicaments ayant une action anti-inflammatoire afin de proposer un nouveau traitement et améliorer la prise en charge des patients atteints de ces maladies inflammatoires chroniques telles que Crohn, Alzheimer, maladies inflammatoires de la peau.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels permettent de soulager les symptômes mais ne permettent pas de traiter l’origine de la maladie. Démontrer l’efficacité de ces candidats médicaments nous permettrait de proposer un traitement de fond avec une nouvelle stratégie qui se focalise davantage sur les mécanismes qui favorisent l’inflammation que sur les symptômes uniquement. Ce nouveau médicament pourrait être envisagé seul ou en combinaison avec d’autres traitement existants pour améliorer le potentiel thérapeutique et assurer une meilleur prise en charge et qualité de vie des patients sur le long terme. De plus l’utilisation de ce médicament pourrait être envisagée dans différentes applications cliniques car le mécanisme ciblé dans ce projet provoquant le développement de la réponse inflammatoire, se retrouve dans beaucoup de maladies inflammatoires chroniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux injections de substance, de façon vigile sur une durée de vingt secondes. Dans la première phase qui correspond à la mise en place du modèle d’étude, 440 animaux recevront une seule injection d’un produit inflammatoire de façon vigile pendant vingt secondes. Dans les groupe contrôles, 100 animaux recevront la solution tampon dans laquelle est dilué le produit inflammatoire. Dans la deuxième phase du projet correspondant à la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire, 980 animaux recevront deux injections, l’une avec le produit inflammatoire puis la deuxième avec le traitement. Les deux injections seront réalisées de façon vigile pendant vingt secondes chacune. Dans les groupe contrôles, 100 animaux recevront une seule injection de produit inflammatoire et 100 animaux recevront la solution tampon dans laquelle est dilué le produit inflammatoire. Un seul prélèvement de sang est prévu chez tous les animaux et sera effectué sur animal endormi. Cette intervention durera cinq minutes.

Impact sur les animaux

Les candidats médicaments ont été testés au préalable sur des cellules pour s’assurer de la non toxicité de ces produits et de leur efficacité pour bloquer la réponse inflammatoire. Cependant il s’agit de premières études menées chez les animaux et nous ne pouvons exclure le fait que ces candidats puissent entraîner une toxicité chez l’animal au moment de l’injection se traduisant par les symptômes cutanés suivants : irritation, démangeaison, gonflement ou rougeur passagère. Des nuisances dues au geste technique au moment de l’injection sont également à prendre en compte : ulcération, induration, crampes abdominales. La substance inflammatoire peut entraîner une perte de poids, une baisse de la pression sanguine ainsi que des dysfonctionnements rénaux et hépatiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses post-mortem.

Remplacement

Des premiers tests ont été réalisés au préalable sur des cellules avant de lancer des études chez l’animal pour vérifier la non toxicité et les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments. Néanmoins, aucune méthode de remplacement ne permet de reproduire la réponse inflammatoire à l’échelle de l’organisme. La réponse inflammatoire entraîne la libération de molécules qui vont diffuser à travers la circulation jusqu’à atteindre différents organes et provoquer des lésions notamment au niveau du foie, reins, thymus, rate, poumons. Ces interactions ne peuvent pas être modélisées par une méthode alternative et nécessitent de réaliser des études chez l’animal sur lequel on a reproduit la réaction inflammatoire afin d’obtenir des symptômes similaires.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé pour collecter suffisamment de données qui seront analysées à l’aide d’outils statistiques permettant de répondre aux hypothèses et objectifs scientifiques définis dans ce projet. Cette estimation a été déterminée à partir d’études décrites dans la littérature scientifique ayant déjà utilisées ce modèle d’étude. Néanmoins les paramètres expérimentaux utilisés pour mettre en place le modèle sont variables d’une étude à l’autre. Nous avons donc envisagé une étude pilote pour déterminer les conditions expérimentales optimales afin d’obtenir un modèle d’étude stable sur lequel s’appuyer pour évaluer les propriétés anti-inflammatoires de nos candidats médicaments. Dans cette étude, nous étudierons la réponse inflammatoire au cours du temps et selon la dose de substance inflammatoire injectée. Le nombre d’animaux est défini selon deux critères : la dose et le temps. 4 doses et cinq points de temps ont été déterminés à partir de données issues de la littérature. Suite à cette étude pilote, le modèle sera reproduit pour évaluer le potentiel thérapeutique anti-inflammatoire des candidats médicaments. Le nombre d'animaux a été estimé selon les groupes nécessaires à la réalisation de l’étude. Ces groupes sont définis selon le type de candidats et la dose à laquelle ils seront administrés. Les candidats seront évalués selon 4 doses chacun. Les résultats attendus à l’issue de ces études sont une atténuation de la réponse inflammatoire et une amélioration des symptômes chez l’animal. Ce projet prévoit une répartition équivalente de mâles et de femelles dans chaque groupe pour vérifier un effet sexe potentiel sur la réponse inflammatoire.

Raffinement

L’environnement des animaux sera enrichi de coton, d'abris et d’objet afin de subvenir au bien-être animal. Une période d’acclimatation de sept jours est prévue à l’arrivée des animaux avant le début de la procédure. Une phase d’habituation à la contention sera également faite sur cinq jours consécutifs afin de limiter le stress de l’animal avant une injection. Un suivi quotidien sera effectué pour évaluer l’état de l’animal et l’apparition d’effets indésirables. Une grille d’évaluation basée sur ces observations permettra si nécessaire l’arrêt de la procédure en cours pour éviter toute douleur ou souffrance à l’animal.

Choix des espèces

La souris utilisée dans le cadre de ce projet est une espèce particulièrement adaptée au développement du modèle inflammatoire aigu, notamment dans la phase précoce. Cette réponse inflammatoire se traduit par des phénomènes physiologiques similaires à ceux observés lors de la phase inflammatoire induite après une infection chez l’homme : taux élevé et précoce de cytokines pro-inflammatoires, baisse de la pression sanguine, modification de la fréquence cardiaque, et dysfonctionnements des organes périphériques. Les phénomènes physiologiques observés chez la souris sont autant d’indicateurs pour corréler les bénéfices obtenus chez l’animal à ceux que l’on pourrait obtenir chez l’homme. Cette espèce permet de développer un modèle efficace dans la phase précoce de l’inflammation et de le proposer comme un outil permettant d’évaluer les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments. Il s’agira de souris adulte afin d’inclure dans ce projet des animaux possédant un système immunitaire mature.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Klebsiella pneumoniae, par voie nasale sous anesthésie ou par gavage, reçoivent un inhibiteur de l'inflammasome, puis sont tuées au cinquième jour pour prélever poumons, intestins, foie, rate et sang. Le porteur indique que l'infection pulmonaire peut provoquer sifflements, écoulements nasaux, insuffisance respiratoire et fièvre, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Il reconnaît avoir mené des essais in vitro sur cellules mais les juge insuffisants, et conclut à la nécessité d'un organisme complexe.

Objectifs

L’axe intestin-poumons résulte d’une communication croisée entre le microbiote intestinal et la sphère pulmonaire. La survenue d’une dysbiose intestinale favorise un état d’hyper-inflammation, exacerbe les lésions pulmonaires et aggrave les pathologies respiratoires. Les mécanismes sous-jacents sont méconnus, et notamment les liens entre microbiotes et les complexes protéiques de l’immunité innée que sont les inflammasomes qui ont été identifiés comme de puissants modulateurs de l’inflammation. L’ambition de ce projet est de décrypter le rôle de l'inflammasome en lien avec l’interface hôte/microbiote dans l’axe intestin-poumons via un modèle infectieux impliquant le pathogène respiratoire Klebsiella pneumoniae (bactérie opportuniste commensale de l'intestin). Les objectifs sont d’identifier 1) s'il existe une activation differentielle de l'inflammasome dans le tissu pulmonaire et/ou intestinal chez des souris infectées par K. pneumoniae et 2) les conséquences de son activation (ou inhibition) sur le transfert d’informations immunologiques et bactériennes dans l’axe intestin-poumons. Pour cela, deux modèles murins seront développés: un modèle intestinale (modèle de colonisation intestinale par inoculation intra-gastrique de K.pneumoniae) et un modèle pulmonaire (instillation intra-nasale de K. pneumoniae). Dans les deux modèles, un inhibiteur de l'inflammasome sera administré afin d'étudier l'impact de l'inflammasome dans l'inflammation intestinale, pulmonaire et dans l'axe intestin-poumons. Les connaissances générées permettront d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour une approche spécifique du traitement des pathologies pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce projet a deux effets levier majeurs. Le premier est clinique, puisque le projet a pour objectif d’identifier le rôle des inflammasomes dans l’axe intestin-poumons et ainsi de générer des nouvelles pistes diagnostiques et/ou thérapeutiques. L’identification de bactéries commensales immunomodulatrices permettra le développement de bactéries probiotiques ou d’interventions nutritionnelles ciblées chez des patients atteints de pathologies respiratoires infectieuses et/ou inflammatoires. Ce projet vise également à décrire les interactions du microbiote intestinal avec les poumons en réponse à un pathogène. Ce domaine est encore largement méconnu mais il représente un levier majeur pour améliorer les connaissances sur la pathogénie, la persistance et la transmission des pathogènes. Ainsi, les données acquises lors de ce projet permettront d’initier un programme de plus grande envergure qui pourra faire l’objet d’un dépôt dans le cadre d’appels à projets nationaux.

Procédures

Deux modèles d'infection avec le pathogène bactérien seront mis en place pendant 5 jours. Le premier modèle expérimental correspond à la mise en place d'un modèle d'infection pulmonaire dans lequel le pathogène est introduit dans les voies aériennes par inhalation réalisée sous anesthésie légère (moins de 5 min). Cette première procédure nécessitera 3 lots soit 72 souris. Le deuxième modèle sera un modèle de colonisation intestinale dans lequel les animaux (3 lots soit 72 souris) recevront une unique dose de pathogène par voie orale. Dans chaque modèle, un lot de souris recevra en plus un inhibiteur de l'inflammasome (3 injections tous les 2 jours). Des collectes de fécès quotidienne seront réalisés sur les animaux inclus dans le modèle de colonisation intestinale. Aucun prélevement sur animaux vigiles ne seront réalisés sur les animaux inclus dans le modèle d'infection pulmonaire. Les animaux seront mis à mort au bout des 5 jours de procédure.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables pourraient etre observés avec les animaux infectés par le pathogène en intra-nasale (modèle d'infection pulmonaire). Ils pourraient montrer des signes respiratoires tels qu'un sifflement pulmonaire, des écoulements nasales ou une insuffisance respiratoire accompagnés de fièvre.

Devenir

Tous les animaux des procédures 1 et 2 seront mis à mort afin d'effectuer des prélements d'organes (poumons, intestins, foie, rate), du sang et du liquide broncho-alvéolaire et permettre des analyses immunologiques afin d'étudier le rôle du pathogènes sur la réponse inflammatoire intestinale et pulmonaire et plus précisement sur l'inflammasome. Des analyses microbiologiques seront également effectuées par le dénombrement du pathogène dans les différents organes prélevés ainsi que dans le sang afin de voir l'impact de l'inflammasome sur les processus de colonisation, translocation et dissémination de la bactérie.

Remplacement

Notre approche expérimentale a inclus une première analyse in vitro avec des cellules eucaryotes en culture, mais elle reste largement insuffisante pour analyser l’implication de l’inflammasome dans la réponse inflammatoire induite par K. pneumoniae, car elle n’englobe que très partiellement la complexité de l’in vivo. Le modèle murin utilisé permettra de reproduire fidèlement dans un organisme complexe ce qui est observé en clinique lors de d’infections pulmonaires à K. pneumoniae et permettra ainsi de mieux caractériser le rôle de l’inflammasome (au niveau pulmonaire ou par l’intermédiaire de l’axe intestin-poumons) dans le développement des processus hyperinflammatoires lors des infections à K. pneumoniae.

Réduction

Les expérimentations seront organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible, et chaque expérience sera exploitée au maximum (prélèvement d’un maximum d’organes, prélèvement de sang, réalisation de lavages broncho-alvéolaires...). Le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs est calculé à partir d’analyses statistiques. Nous utiliserons des lots de 8 souris ; ceci est classiquement utilisé afin de prendre en considération la variabilité/reproductibilité intra-lot. La variabilité inter-lot (entre les différentes conditions) ne peut pas être évaluée. Nous estimons que 3 répétitions par point de mesure pour chaque condition de culture (3 lots de 8 souris) sera suffisant pour prendre en compte la répétabilité inter-lot, et seront suffisantes pour obtenir une puissance statistique recevable. Nos précédentes études nous ont permis de confirmer que l’étude de groupes de 8 animaux permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Des antalgiques seront administrés aux animaux pour réduire la douleur si nécessaire. Si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.

Raffinement

Des échelles cliniques journalières et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des animaux. Une grille de score et l'utilisation de points limites adaptés à chaque modèle permettra repérer les signes de stress et de douleur des animaux. Si des signes de douleur sont observés, l’animal concerné sera isolé dans une cage individuelle et des analgésiques lui sera administré. Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% par rapport à leur poids en début d’expérimentation ou présentant des effets indésirables durant les procédures seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris C57BL/6. Des publications internationales montrent que cette lignée est parfaitement adaptée pour étudier la virulence de K.pneumoniae au niveau pulmonaire et intestinal; le fond génétique C57BL/6 est préférable pour l’étude de l’immunité et des outils moléculaires sont disponibles pour cette espèce. Les animaux seront âgés de 6 semaines, âge où les souris ont un système immunitaire mature et fonctionnel caractérisé par un développement maximal des organes lymphoïdes secondaires et une réponse lymphocytaire complète (présence des différentes populations lymphocytaires matures).

18 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des stagiaires apprennent sur elles le gavage, des injections et une prise de sang à la veine mandibulaire, avec jusqu'à deux tentatives par geste, lors d'une formation réglementaire de deux heures. Le porteur emploie des mannequins et des planches, mais affirme que les réactions de l'animal vigile restent "indispensables" et que la réglementation impose des animaux vivants. Les souris sont prises sur des surplus d'élevage déjà destinés à l'euthanasie.

Objectifs

L’objectif du projet est la formation initiale des applicateurs de procédures expérimentales, plus précisément la partie travaux pratiques (2h) de cette formation d’une durée totale de 45h. Les formations spécifiques en experimentation animale constituent en effet une obligation réglementaire à laquelle doivent se soumettre tous les acteurs de la recherche in vivo afin d’acquérir les outils nécessaires à la mise en place d’une démarche éthique prenant en consideration la sensibilité animale. Ces formations ont ainsi pour objectif de sensibiliser les personnels impliqués afin de minimiser les contraintes imposées aux animaux lors des procédures expérimentales. Ce projet s’inscrit ainsi dans le cadre de la formation réglementaire et qualification du personnel utilisant des animaux à des fins scientifiques : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Ceci implique notamment un enseignement pratique comprenant une première approche des techniques de contention et de manipulation de l’animal à laquelle s’ajoute l’apprentissage de gestes peu invasifs courants (prise de sang, injection sous-cutanée…). Les travaux pratiques proposés dans cette formation permettent aux personnels d’apprendre à mettre en oeuvre différents gestes de base, encadrés par des formateurs expérimentés. Les séances (2h) se déroulent en petits groupes, avec 1 encadrant pour 6 stagiaires maximum. Ces travaux pratiques seront réalisés sur souris, les espèces les plus utilisées en recherche scientifique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont le bon niveau de formation des personnes travaillant au quotidien sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.

Procédures

Au cours de la séance de 2h de travaux pratiques, quelques techniques simples d’administration de substances et de prélèvement sanguin peuvent être réalisées, selon le niveau de maîtrise des participants : ces gestes ne seront réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires et validée par l’encadrant. Les gestes qui peuvent alors être appris sont : - le gavage par voie orale (VO), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) - l’injection intra-péritonéale (IP), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) - l’injection sous-cutanée (SC), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) - le prélèvement sanguin (PS) à la veine mandibulaire, dans la limite de 10% du volume sanguin total Chaque geste ne durera que quelques secondes. Chaque animal pourra faire l’objet au maximum d’une administration (gavage ou injection) et d’un prélèvement sanguin. Ainsi, au maximum, pour les 3 animaux dédiés à un participants, il peut y avoir : - Animal 1 : gavage VO + PS - Animal 2 : injection IP + PS - Animal 3 : injection SC + PS En cas d’échec lors d’une administration ou d’un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l’encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles pour les animaux sont : - le stress lié à une préhension et contention d’un manipulateur non expérimenté - la souffrance pouvant être liée à une administration de produit ou prise de sang incorrectement réalisées La durée de ces effets est au maximum de 2h, durée de la seance de travaux pratiques. Si un animal présente des signes de stress ou souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant prendra la décision adéquate pour l’animal

Devenir

Les animaux euthanasiés sont utilisés pour réaliser les gestes techniques n’ayant pas pu être pratiqués sur animal vigile, lorsque la contention n’est pas suffisamment maîtrisée.

Remplacement

Diverses méthodes ont été mises en œuvre au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, les travaux dirigés d’anatomie sont exclusivement réalisés à l’aide de planches anatomiques et d’un puzzle 3D inerte. Les méthodes d’identification par pose de bague auriculaire et emporte-pièce sont enseignées sur des morceaux de carton. Un mannequin ou une peluche sont utilisés pour les démonstrations de contention. Néanmoins, pour l’apprentissage de l’approche de l’animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l’animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente et pour permettre aux participants d’aborder les animaux dans les conditions les plus proches de leur réalité quotidienne. La réglementation et la Commission Nationale de l’Expérimentation Animale imposent d’ailleurs l’utilisation d’animaux vivants pour cette partie pédagogique de l’enseignement dans les formations initiales en expérimentation animales. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour ces travaux pratiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus d’élevage, qu’il est prévu d’euthanasier dans la semaine, issus majoritairement soit de l’élevage de l’établissement d’accueil, soit éventuellement d’un éleveur agréé. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire. Néanmoins, afin de limiter le nombre de gestes appliqués à chaque animal (au maximum : contention, 1 administration et 1 prélèvement sanguin), 3 animaux par participant sont nécessaires. Afin de limiter églement le nombre de participants, nos formations ne sont dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.

Raffinement

En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commençant les travaux pratiques par une approche douce. Une grande importance est donnée à l’observation des animaux, la détection et la prise en compte de tout signe de stress de l’animal afin de préserver son bien-être. Pour la contention, les différentes méthodes montrées sont parmi les moins stressantes pour l’animal. Les notions d’entrainement des animaux, de bientraitance, de raffinement des techniques sont enseignées. Pour des raisons éthiques, les gestes techniques ne sont réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires, avec validation de l’encadrant. Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques.

Choix des espèces

La formation réglementaire dispensée comprend un module général (13h) et un module spécifique des rongeurs et lagomorphes (32h). Les animaux utilisés pour cette formation sont donc spécifiquement des rongeurs ou lagomorphes. Les participants travaillant au quotidien sur rongeurs, ce qui correspond à la grande majorité de nos participants puisque les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en recherche, sont orientés vers des travaux pratiques réalisés exclusivement sur rongeurs (en grande majorité des souris), tels que ceux que nous souhaitons organiser chez le client. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au delà, leur âge n’a pas d’importance pour ce projet.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de protéines et des prélèvements de sang réguliers, une partie développant un diabète, pour tester cinq variantes d'un composé censé régénérer les cellules bêta du pancréas. Le porteur revendique une application "stricte" de la règle des 3R, tout en prévoyant 900 animaux. Les bénéfices annoncés se limitent à l'identification de candidats médicaments contre le diabète de type 1.

Objectifs

Le pancréas joue un rôle clef dans le maintien du taux de sucre sanguin. Cet organe contient de nombreux types cellulaires dont les cellules bêta sécrétant de l'insuline, une hormone permettant de diminuer le taux de sucre sanguin en cas d'apport sucré. Notre recherche se concentre sur le diabète de type 1, une maladie qui se caractérise par la perte sélective de cellules bêta. Sans traitement, cette maladie peut avoir de graves conséquences telles que des dommages vasculaires, des risques de cécité, d’amputation, ou même la mort. Les traitements actuels consistent en l’injection d'insuline pour compenser la déficience en cette hormone. Cependant, des facteurs environnementaux (l'alimentation, l'age, le stress, etc...) peuvent provoquer de fortes variations dans les niveaux de glucose sanguin, malgré un traitement à l'insuline, et donc éventuellement conduire aux complications présentées précédemment. Dans le but de pallier aux limitations des thérapies actuelles, nous nous intéressons à la régénération des cellules beta. Nous avons ainsi récemment identifié un composé pharmacologique capable d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques. Le but de notre projet est donc de tester 5 différentes variations de ce composé (visant à le rendre encore plus efficace) dans un modèle de diabète. Nous utiliserons 900 souris afin d’évaluer et comparer les capacités de ces composés à contrer un diabète. Une attention particulière est portée sur l’application stricte de la règle des 3R.

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux est de démontrer une activité accrue de l’une (ou plusieurs) de nos protéines afin d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques et ainsi contrer les effets de la perte des cellules beta pancréatiques.

Procédures

Les animaux recevront des injections quotidiennes ou hebdomadaires de protéines. Des prélèvements sont prévus pour suivre la glycémie des animaux (1 fois par semaine, 1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures de glycémie) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont un inconfort modéré dû aux piqures, aux prélèvements et à la mise à jeun de 5 h. Une partie des animaux développeront un diabète modéré n’entrainant pas de souffrance particulière.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour examen post-mortem des organes et du pancréas en particulier.

Remplacement

Le diabète est une maladie complexe. C'est une pathologie qui s’exprime à l’échelle d’un organisme et qui fait intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose (la plupart donc). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques nous a permis de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables et sans prévoir de répétition des expériences.

Raffinement

Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en oeuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé ou la souffrance des animaux seront observés selon des grilles d'évaluations indiquées. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi (maisonettes et buchettes), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le diabète est une maladie d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Les souris utilisées ici représentent un modèle de choix pour nos travaux visant à contrer un diabète : il est en effet très difficile de trouver une autre espèce animale développant un diabète provenant d'une attaque des cellules beta pancréatiques. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines, cet interval d'âges correspondant à une période sans diabète. Nous souhaitons en effet initier nos traitements avant l'apparition du diabète (et ainsi contrer son développement).