Rongeurs
Etude de l’inflammation et de la régulation par les glucocorticoïdes et leurs récepteurs dans les maladies neurodégénératives
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
3 765 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 125 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des chocs brefs répétés, un stress de défaite sociale où une souris agresseur peut les blesser, un isolement, des tests de mémoire de la peur et des chirurgies, pour étudier le rôle des glucocorticoïdes et de l'inflammation dans les maladies de Parkinson et d'Alzheimer. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier la mémoire et le vieillissement pathologique sans le modèle murin. Les pistes thérapeutiques annoncées restent lointaines, l'objectif immédiat étant de comprendre des mécanismes.
Objectifs
Notre intérêt de recherche se focalise sur les actions des glucocorticoïdes et leur récepteur, le récepteur aux glucocorticoïdes, dans l’inflammation chronique qui caractérise la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. De plus nous étudions le rôle des médiateurs de l’inflammation dans les processus neurodégénératifs qui induisent des anomalies comportementales et cognitives. Les objectifs de ce projet sont de comprendre : a) comment les glucocorticoïdes et leur récepteur GR, par leurs actions sur les cellules immunocompétentes (par exemple les cellules gliales dans le cerveau) et dans les neurones régulent la pathogenèse des maladies neurodégénératives b) les actions des récepteurs aux glucocorticoïdes dans le stress chronique pouvant déclencher des processus neurodégénératifs c) le rôle des molécules inflammatoires dans les anomalies comportementales et cognitives liées à ces maladies.
Bénéfices attendus
Les mécanismes par lesquels le stress, l’inflammation, les glucocorticoïdes et le récepteur aux glucocorticoïde modifient le comportement, l'humeur et la cognition chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson ne sont pas connus. De plus en plus d’études menées chez ces patients montrent un rôle important du stress environnemental ainsi que du système immunitaire. Nos travaux vont apporter une meilleure compréhension de ce sujet et approfondir nos connaissances sur la pathologie de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson. Nos travaux d’analyses moléculaire et cellulaire ainsi que de l’expression des gènes chez nos modèles murins identifieront des facteurs et des processus qui permettront de réaliser ensuite des études chez des patients de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson.
Procédures
(1) Injections sur souris vigiles, durée=environ 1 minute/souris. Au maximum 2x par jour pendant 5 jours (2) Prélèvement de sang sur souris vigiles (10-20 microlitres) x4 (dans un intervalle de 3h), durée 1-2 minutes par prélèvement (3) Tests comportementaux sur souris vigiles pouvant entrainer une diminution de la prise de nourriture, durée 3 semaines (4) Hébergement en cage individuelle, durée10 jours (5) Certaines souris seront soumises à un choc : durée 2 secondes x3. (6) Procédure chirurgicale avec réveil: injections d’anesthésie et d’analgésie préopératoire, durée de la procédure : environ 30 minutes par souris ; traitements anti-inflammatoire/analgésique post-opératoire-durée 1-3 jours (7) Protocoles de stress (chronique ou aigu), durée 10-15 minutes à 3 h selon le stress. (8) Procédure chirurgicale et sans réveil –injections de l’analgésie suivi par l’anesthésie profonde - durée 20 minutes.
Impact sur les animaux
(1) L’incision dans la queue pour les prises de sang peut entrainer une douleur si elle ne cicatrise pas correctement. (2) Les souris qui seront hébergées individuellement pendant les tests de comportement pourront montrer a) une perte du poids (5-10%) et/ou une diminution du toilettage et/ou une diminution de la locomotion. (3) Douleur possible durant la chirurgie sans réveil. (4) Risque d’hypothermie ou d’arrêt cardio-respiratoire suite à l’anesthésie, douleur et affaiblissement post-opératoire possible, risque d’infection ou inflammation autour des zones de suture après les procédures chirurgicales. (5) Effets possibles du protocole de stress: anxiété, dépression, diminution du toilettage et de la prise du poids, diminution des interactions avec les congénères. (6) Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. (7) Pendant les injections, les souris peuvent avoir « peur » ce qui se manifeste par des vocalisations, des émissions d’urine et une défécation. (8) Les souris sont limitées dans leurs mouvements pendant le stress de contention aigu. (9) Durant le stress de défaite sociale, la souris "agresseur" peut blesser la souris soumise à ce stress (10) L’étude de la mémoire à la peur peut entrainer une douleur.
Devenir
Les souris seront euthanasiées, les tissus prélevés pour les analyses biochimique et immunohistochimiques (analyse de la pathologie, de l'inflammation, changements dans chaque type de cellule) et pour les études moléculaires et génomiques.
Remplacement
Notre modèle de souris est le modèle le plus adéquat pour cette étude car les structures impliquées dans la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer chez l’Homme (régions de cerveau qui régulent des comportements moteurs, la mémoire, humeur et le cellules de système immunitaire) sont conservées chez la souris et présentent le même phénotype comportemental associé à des déficits moteurs ou un apprentissage. L'absence de méthodes alternatives quant à l'étude de la mémoire ou de l'apprentissage au cours du vieillissement pathologique nous oblige à utiliser les modèles murins mentionnés.
Réduction
Le nombre total d’animaux estimé est 3765. Nous analyserons nos résultats avec des tests statistiques appropriés pour avoir des valeurs significatives, afin d’obtenir des conclusions sur ces résultats. Pour ce projet nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental avec une analyse prédictive du nombre d’animaux en utilisant un outil statistique.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation et « handling » puis expériences). Une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement l’euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire leur stress. Pour les procédures chirurgicales, les souris sont injectées avec un analgésique suivi par un mélange anesthésique. Les souris sont surveillées étroitement. Des points limites adaptés ont été définis pour toutes les procédures.
Choix des espèces
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. La souris possède un éventail génétique vaste, une reproductibilité fiable et rapide, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre projet. Dans ce projet, l’étude d’animaux est indispensable puisque nous explorerons les altérations physiopathologiques dans le cerveau et le système immunitaire périphérique ainsi que le rôle du stress. Les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du comportement par le système nerveux central ne peuvent pas être abordés uniquement par des études à l’échelle cellulaire ou subcellulaire. Nous utilisons des souris adultes dont le cerveau est totalement développé pour étudier le rôle du stress dans le contexte de maladies neurodégénératives qui se développent à l'âge adulte chez l'homme. Nous utilisons aussi des animaux au stade périnatal car un stress précoce dans la vie de l'individu a des répercussions une fois adulte, et en particulier, affecte sa réponse au stress. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements moléculaires causés par le stress sur des circuits neuronaux intacts. La nature expérimentale de notre recherche requiert donc l’utilisation de modèles animaux. Nos études sur le rôle du stress dans les maladies neurodégénératives seraient importantes non seulement pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mais donnera de nouvelles pistes thérapeutiques.
Etude des effets de contaminants alimentaires sur le foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales et un toxique induisant une hépatite aiguë et une fibrose du foie, pour évaluer l'hépatotoxicité de contaminants alimentaires. Le porteur décrit les procédures et les atteintes en quelques mots seulement, alors que l'effectif dépasse mille animaux. Il indique renvoyer à des cultures cellulaires "dès que possible", tout en jugeant les maladies du foie non modélisables in vitro.
Objectifs
Associé aux reins, le foie est l'organe de détoxification majeur de l'organisme. Il possède une machinerie complexe lui permettant de métaboliser et de transporter les composés présents dans la circulation sanguine comme les médicaments, mais aussi de mombreuses autres substances exogènes telles que des contaminants alimentaires. Les processus de détoxification hépatique ne suffisent pas toujours à éviter la toxicité des xénobiotiques. Dans ce cas, ceux-ci entrainent des dommages hépatiques qui peuvent favoriser le développement de pathologies hépatiques. Les objectifs de ce projet sont d'étudier la toxicité hépatique de contaminants alimentaires émergents ainsi que leur contribution au développement de l'inflammation et de la fibrose hépatique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l'identification de contaminants alimentaires présentant une hépatoxicité.
Procédures
Les interventions sont des administrations intrapéritonéales.
Impact sur les animaux
Les modèles d'hépatite aiguë et de fibrose hépatique miment certains aspects des pathologies hépatiques dont une inflammation et une fibrose hépatique.
Devenir
Mise à mort pour analyse de la santé du foie
Remplacement
Les processus physiopathologiques complexes des maladies hépatiques faisant intervenir les voies digestives, l'alimentation, le système immunitaire muqueux et sytémique , la flore intestinale, etc... ne peuvent pas être modélisés in vitro. Mais dès que possible, les mécanismes mis en jeu seront étudiés dans des modèles plus simples tels que des cultures cellulaires in vitro afin de satisfaire à la règle du remplacement.
Réduction
La souris est l’espèce utilisée depuis de nombreuses années pour modéliser les maladies hépatiques. Ces modèles sont bien décrits et leur bonne connaissance au niveau de la littérature scientifique et au niveau des expérimentateurs de notre laboratoire permet d’éviter les étapes de mise au point expérimentale et de minimiser les aléas expérimentaux, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre de souris utilisées par groupe expérimental a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des conclusions statistiquement significatives et donc publiables. Les tests statistiques de Mann-whitney compatibles avec un faible nombre d’échantillons seront utilisés.
Raffinement
Les souris contrôles des 2 procédures pathologiques seront utilisées pour étudier les effets en conditions basales. Les doses de Ccl4 employées en aigu et en chronique sont des doses minimales pour induire une augmentation mesurable de l'inflammation et de la fibrose respectivement. Pour réduire l’angoisse, les procédures classiques seront appliquées : pas de bruit inutile et stressant, phase d’acclimatation pour tout changement d’environnement, enrichissement, application des procédures pour le nombre de souris par cage. Afin de palier à d'éventuels problèmes anormaux survenant au cours des expérimentations, des points limites ont été définis.
Choix des espèces
La souris est l’espèce utilisée depuis de nombreuses années pour modéliser les maladies hépatiques. Ces modèles sont bien décrits et leur bonne connaissance au niveau de la littérature scientifique et au niveau des expérimentateurs de notre laboratoire permet d’éviter les étapes de mise au point expérimentale et de minimiser les aléas expérimentaux, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux nécessaires. Des animaux de 8 semaines seront utilisés car les procédures de Ccl4 aigu et chronique sont décrites dans la littérature comme réalisées à ce stade (jeunes adultes)
Évaluation de la réponse aux traitements médicamenteux dans le cancer du foie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie abdominale qui injecte des cellules cancéreuses dans la rate pour provoquer des métastases du foie, puis une chimiothérapie ou un agent anti-vasculaire et jusqu'à quatre IRM sous anesthésie. Le porteur cherche des marqueurs d'imagerie prédictifs de la réponse aux traitements, la validation chez des patients étant renvoyée à plus tard. Il justifie l'effectif par un taux de prise tumorale d'environ 60%.
Objectifs
Le cancer colorectal est l`une des principales causes de mortalité liée au cancer dans le monde. La propagation métastatique représente le principal facteur de mauvais pronostic. Jusqu'à présent, aucun marqueur fiable n'est disponible pour prédire la réponse aux traitements chez les patients atteints de métastases hépatiques (dans le foie). Le traitement standard du cancer colorectal métastatique comprend généralement une chimiothérapie et un agent anti-vasculaire compromettant la survie des cellules cancéreuses. Dans le but de rendre la lésion hépatique opérable, la prise en charge clinique des patients repose essentiellement sur l'évaluation de la réponse des patients aux traitements. La survie globale après la chirurgie dépend de manière cruciale de la réponse à ces traitements. Il n'existe actuellement aucun critère ni marqueur satisfaisant pour prédire la réponse histologique à la chimiothérapie, bien que plusieurs pistes ont été explorées. Par ailleurs nous avons montré dans le contexte du cancer du sein que le mouvement mécanique des cellules permet de distinguer la réponse et la résistance aux thérapies, ainsi que l'impact des agents anti-vasculaires sur la mécanique des tissus. Le but de notre étude est d’identifier de nouveaux marqueurs biologiques en utilisant l'imagerie IRM qui est une technique d`imagerie non invasive pour évaluer l'effet de la thérapie sur le microenvironnement tumoral et le réseau vasculaire afin d'améliorer la survie des patients dans le contexte des métastases hépatiques du cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Identifier des nouveaux marqueurs biologiques pour évaluer l'effet du traitement sur le microenvironnement tumoral et le réseau vasculaire. Valider l'efficacité des ces marqueurs sur une cohorte de patients. Prédiction de la réponse aux traitements pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à : 1) Chirurgie : injection des cellules tumorales dans la rate aprés une incision de la paroi abdominale d'1cm, la plaie sera ensuite fermée à l'aide de plusieurs points de sutures. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et dure 30 minutes. 2) Les traitements anti-tumoraux seront injectés en intrapéritonéale au niveau de l'abdomen, un lot de souris recevra un traitement anti tumoral (une chimiothérapie) deux fois par semaine pendant 4 semaines. Un autre lot de souris recevra un autre traitement tumoral (un agent anti-vasculaire) qui sera injecté 5 jours (de jour 0 à jour 4). 3) Imagerie par résonance magnétique (IRM) :14 jours après l’injection des cellules tumorales, le nombre de séance d’IRM peut aller jusqu’à 4 séances au total, le délai minimal entre les séances d'IRM (Après la première IRM) est d’une semaine. La durée des IRM est de 1heure par souris (cette analyse sera réalisée sous anesthésie générale).
Impact sur les animaux
(1) Risque de douleurs post-opératoire et/ou (2) le développement des tumeurs (dans le foie ou dans d'autres organes) peut également engendrer des modifications des fonctions physiologiques.(3)Perte de poids suite à la chirurgie,(4)Les traitements médicamenteux ont été utilisés dans la littérature et aucun effet secondaire a été relevé, (5) irritation et/ou inflammation de la suture.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à la fin du protocole, pour permettre le prélévement d'organes et l'analyses des tumeurs pour approfondir les connaissances.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude in vivo ne peuvent pas être obtenues actuellement par d'autres méthodes, compte-tenu de la complexité de ce cancer . Ce modèle permettrait d'étudier les métastases du foie dans leur environnement (développement de tumeur dans l’organe), notamment les cellules des vaisseaux sanguins qui jouent un rôle important dans le développement tumoral. Des études in vitro ont été réalisées en amont, qui complèteront ce volet d'expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.
Réduction
Ce projet impliquera l’utilisation de 130 souris pour une durée maximale de 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés est le minimum requis pour atteindre l’objectif fixé en prenant compte que le taux de prise tumorale peut varier (environ 60% de réussite).
Raffinement
Acclimatation de 10 jours pour les souris après leur arrivée à l'animalerie avant de débuter le protocole. Les animaux sont surveillés quotidiennement et ont accès à la nourriture et à l’eau. Ils sont hébergés dans un environnement enrichi permettant la formation de groupes sociaux. Lors de la procédure chirurgicale les souris seront endormies et allongée sur un lit chauffant. Le maintien de la température corporelle pendant la chirurgie sera effectué par une sonde rectale. A la fin de la procédure chirurgicale, le réveil des animaux sera surveillé de près. Après leur réveil les animaux seront réintégrés dans leur cage. Des croquettes humidifiées et de l'hydrogel seront mis en place pour favoriser le bien-être des animaux. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillée et l'animal est placé sur un lit chauffé. La chirurgie ainsi que les IRM seront effectuées sous anesthésie. Les soins et le suivi des animaux seront effectués par des personnes compétentes et expérimentées.Le suivi clinique sera effectué 3 fois par semaine. Un analgésique sera administré avant, pendant et après la chirurgie. L’utilisation de ce dernier sera renouvelée si besoin afin d’éviter toute souffrance à l’animal. La suture sera examinée quotidiennement pour les 5 à 7 jours après la chirurgie en notant la présence d’écoulement, rougeur, enflure, etc…, nous examinerons également la déhiscence de la plaie (ouverture des points sutures). Lors d’observation d’un ou plusieurs signes nous aviserons rapidement le personnel de soins de l’animalerie pour procéder à un traitement adéquat de la condition. Les critères d'évaluation de la douleur ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. La douleur observée peut être due à l’implantation des cellules tumorales. Néanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises. Les points les plus précoces sont les troubles du comportement (repli dans un coin, poil hérissé, etc.), l'altération de l'apparence physique (grattage, poil terne, etc.). Si les points limites sont atteints, l'animal sera euthanasié et ne sera donc pas soumis à la procédure IRM.
Choix des espèces
Les souris utilisées sont des souris adultes de 8 semaines. Ce modèle est le plus utilisé et validé par la littérature scientifique car la maladie se developpe mieux à l'âge adulte. Les cellules tumorales qui seront utilisées dans ce protocole sont des cellules murines, qui sont compatible avec l'espèce choisie.
Etudes moléculaires chez des modèles de rat combinés du Syndrome de Down et de la Maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Modèles combinant trisomie 21 et maladie d'Alzheimer, ils sont mis à jeun six heures puis anesthésiés pour un prélèvement de sang, avant la mise à mort pour prélever cerveau, foie, tissu adipeux et muscle. Le porteur affirme qu'il n'existe "aucune alternative" à l'animal pour l'étude du cerveau, qui exigerait un organisme "dans son intégrité et sa globalité". Les cibles thérapeutiques annoncées pour l'Alzheimer restent renvoyées au long terme.
Objectifs
Le Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 touche 1 naissance sur 800 et représente la forme la plus fréquente de retard mental. Par ailleurs, les personnes atteintes du SD développent de nombreuses comorbidités parmi lesquelles la maladie d’Alzheimer (MA). Ainsi, plusieurs modèles de rats ont été créés afin de pouvoir étudier les mécanismes physiopathologiques de la MA dans un contexte de SD. Les premiers résultats obtenus chez ces modèles sont très prometteurs. En effet, ils mettent en évidence des atteintes de l’apprentissage et de la mémoire chez certains de ces modèles. Nous avons également mis en évidence une augmentation de l’expression d’un marqueur de la MA. Nous souhaitons donc poursuivre/approfondir la caractérisation de nos modèles avec pour but d’identifier les mécanismes impliqués dans le développement de la MA dans le SD. Pour cela, nous voulons réaliser des analyses moléculaires sur des échantillons de sang/plasma ainsi que sur différents tissus (cerveau, foie, tissu adipeux, muscle). Les résultats d’une des analyses que nous souhaitons réaliser sont sensibles à la prise alimentaire des animaux. De ce fait, il est nécessaire de réaliser une mise à jeun des animaux afin de contrecarrer les effets de la prise alimentaire, cette dernière étant très aléatoire d’un individu à l’autre. Les animaux seront donc soumis à une privation alimentaire avant d’effectuer un prélèvement sanguin qui sera réalisé sous anesthésie générale profonde.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de permettre une meilleure caractérisation de modèles SD-MA chez le rat. Le but est de nous permettre d’identifier/comprendre les mécanismes physiopathologiques du développement de la MA dans un contexte de SD. Les mécanismes identifiés pourraient également s’appliquer aux personnes de la population générale affectées par la MA. A long termes, cela pourrait potentiellement permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la MA et ces modèles pourraient alors être utilisés pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, les animaux seront soumis à une privation alimentaire en vu d’une mise à jeun. Cette privation alimentaire sera d’une durée de 6h. Elle sera réalisée une seule fois par rat et sur la totalité des animaux du projet, soit 96 rats. Ces animaux seront ensuite anesthésiés pour pouvoir réaliser un prélèvement sanguin. Pour cela, un mélange anesthésique sera administré par voie intrapéritonéale, cette injection est réalisée en 1 à 2 mins par rat. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé, il se fait en 1-2 mins. A noter que l’injection d’anesthésique et le prélèvement de sang sont réalisés qu’une seule fois par rat. Par ailleurs, les animaux seront soumis à la pose d’une bague à numéro unique permettant de les identifier, ainsi qu’au prélèvement d’une biopsie d’oreille afin de déterminer quels animaux sont porteurs de la modification génétique. Ces deux actes sont réalisés une seule fois par animal et de façon successive en 2-3 mins.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à une privation alimentaire afin de réaliser une mise à jeun. Cette privation alimentaire peut induire un stress léger chez l’animal. Par ailleurs, le prélèvement sanguin nécessite d’anesthésier l’animal au préalable via une injection d’anesthésique par voie intrapéritonéale. Cette injection n’induit qu’une douleur minime et très brève au site d’injection liée à l’introduction de l’aiguille. Elle peut également induire un stress de courte durée chez l’animal du fait de la contention nécessaire pour pouvoir effectuer l’injection. Concernant la pose d’une bague à numéro unique et du prélèvement d’une biopsie d’oreille, ces deux actes, réalisés de façon successive, ne génèrent qu’une douleur minime et un stress léger chez l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux prévu dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir réaliser des analyses moléculaires sur différents tissus (cerveau, foie, tissu adipeux, muscle).
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo.
Réduction
Cette demande concerne la réalisation de prélèvements sanguins et de différents tissus sur des animaux mis à jeun en vu de réaliser des analyses moléculaires. Le recul et les connaissances que nous avons sur la mise en œuvre de ces analyses nous permettent d’estimer que le nombre d’animaux nécessaire est de 12 animaux/génotype/sexe. Cet effectif a été déterminé afin d’avoir un nombre minimal d’animaux tout en ayant des résultats scientifiquement interprétables et ce en prenant en compte une variabilité inter-individu attendue. Par ailleurs, cette étude sera réalisée sur des mâles et des femelles afin d’utiliser l’ensemble des animaux produits et de vérifier qu’il n’y a pas de différence en fonction du sexe.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à une mise à jeun qui n’est en rien délétère pour l’animal. En effet, elle est réalisée sur une période très courte (6h) et pendant la phase de jour, période pendant laquelle les rats dorment principalement et mangent peu, ils ne seront donc que peu perturbés. Il n’y a donc pas de point limite concernant la mise à jeun. Par ailleurs, un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie/analgésie générale profonde. Ainsi, aucune douleur n’est attendue. Le prélèvement de sang ne commencera qu’après la perte totale des réflexes de retrait lors du pincement de la patte et des réflexes de fermeture palpébrale témoignant d’une anesthésie profonde. Les points limites seront donc déterminés en fonction des observations faites pendant l’anesthésie/analgésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l’animal). La procédure d’anesthésie sera arrêtée si ces points limites sont atteints. Par ailleurs, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien permettant de s’assurer de leur bien-être et de leur santé. Si les animaux présentent des signes de mal être ou de douleur (plaies, hérissement du poil, attitude voûtée, perte de poids, altération de la respiration, comportement anormal (perte de réactivité, animal prostré)), ils seront placés sous surveillance accrue et présentés au vétérinaire. Si un traitement est envisageable, il sera mis en place (antiseptiques, antibiotiques, analgésiques). A noter que le traitement utilisé devra être adapté au cas pas cas en fonction des symptômes rencontrés. Si aucun traitement n’est envisageable et que l’état de l’animal persiste ou se dégrade au cours de la journée, il sera mis à mort. Ainsi, l’atteinte de points limites concernant le bien-être et la santé des animaux sera déterminée sur la base des observations quotidiennes de nos animaux. Par ailleurs, tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par deux, le rat étant une espèce très sociable, et disposeront d’un bâton à ronger en guise d’enrichissement.
Choix des espèces
La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme que ne l’est la souris. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez le rat. Enfin, les meilleures capacités d’apprentissage et d’adaptation du rat comparé à la souris en font un meilleur modèle pour l’étude de la maladie d’Alzheimer et des déficiences cognitives associées au Syndrome de Down. L’étude sera réalisée chez des rats âgés de 14-16 mois, car c’est l’âge auquel ont été faites les analyses moléculaires que nous avons réalisées jusqu’à présent. Ce projet visant à complèter et approfondir ses analyses.
Etude en enclos de l’influence du régime alimentaire sur l’hibernation et la reproduction du hamster commun (Cricetus cricetus)
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
2 375 hamsters communs vont être utilisés, dont 375 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec l'intention de les relâcher dans la nature. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'enregistreurs de température, des prises de sang sous anesthésie et la pose de puces, pour étudier en enclos l'effet de différents régimes sur leur reproduction et leur hibernation. Le projet vise la préservation d'une espèce en fort déclin en plaine d'Alsace, liée aux monocultures de blé et de maïs. Le porteur précise que les hamsters seront tués si les autorisations de lâcher ne sont pas obtenues.
Objectifs
Le hamster commun est inféodé à la plaine agricole en Alsace où les cultures de blé et de maïs représentent plus de 80% de la surface agricole utile certaines années. Nous avons montré que ces 2 monocultures ne répondaient pas aux besoins nutritionnels de l’espèce : une carence en protéines dans le blé cause une importante mortalité juvénile tandis que dans le maïs, une carence en vitamine B3 et son précurseur le tryptophane, entraîne du cannibalisme chez 90% des femelles. Pour pallier à ces carences et améliorer la reproduction des hamsters en milieu naturel, nous recherchons des cultures qui sont naturellement riches en acides aminés essentiels et d’intérêt technico-économique pour les agriculteurs. En conditions semi-contrôlées en enclos, nous allons soumettre des hamsters mâles et femelles à différentes associations de cultures et mesurer l’effet de ces régimes sur le succès reproducteur des hamsters et sur leur hibernation.
Bénéfices attendus
Ce projet aura des retombées scientifiques en fournissant de nouvelles connaissances sur les besoins nutritionnels d’une espèce hibernante, qui seront valorisées au travers de communications scientifiques écrites et de conférences. Il contribuera également à la préservation d’une espèce en déclin en proposant de nouvelles pratiques culturales permettant un meilleur succès reproducteur et une et une meilleure survie hivernale de l’espèce. Enfin, ces nouvelles pratiques agricoles devraient bénéficier plus largement à toute la biodiversité des agrosystèmes et répondre aux nouveaux enjeux technico-économiques des agriculteurs.
Procédures
Implantation/desimplantation de ibuttons (15 min par chirurgie) et prise de sang (2 min par prise de sang, 1 prise de sang par animal par an, 2 prises de sang au total par animal) sous anesthésie : 75 hamsters par an. Transpondage (implantation en sous cutané d’une puce individuelle) et prélèvements poils sur animal vigile : toute la descendance produite, 400 hamsters par an environ.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à la chirurgie : Procédure modérée : douleur liée à la laparotomie, inflammation, infection, perte de poids, hématome lié à la prise de sang. Effets liés aux manipulations en enclos : stress lié au transport, lâcher, capture, et manipulation : implantation interscapulaire de transpondeur, douleur aigue transitoire liée à l’injection du transpondeur. Perte de poids lié au changement de régime alimentaire
Devenir
Lâcher en milieu naturel pour le renforcement des populations sauvages, sous réserve d'obtention des autorisations de la DREAL et de l'OFB (en charge des opérations : financement, recherche des parcelles où lâcher les hamsters) et de la DDPP. Si nous n'obtenons pas les autorisations de lâcher en milieu naturel, les hamsters seront euthanasiés.
Remplacement
Cette étude concerne la préservation du hamster commun en plaine d’Alsace et ne peut être réalisée sur une autre espèce, ni par des études de modélisation.
Réduction
Nous allons expérimenter sur 12 femelles et 3 mâles par condition expérimentale. Ce nombre d'individus est le minimum pour qu'une différence éventuelle entre les différents groupes puisse être statistiquement décelée. Les résultats seront soumis à des tests non paramétriques du fait du faible effectif des groupes. Le sex ratio déséquilibré est lié à la biologie de cette espèce : les mâles ont un domaine vital plus grand que les femelles, et lâcher un plus grand nombre de mâles par sous-enclos entraînerait des agressions entre congénères.
Raffinement
En animalerie : Les animaux sont élevés en cages individuelles, car le hamster d’Europe n’est pas une espèce sociale et fait preuve d’agressivité envers ses congénères. Des objets visant à enrichir le milieu (tubes) et des éléments permettant le comportement de construction de nid sont placés dans les cages. Nous réaliserons une surveillance accrue des animaux opérés et un analgésique sera administré en post-opératoire dans l’eau de boisson pendant 3 jours. Les hamsters seront lâchés en enclos uniquement après complète cicatrisation et s’ils présentent une bonne condition corporelle. A noter que nous réalisons ces procédures d’implantation intra-péritonéale d’enregistreurs de température chez cette espèce depuis 10 ans, sans qu’aucune complication post-opératoire n’ait été observée. En enclos : Les hamsters seront transportés à l’enclos à 10 min de l’animalerie dans des boîtes adaptées avec du papier absorbant. Les lâchés seront réalisés en soirée au moment du pic d’activité de l’espèce. Nous serons très vigilants au bien-être des animaux dans l’enclos en réalisant des observations régulières (pièges photos et captures). Un suivi de la masse corporelle et de l’aspect général permettra d’évaluer leur état nutritionnel et sanitaire et d’agir en conséquence : supplémenter leurs apports alimentaires dans l’enclos ou ramener l’animal au laboratoire pour le soigner ou l’euthanasier en fonction du niveau d’atteinte de points limites.
Choix des espèces
Ce programme de recherche s’intéresse spécifiquement à la préservation de cette espèce. Les populations sauvages sont en déclin en raison notamment des pratiques agricoles intensives. Notre objectif est d’améliorer les pratiques agricoles afin de restaurer l’état des populations de hamsters communs. Les animaux seront étudiés à partir de l’âge de 4 mois et jusqu’à l’âge de 1,5 ans. Au-delà, une plus grande variabilité interindividuelle du succès reproducteur est observée et pourrait biaiser nos résultats.
Essai d’une thérapie cellulaire chez le rat avec des précurseurs de photorécepteurs édités génétiquement
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Chaque rat reçoit, sous anesthésie générale, une injection sous la rétine de chacun de ses yeux, de cellules dérivées de cellules souches humaines ou d'une solution tampon, puis jusqu'à six séances d'imagerie de la rétine et d'électrorétinogramme, chacune sous anesthésie. Les 325 rats, d'une lignée immunodéficiente atteinte d'une dégénérescence de la rétine qui les rend aveugles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et passent aussi des tests de vision éveillés : test optomoteur et test d'évitement de la lumière. Le porteur prévoit une "douleur oculaire" après l'opération, puis justifie l'injection du second œil en affirmant que "La rétine ne possède pas de récepteurs spécifiques de la douleur". Tous sont mis à mort à la fin de chaque procédure pour l'analyse de leur rétine.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’un canal ionique. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines, appelées cellules iPS. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une perte visuelle provoquée par une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules modifiées après transplantation. L’utilisation de cellules rendues artificiellement sensibles à la lumière vise à contourner les difficultés rencontrées par différents groupes, et rapportées dans différentes études, d’obtenir une restauration fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire développées ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont permis d’obtenir un certain succès en termes de survie et d’intégration dans le tissus hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d'édition du génome qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante. Les bénéfices attendus sont donc une restauration au moins partielle de la vue chez les animaux modèles aveugles. Ces résultats pourraient permettre à terme de proposer à des patients souffrant de cécité irréversible une thérapie visant à rendre au moins partiellement la vue ; les seuls traitement disponibles à l’heure actuelle permettent au mieux un ralentissement de la perte visuelle avant la cécité complète.
Procédures
Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection intraoculaire (sous la rétine) de cellules en suspension (2 groupes pour deux types de cellules différentes), ou de solution tampon (1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes et est réalisée une seule fois dans chaque œil de l’animal. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. Ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. L’animal étant déjà anesthésié pour la procédure chirurgicale, par conséquent il n’y aura pas d’impact significativement négatif sur le fait de pratiquer une injection intra-oculaire dans chaque œil. La rétine ne possède pas de récepteurs spécifiques de la douleur et, par conséquent, une injection dans l’œil contralatéral n'aura pas d'impact significatif sur la santé globale de l'animal. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.
Devenir
A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (survie cellulaire ; différenciation et intégration aux tissus de l’hôte ; réponse à la lumière des cellules transplantées ; reconnexion avec les autres types cellulaire).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans les deux yeux. Par ailleurs, la majorité des actes peut être réalisée sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 325 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importante des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à environ un quart des expérimentations (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.
Raffinement
Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec éléments d’enrichissement pour toute la durée du protocole ; nourriture et abreuvement à volonté. Les procédures prévoient une surveillance de leur état physique général (et particulièrement du système oculaire). Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux d’évaluation de la fonction visuelle (OCT, test optomoteur, test de comportement d’évitement de la lumière, ERG), qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue pour certains examens (imagerie, ERG) les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant ces différents actes. Le geste chirurgical, qui peut générer une nuisance ou une douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique puis un anti-inflammatoire non stéroïdien à durée d’action longue. Les signes de comportement anormal, signe de possible souffrance, seront également surveillés. Les points limites adaptés sont définis de manière adaptée aux procédures mises en œuvres et inclus une surveillance de l’état physique et comportemental de l’animal. L’observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal selon les méthodes adaptées et réglementaires.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
Quatre-vingt-dix minutes sous anesthésie gazeuse, la tête tenue par des barres d'oreille, pour une craniotomie et une injection de virus dans le cerveau : c'est l'une des deux voies comparées sur 297 souris d'une lignée transgénique pour la maladie d'Alzheimer, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. L'autre voie est une injection intraveineuse derrière l'œil, sous cinq minutes d'anesthésie, de virus modifiés codant pour une "protéine X" que le résumé ne nomme pas. Deux tests comportementaux, que le porteur décrit par ce qu'ils mesurent, alternance spontanée, apprentissage et mémoire, sans les nommer, précèdent un prélèvement de liquide céphalo-rachidien de 20 minutes sous anesthésie, puis la mise à mort de toutes les souris pour des analyses post mortem. Ces souris présentent, selon le porteur, des "signes cliniques dommageables", et leurs couples reproducteurs commerciaux sont eux aussi tués, à la fin de leur période de reproduction, sans aucun prélèvement.
Objectifs
A l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper ou ralentir les maladies neurodégénératives. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de la thérapie génique, consistant à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau afin de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer (MA). Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié permettant de délivrer l’ADN au coeur même des cellules. Notre but étant de développer ces applications en clinique, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie chez les patients. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux virus modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Notre objectif est donc de comparer l’efficacité thérapeutique de virus administrés soit par une injection intraveineuse, soit par une injection intracérébrale. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec signes cliniques dommageables seront utilisés. Les couples reproducteurs commerciaux seront utilisés. Les animaux seront injectés une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (90 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d’un anti-douleur). Deux tests comportementaux permettent de mesurer l’alternance spontanée, l’apprentissage et la mémoire des souris (selon le test, 1 session d’une journée ou des sessions d’entraînement de 4 à 8 jours avec un test effectué en une journée juste après la session d’entraînement ou jusqu’à 72h après) seront effectués afin d’évaluer les déficits cognitifs. Puis le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien (20 minutes sous anesthésie) et sanguin (1 minute) sera réalisé sous anesthésie après injection d’un anti-douleur.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1) Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observé suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) pourrait être observée (5 à 7% du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études),7) le stress engendré par les test comportementaux.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux. Ceux-ci seront euthanasiés à la fin des actes prévus que ce soit à l’issu des procédures (avec prélèvement pour analyse) ou pour l’élevage (à la fin de la période reproductive, sans prélèvement).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (297) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’analgésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection sur les yeux de l’animal. Une surveillance particulière de l’oeil sera faite en post-opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. L’applicateur est formé au geste d’injection intraveineuse. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. Le respect des points limites en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe contribuent au bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux adultes (entre 5 et 6 mois environ) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections intracérébrales ou intraveineuses chez les souris adultes afin de comparer les effets du traitement sur la neuropathologie et le comportement en fonction des deux voies d’administration.
Test des fonctions cardiaques et musculaires chez des souris déficientes en Tafazzin (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles naissent avec un déficit de poids et développent des atteintes cardiaques et musculaires, puis sont gavées deux fois par jour, soumises à des échographies et à des courses forcées sur tapis avant la mise à mort. Le porteur teste le repositionnement de médicaments déjà commercialisés pour d'autres maladies. Il présente le passage à l'humain comme rapide en cas de succès, sans traitement curatif existant à ce jour.
Objectifs
Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.
Procédures
Pas de procédures chirurgicales sur animaux vivants (prélèvements terminaux de différents organes sur animaux euthanasiés). Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (2 fois par jour pendant 1 semaine maximum; quelques secondes pour chaque geste) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste).
Impact sur les animaux
Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 5 mois. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10-12 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 2 fois par jour durant 3 mois lors de la DAP précédente n'ont pas révélé de nuisances particulières. Les prélèvements sanguins et l'echocardiographie sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. Le suivi des performances sur tapis de course teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux en fin de cinétique pour prélèvements terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet (DAP) précédentes.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Ces mêmes animaux seront également communs entre cette demande d'autorisation de projet (DAP) et une autre DAP. Par ailleurs, si les faibles doses ont un effet positif, les doses supérieures ne seront pas testées, diminuant ainsi le nombre total d'animaux. On passera à la dose supérieure uniquement si aucun effet sur dosages sanguins mais également sur poids, échocardiographies, treadmill et analyses sur organes n'est observé. Les mises au point actuelles montrent qu’un n de 5 est suffisant pour obtenir des statistiques robustes. Le logigramme montre que si l’étape 2 (sacrifice pour prélèvements d’organes et de sang) n’est pas engagée alors on aura des lots de 10 en étape 3 et si l’étape 2 (sacrifice pour prélèvements d’organes et de sang) est engagée alors on aura des lots de 5 en étape 2 et en étape 3. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.
Raffinement
Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis la mise en place des conditions optimales pour le bien-être des animaux. Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des animaux inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance : si on dépasse les 20 pourcents d'écart par rapport à l'animal lui-même, alors l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste, développés dans chaque procédure. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir, l'animal sera immédiatement euthanasié. Lors des échocardiographies, la surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux modèle de la maladie, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les animaux contrôles seront séparés des anaimaux modèle de la maladie dans les cages.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront élevés et gavés quotidiennement avec les candidats médicaments dans l'animalerie de production puis envoyés à l'animalerie où se feront les expérimentations de la présente DAP à l'âge de six mois (âge où un défaut en échocardiographie et sur tapis de course a été mis en évidence lors d'une précédente DAP).
Etude des réponses immunitaires dans un modèle souris de sepsis : rôle d’un messager cellulaire et bénéfices d’une immunonutrition
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un sepsis leur est provoqué par injection de bactéries, avec un affaiblissement et une perte de poids pouvant atteindre le point limite de 20%, pour étudier une dysfonction immunitaire et tester un apport d'acides aminés. Le porteur décrit l'accès aux organes comme "indispensable", ce qui exclut de garder les souris en vie. Les débouchés thérapeutiques annoncés, une immunonutrition pour les patients, restent au conditionnel.
Objectifs
Le sepsis caractérise un état infectieux sévère entrainant des perturbations du système immunitaire, responsables d'une susceptibilité accrue aux infections secondaires à l'origine de la majorité des décès tardifs. Notre projet a pour objectif une meilleure compréhension du défaut des cellules du système immunitaire à produire des anticorps protecteurs lors d'une infection secondaire au sepsis. Nous souhaitons déterminer le rôle d'une molécule (un messager) libérée par les cellules immunitaires lors du sepsis dans le développement de cette dysfonction immunitaire. Nous souhaitons aussi démontrer qu'un apport de nutriments (acides aminés) lors du sepsis est capable de restaurer la capacité du système immunitaire à produire des anticorps protecteurs après un sepsis. Ce projet devrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes permettant de réguler cette dysfonction immunitaire acquise dans le sepsis et par conséquent d’envisager le développement de nouvelles thérapeutiques à base d'immunonutrition, ou ciblant le messager, pour une meilleure prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
Nos travaux permettront une meilleure compréhension des mécanismes qui contrôlent les réponses immunitaires dans le sepsis et plus généralement lors d'inflammation, en démontrant notamment les bénéfices d'un apport en acides aminés dans la production d'anticorps protecteurs, et en élucidant le rôle d'un messager produit lors du sepsis. Nos travaux permettraient ainsi d’envisager le développement de nouvelles thérapeutiques à base d'immunonutrion ou ciblant le messager pour mieux prendre en charge les patients et diminuer ainsi le risque de mortalité lié au sepsis.
Procédures
Pour l’induction du sepsis, les animaux vigiles recevront une seule injection d’une quantité définie de bactéries, geste réalisé en moins d'une minute. Les animaux vigiles recevront une injection permettant leur réhydratation (geste réalisé en moins d'une minute) 1 fois par jour les premiers jours suivants l'induction du sepsis. L’apport de nutriment sera réalisé sur animal vigile par administration orale, ce geste est réalisé en moins d’une minute, 1 fois par jour, les 5 premiers jours après induction du sepsis. Pour déclencher une réponse immunitaire spécifique, les animaux vigiles recevront une seule injection d’une quantité définie de molécules immunogènes (geste réalisé en moins d'une minute). Pour le suivi des réponses immunitaires, des prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux vigiles (environ une minute) à raison d’un prélèvement tous les 5 jours maximum.
Impact sur les animaux
L‘induction d’un sepsis consiste à déclencher une infection péritonéale multi-bactériennes qui engendre un affaiblissement transitoire de l'animal avec une perte de poids transitoire, les 2 premiers jours, inferieure à 20% du poids d'origine. L'immunisation par injection d'agents immunogènes n'entraine aucune pathogénicité et pas de stress en dehors du stress bref et modéré lié à l’injection unique de l'agent réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires. Dans le cas où un inconfort est observé, la douleur sera soulagée. De plus si l’un des points limites que nous avons définis serait atteint, la souris serait mise à mort selon une méthode réglementaire.
Devenir
L'accès aux organes est indispensable pour évaluer le bénéfice de l'immunonutrition et étudier la mise en place des réponses immunitaires au niveau de la rate, par des techniques de cytométrie en flux et de marquages sur coupes de tissus. Il nous est donc impossible de garder en vie les animaux concernés par l’étude.
Remplacement
Dans ce projet, nous étudierons les réponses immunitaires au cours d'un sepsis et les réponses immunitaires secondaires à un sepsis. L’utilisation du modèle animal est justifiée car les conséquences physiopathologiques d’un sepsis ne sont pas reproductibles in vitro. En effet, les différents acteurs du système immunitaire sont impactés par le sepsis et contribuent au dysfonctionnement des organes.
Réduction
Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce projet est la continuation de travaux précédents qui nous ont permis d'acquérir l'expertise des modèles utilisés : induction du sepsis, suivi des réponses immunitaires, caractérisation de l'impact d'une immunonutrition. Ces travaux nous ont permis de déterminer précisément le nombre d’animaux nécessaires pour avoir des résultats significatifs et notre expertise nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé dans cette nouvelle étude en utilisant une méthode plus reproductible pour induire le sepsis.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adéquates : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum. Les animaux sont maintenus maximum à 5 par cage et aucun animal ne sera isolé de ses congénères. Un suivi quotidien des animaux comprenant une évaluation du score de grimace, une mesure de leur poids et une évaluation de leur comportement, permettra de pouvoir contrôler correctement leur état de santé. Les souris recevront une réhydratation, une analgésie si le score de grimace moyen est compris entre 1 et 1.5 et une antibiothérapie en cas de perte de poids moyenne > 10% en 24h. En cas d’atteinte des points limites (perte de poids > 20% et score MGS supérieur à 1.5), les souris seront euthanasiées. Le modèle CS de sepsis sera utilisé dans ce projet, moins invasif et plus reproductible que le modèle CLP.
Choix des espèces
Le modèle animal murin est très utilisé en immunologie, les protocoles pour étudier le système immunitaire sont bien établis. Ce modèle animal permet d'invalider des gènes spécifiquement dans un type cellulaire. Cet aspect est important pour évaluer finement les mécanismes impliqués dans un processus biologique aussi complexe que la réponse immunitaire lors d'un sepsis. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, en effet le système immunitaire atteint sa maturité à l’âge adulte. Cela correspond aux âges utilisés dans les publications scientifiques.
Plasticité activité dépendante de la transmission synaptique inhibitrice dans le système nociceptif spinal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une douleur inflammatoire ou neuropathique leur est provoquée par injection ou chirurgie, sans analgésie possible selon le porteur car elle interférerait avec le modèle, pour une durée allant jusqu'à 24 heures ou deux semaines. Elles subissent jusqu'à vingt tests de mesure de la douleur avant le prélèvement de la moelle épinière et la mise à mort. Le projet relève de la recherche fondamentale sur les neurones inhibiteurs de la douleur, les cibles thérapeutiques restant à identifier.
Objectifs
La douleur résulte de la représentation mentale que notre cerveau produit à partir des informations provenant de certains nerfs sensoriels. Avant d'arriver au cerveau, ces informations passent par la moelle épinière. Dans la moelle épinière, des réseaux de neurones mettent en forme cette information sensorielle avant de la transmettre au cerveau où la douleur pourra être élaborée. Les réseaux de neurones de la moelle épinière qui mettent en forme cette information sont très plastiques: ils travaillent différemment selon ce qu'ils ont fait précédemment. Ainsi, une première stimulation aura un impact sur la douleur ressentie lors d'une seconde stimulation. Cette "plasticité" intervient également lors des douleurs inflammatoires ou neuropathiques: suite à l'inflammation ou à la neuropathie, ces réseaux changent leurs fonctionnement. C'est cela que nous étudions. En particulier, dans ces réseaux, il y a des neurones qui servent à freiner le passage des informations: les neurones inhibiteurs. Ce projet de recherche vise à comprendre comment les neurones inhibiteurs changent leurs propriétés de "frein" en conditions inflammatoires et neuropathiques.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de la plasticité de de l'inhibition dans la moelle épinière en situation neuropathique et inflammatoire. Ceci est important pour comprendre comment des douleurs peuvent devenir chroniques et pour identifier des cibles pour le développement de traitements.
Procédures
Un groupe d'animaux subira un test de mesure de la douleur d'une durée de 5 minutes chaque jour pendant 5 jours puis une chirurgie d'une durée de 15 minutes. Un autre groupe subira une injection sous anesthésie d'une durée de 1 minute, 5 tests de mesure de la douleur d'une durée de 5 minutes puis une chirurgie d'une durée de 15 minutes. Un dernier groupe subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes, 20 tests de mesure de la douleur puis une autre chirurgie d'une durée de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Modèle inflammatoire : douleur sans possibilité d'analgésie d’une durée de 24 h. Modèle neuropathique : -douleur sans possibilité d'analgésie -comportements et stress associés à la douleur. Ces comportements associés à l'état douloureux sont notammant: augmentation ou diminution de la mobilité (comportement spontané), hyporéaction ou hyperréaction (comportement provoqué). Le tout d'une d’une durée de 2 semaines. -perte de poids - irritation et inflammation au niveau de l'intervention
Devenir
Chaque procédure débouche sur un préllèvement et la mise à mort de l’animal.
Remplacement
Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes spinaux responsables du développement des douleurs inflammatoires et du développement et du maintien des douleurs neuropathiques. Le réseau neuronal spinal est encore mal identifié et n’est pas modélisé à ce jour. Les connaissances actuelles ne permettent donc pas de réaliser des études par modélisation, sans avoir recours à l'expérimentation animale.
Réduction
a réduction est appliquée à la fois par une approche statistique appropriée et partage/mutualisation des tissus pour des expériences multiples. Réduction par approche statistique appropriée. Le nombre d’animaux par groupe a été établi en fonction de la dispersion des données mésurées lors des expériences précédemment publiées par l’équipe. Pour chaque protocole, nos expériences d’électrophysiologie nécessitent l’enregistrement de 40 neurones pour atteindre le seuil de significativité (analyses de la plasticité synaptique à court terme par régression non linéaire). Puisqu’environ 4 neurones sont enregistrés par animal, 10 animaux de chaque sexe sont nécessaires. Nos expériences d’électrophysiologie nécessitent donc 20 animaux par protocole. Réduction par partage/mutualisation des prélèvements. Autant que possible, les ganglions rachidiens prélevés en même temps que la moelle épinière seront utilisés pour réaliser en parallèle des expériences d’imagerie du calcium sur cultures primaires (partage des tissus). Par ailleurs, nous avons réalisé une étude bibliographique exhaustive assurant que les expériences proposées n'ont jamais été réalisées.
Raffinement
Le raffinement est assuré en offrant un hébergement approprié aux souris, permettant de respecter leur éthogramme : les animaux sont hébergés dans des cages collectives enrichies avec des barrots de bois, et du matériel de nidification (coton et frisure). Lors des procédures invasives de réalisation des modèles douloureux (injection de carragénine pour le modèle inflammatoire, opération pour le modèle neuropathique) et lors du prélèvement de moelle épinière, les animaux sont maintenus sous anesthésie profonde. Lors de l'induction et du développement des protocoles douloureux durant lesquels des analgésiques ne peuvent pas être utilisés car ils interfèrent avec la mise en place du modèle inflammatoire, des points limites sont établis afin de soustraire les animaux à une souffrance excessive. Par ailleurs, la durée des protocoles douloureux est réduite au strict nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Choix des espèces
Les souris sont largement utilisées en recherche sur le système nerveux responsable de la sensation de douleur. En effet, ce système est analogue chez l’homme et la souris car il est apparu chez l’ancêtre commun des rongeurs et des primates. Les souris représentent donc un bon modèle pour l’étude de ce système. De nombreuses lignées de souris transgéniques sont disponibles, et pourrons dans le futur nous permettre de disséquer les mécanismes auxquels nous nous intéressons ; ce qui justifie l’utilisation du modèle murin. Les animaux sont utilisés entre 6 et 10 semaines , stade de développement où le système spinal est mâture.
Développement d’une approche radiomique basée sur l’imagerie scanner pour identifier les signatures radio-immunes dans des modèles de tumeurs sous cutanées chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est greffée sous la peau, puis elles sont imagées au scanner et irradiées sous anesthésie, pour entraîner un algorithme d'intelligence artificielle censé repérer des signatures d'infiltration immunitaire. Le porteur justifie 50 souris par groupe par le besoin d'un grand jeu de données pour l'apprentissage automatique. Les retombées annoncées pour la médecine personnalisée sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant le développement de l'algorithme.
Objectifs
L'avènement de l'immunothérapie a conduit à un changement des pratiques dans le traitement de certains cancers, conduisant à des résultats impressionnants en termes de survie et de réponse tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond à l'immunothérapie, soulignant ainsi le besoin urgent de biomarqueurs pronostiques et prédictifs. L'infiltration immunitaire tumorale est un élément essentiel de la réponse immunitaire contre le cancer, conditionnant la réponse à l’immunothérapie. Le développement de stratégies non invasives pour quantifier cette infiltration immunitaire tumorale et prédire le résultat du traitement pourraient représenter une avancée majeure. Ce projet vise à développer et tester, dans des modèles tumoraux murins, une approche basée sur l’analyse d’images radiologiques (par scanner) combinée à des méthodes d’intelligence artificielle pour développer des algorithmes prédictifs.
Bénéfices attendus
À l'ère de la médecine personnalisée, où les stratégies thérapeutiques sont de plus en plus adaptées aux profils spécifiques des patients et des tumeurs, le développement d’algorithmes prédictifs pourrait représenter un outil précieux d'aide à la décision, guidant la prise en charge des patients atteints de cancer. La possibilité de déchiffrer de manière non invasive le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement, par le biais de signatures radio-immunes, pourrait impacter de façon majeure la pratique clinique. De plus, l’opportunité de suivre dynamiquement et "en temps réel" l’infiltration de cellules immunitaires peut nous permettre de proposer de nouveaux traitements sur mesure. Cela pourra améliorer l’efficacité des thérapies et réduire les chances d’échec thérapeutique, en sélectionnant les patients qui ont le plus de possibilités de répondre au traitement sélectionné et en arrêtant précocement des traitements inefficaces.
Procédures
Deux modèles seront développés en parallèle, le premier chez la souris C57BL/6J avec une injection sous-cutanée de cellules de MC38 (murine colon carcinoma cells) dans le flanc droit et le second modèle chez la souris BALB/c avec une injection sous-cutanée de cellules CT26 (murine colon carcinoma cell line) également dans le flanc droit. Après une période de 10 à 20 jours permettant la croissance tumorale, les souris seront imagées sur scanner 1 jour avant l’irradiation, 4 et/ou 6 jours après l’irradiation, chaque acquisition durera 15 min. Les irradiations seront réalisées sur le SARRP et dureront entre 10 et 30 min. Que se soit pour les acquisitions des images ou les irradiations, les souris seront anesthésiées.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales et la croissance tumorale qui suivra. Les imageries et les irradiations se feront sous anesthésie et ne sont pas susceptibles de causer de souffrance ou détresse aux animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus (dont la tumeur) pour analyses ultérieures.
Remplacement
Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie localisée combinée ou non à des immunomodulateurs sur le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement pour dévoiler des signatures radio-immunes. L’étude du recrutement et de la réponse des leucocytes dans la tumeur nécessite la présence d’un système immunitaire efficace dans un modèle dynamique (depuis la production des cellules dans la moelle osseuse, leur libération dans le sang, leur maturation dans les organes lymphoïdes secondaires, jusqu’au recrutement sur le site tumoral) qui ne peut pas être réalisée in vitro. Ceci met en jeu des interactions complexes nécessitant un organisme vivant entier. Les modèles murins sont imparfaits d’un point de vue purement biologique mais permettent d’étudier la réaction immunitaire anti-tumorale in vivo et ont l’avantage d’être d’une taille bien plus faible que chez l’humain, ce qui permet une inclusion en totalité des tumeurs et des tissus environnant pour une analyse histologique exhaustive. Cette inclusion en totalité ouvre une possibilité plus importante de mise en correspondance spatiale d’images histologiques et radiologiques, non réalisable en clinique, et apportera des éléments concrets quant à la réalité biologique d’hypothèses faites depuis plusieurs années en clinique. De plus, des modèles murins permettant la modulation in vivo de sous-populations spécifiques de cellules immunitaires (par exemple la déplétion vs l'enrichissement en CD8) au sein du microenvironnement immunitaire tumoral pourraient renforcer la signification biologique de notre signature radiomique. Nous envisageons pour cela un traitement personnalisé incluant radiothérapie et agents immunomodulateurs (anti-CD8) capables d'agir sur la contexture immunitaire tumorale.
Réduction
La génération d’un algorithme prédictif et pronostique par deep learning nécessite l’analyse d’un large set de données. En effet, cela est nécessaire pour un bon entraînement des algorithmes de prédiction. De plus, il est nécessaire d’utiliser une cohorte indépendante sur laquelle tester l’efficacité des algorithmes développés. Il n’existe aucune donnée dans la littérature concernant des analyses radiomiques dans des modèles tumoraux murins. Notre estimation de 50 souris par groupe est donc basée sur des observations cliniques et sera adapté sur la base des données obtenues pendant la réalisation du projet. En outre, les modèles murins que nous utiliserons ont déjà été testés et validés dans de nombreuses publications, et la collaboration avec un autre laboratoire nous permettra d'avoir des modèles déjà testés et performants, minimisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au minimum la souffrance et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton ou des nids en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limites seront strictement appliqués. - Le développement de la tumeur ainsi que les signes de toxicité (perte de pois, prostration) seront évalués 3 fois par semaine (euthanasie des souris dès qu’un point limite est atteint).
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures. De plus, des modèles tumoraux ORL et pulmonaire ont été développés et caractérisés en utilisant des souris de cet âge, et nous allons maintenir ces mêmes paramètres pour cette étude avec des tumeurs coliques sous cutanées.
Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur l’inflammation pulmonaire induite par le virus respiratoire syncytial humain, la poussière d’acariens, et leur combinaison chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
4 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 4 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus respiratoire syncytial et exposées à la poussière d'acariens pour reproduire une bronchiolite et un asthme, y compris des nouveau-nés de cinq à sept jours infectés éveillés, avec des pertes de poids pouvant dépasser 25% et une trachéotomie avant la mise à mort. Le porteur indique que la manipulation des nouveau-nés peut entraîner leur rejet par la mère. Les nouvelles molécules testées ne visent une introduction en clinique qu'à terme, l'apport immédiat restant l'évaluation chez la souris.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans des modèles de bronchiolite et d’asthme induits par le virus respiratoire syncytial, la poussière d’acariens, ou leur combinaison.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’infection au RSV, l’asthme allergique ou l’asthme exacerbé. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies.
Procédures
Pour reproduire la bronchiolite, des souris de 5-7 jours ou de plus de 6 semaines seront infectées une ou deux fois au virus respiratoire syncytial par voie intranasale, vigile pour les nouveau-nés (acte de 5min) ou sous anesthésie générale pour les animaux sevrés (
Impact sur les animaux
Dans le cas de l’infection au RSV, avec ou sans administration de poussières d’acariens, nous nous attendons à des pertes de poids importantes pouvant dépasser 25%, mais 25% de perte de poids (ou 20% maintenue sur 3 jours) constituera un point limite. Des difficultés respiratoires pourraient être observées et seront suivies grâce à une grille de scoring (voir procédures 1&3). Elles sont toutefois très rares. Les animaux pourraient présenter le poil hérissé de manière transitoire. Dans le cas des poussières d’acariens seules, nous nous attendons à des pertes de poids modérées . Dans ce modèle, nous n’attendons pas de difficultés respiratoires ou d’autre signe que la perte modérée de poids mais leur absence sera surveillée. Compte tenu des volumes administrés, et à l’analgésie et anesthésie si besoin mis en place, le stress et la douleur associés aux administrations et prélèvements seront légers. Dans le cas particulier de la pose d’une minipompe, la douleur associée à la chirurgie sera modérée au vu de l’analgésie mise en place. Le stress associé sera léger. Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles impliqueront une trachéotomie, donc l’anesthésie inclura l’administration de buprénorphine et un alpha-2 agoniste. Par ailleurs, elles seront réalisées sous anesthésie profonde (avec ajout de curares pour bloquer les mouvements respiratoires spontanés) et suivies d’une euthanasie sans réveil. Dans le cas d'utilisation de nouveau-nés, leur manipulation pourrait entrainer un rejet par la mère.
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, ainsi qu’à des lavages broncho-alvéolaires et des mesures de compliance pulmonaire, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus des pathologies telle que décrites chez l’homme.
Réduction
Chez la souris, d’après la littérature et d’après les études déjà réalisées dans notre laboratoire et sur la base de tests de type ANOVA, un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe est nécessaire pour observer une réduction significative de 50% d’un seul paramètre d’intérêt (exemple : inflammation constatée par histologie). Ce nombre pourra monter jusqu’à 15 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement préventif ou curatif (analyse de l’expression de cytokines…). Des animaux satellites devront être utilisés pour les mesures de paramètres mécaniques ventilatoires (sur animaux non infectés donc études sans RSV). La possibilité de se passer d’animaux satellites et de réaliser ces mesures sur les mêmes animaux que les autres analyses sera évaluée lors des premières études utilisant cette méthode.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une réhydratation sous-cutanée sera mise en place • Entre 10 et 15% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Lactate, 0.5mL, une fois par jour • Entre 15 et 20% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, deux fois par jour. Un scoring des difficultés respiratoires sera effectué tous les jours. En pratique, toute gêne respiratoire très marquée constituera un point limite avec euthanasie immédiate. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les principaux points limites en plus de ceux liés au scoring concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction d’inflammation pulmonaire et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cours d’étude, plusieurs anesthésies seront pratiquées notamment en cas de prélèvements de sang ou d’injections de produits : • Les administrations IV, IM, IP, SC et ID de composés tests se feront si nécessaire sous anesthésie générale à l’Isoflurane. • Une administration de buprénorphine sera réalisée avant les administrations IM/ID. • L’implantation d’une mini pompe en sous-cutané pourra être nécessaire lors d’une délivrance continue du composé test. La chirurgie d’implantation sera réalisée sous anesthésie générale Isoflurane et dans des conditions d’asepsie, avec une prise en charge analgésique 30 min avant l’anesthésie, puis jusqu’à 48 heures post chirurgie si besoin. Le suivi de la cicatrisation sera enregistré, et les sutures désinfectées régulièrement. Afin de minimiser les risques d’infection lors d’injections intradermiques, une tonte de la peau avec désinfection sera réalisée avant injection. Les injections intradermiques se feront sous un volume de 50 µL par site d’injection afin de limiter la douleur.
Choix des espèces
- L’infection RSV chez la souris est bien documentée dans la littérature. - L’inhalation de poussière d’acariens pour déclencher une réponse asthmatique allergique est aussi très bien caractérisée chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées a minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie pulmonaire et la dose toxique dans la même espèce. Pour les études RSV, des nouveau-nés de 5-7 jours pourront être utilisés, de même que des animaux sevrés (jeunes adultes ≥ 6 semaines). Des femelles gestantes seront commandées à 2 semaines de gestation, afin d’avoir une mise bas une semaine plus tard dans nos locaux. Les nouveau-nés seront utilisés pour réaliser une primo-infection à l’âge de 5-7 jours, suivie d’une seconde infection 5 semaines plus tard. Cette condition permet de récapituler tous les signes cliniques de la bronchiolite du jeune enfant. L’infection RSV unique ou double pourra aussi être réalisée sur des animaux sevrés (≥ 6 semaines) pour reproduire uniquement la composante inflammatoire de la maladie, sans production de mucus. Pour les études utilisant la poussière d’acariens, seuls des animaux adultes sevrés ≥ 6 semaines seront utilisés. Pour les études combinant infection RSV et poussière d’acariens, seuls des animaux adultes sevrés ≥ 6 semaines seront utilisés.