Rongeurs

Pour vérifier qu'un candidat médicament ne perturbe pas la respiration avant son administration à des personnes, 1 200 rats, 400 souris et 200 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe six heures, jusqu'à dix, enfermé dans une chambre de plexiglas de dix-neuf centimètres de diamètre, et certains subissent d'abord une chirurgie de quinze à trente minutes pour l'implantation d'un cathéter dans la veine jugulaire, puis restent isolés jusqu'à soixante-douze heures pour que leurs congénères n'abîment pas le dispositif. Les administrations peuvent se répéter deux fois par jour pendant un mois. 270 animaux pourront être réutilisés dans d'autres projets, notamment de formation, si la souffrance réelle est restée légère ou modérée, les autres seront tués pour des prélèvements terminaux ou après des effets marqués du produit testé.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer les effets de différents candidat-médicaments sur les paramètres respiratoires en utilisant la pléthysmographie de corps entier chez le rongeur vigile. Cette technique permet d'évaluer la fonction respiratoire des animaux sans les contraindre (pas d'anesthésie ni contention pendant la réalisation des mesures). Dans la majorité des cas, ce test sera utilisé dans le cadre de la pharmacologie de sécurité pour vérifier que les candidats-médicaments n'ont pas d'impact sur la fonction respiratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Si le candidat médicament doit être administré par voie intraveineuse, les animaux subiront au préalable une chirugie sous anesthésie générale afin d'implanter un cathéter dans la veine jugulaire (durée 15-30min). Les animaux seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Et ces animaux seront ensuite hebergés seuls après la chirurgie afin que leur congénère ne puisse pas altérer le cathéter (maximum 72h). Dans tous les cas, les animaux de ce projet devront séjourner plusieurs heures (généralement 6h, maximum 10h) dans un pléthysmographe (c'est à dire une chambre en plexiglass transparent, de 19cm de diamètre pour 11cm de hauteur) afin de mesurer leurs paramètres respiratoires. Le candidat médicament et le placebo seront administrés aux animaux par différentes voies. Dans la grande majorité des cas, le candidat médicament sera administré une seule fois. S'il doit être administré plusieurs fois, l'administration aura lieu au maximum 2 fois par jour pendant 1 mois. Cette administration nécessitera une contention légère d'environ 1 minutes (non-nécessaire en cas d'administration iv via le cathéter). Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile ou anesthésié (durée des prélèvements: moins de 3min, maximum 2 prélèvements par 24h, sur 5 jours d'affilée maximum).

Impact sur les animaux

Certains animaux pourront subir une chirurgie d'implantation de cathéter veineux qui peut induire des douleurs, qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie et un traitement analgésique. Le séjour dans un espace restraint pendant plusieurs heures peut engendrer un stress léger, qui sera réduit par une habituation préalable aux conditions expérimentales. Par ailleurs, les contentions des animaux vigiles pour administrer le candidat-médicament peuvent engendrer un stress mineur. Enfin, peuvent être envisagés en cours d'expérience des prélèvements de sang, qui induisent chez l'animal une douleur de l'ordre d'une piqure d'aiguille.

Devenir

Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non-utilisés pour d’autres projets. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la respiration; ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, l’objectif principal de ce projet est d'évaluer l'impact sur la fonction respiratoire, ce qu'il n’est pas possible de faire sur des cellules en culture ou organes isolés et qui nécessite un organisme entier dont la physiologie est fonctionnelle. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat, la souris et occasionnellement le cobaye sont les espèces rongeur qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (i.e. 8 par groupe).

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu principalement pas le recours à une procédure non-invasive sans contrainte de l'animal (pléthysmographie corps-entier). De plus, les animaux sont habitués préalablement aux conditions expérimentales. En cas de chirurgie (nécessaire pour une administration intraveineuse), le raffinement sera mis en place par un protocole anesthésique et analgésique adapté. Des points limites adpatés sont définis et le recours à l'euthanasie se fera lorsque cela s'averera nécessaire.

Choix des espèces

Le rat, la souris et occasionnellement le cobaye sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans le modèle animal de pléthysmographie sur corps entier. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Le virus respiratoire syncytial et le SARS-CoV-2 sont instillés dans le nez des souris, une à deux fois, au cours d'expériences de cinq à dix jours. 176 souris génétiquement modifiées pour porter le récepteur humain ACE2 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées au dioxyde de carbone pour le prélèvement de leurs poumons, de leur liquide broncho-alvéolaire et de leur sang. L'objet est de savoir si une enzyme pulmonaire, la MMP-7, freine l'entrée de ces virus dans les cellules, question déjà abordée en culture cellulaire. Le porteur affirme que les animaux "ne ressentent aucune gêne" et qu'aucune manipulation n'a lieu sur animal conscient, tout en listant une gêne respiratoire pendant un à cinq jours, un isolement et une posture recroquevillée pendant vingt-quatre à soixante-douze heures, et une hypothermie possible après anesthésie.

Objectifs

Ce projet part de l’idée que certaines molécules produites par les cellules des poumons lors d’une infection en particulier une enzyme qui décompose certaines protéines et qui pourraient aider le corps à se défendre contre des virus respiratoires. La molécule est naturellement présente en grande quantité dans les cellules qui tapissent nos voies respiratoires, et elle semble jouer un rôle important dans plusieurs maladies pulmonaires. Nos premières expériences en laboratoire montrent que cette enzyme pourrait empêcher ces virus d’infecter les cellules. Mais il reste à vérifier si elle joue le même rôle dans un organisme vivant. L’objectif du projet est donc de comprendre comment la molécule contribue à la défense immunitaire : -influence-t-elle l’entrée des virus dans les cellules ? -participe-t-elle à activer ou réguler la réponse immunitaire ? -permet-t-elle de réduire la gravité ou la progression de l’infection, y compris lors d’une co-infection par les deux virus ? En bref, ce projet cherche à déterminer si l’enzyme en question est un acteur clé de la protection naturelle des poumons contre ces infections virales.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’améliorer notre compréhension du rôle d’une molécule dans l’inflammation des voies respiratoires et dans les problèmes pulmonaires provoqués par les infections virales. En étudiant comment cette molécule influence l’infection et la réaction du corps, nous espérons identifier des mécanismes importants qui pourraient aider, à terme, à mieux prévenir, diagnostiquer ou traiter ces infections chez l’homme. Les observations recueillies permettront de comprendre : -comment les virus se développent dans les poumons, -comment l’organisme réagit (inflammation, substances libérées par le système immunitaire, production de mucus), -et dans quelle mesure la molécule aide à éliminer les virus. Les résultats attendus pourraient ouvrir de nouvelles pistes pour le développement de traitements ou d’outils médicaux destinés aux infections respiratoires. Le modèle utilisé dans ce projet deviendra également un outil précieux pour la recherche future, notamment pour étudier d’autres virus respiratoires ou pour tester de potentielles stratégies vaccinales.

Procédures

Aucune manipulation n’est réalisée sur des animaux conscients. Les virus sont administrés par voie intranasale uniquement lorsque les animaux sont complètement anesthésiés, ce qui évite toute douleur ou stress. L’administration des virus sera réalisée une à deux fois au cours des expérimentations, dont la durée totale est de 5 à 10 jours. Tous les prélèvements nécessaires à l’étude (sang, liquide pulmonaire, poumons) sont effectués uniquement après l’euthanasie, afin que les animaux ne ressentent aucune gêne. Par ailleurs, les animaux ne sont manipulés qu’une seule fois par jour, pour une durée courte de 2 à 3 minutes, afin d’assurer le suivi de leur bien-être. Ainsi, toutes les manipulations pouvant provoquer de l’inconfort sont réalisées sous anesthésie ou après l’euthanasie, et les animaux ne sont jamais vigiles pendant ces procédures.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet pourraient présenter certains effets liés à l’infection expérimentale ou aux procédures nécessaires à l’étude. Ces effets resteront en général modérés et temporaires, et feront l’objet d’une surveillance étroite. Les nuisances possibles sont les suivantes : 1.Gêne respiratoire légère à modérée : Les animaux pourraient respirer plus rapidement ou avec un certain inconfort durant les premiers jours après l’infection (environ 1 à 5 jours). Les signes respiratoires très marqués seront considérés comme un critère d’arrêt immédiat pour protéger l’animal. 2.Changements de comportement : Une baisse d’activité, un isolement ou une posture recroquevillée peuvent apparaître temporairement (24 à 72 heures). Ces réactions sont courantes lors d’infections ou après des interventions légères. 3.Baisse temporaire de la température après anesthésie : Une légère hypothermie peut survenir dans les heures suivant l’anesthésie, mais elle est corrigée rapidement grâce au maintien au chaud. Une hypothermie prolongée serait un critère d’arrêt. 4.Léger inconfort lié aux instillations intranasales : Des éternuements, toux légères ou irritations du nez peuvent apparaître juste après la procédure, mais ces signes sont brefs et disparaissent en quelques minutes ou heures. 5.Diminution transitoire de l’appétit ou de l’hydratation : Certains animaux pourraient manger ou boire un peu moins pendant 1 à 3 jours, entraînant parfois une légère perte de poids. Une perte trop importante ou persistante entraînera l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal concerné. 6.Sensibilité accrue des lignées génétiquement modifiées : Les souris utilisées, dont certaines présentent des modifications génétiques, peuvent être plus sensibles aux infections. Elles pourront donc montrer des signes un peu plus marqués, ce qui justifie une surveillance renforcée et des mesures de prise en charge adaptées. Toutes ces nuisances prévues seront limitées au maximum grâce aux pratiques de raffinement, à un suivi rigoureux et à l’application stricte de critères d’arrêt pour garantir le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux ne pourront pas être réutilisés, car le protocole prévoit un prélèvement terminal des poumons, du liquide broncho-alvéolaire et du sang. Ces échantillons ne peuvent être obtenus que post-mortem et justifient que l’euthanasie soit réalisée en fin de procédure, garantissant la qualité et la validité des analyses prévues. Cette approche assure également que la procédure est uniforme et compatible avec le respect du bien-être animal. Les animaux seront euthanasiés à l’aide de dioxyde de carbone (CO₂), conformément aux recommandations réglementaires et éthiques en vigueur. Le gaz est introduit de manière progressive dans une chambre adaptée, ce qui entraîne une perte de conscience rapide. Les animaux sont observés en continu afin de garantir que la procédure se déroule correctement, et le décès est confirmé par l’absence de respiration et de réflexes. Cette méthode est réalisée uniquement par du personnel formé et autorisé. Une méthode secondaire validée peut être utilisée si nécessaire. L’utilisation du CO₂ permet de limiter les manipulations individuelles et d’assurer une procédure uniforme, réalisée dans des conditions contrôlées et compatibles avec le respect du bien-être animal.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, nous avons d’abord réalisé toutes les études possibles sans modèle animal. Nous avons notamment travaillé sur des cellules cultivées en laboratoire et utilisé des outils informatiques permettant de faire des prédictions. Ces méthodes nous ont permis d’obtenir de nombreuses informations et de réduire autant que possible le recours aux animaux. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des réactions d’un organisme vivant, en particulier pour comprendre l’inflammation des poumons et la manière dont le corps réagit à une infection ou une coinfection. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux reste nécessaire pour certaines étapes du projet.

Réduction

Le projet est conçu pour utiliser le minimum d’animaux nécessaire afin d’obtenir des résultats fiables. Le nombre de souris est défini en tenant compte de la quantité de données nécessaires pour répondre aux questions scientifiques, tout en évitant les groupes trop nombreux. Chaque animal sera étudié de manière optimale : plusieurs mesures et analyses seront effectuées sur le même animal (ex. analyse des poumons, du sang, observation de l’infection), ce qui permet de réduire le nombre total de souris. Nous utiliserons également des plans expérimentaux optimisés, qui combinent différentes analyses et exploitent au maximum les informations de chaque animal, sans compromettre la qualité des résultats. Cette approche respecte le principe des 3R : réduire le nombre d’animaux tout en obtenant des données fiables et significatives, et limiter les nuisances pour chaque animal.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux sont conçues pour réduire au maximum toute douleur, stress ou inconfort. Elles sont réalisées par du personnel spécialement formé et expérimenté. Des mesures spécifiques seront appliquées pour le bien-être des souris : Les anesthésies seront faites de manière sûre avec un gaz adapté, et la température corporelle sera maintenue pour éviter toute hypothermie. Les yeux seront protégés pendant l’anesthésie, et les animaux seront surveillés de près jusqu’au réveil pour détecter tout signe de malaise. La douleur sera gérée avec des médicaments si nécessaire, et les signes de détresse ou de changement de comportement déclencheront une intervention immédiate. Les animaux disposeront d’un environnement enrichi, avec matériaux de nidification, objets pour explorer et cachettes, pour favoriser leur comportement naturel. Toutes les manipulations seront limitées au strict nécessaire, la durée des expériences sera réduite au maximum, et des critères d’arrêt sont prévus pour interrompre immédiatement toute procédure si un animal montre des signes de souffrance. Ces mesures permettent de garantir le bien-être des animaux tout en recueillant des données scientifiques fiables et pertinentes

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont le modèle le plus approprié pour étudier, dans un organisme vivant, les infections respiratoires virales. Elles permettent de mieux comprendre les mécanismes immunitaires et les réactions des voies respiratoires, ce qui n’est pas possible uniquement avec des cellules en laboratoire. Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour étudier le rôle de la molécule MMP-7 lors d’infections simples ou de co-infections. Ces modèles animaux sont nécessaires pour observer l’ensemble des réponses immunitaires et les interactions complexes entre les différents types de cellules impliquées dans l’infection. Les souris auront entre 5 et 12 semaines, correspondant à de jeunes adultes avec un système immunitaire mature. Cette tranche d’âge permet d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la gravité des symptômes et le stress pour les animaux. Elle représente donc un bon compromis entre pertinence scientifique et bien-être animal, conformément aux principes de raffinement.

Une partie des souris utilisées a un système immunitaire volontairement affaibli, ce qui les expose davantage aux infections et impose un hébergement en cages ventilées avec eau et nourriture stériles. 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes seront tuées pour que leurs tissus soient collectés. Chacune reçoit une injection de cellules de mélanome sous la peau après épilation de la zone, et certaines reçoivent en plus une injection deux fois par semaine pendant quatre semaines, sans anesthésie. Le projet vérifie dans un organisme vivant ce que des cultures cellulaires ont déjà montré sur le rôle de GATA6, et le porteur situe les retombées pour le traitement du mélanome "à terme".

Objectifs

Le mélanome est une forme de cancer de la peau particulièrement agressive. Même s’il est moins fréquent que d’autres cancers cutanés, il est responsable de la majorité des décès liés à ces cancers, car il peut se propager rapidement et s’adapter aux traitements. Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines cellules de mélanome changent de comportement et deviennent plus agressives et résistantes aux traitements. Nous étudions en particulier une molécule appelée GATA6, capable de modifier l’activité de nombreux gènes dans les cellules. Des résultats obtenus en laboratoire ont montré qu’un signal du système immunitaire, appelé interféron gamma, peut augmenter la quantité de GATA6 dans les cellules de mélanome. Dans ce cas, les cellules deviennent plus résistantes à certains traitements. À l’inverse, lorsque GATA6 est réduit, les cellules redeviennent sensibles aux traitements. Cela suggère que ce signal immunitaire et GATA6 agissent ensemble pour favoriser la résistance du cancer. Pour vérifier si ces phénomènes existent aussi dans un organisme vivant, nous étudierons la croissance de tumeurs de mélanome de souris. Nous comparerons des tumeurs avec ou sans GATA6 dans des souris ayant un système immunitaire fonctionnel ou affaibli, afin de comprendre comment ces facteurs influencent la progression du cancer. Dans un second temps, si GATA6 joue un rôle important, nous testerons son impact sur l’efficacité d’un traitement d’immunothérapie, qui aide le système immunitaire à combattre le cancer et qui est déjà utilisé chez des patients. L’objectif global de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes qui rendent certains mélanomes plus agressifs ou résistants aux traitements, afin de contribuer à terme à l’amélioration des traitements.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre le rôle d’une molécule appelée GATA6 dans la progression du mélanome. Nous cherchons à savoir comment elle influence la croissance des tumeurs et leurs interactions avec le système immunitaire. Les expériences réalisées chez l’animal permettront de compléter les résultats déjà obtenus en laboratoire, en observant ces phénomènes dans un organisme vivant. Nous étudierons notamment si GATA6 joue un rôle dans la vitesse de croissance des tumeurs, dans leur agressivité et dans la présence de cellules immunitaires à l’intérieur des tumeurs. Si cette molécule influence la réponse du système immunitaire, nous analyserons aussi son impact sur l’efficacité de certains traitements récents contre le cancer, appelés immunothérapies, qui visent à aider le système immunitaire à mieux combattre les cellules cancéreuses. À terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer les traitements du mélanome.

Procédures

Tous les animaux recevront une injection unique de cellules tumorales sous la peau. Avant cette injection, la zone sera épilée et désinfectée. L’intervention dure moins de deux minutes et est réalisée sous anesthésie. Certaines souris utilisées dans ce projet possèdent un système immunitaire affaibli et peuvent être plus sensibles aux infections. Afin de limiter ce risque, elles seront hébergées dans des conditions sanitaires renforcées (cages ventilées, manipulation sous hotte, nourriture et eau stériles). Certains animaux recevront également un traitement deux fois par semaine pendant quatre semaines, sous forme d’injections rapides (moins d’une minute), réalisées sans anesthésie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés à l’implantation de cellules tumorales sous la peau, à la croissance de la tumeur et aux injections répétées. La croissance de la tumeur peut entraîner l’apparition de lésions cutanées au niveau du site d’implantation. Les injections peuvent provoquer un stress temporaire lors des manipulations, ainsi que, plus rarement, une irritation ou une lésion au niveau du site d’injection. Certaines souris utilisées dans ce projet possèdent un système immunitaire affaibli afin de permettre la comparaison entre des animaux avec ou sans réponse immunitaire fonctionnelle. Ces animaux peuvent être plus sensibles aux infections. Afin de limiter ce risque, ils seront hébergés dans des conditions sanitaires renforcées. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance. Des critères d’arrêt stricts seront appliqués pour limiter au maximum les effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L’étude des interactions entre les cellules cancéreuses et le système immunitaire, ainsi que l’évaluation des traitements par immunothérapie, nécessitent de prendre en compte de nombreux types de cellules qui interagissent entre elles dans la tumeur. Les expériences réalisées en laboratoire, en cultivant des cellules entre elles, ne permettent de reproduire qu’une partie de cette complexité, notamment la capacité des cellules cancéreuses à échapper aux défenses de l’organisme. L’utilisation d’animaux avec un système immunitaire fonctionnel est donc nécessaire pour répondre aux objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été soigneusement déterminé pour en utiliser le moins possible tout en obtenant des résultats fiables. Il repose sur des résultats déjà obtenus en laboratoire ainsi que sur l’expérience de l’équipe avec ce type de modèle. Dans une première étape, nous comparerons plusieurs groupes de souris afin d’étudier le rôle de la molécule GATA6 et celui du système immunitaire dans la croissance des tumeurs. Chaque groupe comprendra 15 souris, ce qui permet d’obtenir des résultats solides malgré la variabilité entre individu, tout en limitant le nombre total d’animaux. Dans une seconde étape, nous étudierons l’effet d’un traitement d’immunothérapie sur ces tumeurs, également avec 15 souris par groupe. Cette deuxième phase ne sera réalisée que si les résultats de la première étape le justifient, afin d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Enfin, un maximum d’analyses sera réalisé à partir de chaque animal (analyses des tissus, des cellules, etc.), ce qui permet d’obtenir le plus d’informations possible tout en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux, le protocole est soigneusement planifié et optimisé à chaque étape. Des critères d’arrêt ont été définis pour interrompre les expériences si nécessaire et éviter toute souffrance excessive. Une anesthésie est utilisée lors des procédures qui le nécessitent afin de réduire le stress et l’inconfort. Les animaux sont observés quotidiennement, et leur état de santé est évalué régulièrement à l’aide d’une grille de suivi. Les souris sont hébergées en groupe de quatre par cage afin de respecter leur comportement social. Afin de limiter le risque d’infection, les souris possédant système immunitaire affaibli auront des conditions sanitaires renforcées (nourriture et eau stériles en plus des cages ventilées et de la manipulation sous hotte). Avant le début des expériences, elles bénéficient d’une période d’adaptation de deux semaines, incluant quelques jours sans manipulation puis une habituation progressive aux manipulations, afin de limiter le stress.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères dont le système immunitaire fonctionne de manière similaire à celui de l’être humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour étudier le cancer. L’injection de cellules murines de mélanome chez des souris avec un système immunitaire fonctionnel permet d’observer comment l’organisme réagit face aux cellules tumorales, comment celles-ci parviennent parfois à échapper aux défenses naturelles et comment l’immunothérapie peut contrer ces mécanismes. Un groupe de comparaison sera composé de souris dont le système immunitaire est défaillant, afin de mieux comprendre l’implication de ce dernier dans la progression des tumeurs. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines. Avant cela, elles seront maintenues pendant deux semaines pour s’adapter à leur nouvel environnement. À cet âge, leur système immunitaire est mature pleinement fonctionnel, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et comparables entre les animaux.

Toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés et analysés, 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation de 90 secondes, une injection de cellules leucémiques dans la veine de la queue, des prélèvements de sang à la joue environ une fois par semaine et des ponctions de moelle osseuse dans le tibia environ une fois par mois, auxquelles s'ajoute pour certaines une implantation chirurgicale sous la peau. La leucémie qui se développe peut leur faire perdre du poids, réduire leur activité, modifier leur pelage et provoquer des difficultés respiratoires aux stades avancés. Sur la réduction, le porteur écrit en une phrase avoir utilisé "des logiciels de calcul statistique" pour arrêter ce nombre de 1 680.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde est un cancer grave du sang qui se développe dans la moelle osseuse, où des cellules anormales appelées blastes se multiplient de manière anarchique, perturbant la production normale des globules rouges, des globules blancs et des plaquettes. Dans ce contexte, les cellules leucémiques interagissent étroitement avec leur environnement, qui joue un rôle clé dans leur survie et leur résistance aux traitements, notamment en les protégeant des chimiothérapies. L’objectif de ce projet est d’identifier et de caractériser les interactions entre les cellules leucémiques et leur microenvironnement, afin de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces travaux visent à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie et la résistance aux traitements, dans le but ultime de développer des stratégies thérapeutiques plus efficaces permettant d’éliminer les cellules leucémiques tout en préservant les cellules saines.

Bénéfices attendus

À ce jour, les modèles disponibles en laboratoire ne reproduisent pas fidèlement les interactions entre les cellules leucémiques et leur microenvironnement dans la moelle osseuse humaine, limitant la compréhension des mécanismes de résistance aux traitements. Ce projet vise à mieux reproduire ces interactions afin d’identifier des vulnérabilités spécifiques de la leucémie aiguë myéloïde. L’objectif est de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer des stratégies de traitement innovantes, potentiellement combinées aux chimiothérapies existantes, capables d’agir à la fois sur les cellules leucémiques et sur leur environnement protecteur. L’enjeu est d’améliorer l’efficacité des traitements en s’attaquant aux mécanismes impliqués dans la résistance thérapeutique.

Procédures

Une première étape consiste en une préparation préalable de l’organisme par une exposition courte et contrôlée à des rayonnements, réalisée en une seule fois (durée: 90s). Cette intervention est brève et les animaux retournent ensuite rapidement à leur cage sous surveillance. Des cellules leucémiques sont ensuite introduites dans l’organisme afin de permettre l’installation et le développement de la maladie (injection dans la veine de la queue; souris non anesthésiées, durée: 1 min). Au cours du suivi, des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue seront réalisés sur animaux non anesthésiés afin de contrôler l’évolution de la leucémie. Ces prélèvements sont rapides (quelques minutes) et effectués de manière limitée, généralement à raison d’environ une fois par semaine. Des prélèvements de moelle osseuse (au niveau du tibia) pourront également être réalisés environ une fois par mois afin de suivre plus précisément l’évolution de la maladie. Ces prélèvements sont effectués sous anesthésie générale et anti-douleur (durée: 3 min). Par ailleurs, des interventions réalisées sous anesthésie et traitement antibiotique (dans l'eau de boisson) seront effectuées sur une partie des animaux. Elles incluent des gestes chirurgicaux simples visant à implanter sous la peau (au niveau du dos) des structures en trois dimensions permettant de mimer l'environnement des cellules leucémiques lors de leur développement et multiplication. Ces procédures durent quelques minutes, avec une surveillance jusqu’au réveil. Ces souris seront ensuite traitées avec des traitements pharmacologiques contre la leucémie et/ou soumises à des régimes alimentaires spéciaux permettant d'empêcher l'expression de certains gènes au niveau de la tumeur. L'administration des traitements sera réalisée sur souris non anesthésiées soit dans la cavité abdominale (durée: 10s), soit dans la veine (durée: 1 min), soit par gavage (durée: 30s). Au total, chaque animal sera soumis à un nombre limité d’interventions (environ 4 à 6 au maximum) réparties sur la durée de l’étude, avec une surveillance régulière tout au long du protocole afin de garantir son bien-être.

Impact sur les animaux

Les animaux sont susceptibles de présenter des effets liés au développement de la maladie ainsi qu’aux procédures expérimentales. Au cours de la progression de la leucémie, certains signes généraux peuvent apparaître, tels qu’une diminution progressive de l’activité, une perte de poids, une modification de l’aspect du pelage, ainsi qu’une altération de l’état général. Une augmentation de la fatigue ou des difficultés respiratoires peuvent également être observées à des stades avancés de la maladie. Les procédures réalisées dans le cadre de l’étude (prélèvements biologiques, interventions sous anesthésie, manipulations) peuvent entraîner des effets transitoires tels qu’un inconfort local, une réaction au site d’intervention ou un stress lié à la manipulation. Des réactions locales temporaires peuvent également être observées au niveau des sites où des procédures spécifiques sont réalisées ainsi qu'une irritation/inflammation au niveau de la suture.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et des études seront réalisés sur des organes prélevés en post-mortem pour compléter nos analyses.

Remplacement

Les modèles de culture en laboratoire, comme les cultures en trois dimensions, ne permettent pas de reproduire complètement la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement dans la moelle osseuse. Ils ne reflètent pas fidèlement les conditions réelles présentes dans l’organisme, notamment l’apport en oxygène, en nutriments, la présence de vaisseaux sanguins et les interactions avec l’ensemble des types cellulaires. C’est pourquoi des modèles plus proches de la situation réelle sont nécessaires pour étudier ces interactions, valider les hypothèses et identifier des cibles thérapeutiques exploitables. Il est donc indispensable d'avoir recours à l'utilisation d'un modèle animal entier dans notre projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum. Nous avons pour cela utilisé des logiciels de calcul statistique.

Raffinement

Toutes les expériences et manipulations des animaux seront réalisées dans le respect du bien-être animal. Les animaux bénéficieront d’un hébergement adapté avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, ainsi que d’un environnement enrichi. Une période d’acclimatation sera prévue avant toute manipulation. En plus de l'observation quotidienne des souris, un suivi hebdomadaire de l’état de santé des animaux sera effectué à l’aide d’une grille d’évaluation portant sur l’apparence générale, le comportement et l’évolution de la maladie. En cas de signes de souffrance ou de dégradation de l’état général, l’animal sera immédiatement euthanasié conformément aux points limites établis.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.

1 301 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à vingt-cinq gavages et vingt-cinq injections sur trois à cinq semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent d'abord une injection de cellules tumorales, sous anesthésie générale ou locale selon le modèle, et toutes finissent tuées après un prélèvement de sang par ponction intracardiaque. La croissance de la tumeur peut altérer leur état général, gêner leurs mouvements ou provoquer des difficultés respiratoires selon la localisation. Le projet teste un composé contre l'ostéosarcome, un cancer qui touche 100 à 200 personnes par an en France, et ce que le porteur annonce pour les patients se limite à une "base solide" pour choisir les immunothérapies à combiner ensuite.

Objectifs

Les ostéosarcomes sont des cancers osseux rares qui surviennent principalement chez les enfants, adolescents et jeunes adultes, avec environ 100 à 200 nouveaux cas diagnostiqués chaque année en France. Ils représentent la forme la plus fréquente de tumeur osseuse maligne chez cette population et touchent majoritairement des patients âgés de 10 à 25 ans, avec une incidence particulièrement élevée chez les adolescents. Malgré des protocoles combinant chimiothérapie et chirurgie, 30 % à 50 % des patients rechutent, et ces récidives concernent principalement des patients présentant des maladies métastatiques ou réfractaires aux traitements standard. Pour ces patients, le pronostic reste très sombre et il n’existe actuellement aucun traitement standard clairement efficace, ce qui constitue un enjeu clinique majeur. Dans ce contexte, des données préliminaires de notre laboratoire ont identifié un composé comme une piste thérapeutique potentielle pour les tumeurs d’ostéosarcome pédiatriques de mauvais pronostic, justifiant une évaluation préclinique approfondie de son efficacité, de ses mécanismes d’action et de ses combinaisons thérapeutiques dans des modèles expérimentaux appropriés. En effet, ce composé a montré une activité antitumorale prometteuse in vitro et in vivo dans des modèles de tumeurs de patients implantées chez des souris immunodéficientes, issus de patients atteints d’ostéosarcomes pédiatriques récurrents ou réfractaire. De plus, nous avons synthétisé une douzaine de variants chimiques d'un composé à visée d’optimisation. Le premier objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance et l’efficacité du composé, de ses analogues et de leurs différentes formulations dans des modèles murins d’ostéosarcome immunocompétents, afin de sélectionner le meilleur candidat. Le deuxième objectif est de caractériser le microenvironnement tumoral et les réponses immunitaires associées après traitement par ce candidat optimal, dans le but d’identifier et de prioriser des stratégies d’immunothérapie pertinentes. Enfin, le troisième objectif consiste à évaluer l’efficacité de la combinaison entre le meilleur candidat sélectionné, la meilleure formulation et les immunothérapies retenues. À terme, ce projet devrait permettre d’identifier une association thérapeutique prometteuse pouvant faire l’objet de développements précliniques et translationnels ultérieurs pour le traitement des ostéosarcomes pédiatriques récurrents ou réfractaires.

Bénéfices attendus

Le protocole évaluera l’efficacité antitumorale et les effets immunologiques du meilleur analogue et de sa formulation optimisée du composé testé, sélectionnés après des études préliminaires de tolérance et d’efficacité. Les expériences seront conduites chez des souris porteuses de tumeurs , dans des modèles d'ostéosarcome. Cette approche permettra de caractériser de manière intégrée la progression tumorale, les réponses immunitaires associées et le profil de biodistribution du composé, fournissant une base solide pour le choix des immunothérapies à tester en combinaisons ultérieures. Le bénéfice potentiel global attendu est le développement de nouvelles thérapies plus efficaces contre l'ostéosarcome.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales afin d’établir les modèles tumoraux. Pour un modèle , une unique injection de cellules tumorales dans l'organe sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée de 5-10 minutes par souris, sous analgésie. Pour un autre modèle métastatique, une injection de cellules tumorales sera réalisée chez l’animal vigile sous anesthésie locale, pour une durée maximale de 5 minutes par souris. Les traitements seront administrés par gavage oral ou par injection selon les groupes expérimentaux. Les administrations par gavage auront une durée maximale d’environ 1 minute par souris et seront réalisées jusqu’à 5 fois par semaine pendant une durée de 3 à 5 semaines (maximim 25 gavages). Les injections de composés seront réalisées sous anesthésie locale avec une durée maximale d’environ 1 minute par souris, avec une fréquence pouvant atteindre 5 fois par semaine pendant 3 à 5 semaines selon les procédures expérimentales (25 injections au maximum). Dans certaines expériences, des immunothérapies candidates seront également administrées selon leur voie d’administration spécifique, avec une durée similaire (moins d'1 minute par injection), vigile, anesthésie locale. À la fin de l’étude, un prélèvement terminal de sang sera réalisé sous anesthésie générale et analgésie par ponction intracardiaque transcutanée (durée approximative: 5 minutes), suivi immédiatement de l’euthanasie et de la collecte des organes pour analyses.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement liés à la croissance tumorale, pouvant entraîner une altération progressive modérée de l’état général, une gêne fonctionnelle au niveau des membres ou des difficultés respiratoires modérées selon la localisation tumorale. Les effets indésirables dûs aux interventions (injections, gavages) seront transitoires et légers.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin d'étudier au mieux sur tissus et organes la réponse antitumorale mise en place après traitement par nos molécules.

Remplacement

Les modèles alternatifs in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité du comportement tumoral in vivo, en particulier les interactions dynamiques entre la tumeur, son microenvironnement et le système immunitaire, ni la réponse intégrée à des traitements systémiques. L’utilisation de modèles murins immunocompétents est donc indispensable pour évaluer l’activité antitumorale du composé M30-E05 et de ses formulations optimisées dans un contexte physiologique pertinent, ainsi que pour étudier leurs effets en association avec des approches d’immunothérapie. Ces modèles permettront de caractériser les mécanismes d’action du traitement, d’explorer des stratégies combinées et de générer des données précliniques essentielles en vue d’une application thérapeutique chez des patients atteints d’ostéosarcomes pédiatriques de mauvais pronostic.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les doses du composé à tester, de ses analogues et de leurs formulations optimisées seront définies à partir des données précliniques obtenues dans notre laboratoire précédemment. Ces nombres tiennent compte du taux de prise tumorale attendu (~80 %), des différents modèles tumoraux, des voies d’administration et des analyses supplémentaires, et représentent le maximum nécessaire, pouvant être réduits selon les résultats obtenus au cours des différentes étapes.

Raffinement

Les souris seront greffées et suivies sous anesthésie générale pour l’ensemble des procédures de greffe. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement toute altération de l’état général, du comportement, de la mobilité ou de la prise alimentaire, ainsi que l’évolution du développement tumoral aux sites d’implantation. Des points limites précoces, adaptés aux modèles, seront strictement appliqués. En cas de signes cliniques pertinents, un traitement antalgique adapté sera administré. Les animaux seront hébergés en groupes, avec un accès ad libitum à l’eau et à l’alimentation, et bénéficieront systématiquement d’un enrichissement environnemental adapté à l’espèce, pouvant être renforcé si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence en oncologie préclinique, permettant l’étude de la croissance tumorale et des interactions avec le système immunitaire. L’utilisation de souris immunocompétentes est essentielle pour évaluer l’activité du M30-E05 et de ses analogues/formulations dans un contexte immunitaire fonctionnel et pour explorer des stratégies de combinaison avec l’immunothérapie. Les cancers étudiés touchant principalement les enfants et adolescents, nous utiliserons donc des jeunes souris de 4 à 6 semaines pour refléter ce stade de développement.

Injectées avec des cellules tumorales puis avec des bactéries jusqu'à quatre fois, 3 598 souris passent ensuite sous imagerie une à deux fois par semaine pendant trois à cinq mois, chaque séance sous anesthésie. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et seront toutes tuées, soit à l'atteinte d'un point limite, soit à date fixe pour le prélèvement de leurs organes. L'objet est de vérifier si des bactéries provoquent la formation d'amas de cellules immunitaires dans les tumeurs pulmonaires et si cela améliore l'effet des immunothérapies, qui ne fonctionnent aujourd'hui que chez environ 40 % des patients. Le RNT annonce aussi "une injection d'une substance qui agit sur le système nerveux", administrée deux fois, sans nommer cette substance ni décrire l'effet attendu.

Objectifs

Les immunothérapies, notamment les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ou ICI), ont révolutionné le traitement de plusieurs cancers solides, dont le cancer du poumon. Cependant, seuls jusqu'à 40 pour cent des patients atteints d'un cancer du poumon obtiennent une réponse après traitement par ces immunothérapies. Des recherches récentes ont montré que la présence, dans les tumeurs, de petits groupements de cellules immunitaires appelés "structures lymphoïdes tertiaires" (ou TLS) est liée à une meilleure réponse à ces traitements. Ces structures se forment en cas d’inflammation et disparaissent une fois l’inflammation résolue. Il a été récemment montré qu’une molécule, issue de certaines bactéries, pouvait provoquer l’induction de TLS dans les poumons de souris. Ce projet vise donc à tester si certaines bactéries peuvent, elles aussi, induire la formation de ces structures, et si cela améliore l’efficacité des immunothérapies dans des modèles murins de cancer. Nous chercherons aussi à comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et la maturation des TLS, dans l’objectif, à long terme, de développer de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des traitements chez les patients atteints de cancer. (MODIFICATION) Une modification de projet est nécessaire afin de modifier la méthode réglementaire d'euthanasie pour obtenir des analyses plus fiables.

Bénéfices attendus

En France, le cancer du poumon touche plus de 50 000 personnes chaque année et est responsable de près de 33 000 décès. Il représente également un coût économique majeur estimé à plus d’un milliard d’euros par an pour le système de santé. Malgré les avancées en immunothérapie, notamment avec les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ICI), seulement environ 40 pour cent des patients atteints d’un cancer du poumon répondent favorablement à ces traitements. Ce projet vise à renforcer l’efficacité des immunothérapies. Il reposera sur un modèle de cancer du poumon chez la souris, dans lequel des bactéries seront administrées soit à titre préventif (comme une vaccination), soit à titre curatif (après l’apparition de la tumeur). L’objectif est d’évaluer leur capacité à induire des structures immunitaires dans les tumeurs, appelées structures lymphoïdes tertiaires (TLS), et à améliorer la survie des souris. Le projet permettra de déterminer : 1) si ces bactéries améliorent la survie des souris et induisent la formation de TLS ; 2) si l’effet thérapeutique de ces bactéries est dû à la formation des TLS ; 3) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’effet thérapeutique de ces bactéries 4) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’induction et de la maturation de TLS. Les résultats de ce projet pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteints de cancer, soit en utilisant directement ces bactéries comme traitement, soit en développant de nouvelles molécules capables de stimuler la formation de TLS dans les tumeurs. Cette approche pourrait s’appliquer non seulement au cancer du poumon, mais aussi à d’autres types de cancers dans lesquels la présence de TLS est associée à un meilleur pronostic

Procédures

Les animaux seront soumis à : des injections pour administrer les cellules tumorales (animal vigil ou anesthésié, 1 à 2 fois, 1 minute), des injections pour administrer les bactéries (animal vigil, 1 à 4 fois, 1 minute), un suivi par imagerie (animal anesthésié, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois, 15 minutes) avec injection au préalable de produit de contraste (animal vigil, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois maximum, 1 minute) pour les animaux avec tumeurs, une injection d'une substance qui agit sur le système nerveux (animal vigil, 2 fois, 1 minute), une injection d’anticorps dans certains cas (animal vigile, jusqu’à 6 fois au maximum, à raison de 2 fois par semaine pendant 3 semaines au maximum, 1 minute) (MODIFICATION) ainsi qu’une euthanasie par une méthode réglementaire (animal sous anesthésie générale et analgésie, 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les manipulations des animaux pourront induire un stress. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les injections répétées peuvent induire un risque de péritonite. L’injection de bactéries pourra engendrer une réponse inflammatoire générant une douleur modérée à l’animal associée à une difficulté de se mouvoir et s’alimenter. L’injection de cellules tumorales pourrait engendrer une gêne à se mouvoir. L'imagerie in vivo sera effectuée sous anesthésie et pourra engendrer une baisse de la thermorégulation. Ces administrations et anesthésies pourront également engendrer une gêne respiratoire transitoire. L'induction de tumeur pourra induire une douleur modérée, une perte de poids ainsi qu'une réduction de la mobilité.

Devenir

Les souris injectées avec des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires. Dès l’apparition de signes cliniques indiquant l’atteinte d’un point limite défini, elles seront euthanasiées afin de prévenir toute souffrance inutile. Les autres animaux seront euthanasiés à des temps définis expérimentalement pour permettre le prélèvement d’organes. Ces échantillons seront utilisés pour analyser la réponse immunitaire induite, notamment l’organisation locale du système immunitaire suite à l’injection de bactéries ou en réponse à la présence de cellules tumorales.

Remplacement

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du BCG (Bacillus Calmette-Guérin), une souche atténuée de Mycobactérium Bovis, et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo.

Réduction

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du traitement et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé par un calcul de puissance statistique et réduit au strict nécessaire pour atteindre les objectifs sans compromettre la validité des résultats. En raison de la variabilité de la croissance tumorale entre les souris, 7 souris par groupe seront utilisées dans les expériences suivant l’effet des traitements sur la survie et la progression tumorale (jusqu’à atteinte d'un point limite ou au maximum 3 mois après la dernière injection de cellules tumorales). Pour étudier la présence et le stade de maturation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS), 3 souris par groupe seront utilisées à chaque point temporel. Afin d’établir les cinétiques d’induction et de maturation des TLS, 5 souris par time point seront nécessaires. Les analyses par cytométrie nécessiteront quant à elles 7 souris par groupe et par point temporel. Les écarts attendus entre les groupes devraient garantir une puissance statistique suffisante malgré la taille restreinte des groupes. Pour les expériences nécessitant des souris survivantes, 20 animaux seront inclus initialement pour assurer un nombre suffisant de survivantes, qui seront ensuite soit réinjectées avec des cellules tumorales, soit euthanasiées pour récupérer les cellules immunitaires. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie, permettant des mesures répétées sur un même animal. Chaque expérience sera répétée au moins 2 fois afin d’assurer la reproductibilité des résultats, conformément aux bonnes pratiques expérimentales. Au total, 3 598 animaux seront utilisés dans ce projet

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des portoirs ventilés dans un environnement A2 et ne seront expérimentés qu'après une semaine minimum de stabulation. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (hébergement individuel limité à la fin des expériences s’il ne reste qu’une seule souris survivante dans la cage) en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec 2 des enrichissements ci-après : 6 à 10 bâtonnets de coton, 1 à 2 rouleau en carton ou 1 à 2 maisonnette. La taille des cages est variable, permettant d’héberger jusqu’à 12 souris, tout en respectant la densité réglementaire. Dans les situations nécessitant un hébergement individuel de l’animal (dernier animal dans la cage), il bénéficiera d’un enrichissement en plus et il sera vérifié par le responsable du Bien-Être Animal de l'animalerie pour valider son hébergement individuel. Les conditions de températures et d'hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Dans la réalisation de ce projet, l'ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie). Tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum les nuisances. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. L'évolution tumorale sera suivie et mesurée. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les animaux seront vérifiés quotidiennement. Ils seront également pesés au minimum deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de la procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie). (MODIFICATION) L’utilisation d’une analgésie avant l’anesthésie et la perfusion intracardiaque constitue une mesure de raffinement visant à limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux. L’administration préventive d’un antalgique permet d’assurer une meilleure prise en charge de la douleur potentielle liée à l’acte chirurgical.

Choix des espèces

L’utilisation de souris comme modèle est un outil précieux pour étudier les structures lymphoïdes tertiaires (TLS), car leur système immunitaire fonctionne de manière similaire à celui des humains, en particulier pour les réponses immunitaires innée et adaptative. Malgré quelques différences, la souris reste un modèle pertinent pour comprendre comment se forment les TLS et comment les cellules immunitaires interagissent avec les cellules cancéreuses dans le microenvironnement tumoral. Le modèle de cancer que nous utiliserons a déjà permis d’observer des TLS chez la souris. De plus, il existe de nombreux outils expérimentaux adaptés à ce modèle, comme des anticorps spécifiques ou des cellules tumorales modifiées permettant le suivie de la croissance tumorale par imagerie, ce qui facilite les analyses. Enfin, plusieurs protocoles déjà validés chez les souris commerciales femelles non génétiquement modifiées permettent de mener les expériences efficacement, sans augmenter le nombre d’animaux, ce qui est essentiel dans une démarche préclinique responsable. Les animaux seront reçus à l'âge de 7 ou 11 semaines puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire mature. Les animaux seront identifiés par un code couleur et le nombre de points fait aux feutres sur la base de la queue de l'animal.