Rongeurs

2 020 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyser les cellules immunitaires qui infiltrent leur cerveau, dont 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de lymphocytes T dans une veine sous anesthésie, jusqu'à neuf injections dans l'abdomen sur trois semaines sans anesthésie, et un traitement oral quotidien pendant trois semaines. Le modèle détruit une partie des neurones à orexine de l'hypothalamus, ce qui provoque de légers troubles du sommeil que le porteur dit sans autre conséquence sur le comportement. Il présente cette faible sévérité comme un argument de raffinement, et retient la souris pour ses "faibles coûts", ses cycles de reproduction courts et sa facilité de manipulation.

Objectifs

La narcolepsie de type 1 est un trouble du sommeil handicapant caractérisé par une somnolence diurne, des épisodes de perte brutale totale ou partielle du tonus musculaire allant de quelques secondes à quelques minutes ainsi que des paralysies du sommeil. Cette maladie a un fort impact sur la vie quotidienne des patients. La narcolepsie est causée par la perte sélective d’une population de neurones situés dans l’hypothalamus, produisant un neurotransmetteur appelé orexine. Si les mécanismes menant à cette destruction ne sont pas connus, des éléments pointent vers une origine auto-immune. Le projet vise à mieux comprendre la biologie d’une population de lymphocytes T, appelée lymphocytes T résidents mémoires, impliquée dans des maladies inflammatoires chroniques, notamment dans le système nerveux central. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de narcolepsie afin de mimer la pathologie humaine et ainsi de comprendre les mécanismes moléculaires permettant le maintien de ces lymphocytes T au sein du système nerveux central, ce qui permettra d’interférer avec ceux-ci dans un but thérapeutique. Les implications, y compris cliniques, de ces travaux sont réelles.

Bénéfices attendus

L’utilisation d’une double approche basée sur (i) des molécules candidates suggérée par nos travaux antérieurs et (ii) une approche plus large sur des bases de la littérature scientifique permettra d’identifier plusieurs molécules favorisant la pathogénicité des lymphocytes T résidents mémoires dans le système nerveux central. Ceci conduira à tester les molécules les plus prometteuse dans notre modèle murin de narcolepsie. Les avancées dans la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant à l’accumulation des lymphocytes T résidents mémoires dans le système nerveux central, et par ce biais le caractère chronique de la pathologie, auront des implications à la fois physiopathologiques et thérapeutiques. De façon remarquable, une densité accrue de lymphocytes T résidents mémoires a été tout récemment détectée chez les patients atteints de narcolepsie soulignant la pertinence clinique de nos travaux sur ce modèle animal.

Procédures

Une injection unique de lymphocytes T par voie intraveineuse sous anesthésie. Maximum de 9 injections par voie intra-péritonéale réparties sur 3 semaines avec un maximum de 3 injections par semaine sans anesthésie. Traitement quotidien par voie orale pendant 3 semaines sans anesthésie.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de notre modèle murin de narcolepsie, peu de nuisances sont attendues sur les animaux : une légère perte de poids (transitoire) peut subvenir dans les 2-3 jours suivant l’injection cellules immunitaires ainsi qu’une légère douleur liée à l’injection. Pour les gestes réalisés sur animal vigile, un leger inconfort, du stress et des douleurs légères sont à prévoir selon le type de manipulation. Chez ces animaux, la perte partielle des neurones orexinergiques peut entrainer de légers troubles du sommeil, sans autre manifestation neurologique ni conséquence sur le comportement des animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin d’analyser les cellules immunitaires infiltrant le cerveau dans notre modèle de narcolepsie murine.

Remplacement

Le système nerveux central est un organe particulièrement complexe qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire à ce jour, nécessitant donc l'utilisation de modèles animaux pour ce projet. La capacité des cellules immunitaire à atteindre le système nerveux central, leur interaction avec l'environnement et l'ensemble des mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant à la mise en place et au maintien de la narcolepsie chez l'humain nécessitent l'utilisation de modèles animaux. Le modèle de narcolepsie que nous avons développé chez la souris permet d'étudier les cellules d'intérêt (lymphocytes T résidents mémoires) tout en limitant 1) la sévérité de la pathologie chez l'animal (très peu de signes cliniques) et 2) le temps d'expérimentation (30 jours maximum), permettant ainsi de limiter la souffrance animale.

Réduction

La reproductibilité du modèle de narcolepsie que nous avons développé chez la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation. De plus, nous ne nous intéresserons qu’aux seules molécules ayant un effet marqué sur la présence des lymphocytes T pathogéniques dans le système nerveux central, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour démontrer un effet statistiquement significatif. Nos expériences seront répétées 2 à 3 fois afin de s’assurer de leur reproductibilité et de la robustesse des résultats obtenus. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé sur la base de nos expériences précédentes étant donné que ce modèle est désormais bien caractérisé.

Raffinement

Dans notre modèle murin de narcolepsie, l'inflammation du système nerveux central reste localisée dans une zone précise du cerveau (hypothalamus), n'entrainant donc ni inflammation cérébrale massive, ni douleur, ni déficit moteur ou sensitif (à l’instar de ce qui est observé dans la narcolepsie chez l’humain), permettant ainsi de minimiser la souffrance animale. Des objets d’enrichissement, incluant du coton, de l’essuie-tout et des rouleaux en carton, seront mis à disposition afin de réduire le stress des souris. De plus, la présence permanente d’une maisonnette dans la cage offre un abri aux animaux tout en permettant leur observation par l’utilisateur. Les points d’arrêt et critères d’arrêt anticipé de la procédure ont été prédéfinis pour faire face à tout résultat imprévu ayant des conséquences sur le bien-être des souris expérimentales. Toutes les procédures invasives (injections intraveineuses ou autres) hormis les intra-péritonéales seront réalisées sous anesthésie. Les procédures d’euthanasie seront réalisées après anesthésie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines comme en témoigne les nombreuses références bibliographiques. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, lignées génétiquement modifiées, ...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Pour l'étude des cellules du système immunitaire mature, nous avons besoin de souris adultes, donc âgées de plus de 6 semaines, mais pas plus de 16 semaines afin d'eviter des variations de la réponse du système immunitaire liées aux différences d'âge.

Les souris qui développent un phénotype dommageable pendant la création des lignées sont tuées immédiatement, et le porteur prévoit de supprimer la lignée entière le cas échéant. 594 souris vont être utilisées pour mettre au point une injection d'ARN messager dans l'ovaire, censée restaurer la fertilité de femmes dépourvues d'ovocytes, dont 522 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles reçoivent deux injections hormonales, une chirurgie de vingt minutes pour recevoir des embryons ou de trente minutes pour l'injection intra-ovarienne, et des mâles sont vasectomisés en trente minutes d'opération. Une partie est tuée pour prélever ovocytes ou ovaires, quelques femelles restent en vie pour allaiter ou pour d'autres tests, et les animaux circulent entre deux établissements.

Objectifs

La totalité du projet est réalisé dans l'EU1. Certaines procédures expérimentales seront réalisées également dans l'EU2 ; ainsi, une partie des animaux générés dans l'EU1 est transférée dans l'EU2. Le nombre total d’animaux reste identique et aucun animal n’est dupliqué. Les protocoles expérimentaux sont identiques dans les deux sites et le transfert est réalisé conformément aux normes de bien-être animal et aux exigences réglementaires. L’infertilité est un problème de santé majeur qui concerne un couple sur sept. Dans environ 50 % des cas, la femme est impliquée dans l'infertilité du couple. L’une des causes de cette stérilité est une déficience au niveau des gamètes de cause génétique. A l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients n’ayant pas d’ovocytes. L’objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes en reproduisant les mutations identifiées afin de développer de nouvelles approches pour ces femmes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales, le message génétique capable de produire la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y a pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Le traitement, sera injecté au niveau des ovaires. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité. Il s’agit d’un projet multi-sites impliquant 2 établissements.

Bénéfices attendus

Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de femme génétiquement infertiles avec une thérapie ciblée.

Procédures

Pour les mâles vasectomisés (utilisé dans l'UE1): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour la génération embryons 2-cells (réalisée dans l'UE1 et l'UE 2) : Injection pour les stimulations hormonales (5-10 secondes par injection), 2 injections par souris femelles à 48 h d'intervalle. Pour la réimplantation d’embryons dans femelles pseudogestantes (réalisé dans l'UE1): Chirurgie de 20 minutes par souris pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour le phénotypage (réalisé dans l'UE1) : Risque éventuelle de phénotype dommageable durant la création de lignée, mise à mort directement si c’est le cas. Pour l'Injection intra-ovaire ARNm (réalisé dans l'UE1 et l’UE2): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour l'idnetification et le genotypage:L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner des effets indésirables généralement légers et de courte durée. La manipulation des animaux, notamment lors de leur prise en main pour l’anesthésie, peut provoquer un stress passager. Celui-ci peut se traduire par une agitation brève ou une augmentation temporaire du rythme cardiaque et respiratoire, mais ces effets disparaissent rapidement. Les injections hormonales chez les femelles peuvent également entraîner un léger stress. Les interventions chirurgicales peuvent occasionner une perte de poids temporaire ainsi qu’une diminution de la mobilité pendant quelques jours. Une inflammation au niveau de la zone opérée peut également apparaître, mais cela reste peu fréquent et fait l’objet d’une surveillance adaptée. Chez les mâles vasectomisés et les femelles ayant subi une intervention, une perte de poids peut être observée, généralement transitoire. Lors de la création de nouvelles lignées génétiques, il existe un faible risque d’apparition de modifications affectant l’état général des animaux. Celles-ci peuvent se traduire, par exemple, par une perte de poids, une diminution de la mobilité ou des troubles du développement. Ces situations restent rares. Car l'’infertilité en elle-même n’entraîne pas d’effet indésirable pour les animaux. L’ensemble de ces effets fait l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter au maximum l’inconfort et d’assurer le bien-être des animaux.Lors de l’identification, la contention peut engendrer un stress ainsi que de légères douleurs au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d’oreille).

Devenir

La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons d’euthanasier la lignée. Pour les chirurgies intra-ovaire, les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, le sovaires seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.

Remplacement

L’étude des mécanismes de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. En effet, il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables et matures qui sont essentiels à la fécondation. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine requiert donc des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. Par ailleurs, aucun modèle alternatif à celui du modèle murin ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et l’impact sur la fertilité. En conclusion, nous ne pouvons pas remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte. Les ovocytes pourront être utilisés pour différentes expériences permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque ovaire de souris sera injecté afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’ovaire gauche sera injecté avec une solution saline (control) et l’ovaire droit sera injecté avec nos traitements. Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. Les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an. A partir des données que nous disposons au laboratoire concernant des analyses sur des souris mâles pour ce type d’injection et non femelles, la taille d’effet, avec un écart type convenable minimal varie entre 3 à 6 souris.

Raffinement

Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Des médicaments contre la douleur sont également administrés. Pendant l’opération, les animaux sont maintenus au chaud, et leurs yeux sont protégés pour éviter le dessèchement. Après l’intervention, ils sont surveillés régulièrement jusqu’à leur réveil complet. Dans les jours qui suivent, les animaux sont observés quotidiennement afin de vérifier leur état de santé. Une alimentation adaptée, plus facile à consommer, est mise à leur disposition. Si des signes d’inflammation ou d’infection apparaissent, un traitement approprié est administré. Des critères précis sont définis pour évaluer l’état des animaux. Si leur état de santé se dégrade au-delà de ces limites, ils sont retirés de l’étude et euthanasiés afin d’éviter toute souffrance inutile. Certaines mesures sont mises en place pour limiter le stress et prévenir les blessures. Par exemple, les mâles vasectomisés sont hébergés individuellement, avec des aménagements et de la compagnie pour améliorer leur bien-être. Les procédures de mise à mort sont réalisées dans un environnement séparé afin de ne pas perturber les autres animaux. Le projet se déroule sur deux établissements. Le transport des animaux est réalisé par du personnel formé, dans des conditions adaptées (conteneurs sécurisés, litière, ventilation), afin de limiter le stress. La durée de transport est réduite au minimum. À leur arrivée, les animaux disposent d’une période de repos d’au moins 48 heures avant toute manipulation, avec une surveillance régulière.Lors de l’identification, nous veillerons à réaliser le tatouage d'identification et la biopsie de génotypage de manière rapide et précise. Ces gestes seront réalisés par du personnel dûment formé, ayant suivi un tutorat spécifique à cette procédure technique

Choix des espèces

Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L'utilisation du modèle de souris est incontournable car il n'existe à l'heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Trois modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines. Les souris femelles pour les chirurgies seront âgées au minimum de 6 semaines pour avoir une ovogenèse fonctionnelle et être matures sexuellement.

Injectés dans une veine du visage sous cryo-anesthésie au premier jour de vie, dans la queue, dans un muscle de la patte, dans un ventricule cérébral ou dans le canal rachidien selon le groupe, des vecteurs viraux sont administrés une fois à chaque animal. 10 000 souris sont utilisées ainsi, dont 3 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer des thérapies géniques contre des maladies neuromusculaires. Le porteur décrit des lignées dystrophiques qui "conservent une très bonne santé générale et une espérance de vie normale", avec une dégénérescence musculaire progressive mais lente. Les souriceaux dont le génotype ou le sexe ne convient pas sont tués après génotypage, les autres suivis jusqu'à six mois puis tués après une chirurgie terminale de mesure de la force musculaire.

Objectifs

Nous développons de nouvelles approches thérapeutiques pour des maladies neuromusculaires, c’est-à-dire des pathologies qui affectent le fonctionnement des muscles et peuvent également impliquer les nerfs qui les contrôlent. Ces maladies entraînent une faiblesse musculaire progressive, pouvant altérer la mobilité, la posture et, dans certains cas, certaines fonctions vitales. Ces atteintes sont généralement liées à des anomalies au sein des cellules musculaires, notamment au niveau de structures essentielles à leur stabilité et à leur bon fonctionnement. Lorsque ces structures sont altérées, les fibres musculaires deviennent plus fragiles et se dégradent progressivement, conduisant à une perte de masse et de force musculaire. Certaines de ces maladies peuvent également toucher d’autres organes, ce qui en fait des pathologies complexes et hétérogènes. À ce jour, les options thérapeutiques disponibles restent limitées et ne permettent pas de traiter efficacement la cause de ces maladies. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies capables d’agir directement sur les mécanismes responsables des atteintes musculaires. Dans ce contexte, nous évaluons des approches innovantes visant à restaurer ou améliorer le fonctionnement des cellules musculaires. Ces stratégies sont d’abord étudiées sur des cellules humaines issues de patients, puis dans des modèles animaux, afin d’analyser leur efficacité et leur tolérance dans un environnement biologique plus complexe. Ces étapes sont indispensables pour mieux comprendre les effets du traitement et pour envisager, à terme, une application chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les travaux proposés ont pour objectif d’évaluer et d’optimiser différentes approches thérapeutiques innovantes pour des maladies neuromusculaires d’origine génétique. Ces études reposent sur l’utilisation de modèles animaux présentant des altérations comparables à celles observées chez les patients, permettant d’étudier ces maladies dans un contexte biologique global et pertinent. À court terme, ce projet vise à analyser l’efficacité, la tolérance et la distribution dans l’organisme des approches développées. Il permettra notamment d’identifier les conditions d’administration les plus adaptées, telles que la dose ou la voie d’administration, afin d’obtenir une action efficace au niveau des muscles. Les effets du traitement seront évalués à l’aide de différents paramètres complémentaires, incluant la fonction musculaire, l’analyse des tissus et l’étude de marqueurs biologiques, afin de déterminer une éventuelle amélioration de l’état musculaire. Les bénéfices scientifiques immédiats résident dans l’acquisition de données essentielles sur l’efficacité et la sécurité de ces approches, constituant une étape indispensable avant toute application chez l’humain. À plus long terme, ces travaux contribueront à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans ces maladies et à orienter le développement de stratégies thérapeutiques plus performantes et mieux adaptées. Ainsi, ce programme présente un intérêt scientifique important en permettant de faire progresser de nouvelles approches thérapeutiques, avec des retombées potentielles significatives sur le plan médical et sociétal, notamment pour des maladies actuellement sans traitement curatif efficace.

Procédures

Administrations de vecteurs rAAV : Chaque animal recevra une seule administration de vecteur ou de solution contrôle, par l’une des voies suivantes selon le groupe expérimental et l’âge : injection intraveineuse (veine faciale chez le nouveau-né P0–P1 ou veine caudale chez l’adulte), injection intramusculaire (muscle tibial antérieur), injection intracérébroventriculaire, ou intrathécale. La durée de chaque injection est comprise entre 2 et 10 minutes. Les injections chez l’adulte sont réalisées avec ou sans anesthésie selon la voie, et les injections néonatales sont effectuées sous cryo-anesthésie. Biopsie auriculaire pour le génotypage : Une biopsie auriculaire unique est réalisée chez les animaux issus de l’élevage afin de permettre leur génotypage. Cette procédure, réalisée sur animal vigile sous contention douce, dure moins de 2 minutes par animal. Tests fonctionnels comportementaux et moteurs : Les animaux subiront une session unique de tests fonctionnels comprenant le rotarod, le test de suspension sur fil (hang wire) et le test de force de préhension (grip strength). La durée totale de cette session est d’environ 30 à 45 minutes par animal, incluant les périodes de repos entre essais. Ces tests sont réalisés sur animaux vigiles. Chirurgie terminale pour l’évaluation de la fonction musculaire : En fin de protocole, les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale terminale sous anesthésie générale (kétamine/xylazine), visant à la mesure ex vivo de la force isométrique du muscle tibial antérieur. Cette procédure dure environ 30 à 60 minutes par animal. Les animaux sont ensuite euthanasiés sans réveil, conformément à la réglementation. Les animaux sont maintenus en expérimentation pour une durée maximale de 6 mois après injection, tandis que les animaux reproducteurs sont conservés jusqu’à 12 mois.

Impact sur les animaux

A) Nuisances liées au phénotype Modèles hDMDmdx, hDMDmdxDel44 et hDMDmdxDelCH2 Ces lignées expriment soit la version sauvage (hDMD), soit des versions mutées du gène DMD humain (hDMDmdxDel44 et hDMDmdxDelCH2). Elles présentent un phénotype musculaire comparable à celui observé dans d’autres modèles de dystrophie de Duchenne, mais d’intensité légère à modérée. Ces animaux conservent une très bonne santé générale et une espérance de vie normale. La surexpression de la dystrophine humaine ne provoque pas de pathologie connue. Une dégénérescence musculaire progressive mais lente peut apparaître à partir de l’âge de 3 à 12 semaines, sans impact significatif sur la locomotion ni sur la survie. Modèles FVB, HSAlr et DMSXL Ces lignées expriment soit la version sauvage (FVB), soit des versions mutées du gène DMPK (HSAlr et DMSXL). Elles présentent un phénotype musculaire comparable à celui observé dans d’autres modèles de DM1, mais d’intensité légère à modérée. Pour la HSAlr, le gène muté n’étant exprimé que dans les cellules musculaires, ces souris ne développent qu’un phénotype musculaire, principalement des myotonies de certains muscles mais qui n’affectent pas leurs espérances ou leurs qualités de vie. Pour les DMSXL, ces souris ont principalement un très léger phénotype neuronale qui également ne changent pas leur durée de vie ou leur bien-être. Effets liés aux injections d’AAV (U7-ACCA, U7-del44, U7-delCH2, U7-DM1) Les vecteurs AAV9 ont été utilisé plusieurs fois dans des essais cliniques aux doses proposées dans ce projet. Ils ne sont pas attendus comme toxiques même à long terme sur la base des données générées au préalable (études menées en utilisant 1.e15vg total dans des souris P0-P1 jusqu’a 18 mois). . Chez certaines lignées (notamment hDMDmdxDel44 et hDMDmdxDelCH2), une dégénérescence musculaire très lente et modérée peut être observée, sans impact significatif sur la survie. Aucun effet systémique majeur n’est anticipé. Ces vecteurs ont par le passé était injecté pour générer des données préliminaires et aucun effets négatifs n'a été observé. Toutefois, une vigilance particulière sera maintenue durant la confirmation des données préliminaires préalablement obtenues surtout sur les études à long terme.

Devenir

Les souriceaux issus des portées seront génotypés par biopsie caudale afin d’identifier les animaux présentant le génotype et le sexe d’intérêt pour les études expérimentales. Les animaux ne correspondant pas aux critères requis (génotype ou sexe non adaptés aux objectifs du projet) seront euthanasiés après génotypage. Les animaux sélectionnés seront inclus dans les études expérimentales et suivis jusqu’à 6 mois, selon les différents protocoles d’administration et de suivi prévus dans le projet. À l’issue des expérimentations, l’ensemble des animaux inclus sera euthanasié afin de permettre la réalisation des analyses post-mortem (analyses histologiques, moléculaires et biochimiques).

Remplacement

Les approches in vitro ont été considérées et utilisées autant que possible dans les phases préliminaires du projet, notamment pour la conception et la validation des constructions génétiques (vecteurs AAV, U7snRNA, etc.). Cependant, ces modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité des tissus vivants, ni d’évaluer la distribution, la persistance ou la tolérance des vecteurs in vivo. En particulier, l’efficacité du transfert de gène observée dans une lignée cellulaire in vitro ne reflète pas la biodistribution ni la régulation tissulaire du vecteur dans un organisme entier. De plus, les mécanismes d’expression du transgène, la réponse immunitaire, et les effets sur la fonction musculaire (force, régénération, structure histologique) ne peuvent être étudiés qu’au sein d’un organisme complet. Les modèles murins utilisés reproduisent de manière fidèle les caractéristiques physiopathologiques des maladies neuromusculaires humaines, tout en restant compatibles avec des analyses longitudinales et non létales. Ils constituent actuellement l’unique moyen expérimental pertinent pour démontrer la faisabilité et l’efficacité des approches de thérapie génique évaluées. Ainsi, le recours à l’animal est nécessaire et justifié pour atteindre les objectifs du projet, car aucune alternative in vitro ou in silico ne permet de reproduire la complexité des interactions tissulaires et fonctionnelles impliquées dans les pathologies musculaires humaines.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé à partir des données de la littérature et de nos expériences antérieures avec des modèles similaires de dystrophie musculaire. Les effectifs ont été calculés afin d’obtenir une puissance statistique suffisante pour démontrer les différences significatives entre groupes expérimentaux, tout en limitant strictement le nombre d’animaux utilisés. Chaque expérience est conçue pour maximiser les informations obtenues par animal : • Recueil simultané de plusieurs types de données (force musculaire, histologie, biologie moléculaire, imagerie, analyses biochimiques) sur les mêmes individus. • Utilisation de groupes témoins communs lorsque cela est possible (par exemple, les groupes injectés avec PBS peuvent servir de contrôle pour plusieurs constructions). • Regroupement des temps d’analyse pour limiter le nombre total de prélèvements et de dissections. • Réutilisation des échantillons tissulaires pour plusieurs analyses complémentaires (ex. qPCR, Western blot, immunofluorescence, histologie). Les calculs d’effectifs sont régulièrement réévalués au fur et à mesure des résultats intermédiaires afin d’ajuster les expériences futures. Si les données préliminaires permettent de démontrer une efficacité claire, certains groupes ou doses pourront être supprimés. Ainsi, tout est mis en œuvre pour minimiser le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la validité scientifique du projet.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. L’ensemble de ces points est décrit dans le paragraphe 4.2.1. Le bien-être animal passera également par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (cf exemple en ANNEXE 2 de la saisine). 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme espèce modèle en raison de leur proximité biologique avec l’Homme et de l’existence de modèles reproduisant les principales caractéristiques des maladies neuromusculaires étudiées. Ces modèles présentent des altérations génétiques distinctes affectant une même fonction musculaire, permettant de mimer la diversité des atteintes observées chez les patients. En effet, une même pathologie peut résulter de différentes anomalies génétiques, entraînant des degrés et des mécanismes d’atteinte variables. L’utilisation de plusieurs modèles complémentaires permet ainsi d’évaluer l’efficacité de différentes approches thérapeutiques en fonction du type d’altération présente, et d’anticiper leur pertinence pour des sous-groupes de patients présentant des profils génétiques distincts. Ces modèles reproduisent les principales conséquences de la maladie, notamment la faiblesse musculaire progressive et les altérations des tissus musculaires, ce qui en fait des outils pertinents pour des études précliniques. Les animaux sont utilisés à différents stades de développement afin de répondre aux objectifs du projet. Une administration précoce permet d’évaluer l’effet des traitements avant l’apparition des symptômes, tandis que des administrations à un stade plus avancé permettent d’analyser leur efficacité dans un contexte pathologique établi, plus proche de la situation clinique. Les animaux sont suivis puis analysés à différents temps afin d’étudier l’évolution des effets du traitement sur la fonction musculaire et la progression de la maladie. Enfin, ces approches ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives, car elles nécessitent une évaluation intégrée à l’échelle de l’organisme entier, incluant la distribution du traitement, les interactions entre tissus et les effets fonctionnels globaux.

Une partie des souris porte une mutation qui provoque tremblements et difficultés motrices à partir de 200 jours, l'incapacité de se déplacer vers 400 jours, un risque accru de cancers et une durée de vie réduite. 330 souris vont être utilisées, dont 268 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent trois tests moteurs chaque mois, extension des pattes, coordination et motricité, et une partie reçoit une thérapie génique dont l'injection expose à un œdème pulmonaire et à un risque rare de lésion oculaire. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les organes, le porteur espérant qu'un résultat concluant justifie plus tard un projet à plus grande échelle.

Objectifs

L’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 (AOA1) est une maladie neurologique rare héréditaire qui touche le système de réparation de l’ADN dans les cellules du système nerveux central (SNC), en particulier une zone spécifique appelée le cervelet, mais aussi le système nerveux périphérique et la moelle épinière. Cela se caractérise chez les patients, en particulier des enfants entre 2 et 10 ans, par une ataxie cérébelleuse, une apraxie oculaire, une absence de réponse musculaire aux stimuli, et un handicap moteur sévère avant l’âge de 25 ans. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement pour cette pathologie. Un modèle animal de la pathologie a été développé afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et tenter de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'objectif de ce projet sera de caractériser ce modèle animal puis d'évaluer l'efficacité d'une approche de thérapie génique avec ce modèle.

Bénéfices attendus

L’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 (AOA1) est une maladie neurodégénérative rare de la famille des ataxies cérébelleuses autosomiques récessives. Cette pathologie neurologique héréditaire se caractérise par une ataxie cérébelleuse à début précoce (âge moyen d’apparition : environ 4 ans) et entraine un handicap moteur sévère, avant l’âge de 25 ans. A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour les patients. Le bénéfice de ce projet sera tout d’abord d’obtenir une caractérisation du modèle murin de la pathologie d’AOA1 afin de s’assurer de sa fiabilité pour l’évaluation de stratégies thérapeutiques. Si cette première étape est concluante ce projet permettra également d’évaluer l’efficacité d’une thérapie génique. Si l’efficacité de cette thérapie est démontrée sur ce modèle animal, à plus long terme, cela pourrait contribuer à demander un projet à plus grande échelle visant à proposer un essai thérapeutique chez des patients atteints d’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1.

Procédures

Une partie des animaux aura une injection de thérapie génique sous anesthésie générale (durée 5 minutes au total, une fois). Tous les animaux réaliseront 3 tests comportementaux répartis sur 3 jours chaque mois (14 fois maximum), pour évaluer leur motricité. Nous aurons un jour avec un test évaluant l’extension des pattes (1 essai de 10 secondes maximum). Puis un jour avec un test évaluant la coordination générale (1 essai d’entrainement et 3 essais de 2 minutes maximums avec une pause de 30 minutes entre chaque essai). Enfin un jour avec un test d’évaluation de la motricité (1 essais d’entrainement suivi de 3 essais de 5 minutes maximums avec une pause de 30 minutes entre chaque essai).

Impact sur les animaux

Une partie des animaux, en raison de leurs modifications génétiques, présenteront des difficultés motrices significatives et des tremblements (phénotype dommageable) à partir de l’âge de 200 jours s’accentuant jusqu’à l’atteinte d’incapacité à se déplacer à partir de l’âge de 400 jours. Ces animaux présenteront également un risque augmenté de développement de certains cancers, des anomalies immunitaires et une durée de vie réduite. L’anesthésie générale réalisée pour administrer la thérapie génique pourra engendrer des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de difficultés cardiaque et respiratoire. Ces risques demeureront rares en raison de la courte durée de l’anesthésie. L’injection de la thérapie génique sera associée à des risques d’inconfort au niveau de la zone d’injection, de saignement après injection et un risque rare de lésion oculaire. En fonction du poids des animaux cette injection pourra être associée à un risque d’œdème pulmonaire qui se visualiserait chez l’animal par des difficultés respiratoires. Les tests comportementaux pourront générer un stress en lien avec le changement d’environnement et le test en lui-même.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements d’organes d’intérêts, et leurs analyses, nécessaires pour répondre à notre question scientifique

Remplacement

Il a été démontré qu’un modèle in vitro d’AOA1 peut être généré à partir de cellules souches spécifiques provenant de patients. Bien que ce modèle cellulaire constitue un outil pertinent pour l’étude des altérations moléculaires et cellulaires associées à la pathologie, il présente des limitations majeures. En particulier, il ne permet pas de reproduire le phénotype ataxique ni d’évaluer les conséquences fonctionnelles et comportementales de la maladie. Dans ce contexte, le recours à un modèle in vivo apparaît indispensable afin de reproduire de manière adéquate les troubles moteurs et neurodégénératifs observés chez les patients. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de recourir à des études pré-cliniques chez l’animal. La souris représente un modèle pertinent pour approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’AOA1 et pour évaluer des approches thérapeutiques, notamment de thérapie génique, susceptibles de ralentir la progression de la maladie et potentiellement la guérir. Étant donné qu’un modèle de l’AOA1 associé à la mutation génétique que nous voulons cibler a déjà été créé chez cette espèce, ce modèle constitue un outil particulièrement pertinent et approprié pour nos études de recherche.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 10 à 30 souris par groupe a été choisi pour nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et ainsi réaliser des tests statistiques fiables. De façon générale nos résultats seront analysés avec les tests statistiques appropriés. Un nombre total maximal de 330 souris sera nécessaire pour ce projet. Le projet comprend deux procédures, les résultats de la première conditionneront la réalisation de la deuxième, ainsi le nombre d’animaux déclaré ici est un maximum mais tous ne seront peut-être pas utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’eau et de croquettes à volonté, ainsi que d’un enrichissement de leur environnement composé à minima d’un carré de coton pour nidifier et d’un bâtonnet de bois à ronger. Ils seront observés quotidiennement et pesés une fois par semaine minimum. En cas d’anomalie celle-ci sera transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe afin de mettre en place une prise en charge rapide et adaptée pour l‘animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Pour les souris génétiquement modifiées susceptibles de développer une ataxie à partir de l’âge de 200 jours, nous mettrons en place des mesures supplémentaires afin d'assurer leur bien-être. En plus de l’observation quotidienne nous les surveillerons spécifiquement, les pèserons 2 fois par semaine et ajouterons un soutien nutritionnel dans le fond de la cage (eau gélifié, croquettes humidifiées ou non) pour pallier les difficultés motrices et en cas de perte de poids. Un enrichissement supplémentaire sera également ajouté dans les cages (maisonnette). Pour les tests comportementaux les animaux bénéficieront d’une période d’habituation de 30 minutes à la pièce d’expérimentation avant chaque test. Les tests seront répartis sur 3 jours afin de laisser un temps de repos aux animaux entre chaque test. Pour les tests nécessitant 3 essais, les animaux bénéficieront d’une période de repos de 30 minutes entre chaque essai. Les injections de thérapie génique seront réalisées sous anesthésie générale afin de réduire le stress et bénéficier d’une bonne immobilité de l’animal. Du gel oculaire sera appliqué à la fin de la procédure d’injection pour réduire l’inconfort et une surveillance spécifique des animaux sera mise en place sur les jours suivants.

Choix des espèces

La souris est une espèce largement utilisée pour modéliser les pathologies humaines. Son génome est bien connu et des outils sont disponibles pour le modifier. Dans le cas de l’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 un modèle de souris génétiquement modifié a été créé pour modéliser cette pathologie et donc permettre d’observer les symptômes de la pathologie tels qu’observés chez l’humain. Nous avons donc choisi de l’utiliser pour ce projet pour reproduire et étudier la pathologie et surtout pour évaluer l’effet de notre approche de thérapie génique. Pour caractériser notre lignée de souris génétiquement modifiées elles seront utilisées à partir de l’âge de 1 mois jusqu’à l’âge de 8 mois maximum. En effet d’après les caractéristiques déjà connues de cette lignée, les signes de problèmes moteurs importants devraient apparaitre à un âge compris entre 6 et 7 mois, ainsi réaliser la caractérisation de 1 à 8 mois nous permettra de détecter l’apparition des troubles moteurs et suivre leur évolution à l’aide de tests spécifiques. Par la suite, pour évaluer l’efficacité de notre thérapie génique avec ce modèle, nous injecterons la thérapie à des souris d’un âge compris entre 1 et 4 mois, soit avant l’apparition des troubles moteurs attendus à un âge de 6-7 mois. Afin d'observer efficacement les effets à long terme de notre thérapie génique, les animaux seront suivis pendant une période maximale de 8 à 14 mois.