Rongeurs

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est maintenue isolée en cages métaboliques sur des grilles pendant plusieurs jours, avec de l'eau acidifiée et des prélèvements sanguins pratiqués au coin de l'œil, une autre reçoit des injections quotidiennes puis des régimes déséquilibrés en ions, pour étudier une protéine rénale mutée dans une maladie rare, l'acidose tubulaire distale. Le porteur reconnaît que les prélèvements oculaires peuvent léser l'œil, que l'isolement et la contention en cage métabolique stressent les souris et que les régimes provoquent une aversion alimentaire et une perte de poids. Il affirme que la culture de cellules rénales ne peut fournir un système intégré équivalent, juge le recours aux souris "indispensable" et les met toutes à mort pour prélever leurs reins.

Objectifs

Le rein contrôle la composition en ions et en eau de l'organisme. Cette fonction est rendue possible grâce à des cellules qui forment de longs segments en forme de tubes dans le rein. Il existe plusieurs types de cellules tubulaires qui ont chacune des fonctions particulières. Certaines cellules appelées cellules intercalaires sécrètent des acides dans l’urine en formation. Ces dernières sont importantes lorsque l’organisme est surchargé en acide comme dans plusieurs situations : diabète, régime riche en protéines, troubles du métabolisme. Le nombre des cellules du canal collecteur varient en fonction des apports en ions. Cette augmentation a un rôle important puisque son défaut entraine une perturbation de la régulation de l’état acido-basique pour autant sa régulation n’est pas bien comprise. Ce projet propose d’étudier le rôle d’une protéine située sur la surface des cellules intercalaires. Elle est mutée chez des patients atteints d’une maladie rare : l’acidose tubulaire distale qui peut conduire jusqu’à de sévères atteintes rénales et un trouble de la composition en ions du sang. Le gène muté chez les patients sera invalidé chez la souris permettant d’avoir un modèle d’étude pour cette maladie rare. Le projet aura aussi pour objectif de déterminer l’importance de protéines membranaires pour la sécrétion acide par le rein et le comportement des cellules intercalaires. Il n’existe pas de modèle alternatif de cellules intercalaires en culture au laboratoire qui reproduisent l’ensemble des cellules tubulaires du canal collecteur. Ce projet nécessite l’utilisation de souris dont la composition cellulaire rénale est proche de l’homme. Nous mesurerons la fonction du rein chez ces souris ainsi que le contenu en ions du sang de ces animaux. La composition cellulaire des reins de ces souris sera également explorée.

Bénéfices attendus

Les régulations de la sécrétion acide et du nombre de cellules permettant cette sécrétion sont mal connues. Pourtant, elles jouent un rôle fondamental dans le maintien bien équilibré d’un organisme pour son contenu en eau et en ions, pour le maintien du pH sanguin et une pression artérielle constante. Ce projet permettra de mieux connaitre certains mécanismes du rein qui sont modifiés lors de maladies comme l’hypertension ou de troubles métaboliques comme le diabète. Plus spécifiquement, il permettra d’établir un lien formel entre des mutations observés chez des patients et l’acidose tubulaire distale. Il permettra également de développer un nouveau modèle de maladie rare rénale.

Procédures

Pour étudier la fonction rénale et la sécrétion acide, 80 souris seront installées individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) sur 2 périodes de 7 jours consécutifs permettant de récolter leurs urines. L’eau de boisson des souris sera acidifiée pendant 17 jours permettant de solliciter les cellules intercalaires rénales. Trois prélèvements sanguins avant et après le traitement acide pour chacune de ces 80 souris permettront de mesurer les concentrations en ions du sang. Ces prélèvements durent environ 10 secondes sont réalisés sous anesthésie locale. Un autre lot de 112 souris exprimant une molécule fluorescente qui doit être induite par une molécule chimique injectée aux animaux quotidiennement pendant 5 jours. Une fois la molécule fluorescent induite, les souris subiront différents traitements dans la nourriture ou la boisson pendant 3 à 15 jours perturbant certains équilibres ioniques de l’organisme.

Impact sur les animaux

Des prélèvements sanguins sont nécessaires et seront réalisés au coin de l’œil ce qui peut être entrainer un risque de lésion ou d’inflammation dans la zone autour de l’œil et entrainer une douleur. Certaines souris seront maintenues en cages métaboliques ce qui peut provoquer un inconfort car elles sont maintenues sur une grille pendant plusieurs jours. La cage métabolique étant transparente, les souris ne sont pas à l’abri de la lumière ce qui peut provoquer un stress car cette espèce évite la lumière directe. De plus, l’hébergement dans ces cages se fait de manière individuelle en isolant chacune des souris ce qui peut provoquer un stress car leurs contacts sociaux sont diminués. Dans la cage à métabolisme, l’administration d’un traitement acide dans l’eau de boisson entraine une modification transitoire du pH sanguin qui pourrait provoquer un inconfort à l’animal. Une molécule est injectée à certaines souris et cela implique que les souris soient contraintes pour effectuer l’injection. L’injection induit un stress et une douleur au point d’injection. Une modification des apports en ions dans la nourriture lors des procédures expérimentales sera effectuée. Elle peut provoquer une aversion transitoire pour la nourriture et entrainer une perte de poids chez les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer les tissus (reins) et d’en analyser le contenu en cellules et de quantifier l’abondance de plusieurs transporteurs ioniques.

Remplacement

Les modèles de cellules rénales en culture ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées ; ce projet nécessite un systèmes intégré multi-cellulaire reproduisant fidèlement le canal collecteur. Ce modèle n’existe pas à l’heure actuelle. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable. De plus, nous avons besoin dans ce projet de deux souches de souris génétiquement modifiée. Une première souche permettra d’étudier l’inactivation d’un gène retrouvé chez des patients atteints d’une maladie rare. Une deuxième souche permettra de suivre le devenir de cellules rénales en y exprimant une molécule fluorescente. Ces expériences ne sont pas envisageables dans un modèle plus simple tel que la culture de cellules.

Réduction

Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures du contenu sanguin en ions, les protocoles ont été élaborés pour réduire au minimum le volume de sang prélevé et ainsi faire trois mesures sur les mêmes animaux à 2 semaines d’intervalle entre chaque mesure. Cela permet de réduire le nombre total de souris d’une procédure. L’administration du traitement acide dans l’eau de boisson et l’utilisation des cages à métabolisme pour mesurer la fonction rénale ont été déjà validées par plusieurs publications permettant d’anticiper parfaitement le nombre souris minimum nécessaire au projet. Le nombre de souris a également été calculé pour détecter des différents significatives entre les différents mesures histologiques et biochimiques faites sur les reins prélevés après mises à mort des animaux. En évitant d’avoir un groupe contrôle pour chaque groupe de traitement, nous avons également put réduire le nombre de souris à utiliser.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée (au moins trois fois par semaine). En cas de perte de poids importante, un aliment hydraté sera proposé aux souris Pour la mesure des concentrations ioniques dans le sang, le prélèvement sanguin (90µl) sera fait sur souris vigiles avec un collyre anesthésiant et sera confié à une personne qualifiée et expérimentée pour ce type de prélèvement. Le prélèvement sera de 90µl et correspond à un faible volume par rapport au volume de sang total d’une souris. Le protocole d’utilisation des cages à métabolisme comporte un suivi quotidien des animaux avec une mesure du poids, de quantité de nourriture ingérée et du volume d’eau bue tous les jours. Avant les mesures, une période d’habituation à la cage est réalisée. En plus, une habituation à la nourriture en poudre est réalisée. Un enrichissement (cylindre en plastique opaque) est également proposé permettant à l’animal de se mettre dans un endroit à l’abri de la lumière. Le séjour dans les cages à métabolisme a été réduit au minimum.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du rein très semblable au rein humain. Nous savons également que la protéine participant à la sécrétion acide dans le rein et qui sera étudié dans ce projet est présente dans les mêmes cellules chez l’homme et la souris. L’organisation des cellules rénales est également identique chez l’homme et la souris. Les souris utilisées dans ce protocole seront des souris adultes car le projet porte sur l’étude de la fonction rénale d’un organisme adulte.

308 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont exposées à un manque d'oxygène huit heures par jour pendant deux à seize semaines pour reproduire l'apnée du sommeil, 84 d'entre elles subissant en plus une chirurgie d'ablation du tissu graisseux, et l'ensemble un test de tolérance à l'insuline avec jeûne et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que l'hypoxie provoque une accélération de la respiration, une perte de poids et un stress, et que la chirurgie entraîne une douleur au réveil traitée par analgésique. Il affirme que la culture cellulaire ne peut remplacer un "organe entier" ni permettre l'analyse des facteurs circulants entre tissu graisseux et cœur, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une des pathologies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, et ayant des conséquences cardiovasculaires et métaboliques très délétères. Le SAOS correspond à des épisodes répétitifs d’apnées pendant le sommeil, résultant en une diminution cyclique du niveau d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de lésions multi-organes, contribuant aux complications cardiaques et métaboliques. Afin de proposer une meilleure prise en charge des patients atteint de SAOS et de limiter ses complications, nos travaux de recherche visent à mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’hypoxie. Les objectifs de ce projet sont de comprendre précisément le lien entre les atteintes du tissu graisseux induites par l’hypoxie et la dysfonction cardiaque associée. Nous faisons l’hypothèse que l’hypoxie pourrait affecter de façon précoce le tissu graisseux, qui libérerait alors des facteurs néfastes dans la circulation sanguine et participerait ainsi aux altérations cardiaques. Afin de répondre à nos hypothèses, nous envisageons d’utiliser différents modèles de rongeurs (souris génétiquement modifiées) exposés à l’hypoxie, chez lesquels nous réaliserons des chirurgies visant à retirer le tissu graisseux, ou des traitements médicamenteux visant spécifiquement le tissu graisseux. Ce projet nécessitera l’utilisation de 308 souris.

Bénéfices attendus

Le syndrome d’apnée obstructives du sommeil est un problème de santé publique en raison des complications cardiovasculaires associées, principalement dues au manque d’oxygène transitoire sur le long terme (nommé hypoxie). Il existe de nombreuses interconnections entre le tissu graisseux et le coeur. En particulier, le vieillissement du tissus graisseux, via la libération dans le sang de différents médiateurs, contribue au développement de la fibrose cardiaque, mécanisme qui contribue à diminuer la fonction normale du coeur. L’hypoxie induit de profondes altérations du tissus graisseux, ainsi que du coeur, mais l’interaction entre ces deux organes dans ce contexte est méconnue. Ainsi, nous proposons de démontrer que l’hypoxie induit un vieillissement plus rapide du tissus graisseux, responsable des complications cardiaques. Le but ultime de ce projet est de démontrer que cibler de façon spécifique le vieillissement du tissus graisseux est bénéfique pour limiter les atteintes cardiaques induites par l’hypoxie et d’identifier des marqueurs biologiques circulants spécifiques.

Procédures

Une partie des animaux sera soumis à une chirurgie unique visant à supprimer une grande partie du tissu graisseux. Cette procédure dure environ 15 minutes et sera réalisée sous anesthésie et les animaux seront traités contre la douleur avant la chirurgie et à leur réveil. Cette procédure concerne 84 souris. Tous les animaux (308 souris) sont soumis à un manque d’oxygène (hypoxie) ou non à l’air ambiant, pendant 2 ou 16 semaines. Cette exposition dure chaque jour et 8h/j. Des prélèvements sanguins seront réalisés afin d'évaluer le taux de sucre dans le sang des animaux dans les différents groupes, ainsi que leur sensibilité à l'insuline. Pour ce faire, ce test de tolérance à l’insuline consiste à injecter de l’insuline chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60, 75 et 90 minutes après l’injection. Cette procédure concerne tous les animaux du projet. La procédure d’imagerie échographique est réalisée sous anesthésie et sur tapis chauffant, avant le début de l’exposition à l’hypoxie et 3 jours avant la fin du protocole. Chaque échographie dure environ 15 minutes par souris et concerne le groupe 2a, soit 84 souris. Le traitement médicamenteux est réalisé uniquement sur le groupe 2c (56 souris). Il consiste à administrer le traitement par gavage, 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines pendant 2 à 16 semaines d’exposition.

Impact sur les animaux

L’hébergement des souris dans l’animalerie entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’hypoxie. De plus l’animalerie est susceptible d’accueillir des rats et des souris simultanément. Cette présence peut induire un stress chez les souris. L’exposition à l’hypoxie induit une accélération de la respiration, une légère perte de poids, un stress et une diminution de l’activité lors des premiers jours, puis la souris s’adapte rapidement et ces signes disparaissent. La chirurgie de suppression du tissu adipeux peut induire au réveil une douleur, qui est traitée par administration d’analgésique et qui nécessite un suivi particulier des animaux dans les jours qui suivent. Le test de tolérance à l’insuline chez l’animal éveillé nécessite une injection d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal. Le traitement est administré 1 fois/j, sur 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines, par gavage, tout au long de l’exposition à l’hypoxie. Pour limiter le stress des animaux, les gavages sont réalisés par une personne maitrisant cette technique. Un transport d’animaux est nécessaire pour réaliser les échographies, ce qui peut stresser les animaux. Pour limiter le stress, les animaux sont amenés en amont dans la pièce d’échographie pour qu’ils s’habituent à l’environnement et sont anesthésiés pour l’échographie.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort et les différents organes d’intérêt seront prélevés pour analyses ultérieures.

Remplacement

Le présent projet est basé sur l’hypothèse d’une communication inter-organes (tissu adipeux-cœur), à la fois en réponse à l’hypoxie, mais également lors du processus de vieillissement. Le remplacement partiel des animaux peut être atteint en utilisant des approches de cultures cellulaires, mais cette alternative ne permet pas de répondre aux objectifs spécifiques du projet. 1) Un dispositif de manque d’oxygène appliqué aux cellules permet d’étudier les réponses spécifiques de différents types cellulaires (adipocytes, fibroblastes cardiaques, cardiomyocytes). Ce dispositif permet d’isoler un type cellulaire précis et de déterminer les réponses spécifiques à l’hypoxie. Des co-cultures sont également envisageables, mais ne peuvent en aucun cas remplacer la complexité d’un organe « entier » dans lequel coexiste une grande variété de cellules. Enfin, un des objectifs majeurs de notre projet est d’identifier des facteurs circulants, qui seraient sécrétés par le tissu adipeux, relargués dans la circulation sanguine, et impacteraient ensuite le cœur. L’utilisation de modèle animal est donc la seule alternative permettant une analyse systémique, multi-organes, ainsi que le recueil de plasma et l’analyse de facteurs circulants. 2) Il est également très difficile d’étudier les effets du vieillissement sur des modèles in vitro. Dans ce projet, nous utiliserons des souris jeunes ainsi que des souris adultes, et déterminerons si la cinétique des effets de l’hypoxie (durée de 2 à 16 semaines) est différente selon l’âge (hypothèse d’effets synergiques du vieillissement et de l’hypoxie), à la fois sur le remodelage et le vieillissement du tissu adipeux, mais également sur le remodelage cardiaque. De plus, nous utiliserons une approche chirurgicale de suppression du tissu adipeux, qui nous permettra d’établir la preuve de concept d’une communication inter-organe en réponse à l’hypoxie, dans un organisme entier.

Réduction

Le calcul de nos effectifs est réalisé de manière à utiliser le moins d'animaux possible sans altérer la puissance et la fiabilité de nos tests statistiques. Nous utiliserons un logiciel statistique (GraphPad Prism) pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Les tests statistiques utilisés seront des t-test ou des ANOVA à deux voies suivis de tests post-hoc. Une valeur P

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes, dans un environnement enrichi (sauf pendant l’exposition à l’hypoxie ou à la normoxie) et leur bien-être sera vérifié quotidiennement. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie. Les mesures d'échographies cardiaques et la lipectomie (suppression du tissus graisseux) seront réalisées sur animaux anesthésiés. Pour la lipectomie, les animaux recevront un traitement analgésique avant et après la chirurgie. Globalement et tout au long des différentes procédures du présent projet, les animaux seront surveillés quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être appliquées à l’homme, notamment dans le cadre d’études sur l’organisme entier. Ceci permet ainsi de comprendre les mécanismes qui se produisent dans l’organisme des souris avant d’entreprendre des études chez l’humain. Les souris font également naître un nombre important de souriceaux par portée ce qui n’est pas le cas de tous les mammifères. Cela nous permet donc d’avoir un grand nombre d’animaux du même lot. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 à 12 mois) afin de ne pas utiliser des souris trop jeunes, encore en pleine croissance, et qui pourrait être résistantes aux phénomènes de vieillissement. Les souris à phénotype dommageable développent spontanément des cellules tumorales (lymphomes et sarcomes) à partir de l'âge de 4 à 6 mois mais ces souris seront utilisées et mises à mort avant le développement spontané de ces tumeurs.

204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime gras puis gavées neuf fois d'un mélange de six perturbateurs endocriniens, une dioxine, deux plastifiants, deux pesticides et un isolant électrique, elles doivent confirmer chez la souris des effets d'abord observés sur des larves de poisson-zèbre. Le porteur qualifie la maladie du foie gras d'indolore et ne décrit comme atteinte que l'inconfort du gavage. Il présente ce travail comme une étape vers le remplacement de la souris par la larve de poisson, tout en jugeant "indispensable" le recours aux souris pour valider ce modèle, et les met toutes à mort pour prélever leurs organes.

Objectifs

La maladie du foie gras (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) est devenue une priorité de santé publique à cause de sa prévalence grandissante (20% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elle débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux perturbateurs endocriniens seuls ou mélange, est suspectée. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens sur la santé, en particulier sur la maladie du foie gras. Etant donné la nature complexe de cette maladie qui dépend des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est indispensable d’avoir une approche intégrative uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Ainsi, nous avons mis en place une stratégie en deux temps : d’abord un criblage de l’impact sur le foie de l’exposition chronique à des mélanges de perturbateurs endocriniens dans notre modèle de larve de poisson-zèbre obèse suivi de la confirmation de ces effets dans un modèle murin pertinent. L’objectif de ce projet est donc la réalisation de la 2éme phase de confirmation des effets observés chez la larve de poisson zèbre de mélanges de perturbateurs endocriniens sur le developpement de la la maladie du foie gras chez la souris.

Bénéfices attendus

Le caractère novateur de ce projet repose sur le choix du modèle pour répondre aux enjeux de la recherche sur les perturbateurs endocriniens, notamment dans des populations dites à risque. En effet, ce modèle, qui possède de nombreux atouts, est relativement proche de l’humain, notamment en ce qui concerne le développement de la maladie du foie gras. En outre, l’emploi de ce modèle, en accord avec la règle des 3R, peut être une alternative ou un prérequis à l’emploi des modèles in vivo de mammifères classiquement utilisés. Ainsi, cette étude de faisabilité a pour but de proposer un nouveau modèle in vivo visant à mieux caractériser les effets des perturbateurs endocriniens en mélange sur la maladie du foie gras et ainsi de répondre aux préoccupations concernant leurs potentiels effets cocktails. Pour cela, 6 perturbateurs endocriniens ont été choisis car la population y est couramment exposée et pour garantir les chances de démontrer un effet cocktail (une dioxine issue de rejets d’industrie ou d’incinération, deux plastifiants, deux pesticides, un isolant électrique). En effet, ces molécules sont reconnues pour leurs implications dans la maladie du foie gras et ont des modes d’actions variés, ce qui pourrait ainsi potentialiser leurs effets lors de mélange. Enfin, le choix du modèle s’est porté sur la larve de poisson-zèbre, dont la sensibilité aux perturbateurs endocriniens a été démontrée et pour lequel nous avons déjà mis en place un modèle développant une stéatose rapidement, et qui nous a permis de mettre en évidence qu’un mélange à faible dose de molécules toxiques pour le foie aggrave la maladie du foie gras. Le premier volet de ce projet sur le modèle de larve de poisson-zèbre a été en partie réalisé et a fait l’objet de saisines spécifiques. Les résultats ont permis de déterminer la composition de de différents mélanges pour lesquels on a observé une aggravation de la maladie du foie gras pour des concentrations où chaque molécule en exposition unique n’avait que peu ou pas d’effet, ce qui indique un effet cocktail de ces molécules.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage pour maitriser l'exposition aux perturbateurs endocrniens à rasion d'un traitement par semaine 9 fois (entre la 3eme semaine de régime riche en graisse et la 12eme semaine).

Impact sur les animaux

Le gavage induit un inconfort des animaux, reste que la NAFLD est une pathologie indolore.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort afin de recolter les organes pour permettre l'etude scientifique.

Remplacement

Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissu adipeux et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constitue le foie. De plus, l’altération des systèmes de communications hormonaux est le mécanisme d’action définissant l’action des perturbateurs endocriniens. Seuls les modèles in vivo présentent toutes ces interactions. Le développement d’un nouveau modèle animal pour étudier la stéatohépatite qui peut être mis en œuvre sur des temps plus court et plus éthique a été proposé par l’équipe. Il utilise les larves de poisson zèbre et a montré des premiers résultats très encourageants qui doivent être confirmés sur le modèle murin de référence pour les études de toxicologie pour valider la pertinence de ce modèle de poisson zèbre et permettre la substitution de l’utilisation des souris par ces larves de poissons.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Enfin le projet vise à confirmer chez la souris la validite de résultats obtenus dans un autre modele

Raffinement

les études seront conduites dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux, une attention journalière à l’état des animaux sera mise en œuvre, et un grand nombre de mesures sur les échantillons prélevés sont envisagées pour récolter un maximum d’informations. Les souris seront traitées dans une pièce isolée de leurs congénères sur un temps court ne permettant pas le développement de douleur.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’utilisation du modèle de poisson-zèbre pour étudier l’impact de cocktail de perturbateurs endocriniens sur la transition de la stéatose en un état pathologique, la stéatohépatite et à valider le caractère prédictif du modèle de poisson-zèbre en le comparant à un modèle murin classiquement utilisé pour l’étude des NAFLD. Il est donc indispensable d’utiliser des souris pour remplir les objectifs du projet. Adulte, pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes. Animaux âgées de 8 à 12 semaines, d’environ 20g

308 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont exposées à un manque d'oxygène huit heures par jour pendant deux à seize semaines pour reproduire l'apnée du sommeil, 84 d'entre elles subissant en plus une chirurgie d'ablation du tissu graisseux, et l'ensemble un test de tolérance à l'insuline avec jeûne et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que l'hypoxie provoque une accélération de la respiration, une perte de poids et un stress, et que la chirurgie entraîne une douleur au réveil traitée par analgésique. Il affirme que la culture cellulaire ne peut remplacer un "organe entier" ni permettre l'analyse des facteurs circulants entre tissu graisseux et cœur, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une des pathologies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, et ayant des conséquences cardiovasculaires et métaboliques très délétères. Le SAOS correspond à des épisodes répétitifs d’apnées pendant le sommeil, résultant en une diminution cyclique du niveau d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de lésions multi-organes, contribuant aux complications cardiaques et métaboliques. Afin de proposer une meilleure prise en charge des patients atteint de SAOS et de limiter ses complications, nos travaux de recherche visent à mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’hypoxie. Les objectifs de ce projet sont de comprendre précisément le lien entre les atteintes du tissu graisseux induites par l’hypoxie et la dysfonction cardiaque associée. Nous faisons l’hypothèse que l’hypoxie pourrait affecter de façon précoce le tissu graisseux, qui libérerait alors des facteurs néfastes dans la circulation sanguine et participerait ainsi aux altérations cardiaques. Afin de répondre à nos hypothèses, nous envisageons d’utiliser différents modèles de rongeurs (souris génétiquement modifiées) exposés à l’hypoxie, chez lesquels nous réaliserons des chirurgies visant à retirer le tissu graisseux, ou des traitements médicamenteux visant spécifiquement le tissu graisseux. Ce projet nécessitera l’utilisation de 308 souris.

Bénéfices attendus

Le syndrome d’apnée obstructives du sommeil est un problème de santé publique en raison des complications cardiovasculaires associées, principalement dues au manque d’oxygène transitoire sur le long terme (nommé hypoxie). Il existe de nombreuses interconnections entre le tissu graisseux et le coeur. En particulier, le vieillissement du tissu graisseux, via la libération dans le sang de différents médiateurs, contribue au développement de la fibrose cardiaque, mécanisme qui contribue à diminuer la fonction normale du coeur. L’hypoxie induit de profondes altérations du tissu graisseux, ainsi que du coeur, mais l’interaction entre ces deux organes dans ce contexte est méconnue. Ainsi, nous proposons de démontrer que l’hypoxie induit un vieillissement plus rapide du tissu graisseux, responsable des complications cardiaques. Le but ultime de ce projet est de démontrer que cibler de façon spécifique le vieillissement du tissu graisseux est bénéfique pour limiter les atteintes cardiaques induites par l’hypoxie et d’identifier des marqueurs biologiques circulants spécifiques.

Procédures

Une partie des animaux sera soumis à une chirurgie unique visant à supprimer une grande partie du tissu graisseux. Cette procédure dure environ 15 minutes et sera réalisée sous anesthésie et les animaux seront traités contre la douleur avant la chirurgie et à leur réveil. Cette procédure concerne 84 souris. Tous les animaux (308 souris) sont soumis à un manque d’oxygène (hypoxie) ou non à l’air ambiant, pendant 2 ou 16 semaines. Cette exposition dure chaque jour et 8h/j. Des prélèvements sanguins seront réalisés afin d'évaluer le taux de sucre dans le sang des animaux dans les différents groupes, ainsi que leur sensibilité à l'insuline. Pour ce faire, ce test de tolérance à l’insuline consiste à injecter de l’insuline chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60, 75 et 90 minutes après l’injection. Cette procédure concerne tous les animaux du projet. La procédure d’imagerie échographique est réalisée sous anesthésie et sur tapis chauffant, avant le début de l’exposition à l’hypoxie et 3 jours avant la fin du protocole. Chaque échographie dure environ 15 minutes par souris et concerne le groupe 2a, soit 84 souris. Le traitement médicamenteux est réalisé uniquement sur le groupe 2c (56 souris). Il consiste à administrer le traitement par gavage, 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines pendant 2 à 16 semaines d’exposition.

Impact sur les animaux

L’hébergement des souris dans l’animalerie entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’hypoxie. De plus l’animalerie est susceptible d’accueillir des rats et des souris simultanément. Cette présence peut induire un stress chez les souris. L’exposition à l’hypoxie induit une accélération de la respiration, une légère perte de poids, un stress et une diminution de l’activité lors des premiers jours, puis la souris s’adapte rapidement et ces signes disparaissent. La chirurgie de suppression du tissu adipeux peut induire au réveil une douleur, qui est traitée par administration d’analgésique et qui nécessite un suivi particulier des animaux dans les jours qui suivent. Le test de tolérance à l’insuline chez l’animal éveillé nécessite une injection d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal. Le traitement est administré 1 fois/j, sur 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines, par gavage, tout au long de l’exposition à l’hypoxie. Pour limiter le stress des animaux, les gavages sont réalisés par une personne maitrisant cette technique. Un transport d’animaux est nécessaire pour réaliser les échographies, ce qui peut stresser les animaux. Pour limiter le stress, les animaux sont amenés en amont dans la pièce d’échographie pour qu’ils s’habituent à l’environnement et sont anesthésiés pour l’échographie.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort et les différents organes d’intérêt seront prélevés pour analyses ultérieures.

Remplacement

Le présent projet est basé sur l’hypothèse d’une communication inter-organes (tissu adipeux-cœur), à la fois en réponse à l’hypoxie, mais également lors du processus de vieillissement. Le remplacement partiel des animaux peut être atteint en utilisant des approches de cultures cellulaires, mais cette alternative ne permet pas de répondre aux objectifs spécifiques du projet. 1) Un dispositif de manque d’oxygène appliqué aux cellules permet d’étudier les réponses spécifiques de différents types cellulaires (adipocytes, fibroblastes cardiaques, cardiomyocytes). Ce dispositif permet d’isoler un type cellulaire précis et de déterminer les réponses spécifiques à l’hypoxie. Des co-cultures sont également envisageables, mais ne peuvent en aucun cas remplacer la complexité d’un organe « entier » dans lequel coexiste une grande variété de cellules. Enfin, un des objectifs majeurs de notre projet est d’identifier des facteurs circulants, qui seraient sécrétés par le tissu adipeux, relargués dans la circulation sanguine, et impacteraient ensuite le cœur. L’utilisation de modèle animal est donc la seule alternative permettant une analyse systémique, multi-organes, ainsi que le recueil de plasma et l’analyse de facteurs circulants. 2) Il est également très difficile d’étudier les effets du vieillissement sur des modèles in vitro. Dans ce projet, nous utiliserons des souris jeunes ainsi que des souris adultes, et déterminerons si la cinétique des effets de l’hypoxie (durée de 2 à 16 semaines) est différente selon l’âge (hypothèse d’effets synergiques du vieillissement et de l’hypoxie), à la fois sur le remodelage et le vieillissement du tissu adipeux, mais également sur le remodelage cardiaque. De plus, nous utiliserons une approche chirurgicale de suppression du tissu adipeux, qui nous permettra d’établir la preuve de concept d’une communication inter-organe en réponse à l’hypoxie, dans un organisme entier.

Réduction

Le calcul de nos effectifs est réalisé de manière à utiliser le moins d'animaux possible sans altérer la puissance et la fiabilité de nos tests statistiques. Nous utiliserons un logiciel statistique (GraphPad Prism) pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Les tests statistiques utilisés seront des t-test ou des ANOVA à deux voies suivis de tests post-hoc. Une valeur P

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes, dans un environnement enrichi (sauf pendant l’exposition à l’hypoxie ou à la normoxie) et leur bien-être sera vérifié quotidiennement. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie intermittente. Les mesures d'échographies cardiaques et la lipectomie (suppression du tissus graisseux) seront réalisées sur animaux anesthésiés. Pour la lipectomie, les animaux recevront un traitement analgésique avant et après la chirurgie. Globalement et tout au long des différentes procédures du présent projet, les animaux seront surveillés quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être appliquées à l’homme, notamment dans le cadre d’études sur l’organisme entier. Ceci permet ainsi de comprendre les mécanismes qui se produisent dans l’organisme des souris avant d’entreprendre des études chez l’humain. Les souris font également naître un nombre important de souriceaux par portée ce qui n’est pas le cas de tous les mammifères. Cela nous permet donc d’avoir un grand nombre d’animaux du même lot. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 à 12 mois) afin de ne pas utiliser des souris trop jeunes, encore en pleine croissance, et qui pourrait être résistantes aux phénomènes de vieillissement. Les souris à phénotype dommageable développent spontanément des cellules tumorales (lymphomes et sarcomes) à partir de l'âge de 4 à 6 mois mais ces souris seront utilisées et mises à mort avant le développement spontané de ces tumeurs.

26 520 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent par plusieurs voies des molécules fournies par des clients, dont le porteur indique ignorer la nature et les effets secondaires, avec pour certaines l'implantation chirurgicale d'une pompe et des prélèvements sanguins terminaux. Ce nombre découle du test en série de nombreuses molécules et doses, à raison de dix animaux par groupe, pour retarder l'accouchement prématuré. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut mimer un accouchement, et prévoit la mise à mort de toutes les mères pour prélever le sang fœtal et récupérer les fœtus in utero.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de candidats médicaments pour retarder la mise-bas de femelles gestantes (modèle physiologique).

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patiente accouchant prématurément.

Procédures

Les animaux recevront des administrations de composés à tester. Les voies d’administration sont dépendantes du protocole expérimental mais des administrations per os, intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et intramusculaires pourront être réalisées. Les animaux pourront avoir une implantation de pompe type Alzet sous anesthésie. Ils pourront également avoir des prélèvements sanguins terminaux ou en cours d’expérimentation (étude de pharmacocinétique) sur animal éveillé ou sous anesthésie selon la voie de prélèvement utilisée.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux provoqués par les composés. Cependant, les animaux seront mis en cage individuelle et seront traités plusieurs fois par jour ce qui pourrait engendrer du stress d’autant plus que les animaux sont des femelles gestantes. De plus, les animaux pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’une pompe osmotique, ce qui pourrait provoquer une hypothermie et du stress à l’animal.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, les animaux seront euthanasiés car du sang fœtal et de la mère sera prélevé. A l’issue de la procédure 2, tous les animaux seront euthanasiés car les fœtus devront être récupérés in utero après sacrifice de la mère et des organes pourront être ensuite prélevés (cornes utérines).

Remplacement

Actuellement, aucune méthode in vitro, ex vivo ou in silico ne permet de mimer un accouchement dans son ensemble et d’évaluer des effets sur les fœtus (malformation, avortement in utero..). Le temps de gestation étant dépendante de facteurs hormonaux, du nombre de fœtus par femelle, du bien-être de cette dernière et de son niveau de stress, aucune technique cellulaire ou autre ne permet de remplacer l’animal, c’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour comprendre et traiter cette pathologie.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sera de 26520 animaux en raison de 10 animaux par groupe, le nombre de groupe étant fonction du nombre de molécules et/ou doses à tester. De par notre expérience sur ce modèle, 10 animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour observer des différences statistiquement significatives entre les groupes. Les souris livrées qui ne seront pas gestantes (environ 10-15% d’imprécision pour déterminer les femelles gestantes) seront utilisées pour des apprentissages de gestes techniques ou autre. Ces animaux ne seront pas sacrifiés sans avoir été utilisés

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un suivi quotidien de leur état sera réalisé par du personnel qualifié. Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant de réaliser les expérimentations sous caméra afin de suivre un même animal sur quelques jours. Nous apporterons une attention particulière au bien-être des animaux avec une surveillance accrue (au moins 2 fois par jour), une manipulation en douceur par du personnel qualifié du fait que les femelles soient gestantes, une attention particulière à ce que les animaux soient au calme (pièce spécifique pour ces études), un suivi post-opératoire (observation du réveil, animaux sur plaque chauffante thermorégulée pendant la chirurgie pour éviter une hypothermie). Une attention particulière sera réalisée si un animal présentait des difficultés pour boire, se nourrir (ajout de croquettes humides dans la cage), se déplacer ou des signes de souffrance tels que vocalisation, prostration (euthanasie de l’animal si atteinte des points limites). Un enrichissement (type carré de coton, igloo) sera apporté lors du sevrage des petits.

Choix des espèces

L’utilisation de rongeurs pour étudier l’effet de molécules pour retarder les accouchements prématurés est bien décrite dans la littérature et est très souvent utilisée du fait du faible nombre de jour de gestation et d’un nombre important de fœtus lors de la mise bas pour évaluer les effets secondaires possibles des composés à tester. Classiquement nous réalisons cette étude sur des souris mais des demandes clients sur le rat nous ont été demandées donc nous préférons faire une demande d’autorisation chez la souris et le rat, sachant que la technique reste identique. Nous avons besoin de femelles gestantes donc les animaux devront être matures sexuellement, par conséquent âgés d’au moins 8 semaines. Les petits seront observés de leur naissance jusqu’à leur sevrage au bout de 3-4 semaines (soit des animaux de 0 à 28 jours).

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, reçoivent des injections répétées et des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, pour étudier les atteintes cérébrales de la Covid et tester des traitements. Le porteur indique que l'infection peut entraîner une perte de poids allant jusqu'à 20 % et se révéler mortelle en sept jours, avec atteinte du système nerveux central et chute des capacités motrices et respiratoires, les souris M83 développant en plus une paralysie spontanée. Il affirme que l'étude de la physiopathologie ne peut se faire sans inoculer le virus à l'animal vivant, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la gestion du risque lié à un agent pathogène de groupe III.

Objectifs

L’émergence de variants de SRAS2 requiert de nouvelles données scientifiques. Des patients continuent à présenter certains symptômes, parfois des mois après leur guérison, et d’autres en développent de nouveaux. Ces symptômes sont regroupés sous le nom de COVID- long. Des signes neurologiques sont observés chez les patients atteints de Covid et pourraient accélérer des pathologies cérébrales à long terme. Par ailleurs, le rôle de la réponse immunitaire innée est questionné dans l’établissement des symptômes de la Covid à court et long terme. Enfin, les mucines, composant du mucus, pourraient avoir un rôle clé dans la diffusion du SRAS2 au sein de la cavité nasale puis vers le tissu pulmonaire. Ce projet a pour objectifs (1) l’étude de la physiopathologie cérébrale des infections à SRAS2, (2) une meilleure compréhension du rôle de la réponse interféron induite par le virus (3) l'exploration du rôle des protéines composant le mucus (mucines) dans l'infection de l'épithélium respiratoire par le SRAS2 et (4) l'évaluation de traitements permettant de diminuer la pathologie cérébrale et l'inflammation à SRAS2. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons une souris transgénique qui développe une neuropathologie rappelant la maladie humaine, un modèle de souris qui présente une immunité altérée, et un modèle de souris déficiente pour l'expression de mucines.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la COVID-19 et les variants émergents de SRAS-CoV-2. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche. Ce projet va permettre d’évaluer le risque de survenue de troubles de type maladie de Parkinson suite à une infection SRAS-CoV-2, de mieux explorer le rôle de la réponse immune innée dans les infections SRAS-CoV-2 ainsi que de tester des pistes de traitement et de caractériser le rôle des protéines du mucus (mucines) dans l’infection SRAS-CoV-2.

Procédures

Les inoculations par voie nasale sont réalisées sous anesthésie générale. Les administrations par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale ou intramusculaire sont réalisées sur l’animal vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés au sinus rétro orbital sous anesthésie générale et collyre anesthésique. La durée de chacune des interventions décrites est inférieure à 1 minute.

Impact sur les animaux

Selon les données déjà disponibles de la littérature, il a été observé une chute de poids n’excédant pas 20% du poids initial que ce soit suite à une infection avec une souche adaptée à la souris ou un variant du SRAS-CoV-2. Les souris M83 développent spontanément des symptômes. Pour les souris M83, elles seront gardées jusqu’à un âge maximum de 8 mois, sachant que les premiers signes de paralysie spontanés n'apparaissent pas avant l'âge de 8 mois chez ces animaux. Selon la dose administrée et la souche virale considérée l’infection peut s’avérer létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. De plus nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur des évolutions sur le long terme (2 mois) qui ne peuvent être mimés in vitro. En revanche, les stratégies thérapeutiques seront validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées. L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 sera ainsi entériné par des analyses in vitro. Les essais thérapeutiques seront ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et des données bibliographiques (publications scientifiques). Dans notre expérience, des groupes de 6 animaux permettent d’atteindre une significativité statistique. La comparaison des traitements ou entre lignée de souris s’établit à l’aide de tests non paramétriques avec un niveau de confiance de 95%. Les différences entre les groupes seront considérées comme significatives si la valeur P est inférieure à 0,05%. Pour respecter la règle des 3R, les animaux seront utilisés pour plusieurs expériences (études histologiques et moléculaires).

Raffinement

Pour minimiser le stress induit aux animaux, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane avant inoculation intra-nasale du virus. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et permet d’assurer un réveil rapide en minimisant l’hypothermie. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les souris seront hébergées par 6 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

La souris exprimant le récepteur murin ACE2 est sensible à l’infection par les souches adaptée à la souris et certains variants du SRAS-CoV-2. Elle présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les modèles de souris transgéniques exprimant le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 permettent le développement clinique et virologique des infections à l’ensemble des souches circulantes et variants de SRAS-CoV-2. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris de moins de 6 mois au moment de l’infection. Cette tranche d'âge permettra de disposer de lots homogènes des différentes colonies de souris transgéniques. L'âge maximal de 6 mois permet également d'éviter l'apparition de signes sévères associés à l'infection.