Rongeurs

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont surveillées et pesées pour suivre l'apparition de tumeurs spontanées de l'endomètre, de la peau, des poumons ou du foie, avant des analyses post-mortem. Le porteur indique que la souffrance modérée découle de l'apparition des tumeurs et non des manipulations, limitées à la contention. Il présente un modèle vivant comme "indispensable" pour confirmer qu'un variant génétique identifié chez des patientes prédispose au cancer, et prévoit de tuer les mâles reproducteurs pour stocker leur sperme.

Objectifs

Chez des patientes présentant des caractéristiques évoquant un syndrome de prédisposition au cancer de l’endomètre, un variant spécifique d’un gène, a été identifié. Ce gène n’a jamais été précédemment impliqué dans la prédisposition au cancer chez l’Homme. Ce variant est absent dans la population générale. La surexpression du gène étudié est un facteur de mauvais pronostic dans plusieurs types de cancers (cancers du sein, de l’endomètre, du poumon et du foie). Par ailleurs, une étude a montré un effet tumorigène spontané au sein d’un modèle murin sur-exprimant le gène d’intérêt. Le variant identifié est situé dans un domaine de la protéine qui pourrait diminuer sa dégradation. Par conséquent ce dérèglement pourrait jouer un rôle dans la formation des tumeurs. Notre hypothèse est que le variant de ce gène conduit à une stabilisation de la protéine qui a un rôle essentiel dans le la machinerie de division des cellules. Ainsi, ce variant pourrait prédisposer à la survenue de cancers. L’objectif de ce projet est de confirmer le caractère pathogène du variant identifié chez des patientes, c’est-à-dire montrer qu’il est causal d’un nouveau syndrome de prédisposition tumorale. Un modèle murin porteur de ce variant est utilisé pour démontrer une prédisposition au développement de tumeurs. Par ailleurs, la compréhension du mécanisme de tumorigenèse associé à cette variation de gène, jamais décrite, présente un intérêt scientifique majeur.

Bénéfices attendus

Le variant et le gène impliqué n’ont jamais été décrits comme pouvant conduire à une prédisposition au développement de tumeurs ou de cancers chez l’Homme. Il y a donc un bénéfice direct pour les patients porteurs à confirmer le caractère délétère du variant pour permettre un diagnostic adapté. A plus long terme, l’analyse des tumeurs permettra sur le plan scientifique de mieux comprendre les mécanismes de la tumorigenèse associés à l’hyperactivation de cet oncogène, voire à tester des approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront uniquement observés et pesés pour vérifier le développement de tumeurs potentielles.

Impact sur les animaux

Des tumeurs sont susceptibles de survenir au niveau de l’endomètre ou bien la peau, les poumons ou le foie. Des méthodes non invasives seront utilisées pour évaluer l’apparition de ces tumeurs. Les nuisances expérimentales se limiteront aux stress de la contention et de la manipulation des animaux et les nuisances modérées sur les animaux seront donc la conséquence de l’apparition des tumeurs

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

La variation génétique identifiée a été caractérisée in vitro. Après confirmation du phénotype tumoral associé à la modification génétique testée, l’analyse des tumeurs développées sera une étape importante dans la compréhension du mécanisme de développement tumoral associé. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement auquel est soumis la cellule contenant la mutation. Un modèle vivant intégré est donc indispensable pour étudier les interactions entre la tumeur et ses organes cibles mais également avec l’organisme dans sa totalité. Ces modèles vont nous permettre d'étudier le développement de la maladie en essayant de mimer et comprendre leur mécanisme oncogénique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé grâce à des outils statistiques. Par ailleurs, les mâles reproducteurs seront mis à mort afin de récupérer leur sperme en vue du stockage long terme de cette lignée et réduire ainsi le nombre d’animaux.

Raffinement

Le présent projet inclut uniquement une surveillance des animaux avec un suivi de croissance tumorale (si développement de tumeurs) par observation et pesée des souris. Aucune manipulation invasive n’est prévue. Nous n’anticipons pas de phénotype dommageable pour les souris sauvages mais pour les souris mutées on attend un développement de tumeurs spontanées. Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront administrés. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce souris a été fait pour plusieurs raisons : La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l'Homme, Le gène étudié est présent dans les deux espèces et l’acide aminé muté est également identique entre les 2 espèces, La souris est un modèle classique pour les modifications génétiques et est pertinent pour l’étude de la prédisposition génétique au cancer. Jeunes souris sevrées puis adultes

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées 21 jours à un manque d'oxygène simulant l'apnée du sommeil, puis subissent une ischémie du cœur sous anesthésie sans réveil ou un test à l'insuline, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur décrit une accélération de la respiration, une perte de poids et un stress lors des premiers jours d'hypoxie, ainsi qu'un stress lié aux prélèvements. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier ensemble l'hypoxie et l'infarctus sur un "organisme entier", en intégrant le rôle du sexe.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil est une des maladies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, elle peut entrainer des maladies cardiaques. Cette maladie correspond à des apnées répétitives pendant le sommeil, entrainant un manque d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de nombreux problèmes dans l’organisme dont des complications cardiaques. De plus le sexe biologique joue dans le développement de cette maladie,. En effet il y a plus d’hommes que de femmes qui en sont atteints (2 hommes pour 1 femme). Chez les femmes l’apparition de cette maladie augmente après la ménopause et chez les hommes cette maladie entraine une diminution de leurs sécrétions de testostérone. Les connaissances cliniques et fondamentales sur les interactions entre le sexe et le cœur en hypoxie sont très peu connues. Ainsi l’objectif de ce projet est de comprendre précisément le lien entre le sexe, le manque d’oxygène et la dysfonction cardiaque associés,à travers l’ 1) évaluation de l’ infarctus du cœur chez les souris mâles et femelles exposées à l’hypoxie, 2) évaluation des interactions entre les protéines activées pendant le manque d’oxygène en fonction du sexe de la souris. En considérant le rôle du sexe dans cette étude, nous aurons une contribution unique permettant de mettre en lumière des aspects qui n’ont pas été évalués dans les modèles précliniques d’une maladie qui se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles selon l’Organisation Mondiale de la Santé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre le fonctionnement du syndrome d’apnées du sommeil qui est répandu et fortement associé aux maladies cardiovasculaires qui, selon l’Organisation Mondiale de la Santé, se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles. En considérant le rôle du sexe, , nous aurons une contribution unique permettant de mettre en lumière des aspects qui n’ont pas encore été évalués dans les modèles précliniques.

Procédures

Pour répondre à la première partie du projet, les souris seront placées en hypoxie ou en normoxie pendant 21 jours. A la fin de leur exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, elles subiront une ischémie reperfusion du cœur sous anesthésie générale (3h). A la fin de cette procédure, sous anesthésie générale et sans réveil, elles seront mises à mort par prélèvement cardiaque. Pour répondre à la deuxième partie du projet, les souris seront placées en hypoxie ou en normoxie pendant 21 jours. Elles subiront un test de tolérance à l’insuline. Ce test consiste à injecter de l’insuline chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60 et 90 minutes après l’injection (30 secondes par injections). A la fin de leur exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, elles seront mises à jeun pendant 6 h puis injectées ou non à l’insuline, puis mises à mort par prélèvement de sang sous anesthésie générale (mise à mort au bout de 30 secondes d’anesthésie générale), puis les organes d’intérêt seront prélevés pour réaliser les études mécanistiques associées au projet.

Impact sur les animaux

L’hébergement des souris dans l’animalerie entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’hypoxie. De plus l’animalerie est susceptible d’accueillir des rats et des souris simultanément. Cette présence peut induire un stress chez les souris. L’exposition à lhypoxie induit une accélération de la respiration, une légère perte de poids, un stress et une diminution de l’activité lors des premiers jours, puis la souris s’adapte rapidement et ces signes disparaissent. Le test de tolérance à l’insuline chez l’animal non endormi nécessite une injection intrapéritonéale d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal.

Devenir

A l'issue de la procédure 1, tous les animaux sont anesthésiés, et le cœur est prélevé pour mesure la taille de l’infarctus du cœur. A l'issue de la procédure 2, tous les animaux sont anesthésiés, un prélèvement sanguin est réalisé et les organes sont prélevés pour analyse ultérieure.

Remplacement

Sur des modèles cellulaires, il est possible d’avoir des modèles d’hypoxie ou d'infarctus. Cependant, ces deux modèles nécessitent le même stimulus (i.e. manque d’oxygène). Donc ils ne peuvent pas être étudiés simultanément sur un modèle in vitro. Pour notre projet nous ne pouvons donc pas « remplacer » ce modèle animal par un autre modèle cellulaire puisqu’il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant de comprendre l’effet de l’hypoxie et de l’infarctus du coeur sur les organes et l’organisme entier. Il s’agit d’une étude du corps animal entier, impliquant des modifications de l’organisme et une communication entre les oragnes. Il est donc impossible de la remplacer.

Réduction

Suite à des travaux antérieurs, nous avons « réduit » au maximum le nombre d’animaux par groupe pour observer des éventuelles différences significatives. Nous utiliserons un logiciel statistique pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Le nombre d’animaux est calculé par connaissance du nombre de données finales nécessaire par technique pour réaliser des tests statistiques adéquats, et observer des différences significatives (p

Raffinement

Un hébergement selon les règles de bien-être animal dans une animalerie adaptée et autorisée, avec eau et nourriture à volonté, et enrichissements à leur disposition dans les cages. Les animaux seront toujours manipulés après une semaine minimum de repos dans l’animalerie. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie. Ils seront observés quotidiennement dans leur cage pendant toute la durée de l’hébergement et du protocole d’hypoxie, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet. Pour toutes les procédures qui le nécessitent, les animaux seront sous anesthésie générale avec des antalgiques et les animaux ne seront pas réveillés.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’Homme, notamment dans le cadre d’études systémiques, permettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les souris auront 8-14 semaines, ceci correspond à l’âge adulte de l’animal, cela nous permet de minimaliser les variations possibles liées à l’âge de l’animal.

1200 animaux, dont 500 souris, 500 rats, 80 macaques crabiers, 80 porcs et 40 chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la grande majorité étant tuée et environ 38 non-rongeurs réutilisés ou adoptés. On leur induit des lésions par des produits chimiques administrés jusqu'à deux mois, avec prélèvements répétés, pour rechercher des biomarqueurs de toxicité. Le porteur décrit une baisse d'activité, une perte de poids et des atteintes d'organes, la plupart des animaux étant tués pour analyse anatomo-pathologique. Il présente le recours à l'animal comme "requis" pour transférer ces données à la clinique et estime à 10 à 15 % les non-rongeurs réutilisables.

Objectifs

Un médicament n’est mis sur le marché et rendu disponible aux patients qu’après une longue phase de Recherche et de Développement. Le défi majeur pour la recherche biomédicale est de découvrir de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Actuellement, de nouveaux besoins et enjeux apparaissent, notamment le développement et l’intégration de biomarqueurs au sein même des études chez l’animal de laboratoire afin de permettre une meilleure sélection des candidats médicaments, l’accélération du développement, l’amélioration du suivi personnalisé et du taux de réussite. Un biomarqueur est « une caractéristique biologique mesurable liée à un processus normal ou non. En médecine, il est utilisé pour le diagnostic, la réponse à un traitement ou la toxicité d’une molécule et est dosé préférentiellement dans le sang ou l’urine ». Ce projet utilise des modèles animaux de lésions/atteintes fonctionnelles chimio- ou génétiquement induites avec pour objectifs d’une part d’évaluer des biomarqueurs de toxicité précoce (trouver de nouveaux biomarqueurs plus précoces, plus spécifiques, plus sensibles et qualifier leur cinétique d’apparition), et d’autre part d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments (par exemple diminution de toxicité hépatique ou rénale) grâce au suivi de ces biomarqueurs. Il nécessite la mise en œuvre de modèles animaux rongeurs ou non-rongeurs mimant le processus complet le plus proche de l’Homme.

Bénéfices attendus

L’identification, la cinétique d’apparition et la validation de nouveaux biomarqueurs comme indicateurs de toxicité précoce permettra de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter plus précocement le développement de molécules ayant un profil toxicologique non acceptable au regard de l’indication thérapeutique. À plus long terme, les biomarqueurs les plus pertinents pourront être proposés comme outils futurs d’adaptation dans les essais cliniques (diagnostic, médecine personnalisée, etc.). L’évaluation d’efficacité de candidat-médicament sur des atteintes lésionnelles ou fonctionnelles établies, via le suivi de biomarqueurs permettra, à terme, de proposer des médicaments capables d’améliorer le confort des patients et leur observance au traitement.

Procédures

Pour induire une lésion ou une atteinte fonctionnelle modérée, un produit est administré aux animaux, par différentes voies (principalement orale et intraveineuse) de façon quotidienne ou hebdomadaire sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements associés à une contrainte légère de quelques minutes (en début et fin d’étude) sont nécessaires pour caractériser des biomarqueurs d’intérêt ; leur fréquence et volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie quand ils sont invasifs ( entre 15 et 30 minutes). Des mesures comme par exemple la température corporelle (avec une puce électronique), le poids ( 2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. La durée maximale des études sera de 2 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ils correspondent aux conséquences de l’atteinte fonctionnelle et/ou lésionnelle ainsi que celles de l’administration des candidats médicaments pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une perte de poids, une modification de la température corporelle. Par ailleurs, les prélèvements nécessaires au suivi des biomarqueurs peuvent entraîner des nuisances de courte durée (ex : contention, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).

Devenir

Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse et que les atteintes/lésions sont réversibles que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire est requis pour avoir la possibilité d’identifier ou de valider des biomarqueurs présents dans les fluides biologiques ou certains tissus (ex : sang, salive, urines, fèces, liquide cérébro-spinal, peau, moelle osseuse) et de transférer les connaissances scientifiques acquises au cours de ces études aux études cliniques. La médecine translationnelle s’appuie sur les progrès de la recherche faite avec des modèles animaux pour développer de nouvelles techniques médicales pour le suivi des effets d’un médicament. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, tests in vitro (cellulaires et organoïdes) voire données recueillies chez les patients, ce qui permet de limiter le recours à l’animal de laboratoire.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Ce projet permet indirectement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans d’autres projets de Sécurité Préclinique grâce l’utilisation de ces biomarqueurs.

Raffinement

Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. La contrainte des prélèvements / administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et la distribution de récompenses alimentaires (renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et d’appliquer des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support/analgésie) mis en place par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce pour les études précliniques de toxicologie générale est défini par les lignes directrices internationales (ex ICH, OCDE) définissant qu’elles doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rats, souris) et chez le non-rongeur (mini-porcs, chiens ou primates non humains). C’est sur ces mêmes espèces que seront réalisées les études d’évaluation ou de validation de biomarqueurs de toxicité afin de pouvoir mettre en évidence un lien entre la toxicité observée et la variation du ou des biomarqueurs. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes pour évaluer de manière satisfaisante le profil des biomarqueurs.

750 rongeurs, 690 souris et 60 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner des manipulateurs aux gestes techniques, contention, injections par de multiples voies, prélèvements sanguins répétés et perfusion cardiaque terminale, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur signale qu'un geste mal réalisé par un débutant peut provoquer une infection, une nécrose de la queue, une automutilation ou une détresse respiratoire. Il présente cette formation comme "indispensable" au bien-être des animaux non-humains et indique utiliser autant que possible des animaux de réforme ou surnuméraires.

Objectifs

Pour toute les expérimentations menées chez l’animale, la clé de voute du bien être animale, repose sur la formation des manipulateurs. Plus un geste sera maitrisé, moins il sera traumatisant pour l’animal. Aujourd’hui, la réglementation française en matière d'utilisation d'animaux à des fins scientifiques de par l'arrêté du 1er février 2013 oblige à ce que tout personnel des établissements utilisateurs (EU), titulaire d’un diplôme d’expérimentation animal, soit formé et déclaré compétent pour les gestes à réaliser sur les animaux. La responsabilité de la formation aux gestes est reléguée aux établissements utilisateurs, et doit être effectuée par des manipulateurs (concepteur, applicateur ou éleveur) confirmés et aux compétences reconnues. Ces tuteurs sont autorisés à transmettre leur connaissance uniquement sous le couvert d’une autorisation de projet utilisant des Animaux à des Fins Scientifiques. L'objectif est donc de former les utilisateurs aux gestes qu’ils devront effectuer dans le cadre de leur travail chez la souris et/ou le rat. Les animaux utilisés dans le cadre de ces formations seront autant que possible des animaux de réforme et/ou des animaux surnuméraires. Les utilisateurs pourront être formés aux gestes de bases tel que la préhension, la contention de l'animal mais également à l'administration de substances et le prélèvement de sang sur animal vigil ou anesthésié.

Bénéfices attendus

La formation pratique des utilisateurs est indispensable et indissociable du bien être animal. Seule la maitrise des gestes techniques assure que la finalité de ce dernier est été assuré sans remettre en cause le bienêtre de l’animal. L’apprentissage des gestes est réalisé avec un tuteur technique dont la parfaite maitrise du geste et la pédagogie est reconnue par ses pères et la structure du bien-être animal de l'EU. La formation continue au sein de l'EU permet de maintenir une veille des pratiques expérimentales et des évolution éthiques tout en assurant un niveau d’excellence des pratiques et compétences des utilisateurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une préhension et contention qui ne durera pas plus de 5 minutes le temps de réalisé les injections (durée 1 minute). Ils pourront être soumis à des prélèvements sanguins sur animal vigile qui ne dureront pas plus de 2 à 3 minutes. Ils seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 1 à 2 minutes. Chaque animal ne pourra subir qu'un type d'injection ou 1 prélèvement sanguins au cours de chaque session de formation. La fréquence des différentes interventions est définies telle que: I) Apprentissage des différentes techniques de préhension et de contention : Les animaux (souris et/ou rat) seront manipulés autant de fois que nécessaire jusqu’à la parfaite maitrise des gestes sous la forme de courtes séances (10 à 30 minutes en fonction du nombre d’animaux disponible dépendant des autres gestes à acquérir par la suite), 1 à 2 fois par jour maximum. II) Formation aux administrations SC, IP et PO, un maximum de 1 administrations sera réalisé chaque jour pour un maximum de 20 administrations. Lorsque 2 ou 3 de ces voies doivent être maitrisées, elles seront réalisées alternativement. III) Formation aux administrations IV : les administrations seront réalisées dans la veine caudale tous les 3 jours au minimum (typiquement lundi puis jeudi) pour un maximum de 6 administrations par animal. IV) Formation aux administrations IN ou IT : 1 administration suivie de la mise à mort de l’animal. V) Formation aux administrations ID : 2 administrations ID suivie de la mise à mort de l’animal. VI) Formation au micro-prélèvements de sang dans la veine saphène : Le prélèvement sera réalisé sur les pattes postérieures à 24h d’intervalle minimum et pourra être répété 1x par semaine pour un maximum de 6 prélèvements par animal. VII) - Formation au micro-prélèvements de sang dans la caudale : un maximum de 8 prélèvements espacés au minimum de 2h chacun sur une période d’un minimum de 2 jours. VIII) Formation au prélèvement de sang terminal suivi perfusion intracardiaque: 1 prélèvement de sang entraine la mort de l’animal puis la perfusion est réalisée. IX) Formation à la dislocation cervicale : réalisée 1 fois. Les animaux ayant été utilisé pour la formation aux différentes techniques de préhension et de contention seront ensuite utilisés pour la formations aux administrations et/ou prélèvements de sang, perfusion requise et pour la mise à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

La préhension et la contention peuvent provoquer un stress ponctuel pour l'animal. Les administrations et les prélèvements sanguins provoquent un inconfort transitoire et un stress modéré des animaux. Lors de la formation une mauvaise réalisation des gestes par les débutants peut cependant induire des nuisances supplémentaires. Pour les prélèvements de sang, une blessure trop profonde et invasive peut conduire à une infection, une nécrose de la queue ou à une automutilation de l'animal. Lors des administrations orales, une fausse route est possible (étouffement avec reflux induisant une détresse respiratoire aiguë). Les injections intraveineuses peuvent conduire à la formation d’œdème en cas de rupture de la veine caudale. Les injections intrapéritonéales et sous cutanées peuvent entrainer la formation d’œdèmes et/ou un endurcissement de la zone d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la formation pour la formation aux administrations intranasales, intratrachéales, intradermiques, aux prélèvement de sang terminal et à la perfusion intracardiaque ou à la mise à mort par dislocation cervicale

Remplacement

La formation aux gestes techniques en expérimentation animale ne peut être réalisée que sur animal vivant ayant toutes ces capacités à s’échapper, et manifester ou sanctionner tout signe de mal être et d’inconfort. L’utilisation de mannequins et de vidéo servira à expliquer le principe de chaque geste, les attentes et les difficultés afin de rendre la pratique plus sereine et respectueuse des animaux. Ces alternatives ne peuvent cependant pas produire les réactions d’un animal vivant pour l’entraînement aux méthodes d’administration et de prélèvement. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons la souris et/ou le rat, car ce sont les espèces animales concernées par ces procédures. L’apprentissage sera effectué autant que possible sur des animaux de réforme et/ou surnuméraire en provenance de notre élevage et/ou de fournisseurs externes, sous le contrôle permanent et assidu du tuteur. Nous ferons notre maximum pour qu’aucun animal n’ai été élevé dans le seul but de la formation.

Réduction

Les gestes techniques sont réalisés avec comme objectif premier de nuire au minimum au bien-être des animaux et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. Cela n’est rendu possible que pas la parfaite connaissance et maitrise de ces gestes par les expérimentateurs. Afin de garantir la maitrise et l’excellence de nos expérimentateurs, il est indispensable que l’apprenant puissent apprendre et répéter le/les gestes utiles autant de fois que nécessaire jusqu’à ce que sa compétence puisse être reconnue et validée par le tuteur. Le nombre d'animaux/procédure sera estimé par le tuteur, en fonction du niveau des apprenants et du ou des gestes réalisés, sous le contrôle de la SBEA. Plusieurs gestes pourront être réalisés sur le même animal afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour exemple, lorsque 2 ou 3 voies d’administration doivent être maitrisées, elles seront réalisées alternativement chez le même animal suivant la formation à la préhension et à la contention. Ces mêmes animaux peuvent ensuite être utilisés pour la formation au prélèvement de sang et à la perfusion terminale ou à la dislocation cervicale. De fait, notre expérience montre qu’un nombre moyen de 15 animaux/apprenant est réaliste. L’apprentissage sera effectué autant que possible sur des animaux de réforme ou surnuméraire en provenance de notre élevage et/ou de fournisseurs externes. Aucune analyse statistique ne sera réalisée dans le cadre de la formation.

Raffinement

La formation est réalisée avec pour objectif de garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. Lorsque cela sera nécessaire, pour des raisons liées aux gestes réalisés (administration intranasale, intratrachéale, intradermique, ponction dans la veine cave ou intracardiaque et perfusion intracardiaque) ou dans le but d’assurer l’absence de souffrance de l’animal lors des premières applications pratiques (dislocation cervicale chez la souris), les animaux seront anesthésiés. Les animaux sont maintenus en groupe sociaux dans des cages enrichies d’un tunnel de change, de ouate, de bâtonnet à ronger et de tubes en carton. La gêne occasionnée par la manipulation, la contention des animaux et les administrations est ponctuelle, réversible et fera l’objet d’une surveillance de l’animal, en présence du tuteur, pour visualiser tout signe de mal être imprévu qui impliquerait de soustraire l’animal à ses souffrances.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les 2 espèces présentes au sein de notre établissement utilisateur. Leur choix est donc dicté par la nécessité de former les manipulateurs pour la/les espèce(s) concernée(s) pour les études menées dans l’établissement. Souhaitant utiliser des animaux de réforme ou des animaux surnuméraires, l’âge des animaux n’est pas défini à l’avance. Sauf absolue nécessité requise par les objectifs scientifiques des futures études à mener par l’utilisateur, les animaux seront adultes (> 6 semaines).

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un test de tolérance au glucose et un test à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, deux isolements de 48 heures et deux échographies sous anesthésie, sous régime enrichi en lipides, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur décrit un stress d'isolement et des lésions cutanées possibles liées au sur-toilettage, et présente ces tests comme "incontournables". Il indique combiner modèles cellulaires et animaux pour étudier une protéine impliquée dans une maladie mitochondriale.

Objectifs

Dans le cadre de ce projet nous nous intéressons à une famille d’enzymes, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, en utilisant des cellules en culture, une sous-famille unique de ces enzymes dont les membres sont très similaires à l’enzyme responsable de la pathologie mitochondriale a été mise en évidence. Cette sous famille de protéines est également impliquée dans l’activité énergétique de la mitochondrie. Dans des modèles in vitro, un mécanisme pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients a été récemment décrit. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique mitochondrial, nous voulons étudier le rôle d’une protéine appartenant à cette sous famille. Pour cela un modèle de souris avec cette protéine désactivée a été généré. Nous voulons ainsi étudier les effets de la suppression de cette protéine en particulier sur les fonctions physiologiques en condition normale et sous régime riche en lipides. Nos objectifs spécifiques sont donc chez 36 souris : D’analyser les effets cardiaques et métaboliques en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De mesurer les variations de la biochimie du sang en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De réaliser une étude tissulaire en condition normale et en condition de régime riche en lipides.

Bénéfices attendus

La mitochondrie est un élément présent dans les cellules et jouant un rôle central dans plusieurs fonctions. Elles produisent l’essentiel de l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Cette activité énergétique mitochondriale est donc cruciale et son altération entraine des maladies rares et sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, la compréhension des mécanismes régulant ces activités énergétiques mitochondriales représente une étape essentielle vers le développement d’approches thérapeutiques contre ces pathologies. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une protéine dans la régulation du métabolisme énergétique mitochondriale. Celle-ci fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille. A long terme, notre projet permettra d'identifier les cibles sur lesquelles agir afin d'améliorer les fonctions mitochondriales. Ainsi, une fois que nous aurons détaillé le mode d’action de cette protéine, nous souhaitons identifier des molécules actives sur celle-ci et utiliser ces molécules pour restaurer les fonctions mitochondriales dans des pathologies.

Procédures

Durant ce protocole, une cohorte de 36 animaux suivra une série de tests qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi en lipides sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un seul test de tolérance au glucose par souris, dans lequel l'animal reçoit une injection intrapéritonéale de glucose suivi de 5 prélèvements d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un seul test de sensibilité à l'insuline par souris sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie. Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contention afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 48h, ce qui peut être un stress d'isolement. Ce test sera répété deux fois par souris. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. L'échographie sera réalisée deux fois par souris, elle nécessite que l’animal soit sous anesthésie. La procédure dure environ 20 min par souris. Enfin, des prélèvements sanguins seront effectués en fin d’étude pour analyser des paramètres biochimiques. Ces prélèvements, un par souris, se font en quelques minutes.

Impact sur les animaux

Durant le projet, les animaux subiront un prélèvement sanguin, qui dure quelques minutes. Nous étudierons les mécanismes de régulation du glucose et la sensibilité à l'insuline. Dans ce protocole, les animaux recevront une injection d'insuline et de glucose, et subiront des prélèvements de gouttes de sang à intervalle réguliers sur une période de 3 heures, afin de suivre leur glycémie. Pour connaitre leur métabolisme énergétique, ils seront isolés pour une période de 48h. Ce test sera répété deux fois par souris. Cet isolement permet de connaitre la valeur de chaque individu et est indispensable pour pouvoir conclure sur ce paramètre. Les deux échographies se déroulent quant à elles sous anesthésie à l'isoflurane pendant toute la durée du test. Les animaux seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée. Enfin, le régime enrichi en lipides peut entrainer la présence de lésions cutanées dues à un hyper-toilettage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation génétique sur les organes.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et d'animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests en conditions de régime riche en lipides et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et moléculaires sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro dans le domaine physiopathologique. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire incluant mâles et femelles porteurs des génotypes KO et wild-type. de plus, les groupes contrôles et expérimentaux ont un fond génétique identique. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, nous avons opter pour une approche intégrative où les animaux sont utilisés pour différents tests et analyses. Tous les types de tissus que nous souhaitons étudiés seront prélevés sur chacun des animaux utilisés. Pris dans son ensemble, le design de notre projet permet d'optimiser au maximum la quantité d’animaux nécessaire à sa réalisation.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Ainsi, durant le prélèvement sanguin, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance accrue et quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux sera mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure, si ces derniers sont atteints nous procéderons à l'arrêt de l'expérience.

Choix des espèces

Le modèle expérimental utilisé dans ce projet et le modèle murin, largement utilisé dans le contexte de modifications génétiques. La souris est un modèle établit et solide concernant l’étude des pathologies mitochondriales. En effet, ce modèle permet d'exprimer fortement les syndromes mitochondriaux incluant les atteintes de différents systèmes, l’intolérance à l’effort et les déficits neurologiques. Les animaux seront utilisés à 8 semaines, soit le début de l’âge adulte.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie orale des parasites issus de produits de la pêche, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie, avant d'être tuées pour examiner leurs organes. Le porteur écrit que ces parasites sont inoculés pour la première fois à des souris et que "la prédiction des effets indésirables est impossible", avec un risque de paralysie et de déshydratation entraînant une mise à mort anticipée. Il présente le recours au rongeur comme "indispensable" pour évaluer le potentiel zoonotique de ces parasites.

Objectifs

Le présent projet vise à acquérir des données sur les parasites dans les produits de la pêche potentiellement zoonotiques, et leur pouvoir pathogène, en développant des outils d’expérimentation animale pour une meilleure définition des risques zoonotiques liés à leur présence.

Bénéfices attendus

Les données acquises permettront à moyen ou long terme une meilleure évaluation et une maîtrise accrue du risque lié aux parasites présents dans les produits de la pêche. A ce jour peu connu et peu décrit dans la littérature, le caractère zoonotique de ces parasites doit être étudié. Le projet lui-même est tourné vers le pouvoir pathogène et infectieux des parasites des produits de la pêche sur mammifère terrestre.

Procédures

Chaque souris sera attrapée légèrement à l’arrière de la tête, puis l’embout de la pipette sera introduit dans la gueule et les 20 µL seront donnés à boire à la souris qui les absorbera par déglution naturelle (1 seule intervention de moins d'1 minute). Prélèvement de sang chaque semaine sur chaque souris après anesthésie par inhalation d’isoflurane (4 interventions d'1 minute chacune).

Impact sur les animaux

C’est la première fois que ces parasites seront inoculés à des souris. La prediction des effets indésirables est impossible. Les animaux seront contrôlés chaque jour pour arrêter l'expérience si nécessaire. Les points limites observés dans le modèle souris OF1 infectées par Trichinella spp. seront observés. Chaque souris sera observée le matin à l’arrivée des expérimentateurs et des zootechniciens et en fin de journée avant de leur départ. Au moindre signe neurologique (début de paralysie notamment) ou de déshydratation (dû à une potentielle diarrhée), l'animal sera mis à mort.

Devenir

Les souris seront mises à mort et des prélèvements d’organe seront réalisés afin d’étudier les éventuelles lésions ou réactions de l’hôte provoquées par la présence des parasites

Remplacement

Le projet lui-même est tourné vers le potentiel zoonotique et le pouvoir pathogène et infectieux des parasites des produits de la pêche sur mammifère terrestre. Le recours au modèle rongeurs est donc indispensable.

Réduction

3 lots de souris seront constitués (1 pour chaque parasite étudié (2 espèces de parasites) + 1 groupe contrôle). Nous souhaitons utiliser : 10 souris par lot.

Raffinement

Chaque groupe d’animaux sera hébergé en cages séparées (10 souris/ cage) dans leurs conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balle, morceau de bois pour lapin ; carré de coton, maison en plastique pour les souris, roues). Un suivi quotidien des souris sera réalisé : poids, aspect de selles, comportement, quantité d’eau bue. D’autre part, des prélèvements journaliers des selles seront pratiqués afin d’observer la présence ou l’absence des parasites. Les expériences se poursuivront jusqu’au trentième jour d’infection. Si les points limites sont atteints, les souris seront mises à mort immédiatement.

Choix des espèces

Les souris sont sensibles à l’infection par de nombreux parasites. La lignée OF1 a été choisi car les souris ne sont pas consanguines et sont plus représentatives de la diversité des hôtes. D’autre part, il s’agit de la lignée de souris utilisée pour les infections du parasites zoonotiques transmis par les aliments, Trichinella spp., modèle d’étude parfaitement maitrisé au laboratoire. Adultes de 5 semaines, utilisé dans le modèle d’infection par Trichinella spp.

3240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs, elles reçoivent des agents d'imagerie et sont soumises à des séances d'imagerie sous anesthésie, jusqu'à huit par animal sur sept jours, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la croissance tumorale peut gêner les mouvements et provoquer une cachexie, et que le suivi s'arrête à un volume de tumeur défini comme point limite. Il affirme que l'imagerie divise par deux le nombre d'animaux et qu'aucun test in vitro ne prédit la biodistribution, pour sélectionner des produits de diagnostic et de traitement du cancer.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer les propriétés pharmacocinétiques (adsorption, distribution, métabolisme et excrétion) d'agents d'imagerie diagnostique et thérapeutique dans le domaine de l'oncologie préclinique. Le développement de ces nouveaux agents est nécessaire pour faire progresser le diagnostic et le traitement du cancer. Dans un premier temps, les composés seront évalués sur des cellules (in vitro) pour connaître leurs propriétés de base. Cependant, il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, et certainement pas sa pharmacocinétique, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent. Par conséquent, pour s'assurer que les produits nouvellement développés présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables, ils seront d'abord testés in vivo sur de petits rongeurs.

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer le diagnostique en étant plus précoce mais aussi plus spécifique, afin d’adapter au mieux le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables. Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de sélectionner les produits d'imagerie diagnostique et thérapeutique les plus prometteurs sur la base de leurs propriétés pharmacologiques chez les petits rongeurs. Ceux-ci seront ensuite sélectionnés pour un développement plus approfondi, ce qui dépasse le cadre de ce projet. Les autres candidats, moins prometteurs, seront écartés et ne seront pas utilisés dans de futures études. En outre, les produits prometteurs (basés sur des données obtenues précédemment) pourront être testés dans différents modèles de tumeurs afin de déterminer leurs propriétés pharmacocinétiques dans ces modèles précliniques. Cela nous permettra de choisir le modèle de souris le plus optimal pour des études ultérieures d'efficacité ou de thérapie et d’utiliser le moins de souris possible dans ces études.

Procédures

- Observation des souris (poids, santé générale) : toutes les souris, sur des animaux vigiles, deux fois par semaine. Durée : quelques secondes par souris - Injection d'un agent d’imagerie seul ou avec compétiteur : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Imagerie : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, au maximum huit points d'imagerie sur une période de sept jours après l'injection de l'agent d’imagerie. Selon l'agent d'imagerie utilisé, différentes techniques peuvent être employées : Tomographie par émission de positons (TEP), imagerie par résonance magnétique (IRM), imagerie optique ou une combinaison de différentes techniques, telles que par exemple TEP/IRM, TEP/tomodensitométrie (CT) ou Tomographie par émission monophotonique (SPECT)/CT. Durée : maximum 60 minutes d’anesthésie - Prélèvement de sang : sur animaux anesthésiés, au maximum 2 fois. 10 minutes maximum d’anesthésie - Euthanasie et prélèvement des différents organes : toutes les souris, les souris seront profondément anesthésiées avant que la procédure n'ait lieu, dernière expérience.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait avoir des effets négatifs sur les animaux, comme une gêne des mouvements de l’animal ou des pertes de poids (cachexie). L'évolution de la taille de la tumeur sera donc suivie de près et l'étude sera terminée lorsque les tumeurs auront atteint la taille mentionnée dans les points limites. L’état général de l’animal ainsi que son poids seront aussi suivis et un complément alimentaire sous forme de gel pourrait être fournis pour limiter les impacts. La majorité des procédures (injection [intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale], prélèvements de sang et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant la douleur et l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Peu ou pas d'effets indésirables dus à l'injection du traceur sont attendus (les doses de traceurs sont très faibles).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été, si possible,au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou de tissus sont impliqués. En cas d’observation d’effet secondaire lié à l’injection intraveineuse du traceur, l’étude sera stoppée. La biodistribution réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les nouveaux agents seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo. Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide de calculs statistiques. En comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant. . L'imagerie permet une diminution par environ 2 du nombre d’animaux en comparaison d'une étude n'utilisant pas l'imagerie.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection, prélèvements et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. . Les expériences sont menées, dans une très large majorité sur des animaux pour lesquels le volume de la tumeur n’excède pas 1000-1200 mm3 (plus rarement, il est toutefois possible d’inclure des animaux dont le volume de la tumeur est supérieur à 1000-1200 mm3, mais sans dépassement de point limite). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les animaux seront hébergés par 5 ou 10 en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront donnés ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Au cours de ce projet, nous utiliserons des souris adultes (âge minimum de 8 semaines au début de l'expérience) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles. Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont l’une des seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. D’autre part, de nombreux modèles de cancers humains sont en place et très bien caractérisés chez la souris par l’établissement producteur permettant d’éviter une mise en place de modèle qui nécessiterait beaucoup plus d’animaux.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses de cellules qui induisent des tumeurs pulmonaires, puis des chimiothérapies, avant d'être tuées à J13 ou J17 pour prélever leurs poumons. Le porteur indique que l'injection provoque un stress lié à la contention et une douleur de faible intensité, et affirme s'appuyer sur plus de dix ans d'expérience du modèle. Il conclut que le recrutement des globules blancs au site tumoral ne peut s'appréhender in vitro et doit être confirmé dans un "organisme entier".

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues d’autres globules blancs appelés lymphocytes, isolés de souris montrent que NLRP3 est présent dans ces cellules. En l’absence de NLRP3 ces globules blancs ont une activité anti-tumorale marquée contre différents types de tumeurs. L’absence de NLRP3 dans ces globules blancs semble impacter le recrutement de ces cellules au site tumoral. Grâce à des cellules isolées des tumeurs de souris déficientes pour NLRP3 nous avons pu observer une différence dans l’expression de certains récepteurs membranaires suspecter d’être impliqué dans le recrutement des globules blancs déficients pour NLRP3. Le récepteur appelé CXCR3 interagit avec 3 molécules ayant des effets différents. Différentes lignées tumorales sont capables de les produire. Nous avons validé in vitro la différence de recrutement. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui valider ces observations in vivo. En effet, la complexité de la réponse immunitaire anti-tumorale est telle que les résultats obtenus in vitro ne sont pas suffisants pour affirmer que les mécanismes de recrutement des globules blancs identifiés in vitro sont transposables à un organisme entier et qu’ils pourraient servir de cible thérapeutique. Pour confirmer nos hypothèses in vivo, nous utiliserons des souris contrôles ou déficientes pour NLRP3 comme donneurs de globules blancs. Ces globules blancs seront injectés à des souris ayant de tumeurs au niveau pulmonaire. Ainsi, nous pourrons comparer le recrutement des globules blancs contrôles ou déficients pour NLRP3 dans des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - apporter des connaissances nouvelles concernant NLRP3. - évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie

Procédures

Les injections de cellules seront réalisées en iv sur souris vigiles (2 par souris, chaque injection dure quelques secondes). Les traitements par chimiothérapies seront réalisés en ip sur souris vigiles (4 par souris, chaque injection dure quelques secondes). La mise à mort sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites dans les poumons suite à une injection intra veineuse dans la veine caudale. Cet acte peut engendrer du stress chez l’animal car il doit être maintenu dans un système de contention. L’injection induit une douleur de faible intensité au site de l’injection. Les foyers tumoraux au niveau des poumons permettent d’obtenir des résultats plus clairs et de meilleure qualité. Les animaux seront mis à mort à J13 ou J17 post-injection des cellules tumorales. A ce stade, il y a entre 100 et 200 foyers tumoraux sur les poumons (d’environ 1mm de diamètre) et cela n’impacte pas la vie des animaux (nous avons plus de 10 ans d’expérience sur ces modèles).

Devenir

Les 260 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les poumons

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et des phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires.

Réduction

Dans un souci de réduction et étant donné que nous voulons confirmer des résultats obtenus in vitro, les expériences ne seront réalisées que 2 fois avec 5 souris par groupes et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience sera accompagnée d’une analyse complète de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences (1 lobe pour l’analyse de l’infiltrat et 1 lobe pour les marquages). Enfin, un « go-no go » est appliqué à la fin de chaque phase du projet. En d’autre terme si les résultats de la phase n ne confirment pas l’hypothèse, la phase n+1 ne sera pas réalisée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.