Rongeurs

165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur provoque chez elles un état de mal épileptique et des crises, avec deux chirurgies dont une pose d'implants d'une heure et demie, avant prélèvement du cerveau. Il teste une thérapie génique visant des récepteurs de l'hippocampe, en vue de nouvelles cibles présentées comme lointaines. Il affirme que l'étude est impossible in vitro et in silico, faute de méthode alternative.

Objectifs

L'objectif principal de ce protocole et d'utiliser un modèle murin d'épilepsie afin de tester de nouvelles approches de thérapie génique par injection de vecteurs viraux exprimant des micro-RNA (acide ribonucleique). Des données récentes de la littérature indiquent en effet un rôle des récepteurs kaïnate de l'hippocampe dans l'épilepsie temporale. En particulier il a été démontré que l'inhibition des récepteurs kaïnate permettait de réduire significativement l'épilepsie temporale. Ce protocole vise à tester l’effet de l’inhibition de l’expression des récepteurs kaïnates sur le développement des crises d’épilepsie.

Bénéfices attendus

Le développement d’un protocole d'étude de l'épilepsie nous permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques de cette pathologie et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Induction du status epilepticus et des crises d’épilepsie (impossible de quantifier le nombre en amont). Opérations chirurgicales : tous les animaux sont soumis à deux procédures chirurgicale. La première chirurgie dure environ 20 mins. Au cours de la deuxième procédure des implants sont positionnés. Cette deuxième chirurgie dure environ 1h30. Prélèvements de tissus : tous les animaux sont soumis au prélèvement du cerveau après perfusion intracardiaque à la fin de l'expérimentation.

Impact sur les animaux

Les sources éventuelles de douleurs ou souffrance dans notre procédure : la chirurgie, les crises d’épilepsie ainsi que l'isolement des animaux en cage individuelle.

Devenir

Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.

Remplacement

Nous étudierons l'effet de traitements innovants sur l'épilepsie chez des souris libres de leur mouvement afin de quantifier précisément l'occurrence des crises d'épilepsie et leur réduction après traitement. Par conséquent, il sera impossible de mener cette étude in vitro. Enfin, compte tenu de l’état actuel des connaissances, les questions que nous abordons ne peuvent être traitées in silico. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 165 animaux pour la réalisation de ce protocole.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude de l'épilepsie. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.

Une partie des souris est génétiquement modifiée pour que les neurones de la perception de la douleur puissent être supprimés, et d'autres subissent cette suppression par un traitement dès l'âge de trois ou quatre semaines. 1 808 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des pattes, de la moelle épinière et des ganglions rachidiens. Elles développent une arthrite ou une forme de sclérose en plaques provoquée par l'équipe, sans que le résumé décrive comment, et reçoivent jusqu'à 21 injections quotidiennes de TAFA4. La sclérose induite paralyse leurs membres arrière. Le porteur écrit qu'"aucun analgésique ne peut être utilisé" sans compromettre ses résultats, et promet dans le même texte un "soin particulier" pour éviter la souffrance.

Objectifs

De nombreuses études suggèrent que les neurones impliqués dans la perception de la douleur jouent un rôle important dans le développement des maladies inflammatoires. Notre projet a pour objectif de déterminer le rôle de ces neurones sur l’évolution de deux maladies inflammatoires : la polyarthrite rhumatoïde, causant une inflammation des articulations et la sclérose en plaque, causant une inflammation de la moelle épinière. Un objectif secondaire de ce projet sera également d’étudier le potentiel thérapeutique d’une molécule aux propriétés anti-inflammatoires.

Bénéfices attendus

A ce jour, peu d’études décrivent comment les neurones impliqués dans la perception de la douleur influencent l’apparition et l’évolution des maladies inflammatoires. Notre projet permettra donc à la fois de mieux comprendre comment ces neurones influencent ces maladies inflammatoires et permettra également d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques dans ces maladies chroniques, très invalidantes et nécessitantes de nouvelles thérapies.

Procédures

Outre l’induction de l’arthrite et du modèle de sclérose en plaque qui sont l’objet de notre étude, les animaux vont subir des injections quotidiennes de traitement. La durée de l'intervention (contention + injection intra péritonéale) est de moins d'environ 45 secondes par animal. Les injections de TAFA4 pourront durer jusqu'à 21 jours (une injection par jour soit 21 injections).

Impact sur les animaux

Nos expériences sont susceptibles de déclencher des douleurs chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d’explorer l’effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne peut être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Notre modèle de sclérose en plaque induit une paralysie des membres inférieurs entrainant une difficulté à accéder aux croquettes. Une nourriture gélifiée sera ajoutée systématiquement lors pour prévenir la dénutrition des souris.

Devenir

mise à mort des animaux à la fin des procédure. En effet, pour cette étude nous avons besoin de prélèver différents organes (pattes, moelle épinière, ganglions rachidiens) pour analyser leur composition immunitaire, le score histologique etc.. afin de comprendre les mécanismes de ces pathologies. Les prélèvements nécessitent une euthansie de l'animal.

Remplacement

Nous proposons que les neurones responsables du ressenti de la douleur joue un rôle dans le développement des maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde et sclérose en plaque. Seuls les modèles animaux mimant la complexité du système nerveux périphérique ainsi que de la réponse inflammatoire permettront de vérifier cette hypothèse. Ces interactions ne peuvent à ce jour pas être modélisées ni in vitro ni in silico. Cependant, pour la recherche du mécanisme de l’interaction neurone/cellule immunitaire nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques de remplacement.

Réduction

Le plan de nos expériences sera construit de sorte à limiter le nombre de souris. Le modèle d’arthrite a été choisi et optimisé afin d’obtenir une incidence proche de 100% et une variabilité minimale, permettant ainsi de réduire au minimum le nombre de souris nécessaire. Le modèle de sclérose en plaque est quant à lui le seul modèle murin mimant la pathologie humaine. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé nous avons modélisé les tests statistiques en amont de nos expériences pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour répondre à chacune de nos hypothèses de travail.

Raffinement

Stratégie de réduction du stress : Pour réduire l’angoisse des animaux, un temps d’acclimatation d’au moins une semaine sera respecté avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons de souris en dôme de cellulose et fournies pour l'enrichissement environnemental. Les souris sont nourries et boivent ad libitum, et sont libres de leur déplacement. Stratégie de réduction du la souffrance : Une surveillance quotidienne est réalisée par des spécialistes animaliers permettant de subvenir aux besoins nécessaires au bien-être des animaux. Un soin particulier sera apporté pour éviter la souffrance des animaux par la surveillance de signes extérieurs de souffrance. L’atteinte d’un point limite entrainera la décision d’euthanasie de l’animal concerné. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage des animaux souffrant de sclérose en plaque pour assurer une alimentation suffisante.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle idéal pour notre étude dû au haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, l’état des connaissances actuelles, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de reproduction court. En particulier, la génération de souris génétiquement modifiées bien maitrisée dans notre laboratoire dans lesquelles les neurones sujets de notre étude peuvent être déplétés font de la souris un modèle non remplaçable. Des souris d’âge minimum de 6 semaines seront utilisées afin d’avoir un système immunitaire et sensitif mature. Pour les expériences utilisant une déplétion pharmacoloqique de ces neurones, nous utiliserons des souris âgées de 3-4 semaines. En effet, l’injection doit être effectuée le plus précocement possible lors du développement du système nerveux afin d’obtenir une déplétion optimale. La sclérose en plaque et l’arthrite seront ensuite induites à partir de 6 et 8 semaines, respectivement.

6195 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de cellules tumorales déclenchant des métastases, puis des administrations de substances jusqu'à quatre fois par jour, avec perte de poids, hypothermie et difficultés respiratoires déclarées. Le porteur développe ces modèles pour tester des anticancéreux pour "des clients du secteur industriel privé" comme pour la recherche publique. Il affirme que les métastases ne peuvent être reproduites in vitro.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé publique majeur et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les métastases correspondent à un processus de migration des cellules tumorales de la tumeur primaire vers des organes distants. Les métastases sont la principale cause de décès par cancer. Il reste ainsi nécessaire de disposer de modèles complexes et prédictifs pour évaluer la complexité du microenvironnement tumoral. Dans ce projet, des cellules issues de tumeurs seront injectées à des rongeurs selon différentes voies d’administration afin de permettre d’examiner de larges cohortes de tumeurs dont la croissance et la réponse aux médicaments pourront être évaluées. Les modèles de métastases chez l’animal sont complexes mais récapitulent l’effet de molécules sur le microenvironnement « normal » des métastases et reste prédictif de la réponse aux traitements en recherche. Dès lors l’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire afin de tester de nouvelles substances pharmacologiques. Les procédures décrites dans ce projet correspondent à la création de différents modèles de métastases chez le rongeur (souris ou rat). L’objectif est de mesurer différents critères (taille de la métastases, survie...) afin d’évaluer l'efficacité ou la toxicité de molécules aux propriétés anticancéreuses décrites ou potentielles.

Bénéfices attendus

Le projet consistera à développer des modèles de métastases chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie, qui permettra de tester l'efficacité d'anticancéreux pour des clients du secteur industriel privé ou des laboratoires de recherche publique ou dans un contexte de recherche interne. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration.

Procédures

Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 30 minutes pour les phases de chirurgie ou d’injection. Toujours sous anesthésie, les animaux subiront une injection rapide (

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude : - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs et cela ne permet pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de métastases s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.

Réduction

Des analyses in-vitro pourront être réalisées en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à posteriori la catégorie si nécessaire.

Choix des espèces

Les rongeurs rats et souris demeurent essentiel à étudier les tumeurs in vivo et à comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. En effet, les métastases présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale et une forte prolifération des cellules. Il n’est pas possible de reproduire ces éléments in vitro et nécessite une système complexe comme les modèles animaux. Les deux genres mâle et femelle seront utilisées car le cancer affecte aussi bien les hommes que les femmes. De plus, la nécessité d'utiliser les 2 genres est aussi due au type de cancer (exemple : femelle pour le cancer des ovaires, mâle pour le cancer de la prostate). Tous les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines de développement que ce soit des rats ou des souris. Dans certains cadres, les animaux pourront être utilisés avant sevrage dans des modèles génétiques ou de tumeurs pédiatriques.

580 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une résection étendue de l'intestin sous anesthésie, puis des injections et des gavages de matières fécales, avec pour conséquences déclarées une perte de poids, une diarrhée pouvant être sévère et des carences. Le porteur cherche des bactéries améliorant le traitement d'une maladie rare de l'intestin. Il affirme mimer "en tous points" la pathologie humaine et reconnaît que son modèle d'organoïdes ne peut être fabriqué qu'à partir d'animaux.

Objectifs

Le syndrome du grêle court (SGC), est une maladie rare qui touche 7 à 10 patients par an par million d’habitants. Il résulte d’une importante réduction de l’intestin qui conduit à un intestin restant de moins de 150-200 cm qui ne peut pas assurer une absorption des aliments pour satisfaire les besoins nutritionnels des patients. Une nutrition par voie veineuse est alors mise en place et peut entraîner de nombreuses complications dont l’une est un dysfonctionnement majeur du foie dont les causes restent à identifier. L’évolution des problèmes de foie est rapide et conduit parfois à une dégradation sévère de ses fonctions dont le seul traitement efficace est la double transplantation foie-intestin. Une alternative thérapeutique est un traitement médicamenteux dont le coût actuel est exorbitant et qui présente une grande variabilité de réponses chez les patients. Les patients souffrant du SGC ont une composition particulière de bactéries intestinales appelée lactobiote. Caractériser ce lactobiote nous semble pertinent pour identifier des espèces bactériennes particulières qui aideraient au développement de nouvelles stratégies de traitement des patients. Un modèle de rat mimant au plus près les caractéristiques de la pathologie SGC humaine, sera utilisé. L’objectif du projet est de comprendre comment ce lactobiote en absence ou en présence du traitement médicamenteux actuel participe à l’amélioration de l’état général du rat grêle court et, de rechercher d’autres causes des dysfonctionnements du foie liée l’importante réduction de l’intestin. Les buts ultimes sont : 1°) de développer des stratégies et des approches thérapeutiques pour les patients qui souffrent d’une sévère malabsorption intestinale dans la perspective de réduire la nutrition par voie veineuse, source de nombreuses complications et, 2°) d’identifier d’autres causes des dysfonctionnements du foie lié à l’importante réduction de l’intestin afin d’optimiser la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Les résultats devraient permettre: i) de développer de nouvelles stratégies pour des approches thérapeutiques adaptées pour les programmes de rééducation intestinale des patients souffrant d’une importante réduction d'absorption des aliments dans la perspective de réduire la dépendance à la nutrition par voie veineuse de substances nutritives ; ii) de découvrir d’autres causes et/ou mécanismes conduisant aux dysfonctionnements du foie ( fabrication de la bile, détoxification de produits alimentaires ingérés etc… …).

Procédures

Les animaux auront une chirurgie, d'une durée d'environ 35 min, consistant en une importante réduction de l'intestin sous anesthésie générale et analgésie. Les conséquences de cette réduction intestinale sont la perte de poids et la diarrhée. Les animaux évéillés auront des injections intraperitonéales d'antibiotiques (geste sans anesthésie d'une durée de 10 secondes maximum) et de substances chimiques dans l'abdomen 1 fois tous les 2 jours pendant 2-3 semaines apres la chirurgie et des gavages (geste sans anesthésie d'une durée de 30 secondes maximum) de fèces (1 fois par semaine) pour la transplantation de microbiote fécal (TMF), pendant 3 semaines apres la chirurgie

Impact sur les animaux

Ces chirurgies qui portent sur une importante réduction de l’intestin entrainent une perte de poids, une diarrhée qui peut être sévère conduisant à une malabsorption avec des carences nutritionnelles.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure puis l'estomac, l'intestin, le foie, le cerveau sont préléves pour des analyses .

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux, nous mettrons en place un modèle simplifié de l’intestin dans un tube à essai, (organoïdes) qui sera produit à partir de cryptes (contenant les cellules souches) des fragments intestinaux des différents groupes d’animaux utilisés. Ce modele de l'intestin simplifié ne peut cependant etre créer qu'en utilsant des animaux. Une partie de ces organoïdes sera congelée, conservée pour être utilisée dans d'autres études. A terme ce modèle simplifié de l'intestin en tubes à essai, pourra etre utilisé en lieu et place des animaux..

Réduction

Nous limitons le nombre par groupe au nombre nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement fiables. Cependant, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables ne permettant pas de tirer de conclusions des données. Ce nombre de rats par groupe a été calculé pour pouvoir mettre en évidence une récupération. En outre, les animaux témoins dans les différents groupes pourront être utilisés pour les analyses de plusieurs groupes d’expérience, permettant ainsi une réduction substantielle du nombre d’animaux.

Raffinement

L'ensemble des procédures de ce projet se fera dans le respect du bien-être animal. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur, conforme à celle réalisée chez les patients opérés. Nous avons inclus dans toutes les procédures des grilles de suivi : la pesée journalière pour le suivi du poids, la mesure de la prise alimentaire avant et après l’opération, une grille d'évaluation de la douleur avec des points limites précis et adaptés. Après les opérations chirurgicales, les animaux sont placés dans des cages séparées pour suivre leur prise alimentaire individuelle et la reprise du transit intestinal indispensables à leur surveillance individuelle. Les cages sont alors enrichies avec des tubes en polycarbonate. Les animaux seront donc suivis sur le plan hygiénique tous les jours par un personnel expérimenté afin de respecter le bien-être animal. Afin de limiter leur isolement, ils seront transférés ensuite dans des cages séparées par une grille et enrichies avec des tubes en polycarbonate.

Choix des espèces

Nous utiliserons le/la rat.e adulte car il/elle dispose d'un microbiote intestinal plus diversifié et proche de celui de l’homme. En outre, nous avons développé et caractérisé un modèle de résection intestinale étendue (rat syndrome de grêle court) qui mime « en tous points » la pathologie humaine du syndrome de grêle court.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent neuf gavages, dont cinq en deux heures pour vider leur microbiote, un geste que le porteur qualifie lui-même de stress sévère, puis une coupe de la queue et un prélèvement de sang avant mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur étudie le lien entre microbiote intestinal et attrait pour les régimes gras et sucrés, un enjeu qu'il présente comme majeur. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces relations entre intestin, cerveau et comportement.

Objectifs

L’augmentation de la consommation alimentaire liée au plaisir à manger est un facteur clé dans l’augmentation de la prévalence du surpoids et de l’obésité. La compréhension des dérégulations de ce système du plaisir à manger est un enjeu scientifique et médical majeur. Parmi les nouveaux acteurs de la régulation du comportement alimentaire, le microbiote intestinal est de plus en plus étudié . Des données préliminaires pointent son rôle potentiel dans la régulation du comportement du plaisir à manger dans le cadre d’alternance entre des régimes normaux et régimes gras/sucrés. Ce type de comportement est largement répandu dans la population en général et dans les stratégies nutritionnelles pour la perte de poids, qui sont généralement peu efficaces en termes de perte de poids sur le long terme. Ce travail pourra permetre de mettre en évidence le rôle de certaines bactéries en particulier et leurs cibles au niveau de certaines régions du cerveau impliquées dans la régulation de la prise de nourriture. Des modifications du comportement alimentaire et notamment du plaisir alimentaire qui entraine une augmentation de la prise alimentaire ont été mises en évidence chez des souris lorsqu'elles sont exposées plusieurs fois (effet YOYO) à un régime gras/sucré. En parallèle des modifications du microbiote intestinal et une prise poids plus importante ont été observées chez ces souris YOYO en comparaison avec des souris maintenues en permanence sous un régime gras/sucré. Ceci mettant en évidence l’aspect détrimentaire de l’alternance des régimes alimentaires. L’objectif de ce projet est de mettre en évidence un éventuel lien de cause à effet entre les modifications du microbiote intestinal et le comportement alimentaire. Pour cela, le microbiote caecal de souris YOYO (ayant été exposées plusieurs fois au régime gras sucré) ou pas sera transféré à des souris receveuses naives n’ayant jamais consommé de régime gras/sucré. L'objectif de ce travail est d’une part d'analyser le comportement des souris receveuses et d'autre part de mettre en évidence les aires cérébrales activées par les microbiotes YOYO. Pour cela, des analyses de biologie moléculaire ou des immunohistochimies dirigées contre des gènes impliqués dans le comportement alimentaire et des protéines marqueurs de la neuroinflammation seront réalisées sur les cerveaux des souris receveuses.

Bénéfices attendus

L’augmentation de la consommation alimentaire liée au plaisir à manger est un facteur clé dans l’augmentation de la prévalence du surpoids et de l’obésité. La compréhension des dérégulations de ce système du plaisir à manger est un enjeu scientifique et médical majeur. Parmi les nouveaux acteurs de la régulation du comportement alimentaire, le microbiote intestinal est de plus en plus étudié. Des données préliminaires pointent son rôle potentiel dans la régulation du comportement du plaisir à manger dans le cadre d’alternance entre des régimes normaux et régimes gras/sucrés. Ce type de comportement est largement répandu dans la population en général mais également dans les stratégies nutritionnelles mise en œuvre pour la perte de poids, qui sont généralement peu efficaces en terme de perte de poids sur le long terme. Ce travail pourra permettre de mettre en évidence le rôle de certaines bactéries en particulier et leurs cibles au niveau du cerveau afin, à long terme, d’envisager des développmenents thérapeutiques utilisant les bacteries indentifiées pour moduler la prise alimentaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention nécessaire lors des 9 gavages (quelques secondes) réalisés lors de la déplétion du microbiote (5 gavages en 2h), le transfert du nouveau microbiote (3 gavages en 48h) et au cours du test de tolérance au glucose (un gavage à la fin des 8 semaines). Pour ce test les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes). Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure. Lors de la déplétion du microbiote, les gavages au polyéthylène glycol (PEG), d’une durée de 10 secondes, constituent un stress sévère compte tenu de leur fréquence (5 gavages en 2h). Lors du transfert de microbiote, les gavages d’une durée de 10 secondes, constituent un stress modéré car ils sont espacés de 24h. Une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'expérimentateur lors du premier prélèvement du test.

Devenir

Les 72 souris seront euthanasiées pour prélever les cerveaux.

Remplacement

Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les relations entre le microbiote intestinal, le système nerveux central et le comportement alimentaire d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur la composition et l’abondance du microbiote intestinal et des données phénotypiques et comportementales obtenues sur les mêmes animaux.

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 24 souris par groupe expérimental et nous avons 3 groupes expérimentaux. Chaque groupe sera divisé en deux sous-groupes de 12 animaux qui seront respectivement dédiés à l’analyse de l’expression de gènes ou au marquage de protéines. D’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que 12 animaux par sous-groupe sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier de nidification et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris respectivement de faire un nid et de se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress dû à l'isolement des animaux , les cages seront en plexiglass transparentes et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles et sonores entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Les animaux seront surveillés chaque jour (surveillance visuelle) au moment de la prise alimentaire (mesurée par pesée de l’aliment). Un score clinique sera établi lors de la surveillance quotidienne. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite majeur. Des points limites spécifiques lors des gavages seront également mis en place.

Choix des espèces

Des souris C57BL6 mâles adultes (agés de 12 semaines au début de la procédure) seront utilisés. Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Des données préliminaires sur ce modèle animal sont de plus disponibles notamment sur les souris donneuses dont sont issus les microbiotes qui seront transférés. Il est donc indispensable d’utiliser des animaux de la même espèce, du même âge et du même sexe que les souris donneuses de microbiote. Nous avons choisi de travailler sur des animaux de 12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé.

740 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent plusieurs modèles de douleur provoquée, incision de la patte, ligature du nerf sciatique, douleur cancéreuse et pose d'une pompe, avec des atteintes déclarées allant de la paralysie à une perte de poids de plus de 15 %. Le porteur teste des nanoparticules censées prolonger l'action d'analgésiques naturels, une validation renvoyée à un stade préclinique. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que le recours à l'animal est un "impératif" avant la clinique.

Objectifs

Les opioïdes sont des médicaments importants dans le traitement de la douleur chez l'être humain. Les agents comme la morphine sont les plus utilisés en clinique humaine. Malheureusement, cette catégorie de produits est également associée à des effets indésirables, que l’on ne peut pas éviter si on doit traiter la douleur. L'une des pistes pour éviter ces effets indésirables est d'utiliser des opioïdes existant naturellement dans le corps humain, tels que les enképhalines. La Leu-enképhaline est un candidat intéressant, mais sa durée d'action est très courte, rendant impossible son utilisation en simple injection. Un moyen potentiel pour en conserver les propriétés tout en allongeant sa durée d'action est de pouvoir la diriger directement dans les lieux de la douleur. Ceci a été réalisé dans un laboratoire qui a pu, dans une précédente expérience de synthétiser des nanoparticules de Leu-enképhaline, ce qui a permet de les orienter directement dans les lieux de la douleur et pourrait permettre de prolonger leur durée d'action jusqu'à obtenir un effet cliniquement utilisable, sans agir sur le système nerveux central donc sans les effets indésirables les plus néfastes des opioïdes. Notre équipe a démontré chez le rat que l’opiorphine (un médicament qui bloque la dégradation des enképhalines) agit également contre la douleur sur plusieurs modèles de douleur reproduisant les différents types de douleur chez l’homme. L’objectif de ce travail sera : 1) Évaluer les propriétés antidouleurs des nanoparticules de leu-enképhaline et de l’opiorphine ou leur combinaison dans différents modèles de douleur. En effet, il existe différents types de douleur (mécanique, inflammatoire, neuropathique, cancéreuse) qui ne présentent pas les mêmes caractéristiques et qui réagissent spécifiquement aux différentes familles de médicaments contre la douleur. 2) Réaliser des études à l’échelon cellulaire pour comprendre le mécanisme d’action impliqué dans leur efficacité contre la douleur. La compréhension de ces mécanismes pourrait permettre de mieux anticiper ses modalités d’utilisation chez l’homme et d’appréhender d’éventuels effets indésirables. 3)Déterminer la voie d’administration la plus pertinente. 4) Évaluer les effets indésirables potentiels de ces molécules.

Bénéfices attendus

Le projet s’inscrit donc dans la recherche de nouvelles formes thérapeutiques. En effet, le développement de stratégies ciblées dans le domaine de la douleur est devenu une option incontournable pour faire avancer la recherche médicale et améliorer les traitements des patients. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité antinociceptive de ces nanoparticules dans différents modèles expérimentaux de la douleur. Le résultat attendu sera donc la validation in vivo de l’efficacité de ces nanoparticules dans le traitement de la douleur.

Procédures

5 interventions: Une incision plantaire qui dure 5 minutes. Une ligature du nerf sciatique (L5-L6) qui dure 30 minutes par rat .Une douleur carcinologique qui dure 30 minutes par rat. La pose d'une pompe osmotique qui dure 1 heure par rat. Douleur inflammatoire à la carragénine qui dure 5 minutes.

Impact sur les animaux

Désunion de la cicatrice, hémorragie ou infection du site opératoire suite à l’implantation des pompes. Perte de poids supérieure à 15 %. Paralysie. Apparition d’une tumeur extériorisée à la peau. Agitation excessive. Position anormale (dos vouté, couché sur le Côté). Vocalisation ou réduction de la mobilité.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les tissus qui seront analysé par la suite  

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer l’expérimentation animale dans ce type d’étude. Il n’y a pas de méthodes alternatives possibles. Le recours à l’animal est donc nécessaire et constitue un impératif avant toutes entrée en phase clinique. Les analyses in vitro ou in silico ne suffisent pas en ce qui concerne l’étude de la douleur. Le modèle d’injection intraplantaire de carragénine dans la patte postérieure du rat et le modèle d’incision plantaire de Brennan et le modèle de la ligature sciatique sont des modèles validés pour étudier l'inflammation et la douleur chez les rats L’effet antinociceptif des molécules étudiés doit être validé par une expérimentation animale in vivo qui ne peut être remplacée par d’autre études.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux nécessaires fera intervenir une analyse statistique optimale après un calcul de puissance. Nous avons estimé le nombre d’animaux nécessaire de 740 au maximum.

Raffinement

Nous avons aussi attaché une grande importance au raffinement : les expériences sur la douleur nécessitent que les animaux ne subissent pas un stress supplémentaire, aussi les conditions d’hébergement seront adaptées au mieux et la durée des expériences réduite au strict nécessaire. La surveillance sera rapprochée et des points limites spécifiques sont prévus.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est l’espèce de référence pour l’étude de la douleur et la plupart des études l’utilisent car il est calme, facile à manipuler et s’acclimate progressivement à l’expérimentateur. Ceci permet donc de diminuer le stress induit par la présence de l’examinateur et ne perturbe pas la réponse aux tests comportementaux. Rats âgés de 5 semaines environ, poids 250g, considérés comme adultes.