Rongeurs
Colite : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur l’inflammation du colon induite par administration d’agents chimiques ou de bactéries, par injection d’anticorps, ou par transfert de cellules chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 2000
Une diarrhée parfois hémorragique, des pertes de poids marquées, jusqu'à 22 semaines de colite pour les lignées qui la développent spontanément : 8 000 souris et 2 000 rats, soit 10 000 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. La colite est provoquée par du dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, par du TNBS administré par voie rectale après douze à seize heures de jeûne, par une bactérie, ou chez des souris immunodéficientes par un anticorps ou un transfert de cellules immunitaires, afin de tester des composés anti-inflammatoires. Le porteur retient les rongeurs parce que les études de toxicité de toute nouvelle molécule doivent porter au moins sur une espèce de rongeur. La mise à mort a pour but, selon le résumé, la récupération de "la peau et de grands volumes de sang", sans mention du côlon.
Objectifs
La colite inflammatoire se traduit par une diarrhée chronique consécutive à l’inflammation des parois de l’intestin. Elle peut être provoquée par des bactéries, des parasites, la prise de médicaments, le traitement par radiothérapie, la rectocolite hémorragique ou la maladie de Crohn. La rectocolite hémorragique est caractérisée par une inflammation de la muqueuse et sous-muqueuse du rectum et du colon. La maladie de Crohn entraîne plus de complications, car l’inflammation peut toucher le tube digestif entier, de la bouche jusqu’à l’anus, et créer une obstruction partielle de l’intestin. La colite post-radiothérapie s’observe surtout après irradiation dans la zone abdominale et pelvienne dans le cas de traitement anti-cancéreux. Les parasites et bactéries provoquent des colites spontanément résolutives, mais certains d’entre eux peuvent produire des lésions qui ressemblent à une maladie inflammatoire primitive. Ce projet a pour but de tester in vivo des composés chimiques ou biologiques dont le potentiel anti-inflammatoire aura été déterminé au préalable dans des tests in vitro. Pour cela, il est nécessaire de disposer d’un modèle rongeur où il est possible de créer un état inflammatoire du colon tel qu’on peut l’observer chez l’homme. Actuellement, l’arsenal thérapeutique disponible, notamment les anti-inflammatoires, ne permet pas de soigner correctement ces pathologies lourdes, et de multiples interventions chirurgicales sont nécessaires pour retirer au fur et à mesure les portions lésées de l’intestin. Malgré leur efficacité, les anti-TNF doivent être utilisés avec précaution dans ces pathologies car ils augmentent la survenue de maladies infectieuses. Il existe clairement un besoin thérapeutique pour soigner les colites inflammatoires. Pour réaliser ce projet, un travail important est réalisé au préalable in vitro sur des cellules humaines, ceci dans le but de sélectionner les meilleures molécules à progresser. Cependant, étant donnée la complexité des mécanismes impliqués dans les pathologies inflammatoires du colon, il est difficile de prédire le potentiel thérapeutique d’une molécule uniquement sur la base de résultats in vitro. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les différents aspects de ces maladies, afin de pouvoir évaluer in vivo les meilleurs composés identifiés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur plusieurs maladies inflammatoires digestives : maladie de Crohn, rectocolite hémorragique, colite ulcéreuse... A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour laquelle les options sont pour le moment limitées et imparfaites.
Procédures
Une colite pourra être induite par l’administration de Dextran sulfate sodium (DSS) dans l’eau de boisson des animaux soit pendant 7 jours, combiné ou non à des anticorps (2 injections par semaine, 5 minutes par injection). Ces études dureront au maximum 4 semaines. Il est aussi possible d’administrer le DSS dans l’eau de boisson trois fois 5 jours, avec 5 jours sans DSS entre les cycles. Ces études dureront au maximum 8 semaines. Le Trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) pourra aussi être administré 1 ou 2 fois par voie intra-rectale (sous anesthésie générale, acte d’1h), après 12 à 16h à jeun. Ces études dureront 2 semaines au maximum. Des bactéries Citrobacter Rodentium (administration durant 5 minutes) pourront être administrées. Ces études dureront au maximum 3 semaines. Chez des souris immunodéficientes, le modèle aigu de colite (sur 8 jours) est induit par administration d’un anticorps (injection unique, prenant 5 minutes). En utilisant les mêmes souris immunodéficientes, un modèle chronique de colite est inductible par injection de cellules immunitaires humaines ou murines (injection prenant 5 minutes). Les études dureront au maximum 16 semaines. Des modèles de souris développant spontanément une colite peuvent aussi être utilisés. Ces études dureront au maximum 22 semaines. Les animaux seront pesés deux fois par semaine avant induction, puis une fois par jour à partir de l’induction ou de l’apparition des signes cliniques dans les modèles spontanés (5 minutes). Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie : intranasale et intratrachéale (anesthésie, 1h), intramusculaire et intradermique (anesthésie, avec analgésie, 1h), orale sur animaux vigiles (1 minute), sous cutanée et intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (anesthésié 1 heure). Des prélèvements de sang ou d’urine ou de fécès pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie). Des biopsies de peau pourront éventuellement être réalisées, sous anesthésie générale avec analgésie (1h30). Des endoscopies digestives pourront être réalisées, après de 8h de mise à jeun, sous anesthésie générale (1h environ). Les animaux pourront aussi être mis à jeun avant et pendant l’administration puis la digestion de Dextran Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) afin de mesurer la perméabilité digestive (mise à jeun totale de 8h).
Impact sur les animaux
Dans ces modèles de maladies inflammatoires digestives, de la diarrhée, potentiellement hémorragique, est attendue. Des pertes de poids marquées sont attendues. Les animaux pourront recevoir des traitements par toutes voies et avec toutes les fréquences d’administrations possibles, dans le respect des recommandations vétérinaires. Des prélèvements de sang pourront être effectués dans le respect des recommandations de voies et de volume. Pour induire la colite, les animaux pourront recevoir du TNBS par voie intrarectale, une à deux fois, après mise à jeun 12 à 16H. Des endoscopies pourraient être réalisées, sous anesthésie générale, avec mise à jeun de 12h. Dans le cas où du Dextran FITC serait administré, les animaux seront mis à jeun 12h maximum.
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de la peau et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. Dans tous ces modèles, il a été démontré que 8 à 11 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres, sauf dans les modèles spontanés sur souris transgéniques dans lesquels 10 à 12 animaux seront nécessaires. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévu pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.
Raffinement
La diarrhée et le sang dans les selles seront suivis quotidiennement à partir de l’induction. Dans les modèles spontanés, ils seront suivis deux fois par semaine jusqu’à apparition des signes cliniques puis une fois par jour. Le poids des animaux sera suivi deux fois par semaine jusqu’à l’induction puis une fois par jour. Dans les modèles spontanés, le poids sera suivi deux fois par semaine avant apparition de signes cliniques / pertes de poids puis une fois par jour dès l’induction. Les actes douloureux seront réalisés avec analgésie. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
-L’administration du DSS ou du TNBS peut être réalisée sur des souris ou des rats, et est très bien documentée dans la littérature. -Pour créer un modèle de colite d’origine auto-immune, il faut utiliser des souris immuno-déficientes qui ne possèdent pas de lymphocytes T et B matures. -Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées à minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles d’inflammation digestive d’intérêt sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Conception d’un revêtement capable de pacifier la réponse inflammatoire secondaire à l’implantation de stents aortiques 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
171 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée par chirurgie abdominale un anévrysme de l'aorte, puis on leur implante une endoprothèse à revêtement anti-inflammatoire, avec prélèvements sanguins et imagerie, avant une mise à mort à 7 ou 120 jours pour analyser les tissus. Le porteur conçoit un revêtement censé améliorer l'intégration des stents aortiques chez l'humain, un bénéfice qu'il qualifie de "translationnel majeur". Il affirme qu'aucune simulation fiable d'anévrysme n'existe et juge l'étude animale "indispensable".
Objectifs
Actuellement, les anévrysmes de l'aorte abdominale sont traités par implantation de stents aortiques. Il existe cependant des complications nécessitant de nouvelles opérations liées à un phénomène de rejet de ces stents. En effet, ils ne sont pas complétement intégrés dans le tissu du patient. L’objectif de l’étude est de concevoir un revêtement applicable sur ces stents aortiques pour améliorer leur intégration et donc diminuer le risque de rejet. Cette étude est une étude expérimentale chez l'animal (rat) dont les résultats pourraient permettre de transposer la technique chez l'homme.
Bénéfices attendus
Un anévrysme est une déformation pathologique d'un segment vasculaire. Le risque d'un anévrysme est sa fragilisation et sa rupture, entrainant une hémorragie souvent grave. Chez l’homme, les anévrysmes de l’aorte abdominale (AAA) sont traités avec des endoprothèses (stents aortiques). Ce traitement est toutefois grevé d’un nombre significatif de fuite et de migrations d’endoprothèses au cours du suivi. Ces complications pourraient être liées à un défaut d’intégration de l’endoprothèse L’objectif du projet est de développer une endoprothèse fonctionnalisée avec un revetement permettant sa meilleure intégration dans le tissu aortique. Le bénéfice translationnel est majeur avec une potentielle diminution des complications évolutives du traitement endovasculaire des AAA chez l’homme.
Procédures
Les animaux recevront de l’aspirine tout au long de la procédure pour éviter la formation de caillots (thromboses). Les animaux auront une implantation d’endoprothèses comportant des revetements anti-inflammatoires. Ces endoprothèses seront implantées chez des rats dont l’aorte est saine (pour étudier la biocompatibilité de ces endoprothèses) ou chez des rats chez qui des anévrysmes auront été créés préalablement 3 semaines plus tot pour mimer la pathologie humaine. Ces procédures d’implantation se feront par incision au niveau de l’abdomen sous anesthésie générale et antalgiques et durent 30 minutes. La procédure de création d'anévrysme est également faite par une incision au niveau de l'abdomen sous anesthésie générale et antalgiques et dure 1h. Afin de mesurer l’inflammation, des examens de sang (prélèvement veineux au niveau de la joue) et d’imagerie (echographie abdominale, TEPscanner) seront réalisés sous anesthésie générale. Ces examens d'imagerie seront réalisés dans un autre établissement utilisateur et serviront à mesurer objectivement l'inflammation et donc à comparer les groupes d'étude. Dans l'axe I, les deux examens d'imagerie (echographie et TEPscanner) auront lieu 1 semaine après implantation des endoprothèses. Pour l'axe II, ces examens d'imagerie auront lieu à 1 et 4 semaines après implantation. Concernant les prélévements sanguins, dans l'axe I il aura lieu après euthanasie. Pour l'axe II il auront lieu à 1 semaine après implantation des endoprothèses (sous anesthésie générale) et après l'euthanasie à 3 mois après implantation des endoprothèses.
Impact sur les animaux
Les effets nuisibles attendus sont la présence d'un inconfort ou d'une douleur modérée de courte durée après les procédures chirurgicales. D'autres effets peuvent survenir comme une perte de poids, une deshydratation, une diminution de la mobilité ou encore la survenue de caillots sanguins (thrombose).
Devenir
Dans l'étude I, les animaux sont euthanasiés 7 jours après implantation des endoprothèses pour analyse des tissus (étude microscopique de l'intégration des endoprothèses). Dans l'étude II, les animaux sont euthanasiés 120 jours après implantation des endoprothèses pour analyse des tissus (étude microscopique de l'intégration des endoprothèses).
Remplacement
Il n’est actuellement pas possible de simuler de facon précise l’action d'un revetement anti-inflammatoire dans un tissu aortique. Il n’existe pas non plus de simulation fiable d’anévrysmes de l’aorte abdominale (AAA). L'étude chez l'animale reste indispensable. Toutefois, des expérimentations préliminaires ont permis une séléction précise du revetement anti-inflammatoire à tester chez l'animal et d’établir un protocole robuste.
Réduction
Nous avons volontairement choisi d'utiliser des examens d'imagerie non douloureuses et reproductibles dans le temps (échographie abdominale). Cela permet de suivre sur la durée les mêmes animaux sans les euthanasier. Nous avons également calculé préalablement à l'expérimentation le nombre d'animaux à inclure dans l'étude. Cela permet d'obtenir des résultats statistiques robustes tout en évitant d'inclure trop d'animaux.
Raffinement
-Les conditions d’hébergement seront optimisées au maximum : limitation des transports au strict nécessaire, enrichissement de l'environnement (mise en place de coton pour comportement de nidification, mise à disposition de baton à ronger), respect du rythme jour/nuit -Nous veillerons à réaliser un transport doux en limitant les mouvements brusques pour réaliser les procédures d'imagerie sur le site dédié. -Nous avons prédéfinis la liste d'élements de surveillance du bien-etre des animaux: tous les animaux seront surveillés quotidiennement à l'aide d'une grille standardisée de surveillance. Les animaux seront inspectés (poids, présence d'un inconfort/douleur, état de la cicatrice) et des soins adaptés comprenant des anti-douleurs seront administrés. Si une trop souffrance est constatée (présence de points limites), l'animal sera immédiatement euthanasié. -Nous utiliserons une procédure d’imagerie non invasive : l’echographie abdominale a été préférée à l’angiographie invasive. -Nous aurons recours à l’anesthésie et à l’analgésie pour toutes les procédures. - Concernant le transport entre site d'hébergement et site d'imagerie, une acclimatation avec transport la veille sur le site d'imagerie aura lieu avec manipulations douces.
Choix des espèces
-Le modèle animal (rat) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet (implantation d’endoprothèses dans l’aorte saine et dans des anévrysmes). Les dimensions de l’aorte du rat Wistar permettent son analyse en imagerie (echographie et TEP scanner). Les rats seront utilisés à un stade adulte car la population humaine présentant des anévrysmes de l'aorte abdominale est adulte et agée. Les animaux utilisés seront des males car il existe une nette prédominance masculine dans la population humaine présentant des anévrysmes de l'aorte abdominale.
Offre de prestations de modèles de pharmacologie préclinique chez le rongeur (rat, souris) et le cobaye des désordres de l’audition : pertes auditives et acouphènes
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 12000
Cochons d'Inde : 5120
22 430 souris, rats et cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la quasi-totalité tués à l'issue et 275 réutilisés. On leur inflige des pertes auditives et des acouphènes par traumatisme sonore, par des médicaments ototoxiques comme le cisplatine ou par vieillissement accéléré, avec des administrations à travers le tympan, une chirurgie de l'oreille interne et des tests d'audition sous anesthésie répétés jusqu'à 180 jours. Le porteur décrit une "offre de prestations" commerciale de modèles précliniques pour des clients cherchant des traitements. Il affirme qu'aucune méthode substitutive validée ne mesure l'activité auditive.
Objectifs
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, les déficiences auditives (perte auditive et acouphènes) toucheraient aujourd’hui 15% de la population mondiale. L'impact sociétal est majeur, et peut entraîner chez les malades, isolement social et dépression. Ce projet permet de vérifier l’efficacité de candidats médicaments grâce aux modèles précliniques de perte d’audition et d’acouphènes. Les acouphènes sont des sensations auditives (sifflement, grésillement, bourdonnement) qui ne sont pas causées par un bruit extérieur. Elles apparaissent à la suite de l’exposition à un bruit de forte intensité (ou comme effet secondaire de certains médicaments) et peuvent être permanentes. A ce jour, il n’y a pas de médicament dans le traitement de la perte d’audition. Ceci justifie le besoin important de développer la recherche dans ce domaine. C’est dans ce contexte que s’inscrit notre projet qui consiste à générer chez le rongeur (rat, souris) et le cobaye une perte d’audition et/ou des acouphènes pour vérifier l’efficacité des principes actifs. Les pertes auditives et les acouphènes seront induits chez les animaux via les mêmes mécanismes que ceux retrouvés chez l’homme. Les mécanismes sont les effets secondaires de certains médicaments, les traumatismes sonores (bruit intense pendant une longue durée) et le vieillissement. Nous proposons un panel de modèles afin de tester l’efficacité de nouveaux traitements pour soigner les troubles de l’audition. Les cellules de l’oreille interne permettant de percevoir les sons n’ont pas la capacité de se régénérer et certains phénomènes conduisent à leur destruction ou à d’autres atteintes du système auditif. Les troubles auditifs vont être crées chez l’animal de trois façons différentes : administration de molécules, exposition à un bruit puissant et utilisation de modèles de souris présentant des pertes auditives précoces liées au vieillissement. Sur ces animaux des traitements seront testés pour évaluer les potentiels protecteurs et/ou régénérateurs. En particulier des mesures de l’audition seront réalisées sur des animaux anesthésiés à l’aide de techniques similaires à celles utilisées chez l’Homme. Nous espérons grâce à ce projet permettre la poursuite du développement des traitements ayant démontré une efficacité sur les animaux présentant des troubles auditifs. Toutes les procédures sont réalisées par du personnel formé et compétent et conformément aux recommandations internes.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de permettre la poursuite d’un programme de développement pour les candidats médicaments qui auront démontrés une efficacité dans un des modèles précliniques proposé par notre société. Et donc potentiellement des solutions thérapeutiques innovantes et efficace pour les patients souffrant de perte d’audition ou d’acouphènes.
Procédures
Administration de composés à tester ou de produit de référence : administrations de composés sur animaux vigiles en suivant les bonnes pratiques vétérinaires qui pourront être quotidiennes pendant 90 jours au maximum. Une administration unique par perfusion vigile ou sous anesthésie générale. Jusqu’à 10 administrations de composés par voie transtympanique sous anesthésie générale sur une période de 180 jours maximum. Une chirurgie unique sous anesthésie générale pour l’administration de composé directement dans l’oreille interne. Prélèvements sanguins sur des animaux vigiles ou anesthésiés dans la limite de 7,5% du volume de sang total suivi d’une période de récupération d’une semaine Mesures d’audition : tests d’audition réalisés sous anesthésie générale 3 fois par semaine pendant 180 jours au maximum. Tests comportementaux chez des animaux vigiles pour détecter la présence d’acouphènes 3 fois par semaine pendant 180 jours au maximum.
Impact sur les animaux
Dans nos différents modèles les effets indésirables prévus peuvent être : Stress : l‘isolement des animaux en hébergement individuel pour les animaux implantés avec un cathéter vasculaire pour lequel il y aurait un risque d’arrachement par des congénères. Peur/douleur : l’administration de composés par voie systémique suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires, l’administration de composé à travers le tympan sous anesthésie générale. Douleurs post-opératoires : pour les techniques d’administrations nécessitant un abord chirurgical qui sont réalisées sous anesthésie avec traitement antalgique pré et post opératoire. Maladie : des pertes d’audition et/ou des acouphènes, une toxicité systémique pour les modèles d’exposition au Cisplatine et aux aminoglycosides.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car les tissus et fluides de l’oreille interne sont prélevés afin de réaliser des analyses. Le prélèvement des tissus et fluides de l’oreille interne requiert l’euthanasie des animaux.Les animaux n’ayant pas satisfaits aux critères d’inclusion sont réutilisés dans les études de pharmacocinétique .
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour mesurer l’activité auditive et pour développer des modèles pathologiques de trauma acoustique, d’acouphènes et de vieillissement de l’appareil auditif. Les atteintes des cellules ne peuvent pas être étudiées via la culture cellulaire ou les modèles informatiques car nous ne pouvons pas reproduire la complexité des mécanismes conduisant aux troubles de l’audition. Néanmoins nous réalisons une veille bibliographique active afin de suivre les modèles de remplacement qui sont susceptibles d’être développés à l’avenir.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé, selon des méthodes de biostatistique, en tenant compte de la variabilité des modèles et des méthodes d’induction des troubles auditifs. Ce nombre d’animaux nous permettra d’avoir des résultats fiables sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. La réutilisation d’animaux (pour la formation et le maintien des compétences) s’effectue dans le cadre de nos procédures internes et après approbation par un vétérinaire.
Raffinement
Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Mais aussi la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal.
Choix des espèces
En amont une évaluation est faite avec chaque client sur le choix des modèles les plus pertinents. Le rat est l’espèce couramment utilisée en expérimentation animale et plus particulièrement dans l’étude des acouphènes. Le cobaye est également utilisé dans le cadre de nos études de perte d’audition liées à un trauma acoustique et pour les études de pharmacocinétique. D’une part, cette espèce permet le prélèvement d’un volume de périlymphe plus important pour analyser le passage des principes actifs dans l’oreille interne. D’autre part, la structure de l’oreille du cobaye permet d’administrer plus facilement les produits localement. La souris est aussi utilisée car elle peut être génétiquement modifiée ou mutante, permettant d'accéder à un vieillissement accéléré associé à une perte d'audition. Les animaux utilisés sont des adultes avec une oreille interne complétement formée et fonctionnelle à l’exception d'une procédure qui implique l’utilisation d’animaux âgés de 4 semaines (modèle de prévention dans lequel l’administration du principe actif doit s’effectuer avant l’apparition des signes de dégénérescence de l’appareil auditif).
Identification et caractérisation des nanotubes dans le cerveau de souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
698 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souriceaux nouveau-nés subissent une chirurgie cérébrale et une électroporation qui peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire mortel, ainsi qu'une séparation maternelle pouvant entraîner le cannibalisme par la mère, avant une mise à mort aux jours 7 et 14 pour analyses. Le porteur cherche à observer pour la première fois des nanotubes entre neurones dans le cervelet, une étude qu'il qualifie lui-même de "hautement exploratoire" et à visée qualitative. Il affirme avoir besoin d'un modèle vivant proche de l'humain et retient la souris pour ses outils génétiques.
Objectifs
Le développement du cerveau est un ensemble de processus complexes durant lequel les cellules se divisent, migrent, se différencient, forment des circuits neuronaux et deviennent matures. Le bon déroulement de chacun de ces processus nécessite que les cellules puissent communiquer entre-elles, même à longues distances. Perturber cette communication peut altérer ces différents processus et engendrer des troubles du neurodéveloppement. Il a été montré, in vitro, que les cellules neurales peuvent former des nanotubes (TNTs), des connexions membranaires entre cellules distantes, parmi lesquelles on compte les cellules granulaires du cervelet. Deux types de TNTs ont été définis. Ils peuvent être ouverts à chaque extrémité et permettre ainsi le transfert de matériels cellulaires larges comme les organelles. Ils peuvent également être fermés à une extrémité par une jonction gap et permettre le couplage électrique entre cellules. Notre hypothèse est donc que les TNTs pourraient permettre aux neurones de communiquer entre eux par couplage électrique et/ou par des échanges de matériels cellulaires, notamment par transfert d’organelles, durant la période développementale. Dans ce projet, nous souhaitons identifier et caractériser les TNTs in vivo en prenant comme modèle le cervelet. Une fois que nous aurons confirmé la présence des TNTs et identifié leur localisation, nous nous assurerons que ces TNTs sont fonctionnels. Durant les deux premières semaines post-natales, les cellules granulaires du cervelet prolifèrent intensément. Durant la cytokinèse, dernière phase de la multiplication cellulaire, la membrane cellulaire se rétrécit entre les deux cellules filles, de manière à former transitoirement un pont, appelé pont cytokinétique. La fin de la multiplication cellulaire se traduit normalement par la suppression de ce pont, séparant ainsi totalement les deux cellules filles formées. Toutefois, il arrive que ce pont cytokinétique persiste et, à la manière des TNTs, permette aux deux cellules filles qu’il connecte de communiquer, via des échanges de matériel cellulaire. Nous étudierons donc également la présence de ces ponts cytokinétiques persistants ainsi que la possibilité que les cellules granulaires du cervelet puissent les utiliser pour communiquer entre elles.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet pourraient changer notre conception de la communication entre neurones, qui était jusque-là limitée aux notions relatives aux synapses. Nous mettrons ainsi en lumière un rôle possible des TNTs dans le développement précoce des réseaux neuraux. Ces résultats pourraient aussi améliorer notre compréhension des processus impliqués dans le développement du cervelet. Enfin, mettre en évidence l’existence de TNTs a également le potentiel d'ouvrir à long-terme de nouvelles voies pour le traitement de maladies non seulement neurodéveloppementales mais aussi neurodégénératives, actuellement incurables.
Procédures
Les animaux subiront au plus une seule procédure chirurgicale. Un premier groupe d’animaux nouveau-nés subira une seule intervention chirurgicale d'une durée de 30 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde précédée et suivie d’injections intra-péritonéale répétées sur 72h00. Un deuxième groupe d’animaux nouveau-nés subira une seule intervention chirurgicale d'une durée de 30 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde. Un troisième groupe de souris nouveau-né subira une à trois injections intra-péritonéales (chaque injection durant quelques secondes).
Impact sur les animaux
Procédures 1, 2, 3 : L’électroporation peut induire un arrêt cardio-respiratoire conduisant à la mort de la souris nouveau-née dans les minutes qui suivent la délivrance des pulses électriques. La séparation maternelle de plusieurs heures peut induire un stress pour la mère et les souris nouveau-nées. La chirurgie sur les souris nouveau-nées peut induire du cannibalisme par la mère. Des pertes de poids, des douleurs et réactions inflammatoires peuvent être induites par la chirurgie. Procédures 1 et 4: Les injections intra-péritonéales peuvent induire des sensations désagréables de piqûre et des douleurs abdominales modérées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques ou électrophysiologiques.
Remplacement
Les études mettant en évidence l’existence des TNTs ont été faites sur des cellules en culture. Le but ici est de mettre en évidence leur présence, in vivo, dans le cerveau et de comprendre leur rôle dans le développement du cervelet. Sur le long terme, ce projet est à visée thérapeutique. Nous avons donc besoin d’utiliser un modèle vivant assez proche de l’être humain et utilisable facilement en laboratoire. De plus, nous utiliserons des souris car c’est dans cette espèce que les outils d’ingénierie génétiques sont les mieux développés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques. Cette étude a pour but principal de montrer pour la première fois l’existence de TNTs in vivo, dans le cervelet, durant le développement. Il s’agit d’une étude hautement exploratoire, à visée principalement qualitative. De ce fait, aucun véritable test statistique ne peut être utilisé pour estimer le nombre de souris dont nous avons besoin. Cependant, le nombre de souris estimé est basé sur ces différents facteurs : - Le taux d’échec des électroporations effectuées (dans 20% des cas, l’électroporation est un échec. - Nos expériences préliminaires n’ont permis de mettre en évidence qu’un TNT par souris. Nous basons donc notre estimation du nombre de souris nécessaire sur ces données préliminaires (qui est le pire scénario que nous envisageons), afin de détecter un nombre suffisant de TNTs pour juger de leur importance biologique. Toutefois, l’approche expérimentale que nous allons employer ici devrait nous permettre de mettre en évidence plus qu’un TNT par souris. Si nous réussissons à mettre en évidence plus de TNTs dans une seule souris, nous utiliserons moins de souris que celui estimé. - Pour les souris transgéniques, nous tiendrons compte du nombre d’animaux potentiellement obtenus par croisement. De plus, nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre. Les sections de cerveau provenant des animaux tests seront également utilisés dans nos analyses lorsque cela est possible.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience, l'enrichissement (matériel de nidification et bâton à ronger) est systématiquement appliqué à toutes les cages. L’anesthésie et l’analgésie sera fourni à chaque fois que nécessaire. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. En cas de nécessité, des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour stopper tout signe de mal-être de l’animal. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend la mise à mort lorsque les nuisances sont importantes.
Choix des espèces
Nos questions biologiques nécessitent d’induire des modifications génétiques. De nombreux outils de manipulation génétique sont disponibles chez la souris, ce qui en fait un modèle animal de choix pour notre projet. De plus, l’organisation du cerveau de souris présente des similarités avec le cerveau humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier le développement du cerveau. Des travaux ont notamment démontré que la souris est un modèle d’étude valide pour étudier les défauts de développement du cervelet. Dans ce projet, nous utiliserons des souris WT et des souris transgéniques permettant de : - Cibler les cellules progénitrices granulaires du cervelet et leurs progénitures. - Cibler toutes les cellules d’origine neuronale. - Suivre les neurones grâce à un marquage fluorescent. - Stimuler l’activité des neurones. Le développement postnatal du cervelet se fait entre les jours postnataux 0 à 21. Au jour postnatal 0, la majorité des cellules progénitrices sont en prolifération, le nombre de cellules progénitrices arrêtant de se diviser augmente progressivement jusqu’à être presque totale au jour postnatal 14. Au jour postnatal 21 ces cellules ont toutes fini de migrer vers leur position finale. Pour les expériences d’électroporation nous devons donc cibler les cellules progénitrices le plus tôt possible (entre le jour postnatal 0 et 5). La mise à mort des animaux qui serviront à identifier la présence des nanotubes et à caractériser leurs fonctions se fera au jours postnatal 7, une période où les cellules progénitrices prolifèrent encore intensivement et où on peut également observer les cellules qui effectuent leur migration, mais aussi au jour postnatal 14, lorsque le développement du cervelet est presque terminé. Des animaux adultes seront également utilisés pour générer les animaux entrant dans les différentes procédures.
Réalisation des travaux pratiques de la « Formation spécifique destinée aux personnes appliquant des procédures expérimentales sur rongeurs et lagomorphes »
- Formation professionnelle
Rats : 180
1 800 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour la recherche mais pour des travaux pratiques de formation. Des stagiaires débutants s'exercent sur animal vigile au gavage, aux injections et au prélèvement sanguin, chaque animal subissant jusqu'à deux tentatives par geste, les exercices non maîtrisés étant pratiqués sur cadavres. Le porteur présente ces séances de deux heures comme une obligation réglementaire et emploie des animaux de "surplus d'élevage" destinés à être tués. Il affirme que les réactions de l'animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes substitutives et juge le remplacement "non envisageable".
Objectifs
Conformément à la réglementation, les personnes chargées de réaliser les protocoles scientifiques et d’appliquer les procédures expérimentales sur les animaux doivent suivre, dans l’année suivant leur prise de poste, une formation spécifique. L'organisme de formation spécialisé dans le domaine de l’animal de laboratoire, dispense chaque année environ 3 sessions de cette formation spécifique d’une durée totale de 45h (volume horaire réglementaire), intégrant des cours théoriques (38h), des travaux dirigés (5h) et des travaux pratiques (2h). La séance de travaux pratiques permet aux participants d’acquérir quelques gestes techniques basiques. Le projet consiste donc à réaliser une séance de 2h de travaux pratiques sur animaux, lors de chaque session de formation réglementaire en expérimentation animale destinée aux personnes appliquant les procédures expérimentales sur animaux. Le principe est d’enseigner aux stagiaires, en petits groupes de 6 stagiaires maximum pour 1 encadrant : - Les bonnes pratiques d’approche de l’animal, en maîtrisant toute appréhension du stagiaire et tout stress pour l’animal - Les bons gestes pour la contention, dans le respect de l’animal - Quelques techniques simples d’administration de substances et de prélèvement sanguin
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont le bon niveau de formation des personnes travaillant au quotidien sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.
Procédures
Au cours de la séance de 2h de travaux pratiques, quelques techniques simples d’administration de substances et de prélèvement sanguin peuvent être réalisées, selon le niveau de maîtrise des participants : ces gestes ne seront réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires et validée par l’encadrant. Les gestes qui peuvent alors être appris sont : - le gavage par voie orale (VO), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) d'une durée de 10 minutes maximum - l’injection intra-péritonéale (IP), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) d'une durée de 10 minutes maximum - l’injection sous-cutanée (SC), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) d'une durée de 10 minutes maximum - le prélèvement sanguin (PS) à la veine mandibulaire, dans la limite de 10% du volume sanguin total d'une durée de 10 minutes maximum. Chaque animal pourra faire l’objet au maximum d’une administration (gavage ou injection) et d’un prélèvement sanguin. Ainsi, au maximum, pour les 3 animaux dédiés à un participants, il peut y avoir : - Animal 1 : gavage VO + PS - Animal 2 : injection IP + PS - Animal 3 : injection SC + PS En cas d’échec lors d’une administration ou d’un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l’encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles pour les animaux sont : - le stress lié à une préhension et contention d’un manipulateur non expérimenté - la souffrance pouvant être liée à une administration de produit ou prise de sang incorrectement réalisées La durée de ces effets est au maximum de 2h, durée de la seance de travaux pratiques. Si un animal présente des signes de stress ou souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire, voir points limites)
Devenir
Les animaux euthanasiés sont utilisés pour réaliser les gestes techniques n’ayant pas pu être pratiqués sur animal vigile, lorsque la contention n’est pas suffisament maîtrisée.
Remplacement
Diverses méthodes ont été mises en œuvre au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, les travaux dirigés d’anatomie sont exclusivement réalisés à l’aide de planches anatomiques et d’un puzzle 3D inerte. Les méthodes d’identification par pose de bague auriculaire et emporte-pièce sont enseignées sur des morceaux de carton. Un mannequin ou une peluche sont utilisés pour les démonstrations de contention. Néanmoins, pour l’apprentissage de l’approche de l’animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l’animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente et pour permettre aux participants d’aborder les animaux dans les conditions les plus proches de leur réalité quotidienne. La réglementation et la Commission Nationale de l’Expérimentation Animale imposent d’ailleurs l’utilisation d’animaux vivants pour cette partie pédagogique de l’enseignement dans les formations initiales en expérimentation animales. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour ces travaux pratiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus d’élevage, qu’il est prévu d’euthanasier dans la semaine, issus majoritairement soit de l’élevage de l’établissement d’accueil, soit éventuellement d’un éleveur agréé. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire. Néanmoins, afin de limiter le nombre de gestes appliqués à chaque animal (au maximum : contention, 1 administration et 1 prélèvement sanguin), 3 animaux par participant sont nécessaires. Afin de limiter églement le nombre de participants, nos formations ne sont dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.
Raffinement
En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commençant les travaux pratiques par une approche douce : en présentant simplement, un à un, leur main dans la cage des animaux, les stagiaires prennent tout le temps nécessaire pour maîtriser leur propre appréhension et habituer les animaux à leur présence. Une grande importance est donnée à l’observation des animaux, la détection et la prise en compte de tout signe de stress de l’animal afin de préserver son bien-être. Pour la contention, les différentes méthodes montrées sont parmi les moins stressantes pour l’animal, en utilisant par exemple pour les souris un tube de plexiglas transparent ou les 2 mains en « bol ». Les notions d’entrainement des animaux, de bientraitance, de raffinement des techniques sont enseignées. Pour des raisons éthiques, les gestes techniques (administration et prélèvement sanguin) ne sont réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires, avec validation de l’encadrant. Lorsque la contention n’est pas validée, les gestes sont uniquement appliqués sur cadavres. Le nombre de geste technique appliqué à chaque animal est limité : chaque animal fait l’objet au maximum d’une administration (gavage ou injection) et d’un prélèvement sanguin. En cas d’échec lors d’une administration ou d’un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l’encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum) Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques.
Choix des espèces
La formation réglementaire dispensée comprend un module général (13h) et un module spécifique des rongeurs et lagomorphes (32h). Les animaux utilisés pour cette formation sont donc spécifiquement des rongeurs ou lagomorphes. Les participants travaillant au quotidien sur rongeurs, ce qui correspond à la grande majorité de nos participants puisque les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en recherche, sont orientés vers des travaux pratiques réalisés exclusivement sur rongeurs (en grande majorité des souris), tels que ceux que nous souhaitons organiser à l’établissement d'accueil. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au delà, leur âge n’a pas d’importance pour ce projet.
Évaluation de l’efficacité de nouveaux outils thérapeutiques sur le développement de pathologies inflammatoires ostéoarticulaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections destinées à induire une arthrite psoriasique, une arthrite rhumatoïde ou une spondylarthrite, avec inflammation des orteils et des pattes suivie par scoring pendant plusieurs semaines, des traitements par gavage ou injection et un prélèvement sanguin terminal par ponction cardiaque. Le porteur teste de nouveaux traitements anti-inflammatoires, les pathologies induites étant irréversibles. Il indique n'utiliser les animaux qu'après des tests in vitro et ex vivo.
Objectifs
Les maladies inflammatoires ostéo-articulaires sont parmi les pathologies douloureuses et invalidantes les plus courantes et les plus répandues dans le monde, dont la prévalence devrait augmenter principalement en raison de l'augmentation de l'espérance de vie. Ces pathologies sont le plus souvent difficiles à repérer, mais peuvent avoir des répercussions sur l’état psychologique des personnes affectées par les douleurs chroniques qu’elles engendrent, et à plus long terme sur la vie professionnelle. On estime que 25 % des personnes atteintes d’ostéoarthrite sont incapables d'accomplir leurs activités quotidiennes. De plus en plus de preuves indiquent maintenant que l'inflammation, locale et systémique, est à l'origine de dommages aux articulations et aux os. Le projet décrit dans cette demande consiste au développement de modèles pathologiques chez le petit animal de laboratoire (souris) afin d’évaluer la pharmacocinétique et l’efficacité thérapeutique de cellules médicaments ou de nouvelles molécules (études de PK/PD) dans le domaine des maladies inflammatoires ostéo-articulaires telles que l’arthrite psoriasique, l’arthrite rhumatoïde et la spondylarthrite ankylosantes. L’objectif sera de valider leurs propriétés immunomodulatrices, anti-inflammatoires et anti-fibrotiques afin de les proposer comme nouvelles modalités de thérapies dans le traitement des maladies inflammatoires ostéo-articulaires.
Bénéfices attendus
Faire émerger de nouveaux outils de thérapies dans le traitement des maladies inflammatoires ostéo-articulaires.
Procédures
L’induction du modèle d’arthrite psoriasique nécessite une injection intrapéritonéale de mannan. Cette induction entrainera une inflammation de la peau et des articulations évaluée quotidiennement par scoring pendant 7 jours. L’induction du modèle d’arthrite rhumatoïde nécessite l’injection intradermique d’une émulsion de collagène. Cette induction entrainera une inflammation des orteils et des pattes entières évaluée tous les 3 à 4 jours par scoring pendant 40 à 50 jours. L’induction du modèle de spondylarthrite ankylosante nécessite 3 injections intrapéritonéale de protéoglycane (la première réalisée sur des animaux de 12 semaines, puis 3 et 6 semaines plus tard. Cette induction entrainera une inflammation des orteils et des pattes entières évaluée deux fois par semaine par scoring de l’œdème et de la douleur pendant 20 jours. Les traitements évalués pour lutter contre l’inflammation seront administrés soit par voie orale (gavage), soit par voie sous cutanée au niveau de la nuque, soit par voie intraveineuse (veine caudale), soit par voie intrapéritonéale, soit par voie topique. Des prélèvements sanguins de 50µl seront également effectués une fois par semaine maximum avant et pendant les phases de traitement. Un dernier prélèvement, terminal, sera réalisé en fin de protocole par ponction cardiaque juste avant mise à mort, sans réveil. Chaque procédure d’administration étant pratiquée par du personnel formé, chaque geste ne prendra que quelques secondes. Pour les protocoles d’imagerie (Tomographie moléculaire de fluorescence, Tomodensitométrie et Tomographie par émission de positons) les animaux subissent une injection intraveineuse (animal vigile pour la fluorescence, anesthésié dans les autres cas) avant imagerie sur animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Le psoriasis est une maladie auto-immune entraînant une inflammation chronique de la peau qui, lorsqu'elle s'étend dans les articulations, résulte en arthrite psoriasique. Le modèle induit permet de reproduire des lésions semblables à celles observées chez l'Homme (inflammation et hyper prolifération cutanées avec atteintes articulaires). L'inflammation de la peau pourra se traduire par un épaississement des oreilles et de la desquamation. L'inflammation articulaire pourra entrainer un gonflement des orteils, chevilles ou des articulations.
Devenir
Les pathologies induites dans le cadre de cette étude étant irréversibles, les animaux seront tous mis à mort en fin de procédures expérimentales (prélèvement sanguin trans-thoracique terminal).
Remplacement
L’utilisation des animaux ne se fera qu’en dernier recours après des tests préalables de criblage et d’efficacité in vitro et ex vivo.
Réduction
Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé en mesures répétées, le nombre d'animaux est réduit à 8 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats des études réalisées. L'utilisation de l'imagerie permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés grâce au suivi longitudinal du même animal.
Raffinement
L’enrichissement du milieu d’hébergement sera contrôlé. Une évaluation quotidienne du bien-être animal sera réalisée selon une grille de scores spécifiques, établie selon des paramètres physiologiques (prise de poids, hydratation par exemple) mais également selon des critères décrivant de façon précise l’apparence physique et le comportement général de chaque animal. Ainsi, l’ensemble de ces observations permet d’intervenir au plus tôt dans la prise de décision de la poursuite du protocole pour un animal donné, cela avant même d’atteindre les points limites pré-établis et fixés par la procédure.
Choix des espèces
La souris s’est rapidement imposée au cours du temps comme un modèle fondamental dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation et les pathologies associées, l’essentiel de la littérature est obtenue chez cette espèce pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales, l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~7-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction d’une inflammation menant au développement de maladies ostéo-articulaires chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques. Il s'agit également du stade auquel les animaux sont les moins susceptibles de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale.
Evaluation du potentiel anxiolytique/anxiogénique de candidats-médicaments avec le test du labyrinthe en croix surélevé chez le rat et la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 4500
6 300 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tués à l'issue pour prélever des tissus, l'autre réutilisée dans d'autres études. Pour accentuer l'anxiété avant le test du labyrinthe en croix surélevé, chaque animal peut être isolé jusqu'à quinze jours et privé d'enrichissement, puis reçoit un composé et des prélèvements sanguins. Le porteur teste l'effet anxiolytique ou anxiogène de candidats médicaments, des retombées thérapeutiques renvoyées au long terme et au passage chez l'humain. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit et que le rat et la souris restent "un passage obligatoire".
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer un potentiel effet anxiolytique (diminution de l’anxiété) ou anxiogénique (augmentation de l’anxiété) d’un candidat-médicament chez le rat ou la souris avec le test du labyrinthe en croix surélevé. Les rongeurs ont une tendance naturelle à éviter les environnements lumineux et ouverts et à rechercher la sécurité des endroits exigus et sombres. Le test du labyrinthe en croix surélevé consiste à placer les rongeurs dans un labyrinthe surélevé par rapport au sol d’environ 60 cm et constitué de 4 bras en forme de croix (2 bras fermés avec des parois hautes et opaques et 2 bras ouverts sans parois) pendant 5 minutes. Les rongeurs vont avoir tendance à se réfugier dans les bras fermés (plus sombres et exigus, donc plus sécurisants) et à passer peu de temps dans les bras ouverts, dans lesquels leur curiosité naturelle les pousse à explorer. Le niveau d’anxiété des animaux est évalué par le temps passé et le nombre d’entrées effectuées dans les bras ouverts pendant les 5 minutes du test.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter différentes pathologies telles que les troubles anxieux ou le stress post-traumatique. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat et souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée et d’évaluer ses éventuels effets secondaires sur le stress avant son passage en phase I chez l’humain. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.
Procédures
Au maximum, l’animal pourra être isolé socialement jusqu’à 15 jours avant l’expérience afin d’augmenter son état d’anxiété. Un composé pourra lui être administré une ou plusieurs fois avant le test (~2 minutes par administration). Il pourra subir des prélèvements de sang vigile ou anesthésié selon les recommandations éthiques en vigueur (~2 minutes par prélèvement). Le test de comportement dure au maximum 5 minutes.
Impact sur les animaux
Au maximum, l’animal pourra être isolé socialement jusqu’à 15 jours avant l’expérience afin d’augmenter son état d’anxiété et permettre une meilleure évaluation d’un composé anxiolytique. Dans ce cadre, il pourrait être privé d’enrichissement afin de maintenir un état d’anxiété suffisant pour les tests. L’administration et les prélèvements de sang seront effectués par un personnel entraîné et la douleur associée sera réduite à son minimum et sera l’équivalent d’une piqûre.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont gardés en vie et peuvent être réutilisés dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire. Sinon, les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des prélèvements de tissus (organes, sang, etc…).
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet pratiqué sur l’animal ne peut être remplacé par d’autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution n’existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez les rongeurs car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l’état de type anxieux. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures les moins invasives possibles, le suivi d’éventuels signes cliniques, la détermination des points limites et le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. Les effets potentiellement indésirables des candidats-médicaments qui seront testés dans ce modèle feront l’objet d’échange avec les inventeurs du médicament et les responsables du bien-être animal afin d’adapter les outils d’observations des animaux pour permettre la mise en place de traitements des potentiels signes cliniques. L’administration et les prélèvements de sang seront effectués par un personnel entraîné et la douleur associée sera réduite à son minimum et sera l’équivalent d’une piqûre.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d’un produit sur l’état de type anxieux. Dans ce projet, seuls les animaux adultes seront utilisés car il n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Evaluation de thérapeutique innovante dans des modèles de tumeurs cérébrales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou par chirurgie dans le cerveau, puis des traitements, un suivi par imagerie et des prélèvements sanguins, avant une mise à mort pour prélever organes et fluides. Le porteur évalue de nouveaux médicaments contre les tumeurs cérébrales, des bénéfices situés à court terme mais "avant passage chez l'homme". Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que la souris est l'espèce la plus adaptée.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments dans des modèles pertinents de tumeurs cérébrales chez la souris. A noter, les tumeurs cérébrales touche plus de 360 000 personnes par an en France.
Bénéfices attendus
A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que les nouveaux traitements testées sont efficace et également d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage chez l'homme.
Procédures
Les animaux recevront 1 greffe de cellules tumorales soit par voie peu invasive (sous cutané) soit par chirurgie (injection dans le cerveau - durée de la chirurgie estimé à 5-10 min). Dès lors, des essais de traitements seront menés. En cas de prélèvement de sang ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Une suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).
Impact sur les animaux
Le développement de la tumeur chez la souris pourra à terme être associé à des effets secondaires. Dans ce contexte, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter ces signes au plus tôt. De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Encore une fois, la mise en place de points limites adaptés permettra d'agir rapidement. Les procédures chirurgicales intracérébrale repose sur la mise en place de protocoles chirurgicaux incluant une analgésie maitrisée ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet donc de réduire les contraintes potentielles pour l’animal à leur minimum.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer du cerveau. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (test de comparaison entre groupe véhicule et groupes traités.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Utilisation de vecteurs viraux pour la création de modèles murins de Knock-In par la technique CRISPR/Cas9
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles sont vasectomisés et hébergés seuls, les femelles reçoivent des embryons manipulés par chirurgie, et les souriceaux subissent une phalangectomie pour le génotypage, décrite comme "indispensable". Le porteur produit des lignées de souris knock-in par CRISPR/Cas9 à l'aide de vecteurs viraux, une mise au point de méthode destinée à être proposée comme prestation dans toute la France. Les femelles non fécondées sont réutilisées une fois puis tuées, les mâles gardés environ un an avant d'être tués.
Objectifs
Ce projet vise à la création de modèles murins par knockin, la matrice ADN de remplacement étant amené par un vecteur Adeno Associé ou AAV. Il se déroulera en deux étapes. La première étape aura pour objectif de définir le meilleur sérotype et le meilleur titre d'AAV par la manipulation de zygotes murins et l'analyse, d'une part de la fluorescence et d'autre part du nombre de copies du gène rapporteur codant pour la gfp, intégré au génome murin. Une fois les conditions optimales définies, des zygotes seront transduits et retransplantés dans des femelles pseudogestantes pour donner naissance à des souriceaux. Ces animaux seront eux-mêmes génotypés par analyse de la présence et du nombre de copies du gène codant pour la gfp.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de ceux ordres. Un bénéfice scientifique car, même si la technologie Crispr-cas9 devient de plus en plus utilisée et est de plus en plus efficace pour créer des modèles d'invalidation, elle pêche encore dans la création de modèles KI. L'utisation d'AAV amenant la matrice portant la ou les modifications est une voie d'amélioration de cette méthodologie. Techniquement, il s'agira d'électroporer les constructions dans les embryons au stade zygote. Cette étape, déjà nécessaire pour la création des modèles KO par Crsipr-cas9, se révèle demander peu d'animaux, bien moins que la méthodologie originelle d'invalidation dans les cellules souches embryonnaires par recombinaison homologue.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale. Pour certains des mâles, il s'agit de la stérilisation par vasectomie, opération qui ne dure que 15 minutes une fois l'animal anethésié. Pour les femelles pseudogestantes, il s'agit d'une petite chirurgie pour permettre l'implantation des embryons manipulés. Celle-ci n'excède pas 10 min une fois la souris anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux obtenus à l'issue des manipulations seront élevés dans les conditions standards d'hébergement. Le seul acte qu'ils subiront sera une phalangectomie pour déterminer leur génotype, il n'y aura pas d'autre nuisance. Cet acte est indispensable pour permettre à la fois, lors d'un prélèvement unique, l'identification et le génotypage de l'animal. Pour ce qui concerne les animaux subissant des chirurgies, deux cas de figure se présentent. La nuisance pour les mâles vasectomisés réside essentiellement dans leur hébergement isolé un par cage. Pour la limiter ils seront tous hébergés dans la même pièce à proximité visuelle de leurs congénères. De plus, ils seront régulièrement mis en accouplement même en dehors des périodes nécessitant les retransplantations d'embryons manipulés. Pour ce qui concerne les femelles retransplantées, dans la mesure où les précautions pré- et post-opératoires sont respectées, il n'y a pas de nuisance particulière à craindre.
Devenir
Les femelles induites hormonalement et prise par les mâles (présence d'un bouchon vaginal) sont euthanasiées pour récolte des embryons. Celles qui n'auraient pas été accouplées sont gardées 5 jours avant réutilisation. A l'issue de cette nouvelle utilisation, celles qui n'auraient pas été prisee une deuxième fois sont euthanasiées. Les mâles vasectomisés et les mâles fertiles sont gardés environ un an puis euthanasiés.
Remplacement
L'approche méthodologique a tout d'abord été validée par modifications de cellules eucaryotes. Cependant pour travailler sur des modèles mimant des pathologies parfois complexes, la modification du génome murin par ces nouveaux outils de transgénèse demeure l'une des voies indispensables d'approche.
Réduction
Pour cette preuve de concept, l'analyse de la bibliographie a aidé au design des outils (sérotypes à tester, concentrations) et nous nous appuions sur notre savoir-faire pour toute la partie production des zygotes. Ce protocole sera mené en parallèle sur plusieurs plateformes technologiques ce qui permettra de ne pas multiplier en interne les lots expérimentaux et qui correspond au souhait de pouvoir, à terme, offrir les mêmes types de prestations sur toute la France. Aucun test statistique ne sera utilisé car il s'agit ici de produire des souris transgéniques. Le nombre de manipulations sera de deux pour la partie in vitro de détermination du sérotype et de la concentration de l'AAV et de quatre pour les expériences in vivo. Le nombre d'animaux utilisé est détaillé dans chaque procédure.
Raffinement
Les animaux sont suivis de manière quotidienne par du personnel formé et compétent. Du METACAM ND est administré par voie sous-cutané en pré et post-opératoire. Un mélange de kétamine/xylazine est utilisé pour les anesthésies (vasectomies et retransplantations). Du coton est ajouté à l'enrichissement habituel pour favoriser la création de nid par les femelles pseudogestantes. Les points limites de ce projet sont ceux classiquement décrits lors de tout expérience de transgénèse : prostration, perte de poids ou non prise de poids (femelles pseudogestantes), aréactivité lors de l'ouverture de la cage ou de la préhension, aspect corporel.
Choix des espèces
La souris fait partie des espèces historiques et de choix pour l’étude des conséquences de modifications géniques; elle est utilisée en transgénèse depuis 1981. D'autre part la méthodolgie CRISPR/Cas9 y a donné de très bons résultats lors de l'invalidation globale de gènes, résultats tellement bons que le nombre d'animaux utilisés a ainsi été grandement diminué. Enfin, il existe dans cette espèce de nombreux outils d’analyse aux niveaux moléculaire, cellulaire ou de l’animal in toto des caractéristiques phénotypiques. Tous les animaux seront utilisés à partir de leur maturité sexuelle puisque les objectifs sont la production de zygotes sauvages et la retransplantation d'embryons modifiés aux stades une ou deux cellules. Les femelles donneuses d'embryons C57BL/6J seront induites hormonalement puis sacrifiées entre 5 et 7 semaines d'âge. Les femelles pseudogestantes des fonds Swiss-CD1 ou B6CBA/F1 seront retransplantées entre 8 semaines et 6 mois d'âge. Les mâles Swiss-CD1 vasectomisés ou C57BL/6J fertiles seront utilisés à partir de 6 semaines et jusqu'à un an.
Etude par imagerie fonctionnelle Ultrasonore de l’effet du PLX5622 sur l’altération de la fonctionnalité des réseaux cérébraux dans un modèle murin de douleur neuropathique cornéenne.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Elles subissent l'ablation chirurgicale d'une glande lacrymale pour induire une sécheresse oculaire, l'application de filaments rigides sur la cornée vigile pour mesurer l'hypersensibilité, puis des séances de neuro-imagerie par ultrasons de trois à cinq heures sous anesthésie. Le porteur écrit que, voulant étudier les mécanismes de la douleur cornéenne persistante, il ne pourra pas soulager cette douleur. Il décrit les approches sur l'animal entier comme "incontournables" et affirme qu'aucune méthode substitutive n'existe.
Objectifs
La douleur neuropathique cornéenne (DNC) est une douleur chronique qui s’accompagne d’une hypersensibilité sensorielle (air, lumière, contact) et qui affecte de façon dramatique la qualité de vie des patients. Par ailleurs, un ensemble grandissant d’études montre que l’initiation et le maintien de la DNC pourrait être lié à un dysfonctionnement d’un type particulier de cellules gliales cérébrales appelées ‘les cellules microgliales’. Cependant à l’heure actuelle, les traitements de la DNC restent insatisfaisants et les circuits neuronaux impliqués n’ont été que très partiellement caractérisés, du fait de difficultés techniques notamment en recherche préclinique où l’étude des réseaux neuronaux chez le petit animal reste complexe. Dans cette étude, nous proposons d’étudier les changements fonctionnels et structurels des différentes régions cérébrales impliquées dans la DNC et en particulier le rôle des cellules microgliales grâce à l’utilisation d’une technique innovante de neuroimagerie.
Bénéfices attendus
Nos travaux visent à définir 1) les circuits fonctionnels neuronaux impliqués et leurs modifications dans la douleur cornéenne normale et pathologique (chronique) et 2) le rôle spécifique de la microglie dans le développement de la douleur chronique et comment elle peut finement moduler les réseaux de la douleur cornéenne en condition normale et pathologique. A cette fin nous disposons d’un modèle murin de douleur oculaire chronique liée à la sécheresse oculaire développé au sein de l’équipe de nos collaborateurs. Le modèle de douleur cornéenne persistante est un excellent modèle translationnel et pré-clinique qui permet de développer nos connaissances des réseaux neuronaux de la douleur cornéenne et de leurs altérations en cas de douleur chronique. Cette plasticité inadaptée se développe à différents niveaux des systèmes nerveux périphérique et central et a été observée dans de multiples syndromes douloureux chroniques. L’étude de cette plasticité, de l’impact de l’inactivation des cellules microgliales, ainsi que l’existence (ou non) d’un dimorphisme sexuel dans ces mécanismes aideront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette douleur persistante cornéenne, est un point critique pour l’établissement de liens entre observations cliniques et mécanismes endogènes, afin de développer des traitements réellement efficaces.
Procédures
- Réduction du nombre de cellules microgliales des animaux par ingestion de PLX5622 (molécule détruisant la microglie) présent dans leur nourriture. Durée : 3 semaines. Nombre d’animaux impactés : 80. Nombre de répétitions par animal : 1. - Chirurgie de mise en place du modèle de sécheresse oculaire consistant en l’ablation des glandes lacrymales de l’œil droit. Pour la moitié des animaux, ces glandes ne sont pas retirées mais le reste de la chirurgie est inchangée (incision, suture, anesthésie, soin, ...). Réalisée sous anesthésie générale et avec un suivis et une gestion de la douleurs après l’opération. Durée de la chirurgie : 15 à 20 minutes. Nombre d’animaux impactés : 200. Nombre de répétions par animal : 1. - Imagerie de l’œil pour déterminer l’apparition de lésion lors du développement du modèle. Deux types d’imageries sont réalisées sous anesthésie générale pour permettre l’immobilité des animaux. Durée du test : 8 minutes. Nombre d’animaux impactés : 200. Nombre de répétitions par animal : 3. - Mesure des seuils de sensibilité mécanique par application de filaments de plus en plus rigides (jusqu’à ce que l’animal réagisse) sur la cornée d’animaux vigile. Cela permet de mesurer si les animaux développent une hypersensibilité après la mise en place du modèle. Durée du test : 60 à 75 minutes par groupe mais l’application des filaments ne dure que 3 secondes et cette application n’est répétée qu’entre 5 et 8 fois par animal. Nombre d’animaux impactés : 200. Nombre de répétitions par animal : 6. - Neuro-imagerie par ultrason permettant de mesurer de manière non invasive l’activité cérébrale des animaux et leurs réponses à une stimulation des yeux. Réalisée sous anesthésie générale pour permettre l’immobilité des animaux. Durée d’une session : 3 à 5 heures. Nombre d’animaux impactés : 250. Nombre de répétitions par animal : 1.
Impact sur les animaux
Suite aux chirurgies et malgré l’utilisation d’antalgiques pendant et après ces procédures chirurgicales, les animaux peuvent présenter une activité réduire et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Comme nous voulons étudier les mécanismes cérébraux associés à la douleur cornéenne persistante, nous ne pourrons pas soulager cette douleur. Notons que nos analyses en imagerie se feront sur animal anesthésié, limitant ainsi la perception douloureuse de l’animal. Néanmoins, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront monitorées grâce au suivi des fréquences cardiaques et respiratoires. Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’anesthésique gazeux pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés pour la mise au point des protocoles d’anesthésies et pour l’identification du réseau cérébrale impliqué dans la perception de la douleur cornéenne seront mis à mort en fin d’expériences de neuroimagerie, sans qu’ils ne reprennent conscience, pour qu’ils ne soient pas impactés par les stimulations de l’œil réalisées. Le reste des animaux de ce projet seront mis à mort en fin d’expérience de neuroimagerie, toujours sous anesthésie, afin de permettre le prélèvement de leurs cerveaux. Ces cerveaux seront ensuite analysés pour révéler les niveaux de présences de marqueurs biochimiques permettant d’aider à l’interprétation des résultats obtenus dans l’étude.
Remplacement
Notre projet porte sur la plasticité des aires cérébrales dans le contexte de la douleur cornéenne. Dans ce contexte, les approches intégratives sur l’animal entier restent incontournables. A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur des processus cognitifs complexes et pour l’étude et l’analyse des mécanismes de la douleur.
Réduction
Pour ce projet et afin de respecter la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée (analyse de variance suivi d'un test post-hoc paramétrique si la distribution est normale ou un test non paramétrique dans le cas contraire). Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Un suivi quotidien sera assuré contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture. Les animaux seront hébergés de deux à six par cage dans le respect des surfaces réglementaires avec enrichissement (tunnel, bois à ronger). Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental et aux procédures. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons défini, en fonction des observations quotidiennes. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou, enfin, de mettre à mort l’animal en dernier recours. Les chirurgies seront réalisées en conditions aseptiques. Pour réduire la douleur pendant la chirurgie, elle sera effectuée sous anesthésie avec un antalgique. De plus, des antalgiques seront injectés à la fin et le lendemain de la chirurgie.
Choix des espèces
Dans la littérature, les modèles de douleur oculaire ont majoritairement été développés chez des souris mâles et femelles adultes. Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis (ce n'est pas le cas du rat). Ce projet de recherche portant sur la douleur oculaire nécessite d’utiliser des animaux adultes, âgés de plus de 6 semaines.
Étude de l’organotropisme du virus Oropouche chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
1 568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Oropouche puis subissent des prélèvements de sang à la queue tous les deux jours et un prélèvement final avant la mise à mort, qui sert à prélever leurs organes. Le porteur indique que l'infection peut provoquer fièvre, tremblements, prostration, troubles de la motricité et perte de poids, et que chez le hamster elle tue la moitié des animaux, les souris atteignant un score défini étant mises à mort. Il reconnaît la souris comme peu sensible à ce virus et prévoit d'utiliser des lignées à l'immunité affaiblie pour rendre l'infection possible.
Objectifs
Les Orthobunyavirus dont fait partie Oropouche sont des virus émergents très peu étudiés. Ils ont de plus la particularité de pouvoir former des virus recombinés, gagnant en sévérité ou en infectiosité. Il est alors important d’accroitre nos connaissances à leur sujet et plus particulièrement sur les mécanismes de réplication virale et d’infection. Ce projet a donc pour objectif d’améliorer les connaissances sur la pathogenèse de ce virus qui a été récemment responsable d’une épidémie en Guyane française.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension du pouvoir pathogène du virus Oropouche. Ce virus étant émergent et pouvant causer des épidémies au niveau mondial il est important de développer des moyens de préventions et traitements efficaces contre ce virus. De plus, sa capacité à se recombiner pourrait donner naissance un jour à des virus plus pathogènes ou plus infectieux. Les résultats de ces recherches, intégrés dans un projet de plus grande ampleur permettront d’ouvrir la voie au développement de traitements et moyen de préventions.
Procédures
Des prélèvements seront réalisés tous les 2 jours à la queue après une petite incision (volume de 30 ml) de J-1 à J15. Chaque prélèvement ne dure que quelques secondes. Un prélèvement final de 200 ml sera réalisé par voie rétro-mandibulaire juste avant le sacrifice (30 secondes).
Impact sur les animaux
Les animaux seront infectés sous anesthésie générale afin de réduire le stress et la douleur liés à l’inoculation. L’infection des souris par des Orthobunyavirus est encore très peu décrite car souvent non sensible. Cependant, le hamster est un modèle animal sensible à l’infection. Bien que difficile d’extrapoler les symptômes d’une espèce à l’autre, on peut s’attendre chez la souris à des symptômes similaires. On s’attend alors dans le cas d’infections légères à ce que les animaux manifestent un manque d’hygiène et d’alimentation dans les premiers jours de l’infection. En cas d’infections modérées, des symptômes plus sévères peuvent apparaitre tels que de la fièvre, des tremblements ainsi qu’un état prostré. Ceux-ci peuvent également être accompagnés de troubles de la motricité et de l’équilibre ainsi que d’une perte de poids. Enfin, il a été remarqué chez le hamster que l’infection par le virus Oropouche pouvait entrainer la mort des animaux chez la moitié des animaux, les autres ne répondant pas à l’infection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car nous avons besoin de leurs organes pour étudier la physiopathologie du virus Oropouche par des techniques de biologie moléculaire, cellulaire et d’histologie.
Remplacement
Dans un souci de remplacement, nous envisageons dans un premier temps de tester le tropisme de ces virus sur des cellules afin d’étudier le rôle joué par leurs protéines non structurales, cependant, il deviendra indispensable d’utiliser un modèle animal afin d’étudier l’infection au niveau systémique afin de mimer l’infection par un arthropode.
Réduction
Nous envisageons de faire une première expérience sur un petit nombre d’animaux par groupe (6 animaux des deux sexes) afin de déterminer les lignées de souris qui seront les plus sensibles. Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser 8 individus par groupe, soit un sous-total (par expérimentation) de 256 individus répartis en 2 cages par groupe (4 individus par cage). En supposant un effet cage de 25 %, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.47 (effets forts à très forts).
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques (grille jointe à la dap). Dès que le score atteindra 1, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du dietgel sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement supérieur à 10% ou bien si leur mobilité diminue. Si un score égal à 2 est atteint, les animaux seront mis à mort. Des igloos en carton ou du coton seront mis à disposition dans chaque cage afin que les animaux soient dans une ambiance confortable.
Choix des espèces
La souris est un animal de choix dans le cadre de l’expérimentation animale. Bien que ce modèle soit naturellement peu sensible à l’infection par certains Orthobunyavirus, nous estimons que l’utilisation de deux modèles d’étude devraient permettre de surmonter cet obstacle. En effet, les souris issues de croisements génétiques présentent une diversité génétique qui devrait permettre d’identifier une lignée qui sera sensible à l’infection. Le recul que nous avons à ce propos dans le cadre de l’étude de la pathogénicité des arbovirus montre en effet que certaines lignées présentent une virémie et des symptômes qui se rapprochent de ceux observés chez l’homme. Si toutefois aucune lignée ne répond de façon pertinente au virus, nous utiliserons comme alternative des souris dont la réponse immunitaire innée est invalidée (souris IFNAR-/-). Ce modèle est très utilisé dans le cadre de l’étude du pouvoir pathogène de nombreux arbovirus auxquelles elles sont très sensibles. Nous privilégierons l’utilisation de souris dont la réponse à l’interféron est temporairement invalidée par injection avant infection d’anticorps anti-IFNAR. Ces souris seront donc sensibles à l’infection mais recouvreront leur réponse immunitaire, ce qui les rendra plus résistantes aux effets pathogènes plus sévères que l’on peut observer chez les souris KO IFNAR-/-. Dans une première approche, les animaux seront utilisés à l’âge de jeunes adultes de 6 semaines. Les infections avec des arbovirus chez la souris sont en général dépendantes de l’âge et les souris plus âgées sont moins sensibles que les souris jeunes. En cas d’échec de l’infection, des animaux plus jeunes (3-4 semaines) pourront être utilisés afin de vérifier si des animaux dont le système immunitaire est moins mature seraient plus permissifs à l’infection.
Etude d’efficacité et de tolérabilité en modèles rongeurs de candidats médicaments ciblés à la tumeur pour le traitement du cancer chez l’homme
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 120
3 460 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales, des injections répétées d'anticorps conjugués à un médicament, un suivi tumoral trois fois par semaine et des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant une mise à mort pour prélever organes et tumeurs. Le porteur teste des candidats médicaments contre le mélanome, des retombées pour les patients renvoyées au conditionnel et au stade préclinique. Il affirme que les études de stabilité et de toxicité ne peuvent se faire que sur l'animal vivant et conclut au recours aux modèles murins.
Objectifs
Plusieurs traitements reposant sur la chimiothérapie, des thérapies ciblées ou des immunothérapies sont disponibles pour le traitement de nombreux cancers. Cependant, les réponses à ceux-ci peuvent être variables, en fonction non seulement des patients mais aussi des indications, conduisant dans la majorité des cas à des rechutes. C’est pourquoi le développement de nouvelles alternatives thérapeutiques est primordial. Les ADC pour « anticorps conjugués à un médicament » constituent une de ces alternatives. Un ADC permet de délivrer un agent de chimiothérapie de manière spécifique et ciblée au niveau de la tumeur grâce à un anticorps qui reconnait une cible exprimée à la surface des cellules tumorales. Nous avons montré qu’un ADC prototype, combinant un anticorps dirigé contre une cible exprimée préférentiellement sur des cellules de mélanome, à un agent de chimiothérapie, pouvait avoir une efficacité in vitro par l’induction de la mort de cellules cancéreuses, et in vivo par la réduction et l’inhibition de la croissance tumorale dans des modèles de mélanome chez la souris. Ce projet engage plusieurs objectifs : 1) sélectionner l’ADC candidat en évaluant différentes technologies d’ADC que ce soit via la molécule de chimiothérapie fixée sur l’anticorps ou via le lien chimique permettant de l’y fixer et de la délivrer de façon optimale au niveau de la tumeur. Cette évaluation permettra i) de mesurer l’efficacité de l’ADC seul, c’est-à-dire sa capacité à induire la diminution ou l’inhibition de la croissance tumorale, ii) d’étudier la toxicité de l’ADC dans les modèles murins (souris ou rat) et enfin iii) de mesurer la stabilité de l’ADC dans le plasma en étudiant la libération non contrôlée de la chimiothérapie. 2) mesurer la synergie relevant de la combinaison de l’ADC avec les traitements standard du mélanome, les ICI (Inhibiteurs de point de contrôle immunitaire). En effet, il a été constaté dans la littérature que certaines chimiothérapies délivrées par les ADC pouvaient induire une réponse immunitaire capable d’optimiser la réponse anti-tumorale. Cette réponse immunitaire pourrait contribuer à la réussite du traitement de l’ADC en monothérapie mais aussi améliorer et optimiser les résultats des traitements par les ICIs. C’est pourquoi les différentes technologies évaluées pourront être testées seules ou combinées avec les standards actuels de traitement du mélanome, afin d’améliorer le bénéfice thérapeutique pour les patients en rechute.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait apporter des bénéfices sur plusieurs plans. Sur le plan scientifique, il devrait confirmer la puissance du rationnel de la cible identifiée dans le traitement du mélanome, qui amène la preuve de concept préclinique d’un candidat ADC ayant un fort potentiel de stratégie de développement et devrait permettre par ailleurs, d’ouvrir la voie pour d’autres indications d’intérêt pour lesquelles cette cible est aussi présente. Sur le plan technologique, ce projet crée un axe de développement d’ADC de construction à haut DAR (Ratio de chimiothérapie par anticorps), une grande première dans le mélanome, permis par les avancées technologiques que ce soit au niveau des chimiothérapies ou des liens chimiques actuellement développés. Sur le plan clinique, ce projet devrait permettre d’une part de montrer qu’une chimiothérapie peut fonctionner dans le mélanome si elle est vectorisée par une bonne cible, le mélanome étant connu jusqu’à présent pour être une tumeur difficilement traitable par chimiothérapie. D’autre part, ce projet devrait contribuer à confirmer que les meilleures combinaisons avec les ICI demeurent la chimiothérapie surtout si ces derniers représentent traitement standard du mélanome et si une synergie d’action entre ADC et ICI est démontrée.
Procédures
Lors des différentes procédures, les animaux pourront être soumis aux interventions suivantes : •L’injection de cellules tumorales afin de permettre le développement de la tumeur pour évaluer l’efficacité antitumorale des ADC ou de la combinaison des ADC avec les ICI actuellement utilisées comme standard de thérapie en oncologie. Cette intervention ne durera que quelques minutes à partir du moment où les animaux auront été anesthésiés. •La deuxième intervention concerne l’injection des ADC et/ou des ICI entrant dans le processus de traitement des tumeurs, afin d’évaluer leur efficacité. Chaque ICI sera injectée 4 fois à 3 jours d’intervalle sur la durée de l’étude. Chaque ADC sera injecté jusqu’à 3 fois avec un maximum de 7 à 10 jours d’intervalle. Chaque injection prendra au maximum 5 minutes et sera réalisée après l’anesthésie et l’analgésie des animaux. •La troisième intervention concerne la mesure du volume tumoral ainsi que le suivi du poids des animaux qui auront lieu 3 fois par semaine. Le temps d’intervention sera limité à un maximum de 5 minutes par mesure afin de limiter l’anxiété des animaux. •La quatrième intervention concerne les prélèvements sanguins, qui auront lieu notamment pour les études de stabilité des différentes technologies ADC ou encore pour suivre la toxicité des ceux-ci lors de leur injection. Les prélèvements auront lieux au moins deux fois sur chaque animal. L’espèce utilisée sera adaptée aux analyses qui seront réalisées. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie gazeuse et n’excèderont pas 5 minutes après endormissement de l’animal.
Impact sur les animaux
La réception des animaux peut engendrer un stress qui pourrait compromettre le bon déroulement des différentes procédures réalisées. C’est pourquoi après réception une période d’acclimatation est prévue afin de réduire ce stress. Les différentes procédures qui seront réalisées sur les animaux après cette période d’acclimatation pourront générer différents types d’effets indésirables : •Lors de l’injection des cellules, un stress des animaux pourrait être observé ainsi que des douleurs au site d’injection. De plus, le développement des tumeurs pourrait conduire à une perte de poids ainsi que des douleurs qui pourraient être délétères pour l’animal. •Lors des injections des ADC de l’anxiété ou des douleurs pourront être observées. •Pour certaines études, des prélèvements sanguins pourront être réalisés, engendrant un stress lors de la manipulation. Les effets indésirables majeurs de ces études seront donc un stress lié à la manipulation fréquente des animaux, des douleurs ainsi qu’une éventuelle cachexie liée au développement tumoral pouvant conduire à une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés au cours des différentes procédures. Lors de l’euthanasie des animaux, les organes ou les tumeurs pourront être prélevés afin de réaliser des études histologiques dans le but de valider l’expression de la cible ou pour rechercher des signes de toxicités.
Remplacement
Les études préliminaires réalisées avec un ADC prototype ont permis de démontrer in vitro, que celui-ci est capable de se lier à des cellules tumorales de mélanome ou d’autres cancers exprimant la cible à leur surface. Il est aussi capable d’induire la mort cellulaire de ces mêmes cellules. In vivo l’efficacité anti-tumorale de celui-ci a pu être démontrée dans des modèles de mélanome induits chez la souris, via l’inhibition et la régression de la croissance tumorale. Les modèles utilisés pour valider l’efficacité de l’ADC prototype sont des modèles imparfaits. En effet, les modèles in vitro, ne permettent pas de prendre en compte la stabilité du composé tandis que les modèles in vivo reposent sur l’utilisation de modèles murins dont le système immunitaire est déficient. Ainsi, les études de stabilité des différents ADC testés ne peuvent être réalisées que in vivo afin d’évaluer l’impact de leur circulation dans l’organisme. Il en est de même pour les études de tolérabilité du composé, à savoir si celui-ci induit des toxicités. En effet, seule l’administration dans des modèles animaux peut montrer une modification de comportement, une libération d’enzymes hépatiques ou une perte de poids liée à une toxicité du composé. Concernant l’étude du traitement des ADC seuls ou en combinaison avec les ICI, l’utilisation d’animaux ayant un système immunitaire compétent permettra d’étudier les mécanismes d’action permettant d’obtenir une réponse anti-tumorale durable.
Réduction
Des premiers tests avec un ADC prototype ont permis de démontrer in vitro une activité cytotoxique et in vivo une activité anti-tumorale avec une inhibition et une régression de la croissance tumorale sur des modèles de mélanome chez la souris. Avant toute étude in vivo et pour chaque technologie évaluée, une étude préliminaire in vitro sera conduite afin de confirmer la liaison de l’ADC à sa cible exprimée sur les cellules tumorales et de confirmer son activité cytotoxique sur ces mêmes cellules. Ainsi, seules les technologies démontrant une efficacité anti-tumorale in vitro seront testées in vivo. De plus, pour chaque lignée cellulaire utilisée in vivo une étude de tumorigénicité sera réalisée sur un nombre de 10 animaux afin de confirmer la prise tumorale ainsi que l’hétérogénéité de la croissance tumorale. Les études réalisées avec l’ADC prototype ont permis d’établir que 10 souris au maximum seraient nécessaires par groupe afin de générer une courbe de croissance tumorale, une courbe de survie mais aussi des données statistiques pour comparer les différentes technologies ADC ou les différentes combinaisons de traitement. Le nombre d’animaux par groupe pourra ainsi être réduit en fonction de la variabilité intra et inter-groupe observée dans les études de tumorigénicité et dans les études préliminaires.
Raffinement
Les différentes procédures entraînent plusieurs nuisances sur les animaux comme du stress, des douleurs et des pertes de poids. Tous ces paramètres ont été pris en compte afin de les réduire. Pour limiter le stress des animaux, une période d’acclimatation est prévue avant le démarrage des études. Un enrichissement adapté à l’espèce utilisée (souris ou rat) est aussi ajouté dans chaque cage. Toutes procédures induisant des douleurs et du stress seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie locale. Le suivie de la croissance tumorale et du poids des animaux sera monitoré 3 fois par semaine afin de procéder à une supplémentation en nourriture ou à l’euthanasie des animaux en cas de pertes de poids non contrôlées même sous supplémentation ou de croissance tumorale trop importante ou gênant les déplacements de l’animal. De plus, en fonction du comportement des animaux pouvant traduire des signes de douleurs, tels que la prostration de l’animal ou des gémissements, les animaux seront euthanasiés. Une grille de score a été mise en place afin de suivre les animaux sur différents critères, regroupant leur comportement, les effets liés au développement tumoral et aux traitements, afin de pouvoir adapter leur suivi et définir quand il est nécessaire de les euthanasier.
Choix des espèces
Au cours des différentes études menées pour la sélection de l’ADC candidat et de la définition des conditions de traitements à utiliser, plusieurs espèces seront utilisées : • La comparaison des différentes technologies ADC pour la sélection du candidat thérapeutique sera réalisée dans des souris immunodéficientes. Ces souris ont été choisies car elles sont classiquement utilisées dans les études d’efficacité des médicaments expérimentaux évalués en oncologie. Les lignées cellulaires utilisées pour la génération des tumeurs sont des lignées humaines, par conséquent leur système immunitaire déficient n’entraîne pas de rejet de ces cellules tumorales implantées et n’interfère donc pas avec les résultats d’efficacité liée à l’activité cytotoxique anti tumorale de l’ADC. • Pour les études de stabilité et de tolérabilité des ADC, le choix de l’espèce murine utilisée sera dicté par les études in vitro réalisées à la suite de l’injection des ADC. Des souris immunocompétentes seront utilisées, car ce sont des modèles classiquement utilisés pour ces études et qui permettront de faire le lien avec les études d’efficacité réalisées en souris. Les rats pourraient être préférés aux souris afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés dans les études du fait de la disponibilité de plus grande quantité de sang pour les analyses. Les rats sont aussi couramment utilisés pour les études de stabilités des composés. • Les études de combithérapie associant les ADC avec des ICI seront quant à elles réalisées dans des souris immunocompétentes afin d’étudier les mécanismes immunitaires mis en jeu lors de la réponse anti-tumorale de l’ADC, seul ou en combinaison. Pour toutes les études, les souris ou les rats utilisés seront des femelles âgées de 6 à 8 semaines, âge considéré comme l’âge adulte, puisque les traitements étudiés ont pour but de traiter des tumeurs chez l’adulte ayant un système immunitaire mature. De plus, nous n’attendons pas de différence de résultat entre des souris mâles ou femelles. C’est pourquoi des souris femelles seront utilisées pour faciliter l’organisation des cages et limiter les bagarres entre individus pouvant générer du stress risquant de nuire à l’interprétation de l’étude.