Rongeurs

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de lésions cérébrales reproduisant l'encéphalopathie du prématuré, elles subissent des tests d'activité circadienne, d'anxiété, de mémoire et de capacités cognitives, avec isolement, eau acidifiée et prélèvement sanguin, avant la mise à mort pour analyser le cerveau en IRM. Le porteur étudie deux âges, 7 et 16 mois, pour observer un vieillissement précoce. Les retombées annoncées, prévention et pistes thérapeutiques, restent renvoyées au long terme.

Objectifs

La prématurité est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons de très faible poids de naissance qui ne survivent pas au-delà de l’enfance est en baisse. Cependant, le cerveau de ces prématurés reste extrêmement vulnérable et peut ainsi présenter des lésions. L’inflammation périnatale que subissent dans 20 à 40% des cas les enfants prématurés, et la grande vulnérabilité des cellules cérébrales en développement à ce stress inflammatoire est à l’origine de l’apparition de la plupart de ces lésions. Elles induisent des handicaps moteurs, des déficits cognitifs et des troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte qui sont regroupées sous le terme d' "Encéphalopathie du Prématuré". Certaines cellules cérébrales, appelées cellules gliales, sont les relais majeurs des modifications environnementales dans le cerveau, dont les réponses inflammatoires. Ces cellules résidentes du système nerveux central, analysent de manière continue leur environnement et participent à la stabilisation de ce dernier. On sait aujourd’hui que les mécanismes qui permettent la maturation cérébrale sont les mêmes que ceux qui sont perturbés au cours du vieillissement. Nous cherchons donc à comprendre l’impact de l’inflammation périnatale sur le vieillissement en émettant l'hypothèse que celle-ci peut être à l'origine d'un vieillissement prématuré. Dans ce projet nous allons donc caractériser le comportement des souris à 7 mois ce qui correspond à un temps dit de « milieu de vie » auquel on peut s’attendre à l’apparition de premiers signes de vieillissement prématurés et à un âge avancé, c’est-à-dire à 16 mois où un phénotype clair de vieillissement est attendu. Nous étudierons à ces deux âges l’activité circadienne des animaux, leur comportement de type « anxieux », leurs capacités mnésiques et cognitives. Des prélévements sanguins seront réalisés et envoyés au partenaire pour des dosages complémentaires. A la fin de ce projet les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir analyser leurs cerveaux en IRM.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la caractérisation des conséquences à long terme de l'encéphalopathie du prématuré et ainsi la mise en place d'outils de prévention chez les individus concernés. A long terme, nous pouvons penser que ce projet permettra l’amélioration du pronostic de cette pathologie et la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients.

Procédures

Les tests comportementaux auront les durées suivantes : -Activité circadienne des animaux durée du test : 32h - Test d’anxiété durée du test : 5 minutes - Test de mémoire : 15 +10 + 10 minutes - Test capacités cognitives : 21 jours Un prélèvement sanguin sera effectué en fin d’étude pour analyser des paramètres biochimiques. Ces prélèvements, un par souris, se font en quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances seront les suivantes : pour le test des capacités cognitives les animaux auront des conditions d’hébergements non standards avec un accès à de l’eau acidifiée pendant 21 jours. Pour connaitre l’activité circadienne des animaux, ils seront isolés pour une période de 32h. Enfin, les animaux auront un stress léger lié à l’anesthésie qui précédera le prélèvement sanguin.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses IRM.

Remplacement

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication de la neuro-inflammation dans le développement d'un vieillissement précoce. Cela suppose des interactions complexes entre différentes cellules du système nerveux central. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions complexes in vitro ou dans un système de cellules en culture, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal pour reproduire ces interactions complexes. A cet égard la souris est un modèle pertinent, car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme.

Réduction

Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 32 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative et peu de variabilité. En fonction de la répartition des données nous utiliserons un test paramétrique ou non paramétrique pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (Avec inflammation et Contrôles sans inflammation) : activité circadienne, niveau d’anxiété, capacités mnésiques et cognitives.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort des animaux et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupération, d’au minimum une semaine, entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Afin d'étudier les interactions entre les cellules du système nerveux, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition. Dans ce modèle d'inflammation périnatale un vieillissement précoce est attendu. Nous nous intéressons ainsi à 2 temps de vie chez les animaux : 7 et 16 mois de vie. Le temps de 7 mois est ainsi communément admis comme étant un temps de "milieu de vie" (40-45 ans). Alors que le temps 16 mois correspond à un âge déjà avancé (80 ans).

77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées à une lumière intense de 20 000 lux pendant une heure et demie pour provoquer une dégénérescence de la rétine, elles reçoivent un composé par gavage et subissent un électrorétinogramme sous anesthésie, avant le prélèvement des yeux. Le porteur décrit les dommages rétiniens attendus, la perte de l'intégrité et de l'activité des photorécepteurs. Il présente ces essais comme "indispensables" pour prouver l'efficacité du composé sur un organisme complet, une preuve de concept d'un traitement préventif.

Objectifs

Il s’agit de faire la preuve de concept d’un traitement préventif de la perte de fonction visuelle par un nouveau principe actif avec une nouvelle formulation par voie orale dans une situation de dégénérescence rétinienne chez la souris modèle de la Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age (DMLA). Il permet également d'évaluer l'impact de la formulation sur l'amélioration potentiel de l'efficacité du composé à protéger de la perte de la fonction visuelle en comparant des souris traitées avec la formulation vs sans formulation.

Bénéfices attendus

La rétinopathie regroupe plusieurs pathologies de la rétine qui sont soit génétiques, comme la rétinite pigmentaire et la dystrophie maculaire de Stargardt, qui touchent respectivement la périphérie et le centre (macula) de la rétine, soit multifactorielles, comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Nous voulons apporter à ces patients un traitement préventif contre la progression de ces maladies. Ce projet est donc à profil santé publique avec une échéance à moyen terme applicable à l'échelle clinique.

Procédures

Gavage voie orale : durée : 30 secondes Exposition à la lumière à 20 000lux : 1h 30 Mise à l’obscurité : 5 jours ERG (éléctrorétinogramme) : 10min par souris

Impact sur les animaux

La nuisance attendue sur les souris est l’exposition lumineuse. les souris sont placées dans l’obscurité 24 h avant l’exposition à la lumière pour minimiser le temps et l’intensité lumineuse. Les dommages rétiniens engendrés sont la perte de l’intégrité et de l’activité des photorécepteurs minimiser le temps et l’intensité lumineuse. Les dommages rétiniens engendrés sont la perte de l’intégrité et de l’activité des photorécepteurs

Devenir

A l'issue de cette procédure, les souris seront euthanasiées. Une analyse histologique et/ou biochimique pourra être effectuée après la mort après prélèvement des yeux.

Remplacement

Toutes les approches in cellulo ne peuvent pas se substituer aux essais chez l’animal qui restent plus proche du patient. L'approche animale est la suite logique des résultats précédemment obtenus sur cellules rétinienne qui nous ont permis de prouver l'efficacité du composé. Ces études précliniques sont indispensables pour prouver l'efficacité sur un organisme complet.

Réduction

Cette quantité d’animaux a été réduite le plus possible sans compromettre les résultats expérimentaux et les études statistiques Comme ces 77 souris se répartissent en 11 lots de 7 souris, en cas d’atteinte de la significativité avant l’utilisation de tous les lots, les souris restantes pourront être réutilisées.

Raffinement

A l’arrivée dans le laboratoire, les animaux sont hébergés au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation d'une semaine. Celle-ci leur permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter aux nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période qu’ils pourront être inclus dans cette étude. L’hébergement des souris se fait obligatoirement en groupe d’étude dans des cages de stabulation sous une lumière (90 lux) faible qui n’affecte pas la réponse rétinienne. Comme de nombreuses souches de souris construisent des nids, la présence de matériaux de nidification est un impératif dans les cages. La nidification permet aux souris de réguler leur température et de gérer leur exposition à la lumière. Dans le déroulement de cette étude, on administre aux animaux un produit dont on souhaite connaître les effets. On en connaît déjà les caractéristiques physico-chimiques ainsi que l’activité sur des extraits biologiques et des cellules (études in vitro), ce qui permet d’éviter d’administrer aux animaux des substances non biocompatibles. L’examen spécialisé (électrorétinographie) nécessite une anesthésie. Celle-ci est réalisée en conformité avec les pratiques vétérinaires et par des personnes formées.

Choix des espèces

La souris de laboratoire (Mus musculus) représente 60% du total des animaux utilisés en recherche. Ce rongeur est devenu le modèle expérimental de prédilection des scientifiques. Sur le plan génétique, la souris est très similaire à l’homme : 99 % de ses gènes présentent un gène homologue chez l'humain. De plus, elle possède tous les atouts pour l’élevage en laboratoire : une descendance nombreuse, un développement rapide et une taille réduite. L'utilisation de souris non génétiquement modifiées allège l'aspect réglementaire qui est très bien respecté par le fournisseur agréé. La souris est une lignée consanguine albinos couramment utilisée dans la recherche biomédicale. En ophtalmologie, elle est très sensible à la lumière fluorescente blanche, ce qui constitue un trait intéressant pour mimer la rétinopathie à évolution rapide. Stade adulte jeune (2-3 mois). La rétine est bien développée à ce stade et la réponse rétienne à la lumière est optimale

240 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à une restriction alimentaire allant jusqu'à 50 % de leur ration pendant trois semaines avec accès à une roue d'exercice, elles subissent des injections intrapéritonéales et des prélèvements de glycémie, avant une mise à mort par perfusion d'un fixateur sous anesthésie pour prélever les organes. Le porteur reconnaît que la restriction induit une sensation de faim et choisit des femelles jeunes pour mimer l'anorexie mentale humaine. Le bénéfice annoncé, mieux prendre en charge la maladie, reste hypothétique face à ce modèle de privation alimentaire imposée.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est une maladie qui touche majoritairement les jeunes filles et les femmes, et se caractérise par une prise alimentaire très diminuée, souvent associée à une activité physique exagérée et une préférence pour une alimentation riche en protéines. Beaucoup d’études se focalisent sur les aspects psychiatriques de la maladie, mais il est également intéressant d’en explorer les aspects métaboliques afin de mieux traiter, voire prévenir, cette maladie. En particulier, les patients atteints d’AM maintiennent une glycémie proche de la normale et un poids faible mais constant, malgré un très faible apport calorique et une forte dépense énergétique, ce qui suggère une forte adaptation de leur métabolisme vers la conservation de l’énergie. Nous proposons dans cette étude que la production endogène de glucose par la voie de la néoglucogénèse joue un rôle fondamental dans cette adaptation : il s’agit de la formation de glucose à partir de substrats non glucidiques (phénomène qui entre normalement en jeu au cours d’un jeûne) par le foie essentiellement, mais aussi par les reins et l’intestin. Nous testerons l’hypothèse du rôle « renforçateur comportemental » de la néoglucogénèse intestinale (NGI) dans un modèle de souris femelles qui réplique les aspects métaboliques de l’AM : faible prise alimentaire et exercice physique volontaire, en imposant une restriction alimentaire aux souris et en leur laissant un libre accès à une roue d’exercice.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes qui permettent de maintenir le poids et la glycémie de personnes en situation d'anorexie mentale pourrait déboucher sur une meilleure prise en charge tant sur le plan médicamenteux que sur les recommandations nutritionnelles et d'hygiène de vie. En effet un régime riche en protéines stimule la production intestinale de glucose, et nous pensons mettre en évidence également que l'exercice physique stimule cette voie.

Procédures

Procédures 1 à 4 : les animaux subiront une restriction alimentaire, pendant 3 semaines. Procédure 3 : les souris seront mises à mort par perfusion transcardique d'un produit fixateur, le paraformaldéhyde 4%, sous anesthésie générale (le décès survient en 1 à 2 minutes). Procédure 4 : les souris subissent 3 tests fin d 'évaluer l'homéostasie glucidique, ces tests consistent à un suivi de la glycémie (prélèvements sur animaux vigiles) après une injection intrapéritonéale de pyruvate, glycérol ou glutamine, ces différents tests seront réalisés avec au minimum quatre jours d'intervalle. Les tests durent 120 minutes entre l'injection du produit et le dernier prélèvement de sang pour la glycémie.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont essentiellement liées à la restriction alimentaire susceptible de conduire à une sensation de faim. Cependant la restriction se fera de manière progressive avec une restriction de 30% de leur ration calorique pendant 3 jours, puis passage à 50% pendant 3 semaines. Les animaux subiront également des injections intrapéritonéales qui provoqueront une douleur légère et de faible durée, sans conséquences indirectes du produit injecté, puis des prélèvements de sang (microgouttes) pour mesurer la glycémie.

Devenir

mise à mort pour prélèvements d'organes.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôlent les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiables et robustes, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible. Nous réaliserons des ANOVA à 2 facteurs pour les tests avec mesures répétées au cours du temps, avec une analyse post-hoc (Bonferroni). Lorsque les statistiques concerneront 2 moyennes (le poids par exemple, ou la prise alimentaire), nous utiliserons un test de Student après vérification de la normalité de nos échantillons.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des milieux enrichis (nids végétaux, tubes) ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement afin d'identifier les animaux en souffrance.

Choix des espèces

Les modèles précliniques de rats et de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Npus utiliserons ici des souris femelles "jeunes adultes" (8 semaines au début des procédures) afin de mimer la pathologie humaine de l'anorexie mentale qui touche essentiellement des jeunes filles.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un entraînement forcé sur tapis roulant et sur échelle, des tests moteurs et un test de reconnaissance d'objet, puis une suspension du train arrière jusqu'à trois semaines simulant la microgravité, avec des injections intrapéritonéales, avant le prélèvement de tissus. Le porteur indique que la suspension provoque un stress et une perte de poids modérée les premières 48 heures. Il justifie l'usage animal par l'absence de modèle cellulaire des effets "corps entier" de l'impesanteur, pour une recherche à finalité spatiale et clinique.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de développer des méthodes de prévention des effets néfastes de l’inactivité physique et de la microgravité sur la santé. Celui-ci s’intègre donc à la fois dans la recherche spatiale (astronautes) mais également dans la recherche clinique (alitement, immobilisation, opération, sédentarité…). Pour répondre à ces objectifs, 7 équipes de recherche de spécialités différentes travailleront enssemble pour évaluer l’effet des méthodes de prévention sur l’ensemble de l’organisme et plus particulièrement l’appareil locomoteur qui est fortement impacté. L’expérimentation proposée sur le modèle rongeur devra permettre de mettre en place des recommandations pour une étude clinique humaine future, et proposer des hypothèses de travail pour des recherches cliniques en lien avec la sédentarité. Ces travaux se centreront autour de trois axes principaux : 1- Évaluer l’intérêt d’une préparation physique spécifique avant un vol spatial. 2- Evaluer un assortiment de moyens de prévention du déconditionnement de l’appareil locomoteur pendant la phase d’immobilisation. 3- Evaluer l’étendue de la récupération dans les différents organes de l’appareil locomoteur induite par les moyens de prévention proposés. L’ensemble de ce projet expérimental vise donc à la fois des études scientifiques fondamentales centrées sur les différents environnements (microgravité et remise en charge), mais également l’évaluation de contremesures pour préparer les défis spatiaux de demain. Enfin, bien que ces expérimentations soient réalisées dans le cadre d’étude du domaine spatial, leurs résultats auront un impact important dans le domaine clinique sur Terre, que ce soit en rapport à l’alitement prolongé, la sédentarité, les maladies chroniques, ou le vieillissement, ainsi que sur les moyens de prévention.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet permettront à la fois d’accroitre les connaissances scientifiques en lien avec l’appareil locomoteur et la microgravité/inactivité, mais également d’évaluer des mesures concrètes pour en atténuer les effets néfastes en se basant sur de nombreux travaux antérieurs. En effet, l’inactivité est, dans l’espace mais également sur Terre dans le domaine clinique, un réèl probème en matière de santé. Ces expérimentations sont de fait à la fois une étape importante pour réaliser les objectifs de demain dans l’exploration spatiale, mais également un axe de recherche primordiale en matière de santé humaine. Ces résultats pourraient donner lieu à des recommandations importantes lors d’immobilisation, de blessure, d’alitement prolongé dans le domaine clinique, ou encore au cours du vieillissement.

Procédures

Les animaux suivront un programme d’entrainement sportif sur tapis roulant (au maximum 9 fois 30 minutes pendant 3 semaines). Cet entraînement sera qualibré de manière individuelle. Les animaux suivront un programme d’entrainement sportif sur échelle d’escalade (au maximum 9 fois 30 minutes pendant 3 semaines). Cet entraînement sera qualibré de manière individuelle à l’aide d’un test de force d’agripement et un test de retournement réalisé une fois préalablement. Les animaux réaliseront également une évaluation de coordination motrice (3 fois 5 min), une évaluation de composition corporelle (3 passages de moins de 2 minutes), et un test comportemental de reconnaissance d’objet (1 passage; 15minutes). Enfin, une partie des animaux seront suspendus selon le modèle de suspension du train arrière (7 jours ou 3 semaines) et 3 injections intra-péritonéales (5 secondes par injection) seront réalisées au cours des 3 derniers jours de suspensions respectant les volumes préconisés (200 microlitres).

Impact sur les animaux

La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera lié à l’inactivité induite par le modèle de suspension du train arrière. En effet, celui-ci peut induire du stress et durant les premières 48h une perte de poids modérée et des bouchons externes des voies uro-génitales. Cette perte de poids s’arrête ensuite. Les animaux seront aussi stréssés lors des tests de force et de l’entrainement sur tapis roulant. Les animaux auront 3 injections intra-péritonéales respectant les volumes recommandés, et induisant une douleur légère de courte durée.

Devenir

A la fin des expérimentations, les animaux sont euthanasiés pour permettre les différents prélèvements de tissus pour analyses.

Remplacement

Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps entier de l’impesanteur sur l’ensemble des tissus d’interêt ainsi que les effets des méthodes de prévention. De plus, ces expériementations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de part les résultats très précieux qu’elle génère.

Réduction

Ces expérimentations ont été adaptées pour diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés au moyens de deux axes de réductions. Le premier axe consiste à centraliser les procédures de 7 équipes de recherches lors d’une unique expérimentation animale, réduisant ainsi par 7 le nombre de souris qui aurait été classiquement employées. Le deuxième axe consiste à réduire le nombre d’animaux par groupe au moyen d’analyses statistiques réalisées préalablement en vue des effets attendus (logiciel Gpower).

Raffinement

Du point de vue du raffinement, les procédures engagées durant l’expérimentation n’entraînent pas de douleurs spécifiques. Pour l’activité physiques et les tests sportifs réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit. L’animal est libre de cesser de courir lorsqu'il le souhaite. Pour les différentes supplémentations de molécules naturelles, celles-ci sont associées à la nourriture. Les procédures de suspension du train arrières ont été validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toute complication. La température d'élevage sera de 24 à 25 degrés pour éviter le refroidissement des animaux. De plus, les souris seront suspendues par deux pour éviter l’isolement social. Chaque procédure possède également des points limites et critères d’arret stricts. Nous assureront un suivi quotidien des animaux et mesureront le poids des souris tous les 3 jours. Enfin, pour permettre les prélèvements finaux des différents tissus d’intérêt les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse avant d’être mis à mort.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été privilégiée pour plusieurs raisons. Même si il existe des différences subtiles, les espèces murines rat et souris se rapprochent de l'humain en ce qui concerne le système musculosquelettique. Les souris sont par exemple utilisées lors des missions dans l'espace « Bions » pour étudier les effets de la microgravité réèlle. De très nombreuses études ont employé ce modèle et témoignent de sa fiabilité. Les animaux seront utilisés entre 3 et 7 mois en fonction de leurs groupes. Cette tranche d'âge permet de travailler avec des animaux adultes mais non vieillissant, ce qui nous est indispensable vis à vis des différentes analyses (exemple : analyses osseuses) réalisées par la suite.

4 011 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de médicament et de cellules cancéreuses, une incision de la glande mammaire sous anesthésie, de nombreux prélèvements sanguins et jusqu'à sept séances d'imagerie, pour comparer des nanoparticules censées mieux cibler les tumeurs du sein HER2 positives. Le porteur reconnaît des nuisances tumorales, perte de poids et nécrose, et prévoit une mise à mort selon des points limites. Il qualifie la recherche de nouveaux traitements d'"indispensable" et renvoie les bénéfices pour les patientes, une toxicité réduite, au conditionnel.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer chez la femme en France, dont 10 à 20% sont HER2 positifs (protéine exprimée à la surface des cellules positives). Cependant, des résistances aux traitements proposés actuellement se développent, et la toxicité systémique (toxicité qui affecte l’ensemble de l’organisme) des traitements existants reste problématique. Il reste donc indispensable de chercher de nouveaux traitements contre le cancer du sein. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules associées à des nanoparticules ciblant HER2, réduisant les effets secondaires dans le traitement du cancer du sein. Nous espérons ainsi ouvrir de nouvelles pistes pour résoudre cette problématique de santé publique.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanoparticules dans l’arsenal thérapeutique actuel du cancer du sein. La comparaison des différentes nanoparticules ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanoparticules sur le ciblage de la tumeur, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanoparticules pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer du sein humain grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

- Un groupe de 700 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis 2 prélèvements sanguin à deux jours d’intervalle, sous anesthésie (durée : environ 30 secondes). Les souris subiront cette séquence d’une semaine sur 4 semaines (4 injections et 8 prélèvements au total). - Un groupe de 2100 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie terminale (sans réveil) (durée : 30 secondes). - Un groupe de 210 souris subira 2 injections de cellules cancéreuses (10 secondes chacunes) sur animal anesthésié, puis une injection du médicament (7 à 15 jours après) sur animal vigile d’une durée de 10 secondes ; puis sera observée à 7 temps différents par imagerie sous anesthésie (durée : 30 secondes) réparties sur 3 jours. - Un groupe de 1001 souris subira 1 incision sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes) suivie d’une injection de cellules cancéreuses dans la glande mamaire sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes), puis 10 à 20 jours plus tard, huit injections du médicament (10 secondes) sur animal vigile, et deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (4 mois maximum), une injection de la luciférine (nécessaire à l’imagerie) sur animal vigile (durée 10 secondes) suivie de l’examen en imagerie (durée 1 min) sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de nuisances attendues sur les souris saines autre que la toxicité éventuelle de la molécule à haute dose (perte de poids, perte de poils). Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Les nuisances attendues pour l’incision du flanc sont des douleurs au niveau de la zone incisée. Les nuisances attendues pour les souris porteuses de tumeurs sont la nuisance due à la tumeur : perte de poids, nécrose, etc. Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Après injection intraveineuse, des irritations au point d’injections peuvent apparaître et seront surveillés.

Devenir

Les souris sont prélevées post-mortem pour des analyses ultérieures, elles seront donc toutes mises à mort. Les souris dont la pousse tumorale n'a pas prise seront mises à mort car elles ont étés injectées avec des cellules tumorales.

Remplacement

Nous avons préalablement réalisé des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. En effet, cette étude préclinique, visant à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanoparticules pour le traitement du cancer du sein nécessite obligatoirement l’utilisation d’animaux entiers pour déterminer la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique et leur efficacité.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible grâce au suivi par imagerie non invasive et non irradiante (croissance tumorale et biodistribution des formulations dans les modèles de souris porteuses du cancer du sein). Une étude préliminaire, avec un nombre restreint de groupes conditionnera la suite du projet, le nombre d’animaux annoncé est donc un nombre maximum.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Un analgésique sera localement appliqué sur les sites d’ouverture de la souris. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs sera mesurée tous les 3 jours. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la structure du bien-être animale.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La plupart des antécédents génomiques de la souris sont similaire à ceux de l’homme (env. 95%), ce qui rend les souris particulièrement utiles pour la recherche sur les maladies humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6-8 semaines, âge adulte de manière à avoir un poids corporel plutôt stable d’environ 20g.

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques et hypertendues, elles subissent des injections intrapéritonéales quotidiennes, une chirurgie, des séjours en cage métabolique, des mesures de pression et une échographie sous anesthésie, avant un prélèvement sanguin terminal et le prélèvement des organes. Le porteur reconnaît une possible atteinte du cœur, des reins et des rétines, et décrit un modèle où les souris urinent abondamment. Il indique recourir, malgré des cultures cellulaires, au modèle souris pour ses interactions entre organes, pour une étude dont le bénéfice annoncé se limite à mieux comprendre l'atteinte des vaisseaux.

Objectifs

Le diabète est une maladie vasculaire très répandue affectant plus de 500 millions de personnes en 2021. Les cellules endothéliales, tapissant la face interne des vaisseaux, sont les premières affectées par les modifications métaboliques générées par le diabète. Il est connu que l'excès de sucre dans le sang et une dérégulation de la composition du gras participe à l'atteinte des vaisseaux que l'on retrouve chez les patients diabétiques. Nos données ont permis d'identifier un potentiel système dérégulé dans le diabète et participant au maintien du fonctionnement normal des vaisseaux sanguins. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle de la protéine identifiée sur les vaisseaux chez des souris diabétiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'atteinte des vaisseaux sanguins dans le diabète.

Procédures

Une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours (20 sec/ jour) puis pendant 2 jours (20 sec/ jour). Une procédure chirurgicale (10 min). Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement par semaine). Mesure non invasive de la pression artérielle (15min par semaine) et échographie sous anesthésie (20min). Un prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié (1 minute).

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire soulagée par des analgésiques. Effets des modèles pathologique de diabète et d'hypertension artérielle: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines).

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes

Remplacement

Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.

Réduction

Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur le logiciel en ligne https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/ ce qui donnait 25 animaux par groupe requis. 5 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques et hypertendues urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet pour éviter toute souffrance. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire.

Choix des espèces

La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, les modèles de diabète et d'hypertension artérielle utilisés au cours de ce projet sont établis et validés par la communauté scientifique. Souris adultes agées de 8-12 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.

200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'extraction de leur cerveau. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique d'une à trois heures pour l'implantation d'une barre en acier et une injection virale, avec des fibres optiques dans le cerveau pour 100 d'entre elles, puis un à cinq mois d'entraînement en réalité virtuelle, tête fixée, isolée en cage et maintenue par restriction hydrique à 85 % de son poids d'origine. Environ 180 subissent ensuite une craniotomie, et des électrodes leur sont insérées dans le cerveau, parfois chaque jour, pendant un à quinze jours d'enregistrement. Le but est d'observer comment le cerveau prépare plusieurs décisions à la fois pendant une recherche de nourriture ou d'eau, comportement que le porteur qualifie d'"éthologiquement intéressant". Il écarte la drosophile au motif que son circuit neuronal diffère de celui des mammifères, et conclut qu'il "s'avère donc nécessaire" de recourir à la souris.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'identifier les principes neuronaux et computationnels indispensables à la flexibilité comportementale. L’hypothèse centrale est que le cerveau peut imaginer et préparer plusieurs décisions simultanément pour pouvoir changer plus facilement de décisions lorsqu'une situation change. Nous combinerons des tâches comportementales réalisées en réalité virtuelle chez la souris avec des techniques innovantes d’électrophysiologie et de stimulation optique (optogénétique), et des modèles théoriques de décodage de l’activité neuronale. Cette approche nous permettra d’enregistrer et de manipuler simultanément des centaines de neurones dans un large réseau cortico-sous-cortical impliqué dans le contrôle volontaire de l’action durant la prise de décision. Nous choisirons d’étudier un comportement éthologiquement intéressant : le « foraging », qui consiste en la recherche de ressources en nourriture ou en eau.

Bénéfices attendus

Le projet produira une quantité sans précédente de données utiles à un large éventail d'études scientifiques. Ces données seront partagées avec la communauté scientifique après publication des résultats. Ces données seront donc réutilisables pour répondre à des questions scientifiques variées. Plus particulièrement, les résultats de ce projet pourront offrir une nouvelle approche de la flexibilité cognitive au cours de la prise de décision. Ce projet éclairera également les variations individuelles dans les processus décisionnels, ouvrant la voie pour mieux comprendre la diversité comportementale et ses dysfonctionnements cognitifs.

Procédures

(1) Implantation d’une barre en acier et de fibres optiques : cette phase expérimentale consiste en une procédure chirurgicale qui s’effectuera sur tous les animaux (N = 200) sous anesthésie générale. Durant la procédure, une injection virale sera réalisée à l’aide d’un nano-injecteur et des fibres optiques miniatures seront insérées dans le cerveau de certains animaux (N = 100) sur lesquels nous effectuerons des expériences de stimulations optiques. Ces chirurgies stéréotaxiques durent entre 1h et 3h pour chaque animal. (2) Entrainement : cette phase durera entre 1 mois et 5 mois en fonction de la performance de l’animal. Les animaux (N = 200) seront placés dans la plateforme expérimentale 5 jours par semaine pendant 20 à 60 min et pesés quotidiennement avant la séance. (3) Craniotomies : certains animaux entrainés (approximativement N = 180) subiront une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui permettra de réaliser de petites craniotomies. Cette intervention est rapide (20 à 30 min). (4) Enregistrement : l’animal sera placé dans sa plateforme expérimentale et une ou plusieurs électrodes seront lentement insérées jusqu’à leurs positions finales. Cette procédure pourra être répétée quotidiennement pendant plusieurs jours. Cette phase peut durer entre 1 et 15 jours en fonction des résultats. (5) Mise à mort : Tous les animaux (N = 200) seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets plus ou moins nuisibles à la santé des animaux peuvent être attendus. 1) Isolement : pour leur protection, les animaux devront être hébergés individuellement dans leur cage 2) Restriction hydrique : les animaux seront maintenus à 85% de leur poids originel 3) Interventions chirurgicales sous anesthésie : les conséquences de ces interventions sont parfois néfastes (hémorragie, infection, détresse respiratoire, douleurs post-opératoires) 4) Implants : potentielle gêne occasionnée par un corp étranger 5) Stress lié à la manipulation : les animaux seront manipulés durant les phases de tests 6) Restriction des mouvements : les animaux auront la tête fixée durant les périodes de tests

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure dans le but de procéder à l'extraction du cerveau à des fins histologiques.

Remplacement

Pour évaluer la complexité des comportements adaptatifs, comme proposé dans ce projet, il est fondamental d'utiliser un modèle animal approprié qui ne peut être facilement remplacé par des expériences in vitro ou des modèles informatiques. D’autre part, l'étude des bases neuronales de la prise de décision par l’enregistrement et la manipulation sélective de l’activité des neurones nécessitent des techniques invasives qui ne peuvent pas être réalisées chez des sujets humains sains et extrêmement rarement chez des sujets malades. Certaines espèces d'invertébrés, telles que la mouche des fruits (drosophile), pourrait sembler adaptées à l’étude du comportement de foraging et aux manipulations génétiques des systèmes cérébraux. Cependant, l'anatomie du circuit neuronal de la drosophile est considérablement différente de celle des mammifères. Ainsi, les résultats scientifiques obtenus chez ces espèces ne sont pas facilement généralisables aux questions abordées dans ce projet. En l'absence de méthode de remplacement possible, il s’avère donc nécessaire d'avoir recours au modèle animal murin dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des résultats statistiques fiables et significatifs. L'utilisation d'outils électrophysiologiques comportant des centaines de sites d'enregistrement réduira aussi considérablement le nombre de sessions d'enregistrement et d'animaux nécessaires pour obtenir des statistiques fiables. Par ailleurs, les données comportementales et neuronales seront extraites des mêmes individus pour réduire encore d’avantage le nombre d’animaux. D’après nos études précédentes, nous estimons que 45 souris par axe de recherche sont nécessaires, et le double pour l'axe de recherche necessitant un comparaison entre un groupe test et un groupe contrôle (soit 180 animaux au total). Etant donné la difficulté technique qu’implique la réalisation des enregistrements et la bonne performance des animaux dans la tâche, un pourcentage de perte de l’ordre de 10% ou plus est à prévoir, ce qui augmente l’estimation finale à 200 animaux pour les 5 ans.

Raffinement

Des méthodes de raffinement seront mises en place dans le but d’atténuer les nuisances provoquées par les procédures expérimentales. Le poids des animaux sera surveillé quotidiennement et la poursuite du protocole de restriction hydrique sera décidée en fonction du bien-être des animaux. L’eau naturelle ad-libitum sera remise à disposition pour assurer la récupération totale du poids si la perte de poids est supérieure à 20%. Afin de réduire le stress, les animaux seront habitués, par étapes, à la présence et aux interactions avec l’expérimentateur plusieurs jours avant le début des tests. L’angoisse éventuellement ressenti par l’animal due à la contention sera atténuée par une habituation renforcée positivement via des récompenses (eau sucrée).  Pour prévenir la douleur et les inflammations, nous administrerons à chaque chirurgie des médicaments aux propriétés antalgiques, antipyrétiques et anti-inflammatoires.En cas de sècheresse ou rougeur légère de la peau autour de l’implant, l’animal sera traité localement par une solution dermatologique. Dès l’apparition de comportements anormaux (ex : absence de toilettage, perte de plus de 20% du poids) ou autres signes de souffrance (évalués sur une grille d’évaluation de la douleur) survenant après l’implantation, l’animal recevra un traitement analgésique en sous cutané. Si des signes de souffrances persistent plus de 72h l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle animal le plus approprié pour ce projet et il n'existe pas d'alternative méthodologique. Tout d’abord, l'organisation du néocortex chez la souris comporte des similitudes avec d'autres espèces de mammifères, y compris les humains, et peut donc être utilisée pour révéler des principes généraux de prise de décision. Les souris peuvent aussi être entraînées à effectuer des tâches assez complexes dans des environnements expérimentaux contrôles. Les outils génétiques pour cibler et moduler des populations spécifiques de neurones sont également très bien développés chez la souris et relativement faciles à utiliser. Comme les souris ont un cerveau relativement petit, il est aussi possible d’enregistrer plusieurs régions cérébrales simultanément. Le fait que toutes ces procédures soient devenues l'état de l'art chez la souris facilitera et accélèrera donc grandement l'avancement du projet. Nous utiliserons de jeunes adultes au moment de l’implantation (âgées de 8 à 12 semaines). Il est important que les animaux soient relativement jeunes pour un apprentissage plus rapide et une meilleure performance dans la tâche. Cependant, les animaux doivent avoir terminé leur croissance pour éviter que la taille de la boite crânienne ne change au cours de l’expérience.