Rongeurs

1940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine caudale, parfois complétée d'injections intrapéritonéales, pour développer des tumeurs du foie liées à des mutations de la protéine p53. Le porteur affirme que le foie, peu innervé, rend le développement tumoral peu douloureux et que les tumeurs sont collectées avant qu'elles n'affectent l'animal. Toutes les souris sont euthanasiées pour prélever le foie et analyser les tumeurs.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le principal cancer primitif du foie, dont l'incidence est en croissance constante. Il constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde, du fait notamment d’une rareté d’options thérapeutiques efficaces. Le CHC se caractérise par une importante hétérogénéité entre les tumeurs, que l’on doit mieux comprendre afin d’envisager de nouvelles options thérapeutiques adaptées à chaque patient. Notre projet de recherche vise à caractériser le rôle de mutations d’une protéine dans le développement des tumeurs de cancer du foie. Ces mutations, qui sont fréquemment retrouvées dans les tumeurs de patients, seront étudiées dans un modèle préclinique animal permettant d’évaluer les interactions entre la tumeur et le tissu environnant.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le cancer du foie (800 000 morts / an), étape requise pour le développement de stratégies thérapeutiques adaptées aux différences entre patients. Ils pourront d’ailleurs être étendus à d’autres cancers, p53 étant le gène le plus fréquemment muté dans cette pathologie.

Procédures

La grande majorité des animaux seront soumis à une seule injection dans la veine caudale (15 secondes). Pour certains groupes expérimentaux, ils seront soumis à la même injection dans la veine caudale, puis à deux injections intrapéritonéales (5 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets sont, pour certains animaux, le développement de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elle sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte pas le fonctionnement de l’organe. Les animaux sont évalués quotidiennement (avec une grille d’évaluation) pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies et analyser le développement de tumeurs dans cet organe.

Remplacement

Nous avons effectué le maximum d’expériences sur des lignées cellulaires surexprimant les différents mutants de p53, il est désormais nécessaire de réaliser les expériences in vivo, notamment pour l’étude de l'environnement immunitaire des tumeurs. Nous tenterons d’établir des lignées dérivées des tumeurs afin de réaliser une partie de l'étude en culture.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille de groupe pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique. De plus nous avons réduit le nombre d’animaux pour certains groupes contrôles.

Raffinement

Nous avons optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences précédentes montrent que les procédures expérimentales proposées préservent le bien-être animal. Une grille de score a été mise en place pour l’observation quotidienne des animaux afin d’euthanasier les animaux et collecter le foie avant le développement éventuel d’une gêne liée à la présence de tumeurs.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie. Le modèle proposé est le plus proche de la maladie humaine, permettant d’analyser les premières étapes du développement de tumeurs. La souris est également un modèle d’étude classique pour tester de nouveaux médicaments dans les cancers. Ces approches sont soutenus par de nombreuses publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).

2660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles subissent sous anesthésie une injection chirurgicale dans l'oreille interne pour tester des thérapies géniques contre la surdité d'origine génétique. Le porteur renvoie les bénéfices au long terme, un éventuel passage en clinique après démonstration d'efficacité sur les modèles cellulaires et animaux. Il décrit le recours à l'animal comme "nécessaire", faute selon lui de méthode alternative validée pour prédire l'efficacité in vivo.

Objectifs

La surdité est le déficit sensoriel le plus fréquent ; il touche 1 enfant sur 1000 à la naissance, un enfant sur 700 avant l’âge adulte et un pourcentage important de la population adulte. On estime actuellement à 80 % les origines génétiques des surdités de l’enfant. La part génétique des surdités apparaissant à l’âge adulte reste à déterminer mais sera probablement importante. Plus de 100 formes génétiques différentes sont actuellement identifiées dans les surdités isolées. Les thérapies actuelles pour les pertes d’audition sont pour l’essentiel des dispositifs médicaux, qui amplifient le son ou stimulent directement les neurones de la cochlée. Ces deux approches présentent des limites en termes d’efficacité particulièrement pour la perception du son dans un environnement bruyant, car tous les sons vont être amplifiés de façon quasi identique. Les thérapies géniques, sont des solutions pour restaurer la fonction auditive perdue ou altérée, dans le cas de surdité d’origine génétique. Une des difficultés de la thérapie génique est de trouver une solution pour atteindre la cochlée. Il y a plusieurs obstacles à franchir pour atteindre cette cible en raison des particularités anatomiques et physiologiques de l’oreille interne. Ce projet a pour but de proposer un modèle vivo qui permettra de valider l’efficacité de thérapies géniques afin de traiter les pertes auditives.

Bénéfices attendus

A court terme, valider ou non la poursuite d’un programme de développement de thérapie génique pour traiter les troubles de l’audition. A long terme, permettre le passage en phase clinique de thérapies géniques qui auront démontré une efficacité dans les modèles cellulaires et vivo des troubles de l’audition.

Procédures

L’injection unique par chirurgie d’une durée de 30 minutes, dans l’oreille interne des nouveau-nés est réalisée sous anesthésie générale. Aucun prélèvement ne sera effectué sur l’animal vivant. Les tissus de l’oreille pour des analyses histologiques, seront prélevés post mortem.

Impact sur les animaux

Une anesthésie et une injection avec un abord chirurgical, chez le nouveau-né, pour l’administration des substances d’essais directement au niveau de la cochlée. Ceci pouvant engendrer une douleur et/ou inflammation/suppuration post-opératoire. Une euthanasie en fin d’étude pour collecter les tissus frais de l’oreille pour des analyses histologiques.

Devenir

Tous les animaux des procédures 1, 2 et 3 sont euthanasiés en fin d’étude. L’ immunohistologie est nécessaire pour confirmer l’efficacité des produits, et ne peut se faire que post mortem.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas, à ce jour, de méthodes alternatives validées pour prédire l’efficacité in vivo les thérapies géniques en développement. Les atteintes des cellules ne peuvent pas être étudiées uniquement via la culture cellulaire ou les modèles informatiques car nous ne pouvons pas reproduire la complexité des mécanismes conduisant aux troubles de l’audition. Les candidats médicaments qui sont testés auront, lorsque c’est possible, préalablement démontré une activité sur des modèles vitro ou ex vivo afin de poursuivre les projets in vivo avec les candidats les plus prometteurs.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon les résultats de la bibliographie. Entre 6 et 10 nouveau-nés sont nécessaires pour tester chaque vecteur (AAV).

Raffinement

Dans nos études, les impératifs éthiques associés tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique, la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal seront intégrées. Les animaux disposent d’éléments participant à l’enrichissement de leur environnement et à l’améliorer des conditions d’hébergement. Apres administration intracochleaire, les nouveau-nés réveillés sont replacés avec les autres nouveau-nés de la portée. Des points limites spécifiques et adaptés sont mis en place afin de prévenir toute dégradation de l’état de santé des animaux. Un raffinement des techniques d’anesthésie est prévu dans la procédure N°1 afin d’obtenir la meilleure couverture anesthésique possibile.

Choix des espèces

La souris est l’espèce phylogénétiquement inférieure et est un modèle établi dans la littérature pour les études auditives. Les modèles de thérapie génique cochléaire sont développés chez le nouveau-né. Ceci en raison de l’abord chirurgicale qui est simplifié et d’autre part les nouveaux nés ne développent pas de pertes d’audition après l’acte chirurgical contrairement aux animaux adultes. C’est pourquoi ce stade de développement est le plus pertinent pour ce type de modèle. Les modèles de thérapie génique cochléaire sont développés chez le nouveau-né. Ceci en raison de l’abord chirurgical qui est simplifié et d’autre part les nouveau-nés ne développent pas de pertes d’audition après l’acte chirurgical contrairement aux animaux adultes. C’est pourquoi ce stade de développement est le plus pertinent pour ce type de modèle.

Bloquées jusqu'à quatre fois, éveillées, au fond d'un tube en plastique pour mesurer leur masse grasse, 1 392 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. 384 d'entre elles subissent une neurochirurgie sous anesthésie pour recevoir un implant ou un virus qui modifie leurs microglies, 128 une seconde chirurgie, 704 un test de tolérance au glucose après cinq heures de jeûne, et jusqu'à 448 passent deux semaines isolées en cage de calorimétrie. L'équipe nourrit des souris d'un régime hypercalorique riche en graisses pour étudier le rôle de ces cellules immunitaires du cerveau dans l'inflammation de l'hypothalamus et la prise de poids, avec l'ambition, à terme, de pistes contre l'obésité. Le porteur annonce six procédures mais ne liste que les "principaux gestes techniques", sans préciser combien de temps dure ce régime.

Objectifs

Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Une région du cerveau appelé hypothalamus regroupe des neurones sensibles aux signaux des autres organes du corps, les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. La consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses (High fat diet, HFD) entraîne une inflammation de l’hypothalamus. On sait que les microglies, qui sont les cellules immunitaires du cerveau (qui protègent le cerveau des attaques extérieures), sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. En effet, elles participent à l’inflammation hypothalamique suite à la consommation d’un régime HFD. Leur activation est variable en fonction de la période d’exposition au régime HFD (entre les premiers jours et plusieurs semaines). On sait que limiter l’activation des microglies en réponse au HFD limite l’inflammation. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans ces cellules restent mal connus. Nous faisons l’hypothèse que certaines molécules microgliales, qui sont impliquée dans les fonctions inflammatoires, participent aussi à la régulation de la prise de poids. Dans ce projet, nous souhaitons présicer le rôle des microglies dans le développement de l’inflammation hypothalamique en réponse à un régime hypercalorique afin de mieux les contenir et ainsi de prévenir la prise de poids. Notre ambition à terme est de permettre l’ouverture de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints d’obésité. Pour cette étude, nous allons utiliser des approches pharmacologiques et génétiques (utilisation d’animaux transgéniques). Nous utiliserons un modèle animal d’obésité, c’est-à-dire des animaux nourris avec une alimentation hypercalorique obésogène. Nous réaliserons un suivi métabolique chronique des animaux (prise alimentaire, tests métaboliques), ainsi que de nombreuses études moléculaires à partir des cellules cérébrales isolées. Ce projet comprend six procédures.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de la microglie dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans le cerveau. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation de la microglie afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite que la souris vigile soit maintenue en contention, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 1 à 4 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées au minimum de 3 semaines (1392 animaux). 2) Neuro-chirurgie : cette technique permettra soit de mettre en place un implant permettant d’injecter des traitements pharmacologiques, soit un virus qui permettra un changement génétique des microglies. Elle est réalisée sous anesthésie générale. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée dans la vie de l’animal (384 animaux). Une partie des 384 animaux subiront une seconde chirurgie de courte durée (10 minutes, 128 animaux) pour le remplacement d’un implant sous-cutané. 3) Test de tolérance au glucose : ce test nécessite de réaliser, après un jeûne de 5 heures, une injection de gluocose dans l’abdomen des souris, puis de mesurer leur glycémie à différents temps post-injection. Les 5 mesures de glycémie sont espacées d’au moins 15 minutes chacune. Ce test est réalisé sur souris vigiles. Un seul test sera réalisé durant toute l’étude (704 animaux). 4) Tests de calorimétrie indirecte (448 animaux concernés au maximum) : ces cages spéciales permettent d’enregistrer en temps réel la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et la dépense énergétique. Elles nécessitent d’isoler l’animal en cage individuelle (pendant deux semaines), qui sont enrichies avec un nid de coton et un bâtonnet de bois à ronger.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront parfois isolés à l’âge adulte (suite à une chirurgie ou lors des sessions de cages métaboliques). Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal ou limiter la dégradation des implants. Au-delà du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. L’incision de la peau du crâne et la déshydration induite par l’anesthésie peuvent provoquer des douleurs post-opératoires.

Devenir

À l’issue de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer des tissus, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les conqéquences des changements moléculaires microgliaux.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle de la microglie hypothalamique sur un ensemble de variables métaboliques intégrées, telles que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. A noter, ce projet a d’abord fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures cellulaires) afin de mieux cibler les voies de signalisation impliquées dans notre hypothèse. De plus, les modèles génétiques nécessaires pour répondre à notre question scientifique ont été développés chez la souris.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le métabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l'inflammation hypothalamique et la réactivité microgliale induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.

384 souris, 192 mâles et 192 femelles, porteurs ou non d'une mutation du récepteur Rarb, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès 4 semaines d'âge, elles sont gavées une fois par jour pendant quatre semaines avec l'un de trois traitements ou une solution saline, puis passent cinq tests : locomotion face à la nouveauté, coordination des membres, activité locomotrice enregistrée sur 32 heures, réflexes et mémoire, avant que la moitié soit tuée par perfusion intracardiaque sous anesthésie générale. Le porteur espère prévenir ainsi les symptômes d'une maladie neurologique rare, la MCOPS12, un bénéfice qu'il formule au conditionnel. Il qualifie ces tests de "non aversifs" et écrit en capitales que la souris "N'EST PAS REMPLAÇABLE".

Objectifs

Des mutations ponctuelles du recepteur à l’acide rétinoique beta (Rarb) sont à l’origine d’une maladie neurologique rare (MCOPS12) responsable de symptomes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodeveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostic vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations ponctuelles. Les souris mutantes présentent des symptomes moteurs similaires (n’affectant pas fondamentalement la vie des animaux qui peuvent marcher et se redresser sans aucun problème) à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle du récepteur dans le dévelopement et dans la fonction du striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire RARb contrôle le développement d’une sous-population de neurones (appelés neurones de type 1) dans le, alors que à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une autre sous population de neurones (appelés neurones de type 2). Notre objectif est de prévenir et/ou de normaliser les symptomes moteurs et cognitifs en modulant l’activité des neurones de type 1 et 2 afin de prévenir leur mort et/ou leur dysfonctionnement pour éviter l’apparition des symptomes. Les effets liés au mode d’administration des traitements seront contrôlés grâce à un traitement supplémentaire avec une solution saline, pour s’assurer qu’aucun effet observé ne soit en réalité que le résultat du stress causé par l’administration des composés. Nous avons donc 4 traitements différents à tester.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter de nouvelles pistes de traitements pour la maladie sur laquelle nous travaillons. En effet, notre objectif est de prévenir l’apparition des symptomes moteurs et cognitifs grâce aux différents traitements que nous allons utiliser en empêchant la perte de certains neurones responsables de ces symptomes. Si un ou plusieurs traitement(s) montre(nt) des effets bénéfiques, nous pourrions envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients.

Procédures

Les trois traitements pharmacologiques et le traitement contrôle avec de la solution saline (4 traitements différents) se feront sur des cohortes différentes provenant de 4 groupes distincts d’animaux porteurs, ou non, d’une mutation et agés de 4 semaines. Tous les traitements se feront par voie orale (gavage des animaux, 15 secondes par traitement) pendant 4 semaines, à raison d’un traitement par jour. Nous utiliserons 12 animaux par groupe et par traitement (12 x 4 x 4), soit 192 mâles et 192 femelles = 384 animaux au total. Les 4 semaines de traitement seront suivies d’une batterie de tests comportementaux non aversifs que chaque animal passera une seule fois : test 1 = 30 minutes, évaluation de la locomotion induite par la nouveauté, test 2 = 3 x 5 minutes, évalution de la coordination des membres, test 3 = 32h, évaluation de l’activité locomotrice, test 4 = 30 minutes, évaluation des reflexes, test 5 = 30 minutes, évaluation de lé mémoire. Un delai minimum de 1 jour sera respécté entre chaque test comportemental, afin de diminuer l’effet du stress sur les résultats obtenus. La moitié des animaux de chacun des 4 traitements = 192 animaux (96 mâles et 96 femelles), sera ensuite euthanasiée par perfusion intracardiaque après anesthésie générale. Une vérification de la perte des reflexes au niveau des membres et palpébral est réalisée avant tout acte chirurgical.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables ne dépasseront pas la gêne occasionnée par le gavage des animaux. En effet, les tests comportementaux effectués ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive est à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisé seront mis à mort afin de récolter le matériel biologique pour des analyses cellulaires et moléculaires qui compléteront les résultats obtenus en comportement.

Remplacement

Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique de la signalisation calcique et de la neurotransmission ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.

Réduction

Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée. De plus, nous n’utiliserons qu’un seul groupe d’animaux traités avec le vehicule (contrôle). En effet, les différents traitements seront préparés et administrés de la même manière, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux contrôle. Enfin, la réalisation de la procédure numéro 2 dépendra des résultats obtenus dans la procédure numéro 1. En effet, nous n’utiliserons la seconde procédure uniquement si les résultats de la première procédure ne sont pas concluants. En effet le caractère moins séléctif de la seconde molécule, permettra de moduler la signalisation calcique plus largement.

Raffinement

En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses et effectuées par des personnes compétentes et qualifiées (formations conception et chirurgie des rongeurs). Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans traitement préalable de composés pharmacologiques à des doses faibles. Les molécules pharmacologiques permettent de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Les traitements par gavage seront réalisés par des expérimentateurs formés à l’aide de canules souples afin d’éviter toute lésion interne. Un suivi du poids des animaux sera mis en place deux fois par semaine (le mardi et le vendredi), afin de detecter rapidement un signe de mal être. Les animaux seront aussi analysés méticuleusement tous les jours à l’occasion des traitements afin de vérifier leur état général.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle des mutations d’un gène dans la mise en place et la progression d’une maladie neurologique progressive rare, les performances comportementales et les fonctions de la signalisation calcique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans la plupart des cas des animaux de 4 semaines afin d’oberver les changements de comportements des animaux à la suite des traitements, avant même l’apparition de des symptomes.

277 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des tests de tolérance au glucose associant gavage et huit micro-prélèvements de sang, un test de reconnaissance d'objet et un test de préférence entre deux boissons, ainsi qu'un "test comportemental" que le porteur ne précise pas. Les mâles sont isolés après accouplement, ce qui peut induire un stress modéré, et tous les animaux sont tués pour prélever organes et tissus. Le porteur inscrit ce travail dans un consortium international sur l'effet de l'alimentation du père sur la descendance.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de l’alimentation paternelle sur la santé et le comportement de la descendance chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier l’impact du régime alimentaire paternel sur sa santé ainsi que sur celle de sa descendance. Ce projet fait partie d’un consortium international qui a pour but d’étudier les modifications d'expression des gènes duent à l’alimentation du père sur la génération suivante dans différentes espèces animales et chez l’Homme afin de déterminer comment le mode de vie peut impacter la santé de la descendance.

Procédures

Les pères auront 1 test de tolérance au glucose et la descendance 2 tests de tolérance au glucose, soit par test : 1 gavage (20s) ; 8 micro-prélèvements de sang (20s/micro-prélèvements). Chaque animal aura 1 test de reconnaissance d’objet nouveau (20 min d’habituation + entrainement et 10 min de test) ; 1 test comportemental (10 minutes) et un test de préférence entre deux boissons (sucrés ou non) (4 jours).

Impact sur les animaux

Un stress de courte durée peut être généré par les tests comportementaux. Une douleur modérée de courte durée associée au prélèvements de sang lors du test de tolérance au glucose. Les mâles F0 seront isolés afin d’éviter les bagarres après la mise en accouplement et pourront donc subir un stress modéré (contact visuel avec leurs congénères toujours possible).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer organes et tissus d’intérêts pour analyses.

Remplacement

Le but de ce projet est d'étudier l'effet de l'alimentation sur le comportement et le métabolisme d'un individu ainsi que sur celle de sa descendance. Pour cela nous ne pouvons nous passer d'un organisme vivant qui nous permettra d'obtenir plusieurs générations. Aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut remplacer l'animal dans ce projet.

Réduction

Le nombre de pères (n=9/régime) a été déterminé de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre d'animauxde la descendance découle du nombre de pères.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Pour les tests comportementaux, des périodes d’adaptation à la salle et au matériel sont prévues ainsi que des entrainements. Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation quotidienne des signes cliniques et la pesée hebdomadaire des animaux après la période d’acclimatation. Des points limites gradés précis et adaptés ont été défnis et seront appliqués à partir des observations faites sur les animaux. En cas d'atteinte d'un point limite, les animaux seront sortis de l'étude.

Choix des espèces

La souris a été choisie dans ce projet pour la facilité d’obtention d’une descendance (maturité sexuelle jeune et obtention de portées importantes). De plus les tests comportementaux et métaboliques étant très bien décrits pour cette espèce, la souris est un modèle de choix pour ce projet. Tous les tests seront réalisés sur des animaux adultes.

86 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des chirurgies vasculaire et intracérébrale, l'injection d'un ARN interférent dans le cerveau et l'auto-administration intraveineuse d'héroïne pendant vingt jours. Les animaux sont tués pour prélever leurs cerveaux. Le porteur présente comme bénéfice attendu la possibilité de répondre aux relecteurs d'un manuscrit déjà soumis, ce qui situe l'enjeu au niveau d'une publication.

Objectifs

Notre objectif est mettre en évidence un rôle fonctionnel de Sez6 dans la mise en place d’un comportement compulsif de prise d’héroïne chez le rat, en diminuant son expression et en étudiant le comportement des rats vis-à-vis de la prise de drogue.

Bénéfices attendus

Notre objectif est mettre en évidence un rôle fonctionnel de Sez6 dans la mise en place d’un comportement compulsif de prise d’héroïne chez le rat. Ce résultat nous permettra de répondre aux experts qui ont évalué le manuscrit que nous avons soumis.

Procédures

Les chirurgies vasculaires (qui durent 30 min) et les chirurgies intracérébrales (qui durent 15 min) seront réalisées sous anesthésie générale. Les injections des ARN interférents se feront par voie intracérébrale, et la mise en place du comportement d’auto-administration par voie intraveineuse d'héroïne. Le comportement des animaux sera enregistré pendant 20 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont essentiellement liées à la procédure chirurgicale. L’administration d’antalgiques est prévue en pré et post opératoire.

Devenir

A l'issue des 2 procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement des cerveaux.

Remplacement

Ce projet ayant pour but d’étudier le rôle fonctionnelle d’une protéine sur le comportement d’auto-administration de drogue, aucune méthode alternative n’existe. Il s'agit en effet d'étudier le comportement spontané et volontaire des animaux après apprentissage, ce qui ne peut être réalisé sur des modèles alternatifs (approches in silico, in vitro ou ex vivo).

Réduction

Pour réduire au miminum le nombre de rats utilisés, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données obtenues lors de projets précédents. Pour les études d’éfficacité de l’ARN interférent à diminuer la quantité de notre protéine d’intérêt nous aurons 5 rats par condition. Pour les études comportementales, chaque groupe sera constitué de 14 animaux pour révéler des différences inter-individuelles comportementales.

Raffinement

L’hébergement s’effectuera dans un environnement enrichi (présence de nids végétaux et de tunnels opaques). Les rats seront également logés à deux par cage d’habitation permettant un enrichissement social tout en assurant un espace d’hébergement suffisant. L’angoisse des animaux sera réduite par une manipulation quotidienne par l'expérimentateur. Les chirurgies sous analgésie et anesthésie générale seront réalisées par une personne compétente ayant suivie la formation réglementaire de chirurgie. De plus les animaux seront observés quotidiennement, et pesés tous les 2 jours. Ces observations permettent de graduer les points limites pour l'apparence et la perte de poids. En fonction du degré de gravité, les animaux seront isolés et mis sous antibiotiques (perte de poids 15%; apparence avec dos rond, agitation ou immobilité importante).

Choix des espèces

L’investigation d’une pathologie telle que l’addiction nécessite d’étudier une espèce animale phylogénétiquement voisine de l’homme pour pouvoir reproduire la maladie. Le rat est un modèle de référence dans le domaine des addictions. Il possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. De plus, il est idéal pour les études comportementales. Le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés. Les animaux testés seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 7 semaines environ et ne sont pas testés avant leur 8ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte pour pouvoir éviter le facteur confondant de l’âge sur les facteurs comportementaux mesurés. En effet, l’âge peut influencer de manière significative l’état émotionnel et le comportement de l’animal.

380 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau ou le cœur, un inhibiteur administré par la bouche, une irradiation cérébrale et la pose répétée de cathéters, le porteur anticipant perte de poids, de motricité et de sensibilité liées aux métastases cérébrales. Les animaux sont tués à un stade défini ou après une étude de survie. Le porteur évalue un traitement des métastases cérébrales pour une application clinique lointaine, et affirme que le microenvironnement tumoral rend le remplacement in vitro impossible.

Objectifs

Au vu des échecs des thérapies standard existantes en ce qui concerne les MC, ce projet vise à évaluer l’intérêt de nouveaux traitements pour ces MC en ciblant spécifiquement leur microenvironnement tumoral hypoxique. En effet, l’hypoxie est connue pour être un facteur de mauvais pronostic dans de nombreuses tumeurs. Elle est à l’origine de l’expression des facteurs de transcriptions Hypoxia Inducible Factors (HIFs), principaux facteurs de résistance à la radio- et chimiothérapie. Ce projet visera donc à évaluer l’intérêt d’un inhibiteur de HIF-2 dans les MC, qui s’avère déjà être prometteur dans le traitement des carcinomes rénaux. Ce projet permettra également de mieux caractériser le microenvironnement tumoral des MC dans différents modèles chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de connaître l'efficacité d'un inhibiteur de HIF-2 en combinaison ou non à la radiothérapie externe pour le traitement des métastases cérébrales, ce qui pourrait être appliqué à long terme par la suite en clinique. Il apportera également des connaissances complémentaires sur le microenvironnement tumoral de ces tumeurs et permettra de trouver des cibles thérapeutiques supplémentaires potentielles contre ces métastases cérébrales.

Procédures

Implantation, réalisée sous anesthésie générale (isoflurane) : - Implantation intracérébrale : une seule fois par animal, durée de l’acte = 30 minutes maximum, 240 animaux (rats nudes) - Implantation intracardiaque : une seule fois par animal, durée de l’acte = 20 minutes maximum, 140 animaux (souris nudes) Administration per os d’une solution contrôle ou de l’inhibiteur : durée du geste = 1 minute maximum, 2 fois par jour par cycle de 21 jour ON/7jours OFF, 320 animaux (180 rats nudes et 140 souris nudes) Irradiation : Elles auront lieux sous anesthésie générale à l’isoflurane comme décrit précédemment. L’irradiation sera réalisée à une dose de 4 Gy pendant 3 jours. Le protocole complet d’irradiation dure 30 minutes par animal sur 120 rats nudes. La pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale comme décrit précédemment et anesthésie locale au niveau de l’incision. La pose de cathéter dure maximum 10 minutes et sera réalisée 4 fois maximum sur chaque animal, 300 animaux sont concernés par cet acte.

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de métastases cérébrales au bout d’une vingtaine de jours. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale dans la première semaine suivant la fin de l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte du point limite.

Devenir

Les animaux seront soit mis à mort à un temps défini ou à un volume tumorale défini, en fonction des résultats obtenus en procédure 1, 3 et 5, afin de réaliser des analyses post-mortem, soit ils seront gardés en vie pour une étude de survie jusqu’au point limite puis mis à morts.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, à savoir qu'en plus de la simple cellule cancéreuse, les tumeurs sont composées d’un microenvironnement tumoral. Celui-ci comprend une composante hypoxique, inflammatoire et vasculaire, toutes connues pour avoir un effet majeur sur la réponse aux traitements tels que la radiothérapie et la chimiothérapie. Ici, l'utilisation de modèles in vivo, permet de travailler sur des modèles de métastases cérébrales entièrement intégré à l'organisme. Ces modèles, à la différence des modèles in vitro, permettent l'intégration de ces différentes composantes, qui sont indispensables pour la compréhension des mécanismes de développement tumorale et de réponses aux différents traitements. Par conséquent, ce projet ne peut pas s’effectuer sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L'utilisation de méthodes d’imagerie non invasive telle que l’imagerie IRM permet de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur sans nécessité de mettre à mort plusieurs animaux à chacun de ces temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle dans chaque point de l’étude et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Des simulations statistiques en ligne ont été réalisées à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe. . Concernant les modèles d’injection intracérébrale et intracardiaque, ces simulations ont mis en évidence un nombre minimum de 4 animaux par sous-groupe. Connaissant la littérature et l’expérience du laboratoire pour ces modèles, le nombre d’animaux doit être augmenté à 10 animaux maximum par sous-groupes. Le nombre maximum d’animaux sera de 10 mais il pourra cependant être revu à la baisse. Dans la mesure où ce nombre de 10 animaux par groupe n’est pas réalisable en même temps pour toutes les procédures, 2 cohortes de 5 animaux seront réalisées. Les résultats de la première cohorte nous permettront de réaliser des statistiques séquentielles et ainsi de décider du nombre d’animaux à inclure dans la deuxième cohorte pour obtenir des résultats significatifs et ainsi de réduire le nombre d’animaux au total.

Raffinement

La présence quotidienne de personnels formés et expérimentés permettra le suivi du bien-être des animaux et la mise en place des différentes procédures du projet. L’apparence physique, mais aussi le poids des animaux sera suivi, par ce même personnel 3 fois par semaine et permettra d’évaluer l’inconfort des animaux. Les animaux seront scorés 3 fois par semaine via différents item, lorsque l’un des items atteindra un score de 1, l’animal sera scoré quotidiennement et différentes mesures seront mises en place en fonction de l’item pour éviter à l’animal d’atteindre un score de 2. Le score établi en amont comme point d’arrêt des expériences sera lorsqu’un des items possède un score de 2, ou que l’ensemble des items donnera un score un score supérieur à la moyenne. Si malgré les mesures en place, le score limite est dépassé pendant plus de 48h, l’animal sera mis à mort. En raison de l'utilisation de modèles animaux immunodéprimés, les animaux seront hébergés en zone EOPS, ils seront placés dans des cages individuelles, ventilées et mis sur des portoirs ventilés. L’entrée dans l’animalerie se fait via un sas et un protocole de désinfection est mis en place. Le port d’une combinaison intégrale, avec masque chirurgical, charlotte et sur-chaussures est nécessaire pour accéder à l’animalerie. Ils seront hébergés en groupes sociaux permettant une stimulation sociale (2 animaux par cage pour les rats et 5 animaux par cage pour les souris). Ils bénéficieront également d’enrichissement dans la cage : roue d’activité, stimulation sensorielle par différents objets. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriées et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Pour les deux espèces utilisées, l'utilisation de souches nude est nécessaire en tant qu’hôte pour des modèles de développement de tumeurs humaines afin d’éviter leur rejet. Le modèle de développement des MC par voie intracérébrale chez le rat est pertinent car il possède un cerveau dont la taille est supérieure à celui de la souris. Cela nous permet d’utiliser des appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée, une imagerie de haute résolution mais aussi l’utilisation de la TEP, qui, à cause de sa résolution spatiale, nous contraint à imager des cerveaux plus volumineux comme celui du rat. Le modèle de développement de MC chez la souris, injectées par voie intracardiaque est le modèle se rapprochant le plus pour inclure les phases précoces d’apparition et développement des MC chez l'Homme. Ce modèle est bien décrit et validé dans la littérature ainsi que dans notre laboratoire. Les animaux seront âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. A ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l'évolution des animaux sur des temps longs. De plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux, ce projet scientifique est une poursuite de travaux antérieurs réalisés dans l'équipe et cela nécessite que nous puissions compléter les expériences avec des animaux du même âge. En effet, toute modification de l'âge nécessiterait de nouvelles mises au point.