Rongeurs
Thérapie génique par AAV pour le traitement du syndrome de l’X fragile
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour amener une thérapie génique vers un essai chez l'humain, 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, douze étant opérées sans réveil. Elles reçoivent une injection dans le cerveau, sous anesthésie, d'un vecteur viral censé corriger le syndrome de l'X fragile. Le porteur écrit espérer combler le fossé entre sa preuve de concept et l'autorisation d'un essai clinique. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour mesurer correction et toxicité.
Objectifs
Le syndrome de l’X fragile est l’une des principales causes de handicap intellectuel héréditaire et de troubles liés à l’autisme. Il concerne environ 1 garçon sur 4 000 et 1 fille sur 8 000 dans le monde. Cette maladie, qui affecte le développement du cerveau, est grave, incurable et nécessite un accompagnement médical et social tout au long de la vie. L’objectif de ce projet est de développer un traitement innovant basé sur la thérapie génique pour le syndrome de l’X fragile. Les chercheurs ont découvert qu’un dysfonctionnement dans la régulation de certains signaux chimiques du cerveau joue un rôle clé dans cette maladie. En ciblant ce mécanisme, il pourrait être possible de corriger certains symptômes. Des études préliminaires sur des souris atteintes d’une forme similaire de la maladie ont montré que ce traitement expérimental, administré directement au cerveau, permettait d’améliorer durablement les symptômes comportementaux et biologiques. Le projet vise maintenant à franchir une étape supplémentaire : adapter ce traitement pour qu’il puisse être testé chez l’humain, en vérifiant son efficacité et sa sécurité. L’objectif final est de proposer une nouvelle approche thérapeutique pour les personnes atteintes du syndrome de l’X fragile.
Bénéfices attendus
Le syndrome de l'X fragile (FXS) est une maladie très invalidante qui touche environ 150 000 personnes en Europe, dont environ 12 000 en France (https://www.xfra.org/). À ce jour, aucune option thérapeutique n'a été validée pour le FXS. En l'absence de traitements efficaces, il existe un besoin important non satisfait de solutions pour cette maladie très invalidante. Le projet vise à trouver un traitement pour le FXS, plus précisément à tester un traitement par thérapie génique dans un modèle préclinique souris de la maladie. Ce projet vise à tester une nouvelle option thérapeutique pour le FXS en ciblant un mécanisme clé dérégulé dans la maladie et en fournissant une alternative avantageuse à la correction du gène FMR1, un gène difficilement exploitable en raison de sa toxicité et de la difficulté à le doser. Nous espérons que ce projet permettra de combler le fossé qui subsiste entre notre preuve de concept initiale d'une approche de thérapie génique dans le modèle murin de la maladie et l'autorisation pour un essai clinique. Nous espérons notamment démontrer la validité préclinique du traitement par vecteur viral (virus adeno-associé) pour corriger les principaux déficits comportementaux du modèle murin FXS en l'administrant de manière efficace et sûre au cerveau de la souris à l'aide d'une voie d'injection applicable à l'homme. À la fin de ce programme, nous espérons proposer une solution prête à être testée sur des modèles animaux plus grands. Les innovations dans le système d'administration développé pour le FXS pourraient être adaptées et utilisées pour d’autres maladies génétiques.
Procédures
225 souris recevront une injection intracérébrale d’un vecteur viral ou d’une solution contrôle saline sous anesthésie générale. La durée des injections sera de 25 minutes pour les injections intra-thalamiques ou intra-striatales et 50 minutes pour les injections intra-striatales et intra-hippocampales combinées. La durée des anesthésies sera de 30 minutes pour les injections intrathalamiques et intra-striatales ou 55 minutes pour les injections intra-striatales et intra-hippocampales combinées.
Impact sur les animaux
Contention de l’animal suivie d’une injection sous la peau avec une seringue, ce qui entraine un stress léger et une douleur légère de courte durée. Lors du réveil en fin de session de chirurgie, les souris peuvent être désorientées et stressées. L’injection intracérébrale d’un vecteur viral (AAV) peut induire une inflammation.
Devenir
Afin de caractériser l'effet de nos traitements; notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les cerveaux des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder a euthanasie de l’ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tissus, est indispensable pour évaluer les effets de correction neurologique mais également la toxicité des traitements testés.
Remplacement
Un modèle d'organoïde humain de cerveau antérieur existe pour le syndrome de l'X fragile et le présent projet comporte d’ailleurs une partie où ce modèle sera utilisé en collaboration. Cependant l’utilisation de ce modèle est limité et ne permet pas actuellement d’investiguer les aspects neurologiques complexes (déficience intellectuelle, troubles du comportement) sur lesquelles une action du traitement est recherchée. Le modèle organoïde humain est cependant utilisé en complément du modèle souris pour valider les aspects de correction moléculaire et electrophysiologique dans un modèle humain, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés (altérations comportementales du modèle et leur correction par un traitement de thérapie génique aux AAV). Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant nos données préliminaires.
Raffinement
Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Afin de diminuer l'effort en convalescence, de la nourriture gelifiée est placée dans les cages pendant 48h. Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée pour décider l'arrêt des expériences avec l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est oriente vers la souris car c’est le modèle actuellement le mieux validé et le plus robuste pour tester un nouveau traitement visant une correction comportementale. Les animaux, âgés de 5 semaines, seront utilisés pour réaliser la procédure d’injection car ils correspondent au stade enfant/jeune adolescent humain visé par la preuve de concept de ce projet de thérapie génique. Après 4 semaines, correspondant au temps nécessaire à l’action du virus AAV les animaux seront soumis à des batteries de tests comportementaux pendant 2 semaines. Une proportion des animaux (n=10 par cohorte) sera conservée pour surveiller le comportement normal des animaux 2 mois après le début du traitement, pour démontrer l’innocuité du traitement à long terme, puis seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de tissus nécessaires à des analyses moléculaires et cellulaires.
Caractérisation de deux modèles murins porteurs d’une mutation du gène Stac3
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les souris dont la faiblesse musculaire évolue vers la paralysie ou la détresse respiratoire sont mises à mort. 540 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, porteuses de mutations reproduisant une myopathie humaine sans traitement existant. Le porteur reconnaît un risque de mortalité potentiellement élevé et des défauts respiratoires. Toutes sont tuées pour prélever muscles et organes et corréler les mesures fonctionnelles aux analyses des tissus.
Objectifs
Le projet vise à caractériser in vivo les conséquences fonctionnelles et moléculaires d’une mutation associée à une myopathie tubulaire chez l’Homme, à l’aide de modèles murins génétiquement modifiés. À ce jour, aucun modèle animal spécifique de cette maladie n’existe, ce qui limite la compréhension des mécanismes physiopathologiques et le développement de thérapies ciblées. Cette myopathie est caractérisée, chez l’Homme, par une faiblesse musculaire progressive, une fatigue importante, une difficulté à marcher, une instabilité posturale et, dans les formes plus sévères, une atteinte respiratoire et une limitation majeure des activités de la vie quotidienne, rendant la maladie fortement invalidante. Trois modèles murins sont utilisés dans cette étude. Le premier reproduit fidèlement la mutation génétique la plus fréquemment observée chez les patients, ce qui lui confère une forte pertinence translationnelle. Le deuxième est un modèle dans lequel le gène est modifié soit dans l'ensemble de l'organisme, soit exclusivement dans le muscle, permettant de comparer les effets selon l'étendue de la modification. Le troisième est un modèle inductible dans le muscle squelettique, dans lequel la modification génétique est activée de manière ciblée à 4 semaines d'âge, afin d'évaluer les conséquences d'une perte complète de la fonction du gène sur la fonction musculaire. Les données obtenues devraient contribuer à mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette myopathie et à identifier des biomarqueurs fonctionnels et histologiques utiles pour le développement de stratégies thérapeutiques. Ce modèle animal unique, qui reproduit la forme génétique humaine la plus fréquemment observée, constituerait ainsi un outil essentiel pour la recherche translationnelle et l’évaluation préclinique de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la myopathie tubulaire associée à cette mutation, en identifiant les mécanismes moléculaires et fonctionnels qui sous‑tendent la faiblesse musculaire et l’invalidité. Il conduira à la mise au point d’un premier modèle animal pertinent de cette maladie, reproduisant la forme génétique humaine la plus fréquemment observée et comblant un vide majeur dans la recherche préclinique sur cette pathologie rare. Ce modèle servira également à identifier des biomarqueurs fonctionnels et histologiques utiles pour suivre l’évolution de la maladie et évaluer l’efficacité de traitements potentiels. Il permettra de valider ou d’invalider des cibles thérapeutiques et de tester des approches pharmacologiques ou géniques dans un contexte proche de la situation humaine, avant tout essai clinique. À terme, ce travail ouvrira la voie à de futures stratégies thérapeutiques capables de ralentir la progression de la maladie, d’améliorer la force musculaire et la qualité de vie des patients, et de réduire l’invalidité liée à cette myopathie. Enfin, les connaissances acquises pourront également enrichir la compréhension des myopathies tubulaires et des troubles de la signalisation calcique musculaire, avec un impact potentiel sur d’autres pathologies musculaires rares partageant des mécanismes communs.
Procédures
Le phénotypage comportemental est réalisé chez l'animal vigile, sans anesthésie. L'enregistrement de l'activité locomotrice spontanée est effectué pendant un maximum de 22 h, période au cours de laquelle les animaux sont hébergés individuellement sans isolement sensoriel (ni olfactif ni auditif), toutes les 2 semaines à partir de 5 semaines. Les tests de coordination motrice (durée maximale de 4 minutes par essai) et d'endurance (durée maximale de 2 minutes par essai) sont réalisés toutes les 2 semaines à partir de 5 semaines. Les tests de force musculaire sont réalisés toutes les semaines à partir de 4 semaines, avec une durée maximale de 1 minute par essai. Ces tests sont répétés jusqu'à 16 semaines maximum. Les mesures de force musculaire in vivo consistent en l'enregistrement de la production de force des muscles antérieurs sous anesthésie profonde par inhalation d'un mélange gazeux continu. Chaque séance dure au maximum 15 minutes et est réalisée toutes les 2 semaines à partir de 5 semaines, jusqu'à 16 semaines maximum. Les mesures de force musculaire in situ impliquent une intervention chirurgicale mineure sous anesthésie générale profonde associée à une analgésie, dont l'administration ne dépasse pas 5 secondes. Chaque séance dure au maximum une heure et est réalisée une seule fois par animal, sans réveil, en fin de procédure (8 ou 16 semaines). L'induction génétique consiste en l'administration d'un agent inducteur, une fois par jour pendant 5 jours consécutifs, chez des souris âgées de 4 semaines, avec une durée de manipulation d'environ une minute par jour. Ces interventions sont conçues pour être aussi brèves et peu répétées que possible, tout en permettant la collecte des données nécessaires à la caractérisation complète du phénotype musculaire et à l'analyse moléculaire et histologique.
Impact sur les animaux
Les effets prévus sur les animaux dans le cadre de ce projet sont principalement liés aux manipulations expérimentales, à l'induction génétique et au phénotypage musculaire, et restent compatibles avec un niveau de souffrance modéré contrôlé. D'une part, les souris porteuses de la mutation ciblée développeront une faiblesse musculaire progressive, une fatigue accrue et une diminution de la force de préhension et de la performance locomotrice, en lien avec la myopathie tubulaire modélisée. D'autre part, dans les cas les plus sévères, des défauts de couplage excitation-contraction avec paralysie et difficultés respiratoires pourraient apparaître. Les risques de mortalité sont potentiellement élevés, justifiant les stratégies alternatives et un suivi clinique strict. Ces signes se traduiront par une mobilité réduite, une difficulté à marcher ou à maintenir l'équilibre lors des tests de coordination motrice et d'endurance, ainsi que par une perte de masse musculaire progressive chez les animaux les plus sévèrement atteints. Les procédures de phénotypage comportemental et locomoteur non invasif induiront un stress temporaire lié à la manipulation et au changement d'environnement, mais sans douleur ni lésion tissulaire. L'activité locomotrice spontanée de l'animal sera mesurée, ce qui impliquera un hébergement individuel pendant une durée maximale de 22 heures, sans isolement sensoriel (maintien du contact olfactif et auditif avec les congénères), afin de limiter au maximum le stress lié à la solitude. L'induction génétique à 4 semaines, ainsi que les procédures d'anesthésie générale à 8 ou 16 semaines, s'accompagneront d'un stress lié à la contention de l'animal (d'une durée de 15 secondes maximum) et au point de ponction, mais ces procédures seront réalisées de manière rapide et standardisée, avec une manipulation douce et une formation du personnel visant à minimiser l'anxiété. Des effets indésirables transitoires tels qu'une baisse d'appétit, une léthargie ou des troubles digestifs mineurs peuvent survenir après l'induction génétique
Devenir
Le sort prévu pour tous les animaux, consiste en leur mise à mort pour la collecte de tissus. La collecte terminale de muscles et d’organes est nécessaire pour corréler phénotype fonctionnel et analyses moléculaires/histologiques. Les prélèvements sont réalisés après la mise à mort, ce qui évite toute douleur supplémentaire.
Remplacement
Aucun modèle non animal ne permet actuellement de reproduire de manière satisfaisante la physiopathologie d’une myopathie tubulaire liée à cette mutation, ni de rendre compte de la complexité de la fonction musculaire in vivo, de la locomotion, de la fatigue et des interactions tissulaires. Les modèles cellulaires (cultures de myoblastes, lignées musculaires) ou les approches in silico ne permettent pas d’étudier l’ensemble du phénotype fonctionnel, ni la dynamique de la maladie au cours du temps dans un organisme entier. L’utilisation de souris génétiquement modifiées reste donc indispensable pour comprendre les mécanismes moléculaires de la pathologie, valider la pertinence de cibles thérapeutiques et tester des approches précliniques. Le modèle animal développé reproduit génétiquement la forme humaine de la maladie la plus fréquemment observée, ce qui renforce sa pertinence translationnelle et limite, à l’avenir, le recours à d’autres modèles animaux moins ciblés ou moins représentatifs. En ce sens, le choix de ce modèle murin répond à une nécessité scientifique forte et constitue une application rigoureuse de la règle de remplacement, dans la mesure où aucun système non animal ne peut aujourd’hui remplacer l’animal dans ce contexte spécifique.
Réduction
Le plan expérimental repose sur une répartition optimisée des lots (un lot par stratégie de recombinaison) avec un effectif par génotype (contrôles, hétérozygotes, homozygotes) calculé pour détecter des différences biologiquement significatives dans la force musculaire, la locomotion et la morphologie, sans surdimensionnement inutile. Les procédures de phénotypage non invasif et les mesures de force musculaire in vivo et in situ sont regroupées autant que possible sur les mêmes animaux, afin d'obtenir un maximum d'informations fonctionnelles par individu. Les prélèvements terminaux de muscles et d'organes sont réalisés sur chaque animal à la fin de la période de traitement ou de survie, ce qui permet de corréler données fonctionnelles et analyses moléculaires/histologiques sans multiplier les cohortes. Enfin, le recours à un modèle animal unique, reproduisant génétiquement la forme humaine la plus fréquemment observée, évite le développement de plusieurs modèles redondants. Cette approche limite, à l'avenir, le besoin d'animaux supplémentaires pour des études précliniques ultérieures.
Raffinement
Le bien être des nouveaux nés est surveillé quotidiennement par observation clinique (état général, activité, présence d'une poche de lait, interaction avec la mère et les congénères) et par pesée régulière afin de détecter précocement tout signe de détresse, de retard de croissance ou de souffrance. Au sevrage vers 4 semaines, les animaux sont pesés 2 à 3 fois par semaine afin de surveiller leur état général ; en cas de perte de poids, la pesée est effectuée quotidiennement pour suivre l'évolution et adapter rapidement la prise en charge. En cas de difficultés de locomotion ou de prise alimentaire, de la nourriture en gel est ajoutée dans les cages pour faciliter l'accès à la nourriture et prévenir la dénutrition. Les procédures de phénotypage comportemental et locomoteur sont non invasives et réalisées chez l'animal vigile, avec une durée de test strictement limitée et une fréquence régulée pour éviter la fatigue et le stress cumulatif. Les mesures de force musculaire in vivo et in situ sont réalisées sous anesthésie générale profonde et anti douleur, avec une durée d'anesthésie minimale, une surveillance respiratoire continue et un maintien de la température corporelle afin de préserver le bien être de l'animal. Les injections sont réalisées avec une contention douce et une manipulation rapide. L'isolement des animaux pour la mesure de l'activité locomotrice spontanée est limité à 22 heures maximum et réalisé sans isolement sensoriel (contact olfactif et auditif maintenu avec les congénères). Enfin, la mise à mort en fin de procédure, suivie de prélèvements terminaux, évite la poursuite de l'expérience au delà d'un stade où la progression de la myopathie pourrait entraîner une détérioration importante de l'état des animaux.
Choix des espèces
Ce projet vise à mieux comprendre une maladie musculaire héréditaire en utilisant des souris comme modèle. Les souris sont choisies car elles permettent de reproduire de façon fiable les anomalies musculaires observées chez l’homme, notamment la forme génétique la plus fréquente de cette maladie, tout en offrant un contrôle génétique précis grâce à des outils modernes de modification du génome. Ce modèle pourrait également servir de base pour évaluer de futures approches thérapeutiques visant à corriger ou atténuer les effets de cette maladie. Les souris seront utilisées uniquement après le sevrage, à partir de 4 semaines d’âge, puis suivies jusqu’à 16 semaines. Ces stades correspondent à des animaux jeunes puis adultes, ce qui permet d’étudier à la fois l’apparition et l’évolution de la maladie dans le temps. Des tests fonctionnels, des analyses musculaires et des examens histologiques seront réalisés pour caractériser précisément les effets de la mutation étudiée sur la force et la structure des muscles.
Evaluation des interventions thérapeutiques sur la dynamique de développement oculaire.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Rats : 240
Lapins : 200
740 rats, souris et lapins, le plus souvent juvéniles, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des traitements oculaires par gouttes jusqu'à six fois par jour ou par injections dans l'œil, sous anesthésie, pour étudier des traitements de la myopie sur un œil en croissance. La plupart sont tués à la fin pour analyser leurs yeux. Environ 10 %, surtout des mères et des petits écartés avant le début, peuvent être réutilisés dans d'autres protocoles.
Objectifs
Le développement de l’œil durant l’enfance et l’adolescence constitue un processus dynamique et particulièrement sensible aux influences environnementales, génétiques et biologiques. Au cours des premières années de vie, la croissance oculaire est marquée par une série d’étapes critiques conduisant à la maturation des structures anatomiques essentielles – cornée, cristallin, rétine, sclère – ainsi qu’à l’établissement des fonctions visuelles fondamentales telles que l’acuité, la coordination binoculaire et l’amétropie. Cette période de plasticité accrue rend l’œil des jeunes particulièrement réactif aux facteurs externes, notamment aux traitements pharmacologiques, interventions optiques ou approches thérapeutiques émergentes. Dans un contexte où la prévalence des troubles de la vision, en particulier la myopie, connaît une augmentation importante à l’échelle mondiale, l’intérêt pour des stratégies de prévention ou de modulation de la croissance oculaire s’est intensifié. Plusieurs traitements existent déjà pour influencer cette croissance — comme les collyres à faible dose d’atropine, les lentilles défocalisantes ou certaines approches comportementales. Parallèlement, le développement de nouveaux agents thérapeutiques, fondés sur des mécanismes cellulaires, moléculaires ou biomécaniques, ouvre des perspectives prometteuses mais encore insuffisamment comprises. Étudier les effets de traitements actuels ou innovants sur l’œil en développement constitue donc un enjeu scientifique majeur. Une telle recherche permettrait de mieux comprendre comment ces traitements modulent la physiologie oculaire (croissance axiale, remodelage scléral, réponses rétiniennes) tout en garantissant leur innocuité à long terme. Elle contribuerait également à éclairer les mécanismes fondamentaux qui sous‑tendent la croissance oculaire, améliorant ainsi la prise en charge des jeunes patients et orientant le développement de futures interventions thérapeutiques plus ciblées et plus sûres.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est d’évaluer avec précision l’impact de nouvelles approches thérapeutiques sur la croissance de l’œil en développement. Durant l’enfance et l’adolescence, les structures oculaires – notamment la sclère, la choroïde et la rétine – subissent des processus de maturation complexes qui peuvent être influencés par l’administration de traitements. Il est donc essentiel de caractériser de manière rigoureuse les effets potentiels, bénéfiques ou indésirables, d’un produit administré par voie oculaire ou systémique au cours de cette période sensible. Le projet permettra d’examiner finement les modifications structurelles et fonctionnelles susceptibles d’apparaître après exposition au traitement. Les paramètres d’intérêt pourront inclure : des variations de la croissance axiale du globe oculaire, des modifications du remodelage scléral ou de l’épaisseur cornéenne, des altérations des couches rétiniennes ou choroïdiennes, des perturbations éventuelles des voies de signalisation impliquées dans la régulation de la croissance oculaire. L’évaluation s’appuiera sur des examens ophtalmologiques in vivo reconnus pour leur fiabilité et leur caractère non invasif, tels que : l’examen à la lampe à fente, la rétinographie, la pachymétrie, l’électrorétinographie (ERG), et, si nécessaire, des examens complémentaires comme la biométrie axiale ou l’OCT. Ces techniques permettront de suivre avec précision l’évolution des structures oculaires ainsi que la fonction visuelle, et de détecter à la fois les effets recherchés et d’éventuels effets indésirables induits par le traitement. Ces travaux contribueront à identifier les stratégies thérapeutiques les plus sûres et les plus efficaces pour intervenir sur un œil en croissance, tout en approfondissant la compréhension des mécanismes biologiques impliqués. Ils permettront également d’optimiser les modalités d’administration du produit et d’assurer que son utilisation future s’inscrive dans une démarche rigoureuse, conforme aux exigences scientifiques et éthiques.
Procédures
Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à différentes interventions réparties sur une période allant de 1 à 12 mois, selon les objectifs et la réponse au traitement évalué. Ces interventions comprennent : 1. L’administrations du produit : Elles pourront être réalisées par instillation (1 à 6 fois/jour), nécessitant seulement une contention et durant quelques secondes ; par injection intra ou péri oculaire, généralement hebdomadaire mais pouvant aller jusqu’à une fréquence tous les deux jours si nécessaire ; par injection systémique, quotidienne ou espacée, durant 1 à 2 minutes. Les injections seront effectuées sous anesthésie locale et/ou générale légère afin d’immobiliser l’animal et d’éviter toute douleur. 2. Les examens ophtalmologiques : Les animaux feront l’objet d’un suivi in vivo comprenant : Lampe à fente (en baseline puis régulièrement, durée < 5 min), la biométrie axiale pour la mesure de la longueur du globe, l’OCT pour l’analyse de l’épaisseur et de l’organisation rétino choroïdienne, la rétinographie, l’ERG pour l’évaluation de la fonction rétinienne, la pachymétrie pour mesure de l’épaisseur cornéenne, la tonométrie si nécessaire pour mesurer la pression intraoculaire. Ces examens qui durent en moyenne 10-15min seront effectués une fois par semaine le premier mois, et regroupés autant que possible sous une seule anesthésie. Ils seront mensuel par la suite. Si plusieurs séances sont nécessaires, un intervalle de 1 à 2 jours sera respecté pour le bien être de l’animal. 3. Suivi et conditions d’examen : Les procédures nécessitant une immobilité stricte (biométrie, OCT, ERG…) seront réalisées sous anesthésie générale légère. Pendant la manipulation les yeux seront régulièrement humidifiés pour éviter le dessèchement cornéen et les animaux seront maintenus sur un support chauffant pour prévenir l’hypothermie. Après chaque intervention, les animaux seront replacés rapidement dans leur cage pour limiter le stress. Les conditions d’hébergement seront adaptées à chaque espèce, avec des enrichissements favorisant le bien être (abris, matériaux à ronger, plateformes…). 4. Les prélèvements sanguins: Ils pourront être effectués en général une fois par semaine, sous contention ou anesthésie selon l’espèce et la technique, et dureront 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Dans le cadre des procédures prévues dans ce projet – incluant l’administration du produit par voies oculaires ou systémiques, les anesthésies répétées nécessaires aux gestes techniques et les évaluations in vivo de la structure et du fonctionnement oculaires – plusieurs nuisances ou effets indésirables potentiels peuvent être attendus. Bien que ces procédures soient globalement peu invasives et généralement bien tolérées, certains points doivent être anticipés. 1. Effets indésirables liés aux anesthésies légères. Les anesthésies utilisées pour l’administration du produit ou les examens ophtalmologiques (ERG, rétinographie, OCT, etc.) peuvent provoquer des effets transitoires tels qu’une hypothermie per- et post‑anesthésique, compensée par un tapis chauffant, une sécheresse cornéenne due à la diminution du clignement, ou une brève désorientation au réveil. Ces effets sont réversibles et bien contrôlés par les mesures habituelles. 2. Effets indésirables liés aux administrations oculaires. Les instillations ou injections péri‑ ou intra‑oculaires peuvent entraîner une irritation conjonctivale légère, une augmentation temporaire des sécrétions oculaires, une sensation de gêne ou un comportement de frottement, surtout en début d’intervention, ainsi qu’un faible risque d’inflammation locale, en général transitoire. Ces manifestations sont attendues, modérées et diminuent rapidement. 3. Effets indésirables liés aux examens répétés. La répétition des examens ophtalmologiques in vivo peut induire un stress léger et transitoire lié aux manipulations, ainsi qu’un risque mineur d’irritation locale, notamment en cas d’utilisation répétée de collyres. 4. Effets potentiels liés au traitement étudié. Selon la nature du produit administré, des effets spécifiques peuvent apparaître, tels que des modifications temporaires de la surface oculaire, des variations des paramètres anatomiques (comme l’épaisseur cornéenne ou le volume choroïdien) ou encore des altérations fonctionnelles détectées par ERG. Ces éléments feront l’objet d’un suivi régulier afin d’évaluer leur intensité, leur évolution et leur réversibilité. Globalement, les nuisances attendues sont modérées, transitoires et réversibles, et feront l’objet d’une surveillance continue. Des mesures adaptées seront systématiquement mises en place afin de minimiser l’inconfort et garantir le respect des exigences éthiques et réglementaires en vigueur.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux ayant suivi la totalité du protocole seront euthanasiés de manière éthique et conforme à la réglementation, afin de permettre les analyses ex vivo nécessaires. Ces analyses comprendront notamment : des études histologiques des structures oculaires (rétine, choroïde, sclère), des dosages biochimiques ou moléculaires, ainsi que des évaluations morphologiques complémentaires indispensables à la validation scientifique des résultats. En revanche, les mères et les animaux non inclus dans l’intégralité de la procédure, estimés à environ 10 % (hors exclusions pour atteinte d’un point limite), pourront être réutilisés dans d’autres protocoles compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement retirés avant l’induction car les examens de baseline peuvent révéler : une anomalie anatomique ou physiologique, un défaut oculaire préexistant, ou un critère rendant l’induction de la myopie non pertinente ou non fiable. Ces individus n’auront subi ni induction, ni administration de traitement expérimental. Ils n’auront été exposés qu’à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère (lampe à fente, OCT, biométrie), sans conséquences durables. Dans ces conditions, leur réutilisation éventuelle s’inscrit pleinement dans les principes des 3R, en permettant une réduction du nombre total d’animaux utilisés tout en garantissant la protection du bien‑être animal et le respect des exigences scientifiques du projet.
Remplacement
L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, composé de structures anatomiques et physiologiques étroitement interconnectées (cornée, cristallin, rétine, choroïde, sclère, nerf optique). Ces tissus interagissent en permanence avec leur environnement local et systémique, et leur fonctionnement dépend d’équilibres mécaniques, physicochimiques et biologiques essentiels à la régulation de la croissance oculaire. Bien que des approches alternatives telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico aient progressé ces dernières années, elles restent insuffisantes pour reproduire l’ensemble des interactions structurelles, fonctionnelles et pharmacocinétiques d’un œil vivant. Ces systèmes ne permettent notamment pas de simuler de manière fiable les modifications tridimensionnelles des tissus oculaires, l’évolution de la croissance axiale, les réponses sclérales, choroïdiennes ou rétiniennes, ni les mécanismes intégrés impliqués dans la régulation du développement du globe oculaire. Dans ce contexte, l’étude in vivo demeure indispensable pour atteindre les objectifs du projet, permettant : D’observer de manière complète et dynamique les processus physiologiques impliqués dans la croissance oculaire, incluant l’allongement axial, le remodelage scléral et les adaptations rétiniennes et choroïdiennes. D’évaluer l’efficacité et la tolérance de traitements administrés par voies oculaires ou systémiques au sein d’un organisme intégrant vascularisation, innervation, contraintes mécaniques et régulations neuro sensorielles. D’étudier les effets potentiels à long terme sur les tissus oculaires – sclère, rétine, choroïde – dans un environnement physiologique complet, ce qui n’est pas réalisable in vitro ou par simulation numérique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été volontairement limité afin de respecter les principes éthiques en expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour assurer la fiabilité et la robustesse des résultats. Une analyse de puissance sera réalisée avant chaque série expérimentale afin de déterminer l’effectif nécessaire pour détecter un effet significatif. Ce calcul permettra, lorsque possible, de réduire le nombre d’animaux requis sans compromettre la validité scientifique du projet. Dans une démarche active de réduction, plusieurs stratégies complémentaires seront mises en œuvre. L’utilisation de méthodes non invasives de suivi oculaire in vivo (imagerie, biométrie, examens fonctionnels) permettra de réaliser des suivis longitudinaux chez les mêmes individus, évitant ainsi des sacrifices à différents temps d’analyse. Lorsque scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être examinés, l’un recevant le traitement et l’autre servant de contrôle interne, ce qui limite l’augmentation des effectifs. Par ailleurs, l’optimisation et la standardisation des protocoles expérimentaux, incluant les paramètres d’administration du produit, les conditions environnementales et les variables biologiques, contribueront à réduire la variabilité interindividuelle et à renforcer la cohérence des résultats. Enfin, une attention particulière sera portée à la qualité des soins et à la compétence des expérimentateurs afin d’assurer le bien être des animaux tout au long de l’étude.
Raffinement
Un suivi quotidien rigoureux des animaux sera mis en place afin de détecter précocement tout signe de stress, d’inconfort ou d’effet indésirable lié aux procédures expérimentales. Cette surveillance s’inscrit dans une approche proactive reposant sur des points limites adaptés aux modèles utilisés et aux interventions réalisées, permettant d’identifier rapidement toute altération du bien‑être et de déclencher sans délai des mesures appropriées afin de prévenir toute souffrance. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à leurs besoins physiologiques et comportementaux, avec un logement en groupe pour les rongeurs dans des cages enrichies. Les rongeurs auront un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Chez les lapins juvéniles, une alimentation ad libitum sera maintenue durant la phase de transition (environ dix jours), puis un rationnement adapté sera appliqué selon les recommandations en vigueur. L’environnement sera enrichi (abris ou mezzanine selon l’espèce, matériaux à ronger, supports favorisant l’exploration) afin de préserver un bon équilibre comportemental et psychologique. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie générale, notamment pour l’administration de traitements ou des examens exigeant une immobilité stricte ; une anesthésie locale pourra y être associée si pertinent. Une analgésie pré‑opératoire sera mise en œuvre dans une logique préventive, et une antibioprophylaxie locale pourra être ajoutée en fonction du risque infectieux. Le suivi reposera principalement sur des techniques non invasives permettant une évaluation répétée de la structure et de la fonction oculaires. Lorsque nécessaire, une anesthésie légère et brève sera utilisée. Après chaque anesthésie, les animaux seront maintenus sur un support chauffant avec hydratation oculaire jusqu’au réveil, puis replacés dans leur environnement habituel afin de limiter le stress. Le projet s’inscrit dans une démarche de raffinement continu, intégrant l’ajustement des pratiques sur la base des observations cliniques et comportementales et l’application de seuils d’intervention adaptés. Il a été validé par un comité d’éthique et sera suivi par la structure dédiée au bien‑être animal, garantissant la conformité réglementaire et la pertinence des mesures mises en œuvre.
Choix des espèces
Ces espèces offrent une grande flexibilité pour les suivis longitudinaux, la biométrie, l’imagerie oculaire et l’analyse fonctionnelle ou moléculaire. Leur physiologie oculaire connue contribue à la reproductibilité des observations et à la comparabilité des données avec d’autres études précliniques. Le choix du rat, de la souris et du lapin s’inscrit dans une démarche scientifique et éthique visant à maximiser la pertinence biologique tout en respectant les principes de réduction du nombre d’animaux. Leur complémentarité permet d’aborder la croissance oculaire à différentes échelles anatomiques. Les animaux seront inclus à un stade juvénile (période s'étendant à quelques jours pour les rongeurs à quelques semaines pour les lapins) correspondant à une période de croissance oculaire active, durant laquelle les tissus comme la rétine, la choroïde et la sclère présentent une plasticité élevée tout en étant suffisamment matures pour répondre aux manipulations expérimentales. Cette phase est essentielle pour étudier l’évolution de la croissance axiale et les effets d’un traitement administré par voie oculaire ou systémique chez des rats, des souris et des lapins. À ce stade, la présence de la mère reste indispensable pour les rongeurs. Les animaux pourront ainsi être reçus avec leur mère, ou issus de femelles gestantes dont la mise bas aura lieu directement dans l’établissement. Lorsque les petits seront suffisamment autonomes, les mères seront progressivement séparées et pourront être réutilisées dans un autre projet si leur état le permet. Pour les lapins, la période d'intérêt étant plus importante, la présence de la mère ne sera pas nécessaire.
Mise en place d’une méthode alternative pour le suivi longitudinal du passage d’anticorps dans le cerveau, visant à réduire l’utilisation de souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Opérées puis soumises à cent minutes de tests d'activité locomotrice, 88 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une puce mesure leur température pour suivre le passage d'anticorps vers le cerveau. Le projet s'intitule mise en place d'une méthode alternative pour réduire l'utilisation de souris, et annonce jusqu'à 80 % d'animaux en moins que les méthodes classiques. Il tue malgré tout 88 souris, dont les ovaires et le cerveau sont prélevés, et sert de base à un projet plus large.
Objectifs
Dans cette étude pilote, nous voulons savoir si les anticorps que nous développons peuvent atteindre leur cible dans le cerveau chez la souris. L’objectif est de mettre en place une méthode alternative qui permet de suivre en temps réel le passage de ces anticorps grâce à une puce mesurant la température sur plusieurs heures, sans devoir sacrifier des animaux à chaque mesure. Cette étude permettra de tester si la technique fonctionne, quel anticorps est le plus efficace, quelle dose utiliser et quelle voie d’administration est la meilleure.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de cette étude pilote est de mettre en place une nouvelle méthode qui réduit le nombre d’animaux utilisés tout en permettant de mesurer plus efficacement si les anticorps atteignent le cerveau. Cette étude servira de base pour un projet plus large visant à montrer les effets bénéfiques de ces anticorps sur les troubles du spectre autistique et la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale (une fois, 15 minutes par animal) et effectueront des tests de comportement (100 minutes par animal) pour mesurer leur activité locomotrice. Une administration (1 min) sera réalisée. Les animaux recevront une dose d’antalgiques et d’anesthésiques (1 min) avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
La contention, l’injection des anticorps et le test de comportement peuvent entraîner un léger stress pour l’animal. Les souris seront soumises à des procédures chirurgicales pouvant entraîner une diminution transitoire de leur bien-être et, très rarement, des infections.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les organes prélevés pour l’étude directement (ovaires) mais aussi pour des études ultérieures (cerveau).
Remplacement
Les anticorps sont d’abord développés et testés sur des cellules en laboratoire. Seuls les 5 plus prometteurs seront évalués dans cette étude pilote chez la souris. Il n’existe pas de méthode alternative pour mettre en place cette technique, car elle nécessite un organisme vivant entier, depuis l’injection des anticorps jusqu’à l’observation de leurs effets sur la température, afin de démontrer leur passage dans le cerveau.
Réduction
Cette étude pilote consiste justement à mettre en place une méthode alternative pour réduire le nombre d’animaux utilisés (jusqu’à 80 %) par rapport aux méthodes classiques. Nous avons optimisé le nombre d’animaux pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides.
Raffinement
L’environnement des souris est enrichi et renouvelé régulièrement pour optimiser le maintien de leur chaleur corporelle et de leur bien-être. Les injections et les tests de comportement seront réalisés dans une pièce calme et faiblement éclairée, et seront les plus brefs possibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, les animaux seront habitués à cette pièce et au contact des expérimentateurs, notamment afin de vérifier leur état de santé. Les souris soumises aux procédures chirurgicales seront traitées avec des antidouleurs jusqu’à leur rétablissement pour limiter leur douleur et, comme pour tout changement chez un animal, feront l’objet d’une surveillance renforcée. Des points limites adaptés à chaque procédure ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Les souris sont de petits animaux sociaux, et dont les comportements sont proches de ceux de l’homme. Notre but est d’étudier les effets bénéfiques des anticorps dans les modèles de souris des troubles autistiques et la maladie d’Alzheimer, qui impactent fortement la qualité de vie chez l’homme. À l’heure actuelle, les quantités d’anticorps produites dans notre laboratoire sont compatibles avec une utilisation chez la souris adulte âgée de 2 mois, ayant un cerveau mature.
Organisation spatiale d’une protéine impliquée dans le glioblastome et effet de son inhibition sur l’immunité cérébrale
- Recherche appliquée
- Cancers
Implantées dans le cerveau avec des cellules cancéreuses, 140 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. L'étude cherche où agit une protéine du glioblastome et teste un anticorps la ciblant, seul ou avec une immunothérapie. La tumeur peut provoquer douleurs, céphalées et perte de poids, et des points limites déclenchent la mise à mort des souris dont l'état se dégrade. Les animaux sans tumeur sont eux aussi tués pour éviter tout développement tardif.
Objectifs
Les chercheurs ont identifié une protéine qui joue un rôle important dans le développement et la résistance du glioblastome, un cancer du cerveau particulièrement agressif. Cette étude vise à comprendre où et comment cette protéine agit dans la tumeur, afin de mieux expliquer l’apparition de la maladie. Elle permettra également d’évaluer l’efficacité d’un traitement innovant, basé sur un anticorps ciblant cette protéine, utilisé seul ou en association avec une immunothérapie, et d’en mesurer l’impact sur les défenses immunitaires du cerveau.
Bénéfices attendus
Le cancer du cerveau étudié dans cette étude est l’une des plus fréquentes tumeur originaire du cerveau, et en dépit des efforts de la recherche, cette pathologie reste incurable. Les traitements actuels sont très délétères et la survie des patients après diagnostic est de 12-18 mois. Cette étude évaluerait l’efficacité d’un nouveau traitement.
Procédures
Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées (3x/semaine
Impact sur les animaux
Toutes les manipulations (pesées, traitements) peuvent entrainer du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil) lors de la chirurgie et des imageries. Les nuisances liées à une procédure chirurgicale (douleurs au niveau de la plaie, céphalées).
Devenir
Tous les animaux porteurs de tumeurs seront mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet afin de pouvoir récolter différents organes et/ou les tumeurs pour des analyses biologiques. Les animaux non porteurs ne pourront pas être réutilisés et devront également être mis à mort afin d'éviter un développement de tumeurs de manière tardive.
Remplacement
La protéine d’intérêt étudiée est impliquée dans plusieurs mécanismes associés aux tumeurs qui nécessitent donc la présence de multiples populations cellulaires en interactions complexes. Les cancers du cerveau se caractérisent par la diversité des cellules qui les composent ainsi que toutes les interactions entre elles = microenvironnement tumoral. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension de l’impact de notre protéine d’intérêt. D’après les publications scientifiques, cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires (qui contiennent en général un nombre très limité de types cellulaire différents) mais uniquement dans les tumeurs chez la souris où l’on retrouve un microenvironnement tumoral complet avec tous les types cellulaires comme les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires, les cellules des tissus touchés par ce type de cancer. Les tests précliniques sont aussi indispensables pour valider la capacité d’un nouvel outil thérapeutique à atteindre la tumeur au niveau du cerveau (organe protégé par une multitude de barrières physiologiques), et vérifier son efficacité seul ou en combinaison avec des traitements anti-cancéreux existant comme l’immunothérapie pour élaborer de nouvelles stratégies de traitement.
Réduction
Le nombre de groupe et l’effectif de chaque groupe d’animaux a été réduit au maximum en se basant sur la littérature et l’utilisation de tests statistiques, notamment pour caractériser l’expression spatiale de la protéine d’intérêt au niveau du cerveau des souris.
Raffinement
Les souris ont une période d’habituation aux expérimentateurs qui vont suivre le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour améliorer leur bien-être (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, suivi de la croissance tumorale etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Des points limites adaptés sont mis en place au-delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. L’implantation intracrânienne, les injections et le suivi de croissance tumorale sont réalisés par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux avec au besoin anesthésie et antidouleurs adaptés.
Choix des espèces
La souris sera le modèle dans ce protocole, nous utiliserons des mâles et femelles à 8 semaines pour induire la formation de tumeurs d’une manière proche à ce type de tumeurs chez l’Homme, puis nous suivrons cet avancement chez les mêmes individus. La souris est utilisée car elle permet de maintenir la diversité cellulaire dans les tumeurs qui est nécessaire à l’étude de notre protéine d’intérêt. De plus cette protéine n'est pas exprimée dans toutes les espèces mais on retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils destinés à l'analyse des tumeurs qui n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris.
Role postnatal de Usp28 dans les muscles squelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Pour savoir si un gène répare les micro-lésions du muscle adulte, 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le gène est éteint par un vecteur viral injecté sous anesthésie, puis les souris sont poussées à courir sur un tapis incliné jusqu'à soixante minutes d'effort intense provoquant des lésions musculaires, avec des stimulations pour les relancer si elles s'arrêtent. Chez chaque souris, une patte part en histologie et l'autre en biochimie, et toutes sont tuées pour prélever les muscles. Les applications annoncées, mieux soigner les blessures sportives ou la faiblesse liée à l'âge, sont repoussées au long terme.
Objectifs
Les muscles squelettiques nous permettent de bouger, respirer et maintenir notre posture. Ils contiennent des unités contractiles appelées sarcomères, qui génèrent la force nécessaire au mouvement. Lors d’activités normales ou d’exercice, ces sarcomères peuvent être endommagés. En général, le muscle répare rapidement ces micro-lésions pour maintenir sa force. Si ce processus de réparation échoue, cela peut entraîner une faiblesse musculaire, une mobilité réduite et un risque accru de blessures. Nous avons précédemment identifié un gène d’intérêt comme un régulateur potentiel de ce mécanisme de réparation. Les souris dépourvues de ce gène dès la naissance présentent des muscles plus faibles et davantage de dommages après l’exercice, mais nous ne savons pas si cela est dû à des effets développementaux ou à un rôle direct dans la réparation du muscle adulte. Pour répondre à cette question, nous allons supprimer ce gène spécifiquement dans les myofibres adultes en utilisant un vecteur viral inoffensif. Nous évaluerons ensuite la capacité de ces muscles à se réparer après un exercice contrôlé. Cela nous permettra de déterminer si notre gène d’intérêt joue un rôle direct dans la réparation des dommages aux sarcomères.
Bénéfices attendus
Cette étude fournira des informations importantes sur la manière dont les muscles squelettiques adultes maintiennent leur structure et leur fonction sous stress mécanique. En clarifiant le rôle de notre gène d’intérêt dans la réparation des sarcomères, nous visons à identifier les mécanismes moléculaires qui soutiennent l’entretien normal du muscle. À long terme, ces connaissances pourraient informer des stratégies pour améliorer la réparation musculaire chez les personnes souffrant de blessures sportives, de maladies musculaires ou de faiblesse musculaire liée à l’âge. Améliorer la capacité de réparation des muscles pourrait contribuer à une meilleure mobilité, une récupération plus rapide et une qualité de vie améliorée.
Procédures
Injection d’analgésique, d’anesthésique et d'antidote à l'anesthésique: ces injections sont très rapides, elles ne durent que quelques secondes chacune. Injection d’un vecteur viral chez des souris âgées d’au moins 10 semaines : Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie afin de minimiser l’inconfort. L’injection est rapide, elle ne dure pas plus de 30 secondes. Protocole d’exercice excentrique: Le programme d’exercice réalisé par les animaux est un modèle d’activité physique intense. Il s’agit d’une procédure qui induit des lésions musculaires pouvant provoquer un niveau d’inconfort musculaire important passager. Cet exercice est réalisé une seule fois, il comprend 3 jours de 15 à 20 min de course d’habituation sur tapis roulant légèrement incliné suivi d’un jour de course de 60 min maximum comparable à un exercice physique intense. L’animal reçoit des stimulations légères et brèves pour le motiver à courir s’il s’arrête. Si l’animal ne court pas pendant plus de 5 secondes le test est arrêté.
Impact sur les animaux
Les souris déficientes pour le gène d'interêt dans les muscles (mutant injecté avec le vecteur viral) devraient être en bonne santé et ne devraient pas présenter de phénotype visuellement apparent. Toutefois, d’après nos études précédentes, elles peuvent présenter une légère faiblesse musculaire et une susceptibilité accrue aux dommages induits par l’exercice. Néanmoins, ces effets n’entraînent pas de détresse significative ni d’altération des fonctions de base. Les injections intramusculaires de vecteurs viraux seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie afin de minimiser l’inconfort et un antidote à l'anesthésique sera administré pour accélerer et améliorer le reveil. Cette procédure peut provoquer une douleur locale légère et transitoire au site d’injection. Le protocole d’exercice excentrique induit des dommages modérés aux sarcomères physiologiques, pouvant entraîner une gêne musculaire temporaire, sans provoquer de détresse durable.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Les mécanismes de dommage et de réparation des sarcomères impliquent des forces mécaniques complexes ainsi que des réponses coordonnées des myofibres pleinement développées. Ces processus ne peuvent pas être reproduits in vitro à l’aide de cellules musculaires en culture, qui ne possèdent pas une organisation sarcomérique mature, ni modélisés de manière fiable in silico. Par conséquent, des études in vivo chez la souris adulte sont indispensables pour atteindre les objectifs de recherche de ce projet.
Réduction
L’injection intramusculaire de vecteur viral permet d’induire la délétion génique chez les souris adultes, évitant ainsi la nécessité de croiser des lignées mutantes supplémentaires et réduisant considérablement le nombre total d’animaux utilisés. Les deux membres d’une même souris seront utilisés pour différentes analyses (un muscle pour l’histologie et le controlatéral pour un test biochimique) afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque animal. Nous utiliserons des groupes composés de 8 femelles et 8 mâles, ce nombre d’animaux (n = 8) est fondé sur des expériences antérieures ayant démontré une puissance statistique suffisante pour détecter des différences physiologiques dans les processus de lésion et de réparation musculaires. Nous utiliserons 6 groupes de 16 individus (8 mâles et 8 femelles) par groupe soit un total de 96 souris comprenant les animaux contrôles et les expérimentaux (traités avec un vecteur viral vide ou traités avec le vecteur expérimental), 2 points temporelles après exercice ainsi que des animaux sans exercice. Les resultats seront analysés en utilisant les statistiques appropriées.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des conditions réglementaires, conformes à la réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les injections intramusculaires seront effectuées sous anesthésie générale et analgésie. La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée par l’absence du réflexe en pinçant des orteils. Les souris seront placées sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, et leurs yeux seront protégés à l’aide d’un gel ophtalmique. Un antidote à l'anesthésie sera administré pour accéler et améliorer le reveil. Une surveillance post-injection sera effectuée quotidiennement pendant les 3 premiers jours, puis 2 à 3 fois par semaine par la suite. La surveillance comprend l’observation de l’état de santé général (motricité, apathie, aspect du pelage, aspect physique, vigilance, interaction sociale, toilettage). Le niveau de douleur sera évalué grâce à la fiche d'évaluation de la douleur fournie en annexe. Les manipulations seront réalisées à l’aide de tunnels afin de réduire le stress, et du matériel de nidification sera fourni pour l’enrichissement environnemental. L’exercice excentrique devrait provoquer uniquement un inconfort léger et transitoire. Les souris seront étroitement surveillées après la séance d’exercice pour détecter toute démarche anormale, boiterie ou réduction de l’activité. En cas de douleur de niveau 1 (légère boiterie), d'un anti-inflammatoire sera administré une fois par jour. Pour une douleur de niveau 2 (altération marquée de la mobilité), la dose d'anti-infammatoire sera augmentée. En cas de douleur de niveau 3 ou de détresse sévère, les animaux recevront une injection combinée d'anti-inflammatoire et d'analgésique et si leur état dne s'améliore pas sous 48h, alors ils seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les souris constituent le modèle le plus approprié pour ce projet. Nos études précédentes sur notre gène d'interêt ont été réalisées chez la souris, fournissant une base de référence bien définie pour l’interprétation des phénotypes. Les outils génétiques utilisés dans cette étude, notamment la lignée mutante d'interêt et les vecteurs viraux utilisés, sont déjà établis et optimisés chez cette espèce. De plus, la physiologie du muscle squelettique de la souris est bien caractérisée et présente de fortes similitudes structurelles et fonctionnelles avec celle du muscle humain, ce qui en fait un modèle largement reconnu pour l’étude de la réparation des sarcomères et de la biologie musculaire. L’utilisation de la souris permet de combiner une manipulation génétique précise avec des analyses physiologiques et éthiquement maîtrisable. Toutes les injections seront effectuées sur des souris mutantes âgées de 10 à 12 semaines, correspondant à l’âge adulte. À ce stade, les muscles squelettiques sont pleinement développés et physiologiquement stables, ce qui permet d’étudier la réparation des sarcomères dans un contexte mature, plutôt que pendant la croissance développementale. L’utilisation d’animaux adultes garantit également une anesthésie sûre et efficace et réduit la variabilité de l’efficacité de la transduction virale, puisque des titres de vecteurs viraux plus faibles sont suffisants à cet âge. De plus, cette tranche d’âge est cohérente avec les études précédentes, permettant une comparaison directe des résultats avec les données de référence existantes.
Etude de l’impact fonctionnel de la modulation d’activité neuronale via la modulation du phénotype microglial après démyélinisation chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant deux chirurgies de la moelle épinière à un mois d'intervalle, des injections modulant l'activité neuronale, puis des tests moteurs et une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le modèle reproduit une sclérose en plaques pour observer si stimuler les neurones aide à réparer la myéline. Les prélèvements de cerveau et de moelle épinière imposent la mise à mort de tous les animaux. Les retombées annoncées pour les patients, limiter la progression du handicap, restent renvoyées au conditionnel et au long terme.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire, dégénérative du système nerveux central (cerveau et moelle épinière) et la première cause d’handicap neurologique non traumatique chez les jeunes adultes. Dans cette maladie, on observe des phases de démyélinisation (il s’agit d’une perte de la myéline, substance permettant de favoriser les influx nerveux et la protection des neurones) dans lesquelles l’organisation des neurones est altérée, conduisant à des déficits fonctionnels chez les patients. Un mécanisme de réparation existe, mais il est incomplet et très variable selon les patients. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière (microglie) sont activées précocement lors de la démyélinisation et participent à la réparation de la gaine de myéline. La microglie contacte par ailleurs les neurones et cette interaction peut influencer positivement la réparation post-démyélinisation. Nous avons mis en place une technique permettant de moduler l’activité neuronale lors de la phase de rémission dans un modèle murin de sclérose en plaques pour étudier l’impact de cette modulation sur les interactions entre les cellules immunitaires du cerveau et les neurones, afin de favoriser la réparation tissulaire et la récupération fonctionnelle. Le présent projet vise à mesurer par des tests comportementaux et des mesures de conduction nerveuse chez la souris si la modulation de l’activité neuronale facilite la récupération fonctionnelle dans nos modèles et si cela dépend de l’interaction neurone-microglie.
Bénéfices attendus
La sclérose en plaques touche plus de 100 000 personnes en France et se déclenche majoritairement chez le jeune adulte. La réparation de la myéline (remyélinisation) est essentielle dans cette pathologie, mais reste partielle, d’où une perte neuronale à long terme et des déficits irréversibles chez les patients. L’activité neuronale a été montrée comme favorisant la remyélinisation. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact biologique obtenu de l’activité neuronale sur les interactions neurones-cellules immunitaires et leur rôle dans un modèle murin de sclérose en plaques. A plus long terme, la mise en évidence d’effets bénéfiques de l'activité neuronale sur la réparation via une modulation directe du dialogue neurones-cellules immunitaires pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée, afin de réaliser une injection au niveau de la moelle épinière (chirurgies séparées d’un mois, durée 15 minutes chacune). Tous les animaux recevront à l’état vigile deux injections (moins d’une minute) séparées de 3h pour moduler ou non l’activité neuronale. Tous les animaux participeront à des tests comportementaux visant à mesurer leurs compétences motrices (sessions de 2h30 incluant des pauses entre les tests). Des mesures de la vitesse de conduction nerveuse seront effectuées sous anesthésie générale avec traitement analgésique en fin d’étude (maximum 45 minutes), avant euthanasie par une méthode réglementaire pour réaliser différents prélèvements tissulaires.
Impact sur les animaux
Les chirurgies engendreront un inconfort temporaire lors du réveil après anesthésie (environ 30 min d’inconfort au réveil) et un risque de douleurs post-opératoires. Il existe un risque rare de complications liées à la chirurgie : infections, hémorragie. L’anesthésie générale sera associée à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de défaillance cardiorespiratoire. Les injections seront associées à un risque de légère et brève douleurs et d’inconfort de courte durée. Le traitement modulateur d’activité neuronale peut occasionner un trouble locomoteur et une gêne dans les 3 heures maximum suivant l’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger.
Devenir
Des prélèvements tissulaires (cerveau et moelle épinière) sont réalisés post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux pour répondre à nos objectifs scientifiques. L’euthanasie est réalisée par une méthode réglementaire.
Remplacement
Dans un objectif de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo, qui nous ont permis d’établir le rôle positif de l’activité neuronale dans le dialogue neurone-microglie pour limiter l’aspect pro-inflammatoire de ces cellules après démyélinisation. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la Sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la démyélinisation et la remyélinisation dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux, effecteurs de l’immunité circulante et apports métaboliques par le réseau sanguin, qui sont des composantes importantes de la sclérose en plaques. Le présent projet nous permettra d’avoir une lecture fine de l’impact de l’activité neuronale sur la réparation et la part de cet effet dûe au dialogue neurone-microglie dans nos modèles démyélinisants in vivo.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés après l’utilisation des premiers lots d’animaux afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux nécessaires : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après utilisation initiale de 5 à 6 animaux par condition. Au maximum nous utiliserons 100 animaux pour ce projet. Des tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats obtenus, adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine à leur arrivée avant leur entrée en procédure. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, comprenant nidification (carré de coton, kraft) et bâton à ronger. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Ils seront observés quotidiennement, toute anomalie sera gérée en collaboration entre notre équipe, la structure chargée du bien-être animal et nos vétérinaires afin d’assurer une prise en charge adaptée pour chaque animal. Des points-limites sont définis, ainsi qu’un suivi par l’équipe de recherche pour éviter la souffrance de l’animal. Les animaux soumis aux procédures chirurgicales sont placés sous anesthésie générale (durée maximale de 30 minutes), avec une prise en charge analgésique adaptée. Nous nous assurerons du maintien de la température des animaux durant toute la durée de l’anesthésie. Un gel de protection oculaire sera appliqué sur leurs yeux. En post-chirurgie, les animaux auront un accès facilité à la nourriture et à l’eau pour faciliter leur récupération. Nous mettrons également en place une surveillance renforcée post-chirurgie. Avant les tests comportementaux, les animaux auront un temps d’acclimatation. La mesure de la conduction nerveuse sera réalisée sur un animal anesthésié. L’animal ne sera pas réveillé ensuite et euthanasié au cours de son anesthésie générale.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. L’âge adulte est requis pour pouvoir faire les actes chirurgicaux et les mesures d’activité neuronale envisagées dans ce projet.
Greffes de hépatocytes primaires murins ou humains dans le foie afin de corriger un phénotype et de raffiner le processus d’humanisation
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rendues immunodéficientes pour éviter le rejet des greffes, 933 souris vont être utilisées pour fabriquer un foie partiellement humanisé, dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées à l'issue. Les nouveau-nés reçoivent une injection de cellules hépatiques dans le foie, après tatouage d'un orteil et biopsie d'oreille pour le génotypage. Les animaux sont tués entre quatre et six mois pour prélever sang et organes, ceux gardés pour la reproduction étant tués plus tard, en fin de période reproductive. Le porteur reconnaît l'existence de modèles in vitro, mais les juge insuffisants pour reproduire un foie humain fonctionnel.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer une souris dont une partie des cellules du foie est remplacée par des cellules humaines. Ce type de modèle est essentiel pour mieux comprendre certaines maladies du foie qui ne peuvent pas être correctement étudiées sur des souris normales, comme les infections par certains virus, des maladies métaboliques ou encore des troubles touchant spécifiquement les cellules du foie. Cette souris permettra aussi de mieux évaluer comment des traitements ou des médicaments sont transformés par un foie fonctionnant de façon proche de celui de l’être humain. Pour rendre cette humanisation possible, une lignée de souris a été développée afin de créer, à un moment précis, un espace dans le foie permettant l’implantation de cellules humaines. Cependant, chez les animaux homozygotes (portant cette modification génétique sur les deux chromosomes), ce mécanisme se déclenche trop tôt, entraînant une dégradation du foie qui cause leur mortalité avant l’âge de 4 semaines. Actuellement, seules les souris hétérozygotes (qui portent cette modification génétique seulement sur un chromosome), qui sont en bonne santé, peuvent être utilisées. Pour produire ces animaux, un schéma d’élevage hétérozygote × souris « sans modification » est utilisé, ce qui génère des portées contenant environ 50 % de souris sans modification qui ne peuvent pas être utilisées pour l’humanisation du foie et sont ensuite mises à mort. Le projet vise à corriger le problème observé chez les animaux homozygotes en greffant des cellules de foie saines chez les nouveau nés, afin de rétablir un foie fonctionnel et de permettre à ces animaux fragiles de rester en bonne santé. S’ils survivent et se reproduisent normalement, ils pourraient remplacer les schémas d’élevage actuels et éviter la production de souris sans modification et non utilisables. Si la greffe réalisée chez les nouveau nés fonctionne, le projet examinera également si la greffe des cellules humaines peut être faites à cet âge. Cette approche serait une avancée importante, car elle remplacerait des méthodes plus lourdes appliquées chez l’adulte par une procédure simple et peu invasive pratiquée chez le nouveau né. À terme, ce travail permettra de créer un modèle plus fiable pour la recherche, tout en améliorant le bien être animal et en réduisant le nombre total de souris nécessaires.
Bénéfices attendus
Le développement d’une souris possédant un foie partiellement humain permettra d’étudier un large ensemble de maladies du foie qui ne peuvent pas être correctement reproduites chez les souris normales. Ce modèle pourra notamment servir à mieux comprendre les infections provoquées par certains virus qui n’infectent que les cellules humaines du foie, mais aussi des maladies métaboliques comme celles impliquées dans l’accumulation de graisses dans le foie, ou encore des atteintes chroniques touchant le fonctionnement global de cet organe. Un tel modèle est également utilisé pour étudier comment les médicaments sont transformés dans le corps humain, car le foie joue un rôle central dans l’élimination et la détoxification de nombreuses substances. Si ce projet donne les résultats espérés, il permettra d’améliorer la manière dont les souris sont élevées pour produire le modèle au foie humanisé. Aujourd’hui, suite schéma d’élevage hétérozygote × sans modification, une partie importante des souris nées sont des animaux non-modifiés, qui ne peuvent pas être utilisée et sont ensuite mises à mort. En rendant possible l’utilisation d’animaux homozygotes qui jusque là ne survivaient pas, le projet réduirait fortement ce nombre et rendrait l’élevage beaucoup plus efficace et respectueux des animaux. Le projet pourrait aussi remplacer certaines étapes plus lourdes du processus d’humanisation actuellement réalisées chez l’adulte par des procédures plus simples et moins invasives chez le nouveau né. Cela améliorerait considérablement les conditions de travail avec ces animaux et diminuerait l’inconfort lié aux traitements ou aux interventions nécessaires. Ainsi, ce projet présente à la fois un intérêt scientifique — en permettant de mieux étudier des maladies humaines du foie — et un intérêt éthique, puisqu’il contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés et à rendre les procédures plus respectueuses de leur bien être.
Procédures
IDENTIFICATION ET GENOTYPAGE : Les souriceaux reçoivent un tatouage d’orteil pour leur identification individuelle. Une biopsie d’oreille est prélevée au même moment afin de permettre le génotypage. L’ensemble de la manipulation dure généralement entre 30 et 90 secondes. Dans de rares cas, un second prélèvement auriculaire peut être nécessaire si l’échantillon initial n’est pas exploitable. GREFFES DE CELLULES HEPATIQUES : Les greffes consistent en une unique injection intrahépatique transcutanée réalisée chez les nouveau nés. Cette intervention ne prend que quelques secondes et n’entraîne qu’une douleur minimale. Chez certaines souris hétérozygotes, des injections additionnelles d’un composé destiné à faciliter la reconstitution du foie peuvent être réalisées une fois les animaux sevrés. Chaque injection dure quelques secondes et provoque une gêne très limitée. Au maximum, une injection hebdomadaire est prévue, correspondant à un maximum de 14 injections si l’animal est suivi jusqu’à l’âge de 4 mois. PRELEVEMENTS SANGUINS : Chez les animaux greffés avec des cellules de foie humain, des prélèvements de sang peuvent être réalisés afin de suivre la progression de la reconstitution hépatique. Dans ce cas, 1 à 2 prélèvements par mois sont effectués, pour un maximum de 9 prélèvements par animal. Afin de réduire le stress et la douleur, tous les prélèvements sont réalisés sous anesthésie gazeuse. Les prélèvements durent quelques secondes, mais l’animal reste anesthésié pendant environ 5 à 10 minutes.
Impact sur les animaux
TRANSPORT : Les animaux sont transportés depuis un éleveur professionnel jusqu’à notre site. Bien que le trajet soit court, il peut provoquer un stress transitoire lié aux manipulations et au changement d’environnement. IMMUNODÉFICIENCE : Afin d’éviter le rejet des greffes de cellules de foie, les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui les rend particulièrement sensibles aux infections. Maintenues en conditions sanitaires strictes, elles restent cependant en bon état de santé. PHÉNOTYPE CHEZ DES HOMOZYGOTES : Avant que les cellules hépatiques saines ne recolonisent complètement le foie, les souriceaux homozygotes peuvent présenter des signes rappelant une insuffisance hépatique, tels qu’un retard de croissance, une baisse d’activité, une coloration cutanée altérée, une hypothermie ou un mauvais état général. Ces manifestations sont temporaires et diminuent à mesure que les cellules greffées prennent le relais. IDENTIFICATION ET GÉNOTYPAGE : À cet âge précoce, le tatouage des orteils et la biopsie auriculaire entraînent une douleur légère et brève. La principale nuisance est liée à la manipulation des animaux et à leur séparation momentanée de leur mère. INJECTION DE CELLULES HÉPATIQUES : Les cellules injectées ne provoquent aucune irritation ou toxicité. La seule nuisance associée à l’intervention est la douleur brève causée par l’insertion de l’aiguille lors de l’injection intra hépatique. INJECTION D’UN COMPOSÉ CHEZ LES HÉTÉROZYGOTES : Le composé administré à certaines souris hétérozygotes pour favoriser la recolonisation du foie peut entraîner une atteinte hépatique très légère et temporaire. Cela peut se traduire par une diminution transitoire de l’activité, un appétit réduit ou une hypothermie modérée. L’injection elle même provoque une douleur minime et de courte durée. PRÉLÈVEMENTS SANGUINS : Les prélèvements sanguins peuvent causer une douleur légère au site de ponction. Cette nuisance est fortement réduite puisqu’ils sont réalisés sous anesthésie, ce qui limite le stress et la gêne. STRESS : Toutes les interventions nécessitant une manipulation des animaux peuvent entraîner un stress temporaire, lié au contact, au changement d’environnement immédiat ou à la séparation brève d’avec leur groupe ou leur mère.
Devenir
Les animaux sont mis à mort lorsqu’ils atteignent un point limite, ou à la fin de la procédure, afin de permettre un prélévement de sang ou des organes pour effectuer des analyses plus approfondies. Selon la procédure concernée, cette étape se situe entre 4 et 6 mois d’âge. Les animaux destinés à l’élevage sont maintenus plus longtemps et mis à mort uniquement à la fin de leur période reproductive, soit vers 6 mois.
Remplacement
Le projet présenté s’inscrit dans un programme visant à développer une souris à foie humanisé, utilisée pour l’étude de nombreuses pathologies du foie humain, notamment les infections par des virus hépatotropes, les maladies métaboliques, la toxicité hépatique et le métabolisme des médicaments. Des modèles in vitro existent, comme les lignées cellulaires humaines, les hépatocytes primaires, les sphéroïdes 3D ou les systèmes « organ‑on‑a‑chip ». Bien que précieux pour les études mécanistiques, ces outils ne permettent pas de reproduire l’organisation d’un foie dans un organisme entier, ni ses interactions avec la circulation sanguine, le système immunitaire ou les autres organes. Pour les recherches nécessitant une physiologie systémique, un modèle murin partiellement humanisé reste donc indispensable. Le projet vise à corriger le phénotype létal observé chez les souris homozygotes afin qu’elles puissent être utilisées dans l’humanisation du foie et pour affiner le processus d’humanisation. Dans ce contexte, aucune alternative non animale ne peut être utilisée. Toutefois, ce projet contribue directement à la réduction du nombre d’animaux nécessaires au modèle final et à un raffinement du processus d’humanisation, comme décrit ci‑après.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été limité au strict minimum compatible avec une analyse fiable, tout en incluant des animaux des deux sexes afin de garantir la pertinence biologique des résultats. La stratégie expérimentale repose d’abord sur une étude pilote. Les études suivantes ne sont réalisées qu’en cas de succès de cette phase pilote, ce qui évite d’utiliser des animaux dans des approches qui ne seraient pas scientifiquement justifiées. De plus, la restauration de la fertilité des homozygotes constituerait un levier majeur de réduction. Le fait de pouvoir remplacer le schéma d’élevage actuel, basé sur l’accouplement de souris hétérozygotes et non-modifiées — lequel génère environ 50 % d’animaux sans modification et non utilisables et ensuite mis à mort — par un accouplement homozygote × homozygote, dont 100 % de la descendance serait utilisable, réduirait fortement le nombre d’animaux produits. Cette diminution concernerait non seulement ce projet, mais également l’ensemble du programme visant à développer le modèle murin à foie humanisé.
Raffinement
IMMUNODÉFICIENCE ET HÉBERGEMENT : En raison de leur sensibilité accrue aux infections, les souris sont hébergées et manipulées en permanence sous des conditions sanitaires strictes. Elles sont maintenues en groupes sociaux stables dans des cages transparentes et enrichies et disposent d’un accès ad libitum à l’eau et à une alimentation adaptée. Ces conditions visent à réduire le stress, minimiser les risques sanitaires et maintenir un bon état général. PHÉNOTYPE HÉPATIQUE : Un suivi clinique quotidien permet de détecter rapidement les animaux atteignant un point limite. En cas d’hypothermie, des tapis chauffants sont utilisés. Après sevrage, une alimentation enrichie, complétée par de l’hydrogel si nécessaire, favorise la récupération des animaux présentant une atteinte hépatique. MANIPULATION DES NOUVEAU NÉS : Les manipulations sont effectuées rapidement pour réduire la séparation de leur mère. Les gants des techniciens sont frottés avec de la litière de la cage afin de préserver l’odeur familière et limiter le stress. Les souriceaux sont toujours manipulés sur une couche de litière pour éviter l’hypothermie. Les injections sont réalisées avec des aiguilles la plus fines possible et des volumes minimaux. Le tatouage et la biopsie auriculaire sont pratiqués à un âge où les procédures sont peu douloureuse et le saignement est faible voire absent. PRÉLÈVEMENTS SANGUINS : Les prélèvements sanguins sont réalisés exclusivement sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress. Ils sont limités au strict nécessaire et respectent les seuils éthiques internes, avec des périodes de récupération appropriées. Les sites de ponction sont alternés pour éviter les irritations ou lésions cutanées liées à des prélèvements répétés.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de référence pour le développement de modèles humanisés, car sa petite taille, sa facilité de manipulation et la disponibilité de nombreuses lignées génétiquement modifiées permettent d’obtenir des modèles fiables et reproductibles. Les souris immunodéficientes sont aujourd’hui indispensables pour l’humanisation du foie, car elles permettent la greffe durable de cellules humaines et offrent un système pertinent pour l’étude de maladies du foie, des infections ciblant les cellules hépatiques, ainsi que du métabolisme et de la toxicité de nombreux médicaments. Dans ce projet, les interventions sont réalisées au stade nouveau né (3 à 8 jours). Ce choix est essentiel pour prévenir l’apparition du phénotype létal observé vers l’âge de quatre semaines chez les animaux homozygotes, et pour permettre une reconstitution précoce du foie avant que la dégradation hépatique ne soit trop avancée. Ce même stade d’âge est déjà utilisé avec succès pour d’autres modèles humanisés, car les nouveau nés tolèrent très bien les greffes de cellules et récupèrent rapidement. Une fois la greffe effectuée, les animaux sont suivis jusqu’à l’âge adulte afin de vérifier la stabilité de la reconstitution hépatique et d’évaluer leur capacité reproductive. Les animaux greffés et en bon état général peuvent être maintenus jusqu’à environ 180 jours, ce qui permet d’observer le fonctionnement du foie reconstruit sur le long terme et de déterminer s’ils peuvent être utilisés pour l’élevage et la production du modèle final.
Profilage pharmacocinétique de traitements administrés en doses unique ou répétées chez le rat ou chez la souris
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1440
Pour mesurer le devenir de molécules pharmaceutiques dans l'organisme, 7 200 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent les composés par injection ou gavage, ce dernier pouvant irriter l'œsophage, et subissent des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie. Le volume de sang requis étant trop élevé pour les laisser en vie, ils sont tués juste après le prélèvement, puis leurs organes sont collectés. Le porteur décrit ce modèle comme "indispensable" et comme un prérequis réglementaire pour les dossiers soumis aux autorités.
Objectifs
Dans le cadre de nos programmes internes de maturation et de développement préclinique, nous testons au stade pré-clinique de nouvelles molécules pharmaceutiques, qu’il s’agisse de composés innovants ou de médicaments faisant l’objet d’un repositionnement thérapeutique. Pour chaque molécule intégrée dans notre pipeline de développement, des études de toxicologie, de pharmacocinétique et d’efficacité sont entreprises. La présente demande concerne spécifiquement la réalisation d’études de pharmacocinétique. La caractérisation du profil pharmacocinétique constitue une étape indispensable du développement d’un candidat-médicament. Elle permet notamment : (1) de documenter l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé ; (2) de guider le choix de la voie d’administration la plus appropriée ; (3) de définir des schémas posologiques pertinents permettant une efficacité pharmacologique tout en limitant les risques de toxicité ; (4) d’identifier les principaux métabolites issus de la biotransformation, et d’évaluer leur contribution potentielle à l’efficacité ou à la toxicité. En phase de recherche préclinique, ces données ne peuvent être obtenues qu’au moyen de modèles animaux, avant toute administration du candidat-médicament chez l’Homme. Elles constituent par ailleurs un prérequis réglementaire majeur dans la constitution des dossiers soumis aux autorités compétentes, notamment dans la perspective d’une autorisation d’essai clinique ou d’une demande d’autorisation de mise sur le marché. Dans le cas du repositionnement de médicaments déjà autorisés, en particulier lorsqu’un changement de voie d’administration, de formulation ou d’indication est envisagé, l’établissement ou l’actualisation du profil pharmacocinétique est également nécessaire afin de garantir la sécurité et la pertinence du développement. Ce projet a donc pour objectif de déterminer le profil pharmacocinétique de différents composés, afin d’éclairer les décisions de poursuite, d’adaptation ou d’arrêt de leur développement préclinique. Cette évaluation s’appuiera sur deux modalités expérimentales complémentaires : une étude après administration unique, et une étude après administrations répétées, réalisées chez le rat ou la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer le profil pharmacocinétique d’un composé avant son éventuelle administration à l'Homme dans un contexte physiologique et pertinent. Ces résultats permettront de conclure sur l’intérêt de continuer ou non l’étude préclinique de ces traitements, d’adapter le schéma posologique, et de répondre aux exigences des agences réglementaires, fournissant un préalable nécessaire à toute expérimentation ou commercialisation chez l’humain. À court terme, ce projet générera des données quantitatives sur l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination des composés étudiés. Ces informations permettront d’orienter rapidement les décisions internes concernant la sélection, l’optimisation ou l’arrêt du développement de candidats-médicaments, contribuant ainsi à une utilisation plus rationnelle des ressources scientifiques et animales. À plus long terme, les connaissances acquises participeront à l’amélioration des stratégies de développement des médicaments, notamment en optimisant la sélection des doses et des voies d’administration, et en réduisant les risques d’échec lors des phases cliniques. Ces avancées bénéficieront indirectement aux patients, en favorisant la mise à disposition de traitements plus sûrs et plus efficaces, ainsi qu’aux acteurs de la recherche biomédicale. Ce projet contribue également à l’avancement des connaissances scientifiques en pharmacocinétique, en générant des données sur des composés de nature variée (petites molécules, peptides, biomolécules), parfois encore peu caractérisés. Les bénéfices attendus pourront être obtenus directement dans le cadre de ce projet pour les composés étudiés. Toutefois, leur valorisation complète, notamment en termes de développement clinique ou de mise sur le marché, nécessitera des étapes complémentaires (toxicologie, essais cliniques). Enfin, les résultats obtenus, qu’ils soient positifs ou négatifs, seront exploités en interne pour orienter les programmes de recherche et pourront, lorsque cela est possible, être valorisés (publications, communications scientifiques), contribuant ainsi à la diffusion des connaissances et à l’amélioration des pratiques expérimentales.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à des administrations de composés par injection ou gavage, de manière aiguë (une seule administration) ou répétée sur une durée allant de quelques minutes à environ 15 minutes par séance (temps nécessaire à la contention, l’injection et l’observation immédiate). Le nombre d’administration dépendra de la molécule et de la voie d’administration considérée, cela pourra être une fois par semaine jusqu’à deux fois par jour. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés en utilisant un anesthésique au cours de l’étude afin de mesurer la concentration sanguine du candidat-médicament et/ou de ses métabolites, tout en respectant le volume maximal autorisé ainsi que le temps de récupération par animal. Chaque prélèvement dure environ 5 minutes. Pour les produits injectés présentant des caractéristiques fluorescentes ou bioluminescentes, des séances d’imagerie non invasive sous anesthésie gazeuse pourront être effectuées, avec un maximum de 5 par semaine. Chaque séance dure environ 5 à 10 minutes, incluant l’induction, la mesure et le réveil. En fonction du produit testé, de sa fréquence d’administration et de données scientifiques concernant son absorption, une mise à jeun pré- et/ou post-administration pourra être envisagée. La durée de jeûne sera limitée à la période la plus courte compatible avec l’objectif scientifique, généralement 12h chez la souris et 24h chez le rat, et l’eau restera accessible.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues dépendront du type d’administration employée. Ainsi, les injections peuvent provoquer une douleur transitoire ou une petite irritation au point de ponction. L’administration par gavage peut entraîner un inconfort, une irritation de l’œsophage et du stress lié à la contention. Les administrations répétées, quel que soit le mode, peuvent générer une appréhension de la manipulation et un stress accru. Une éventuelle mise à jeun pré- et/ou post-administration (bien que limitée à la période la plus courte compatible avec l’objectif scientifique) peut également être un vecteur de stress. Deux types de prélèvements sanguins pourront être effectués : d’une part des prélèvements intermédiaires réalisés sous anesthésie qui peuvent causer une douleur passagère, une petite hémorragie locale ou un stress lié à la contention ; d’autre part des prélèvements terminaux réalisés sous anesthésie et analgésie, en fin de procédure avant l’euthanasie des animaux. Les doses administrées seront choisies sur la base de la littérature et/ou des résultats d’études préalables de toxicité aigüe et/ou répétée conduites en interne de telle sorte qu’elles n’induisent pas d’effets délétères ou de souffrance chez l’animal. Cependant, selon la nature du composé testé et la fréquence d’administration, des effets indésirables systémiques modérés pourraient également apparaître, tels qu’une perte de poids, une modification du pelage ou une altération de l’état général (léthargie, diminution de l’activité, troubles digestifs).
Devenir
La quantité de sang nécessaire pour réaliser les études de pharmacocinétique est trop élevée pour laisser une souris en vie après prélèvement ; elles seront donc euthanasiées juste après prélèvement. De plus, l'euthanasie est nécessaire pour permettre une collecte des organes afin d'analyser plus avant les effets physiologiques et biochimiques ainsi que la répartition histologique du composé et/ou de ses métabolites.
Remplacement
Notre projet se focalise sur un modèle intégré d’étude de pharmacocinétique nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier et est un prérequis réglementaire majeur dans la constitution des dossiers soumis aux autorités compétentes, notamment dans la perspective d’une autorisation d’essai clinique ou d’une demande d’autorisation de mise sur le marché. Il n'existe pas de modèle alternatif reproduisant nos procédures expérimentales.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur la pharmacocinétique du traitement. Pour les études en traitement aigu, l’analyse des données entraînera la comparaison au maximum de 64 groupes de souris (groupe contrôle négatif et groupes traitement avec jusqu’à 3 doses de produit testées ; étude chez les 2 sexes ; 8 timepoints pour chaque groupe). Pour les études en traitement répété, l’analyse des données entrainera la comparaison de 80 groupes de souris (groupe contrôle négatif et groupes traités avec jusqu’à 4 cinétiques de traitements différentes ; étude sur les 2 sexes ; 8 timepoints pour chaque groupe). Pour la conduite de ces 2 procédures chez le rat, le nombre de groupes pourra être réduits à 16 et 20 respectivement, puisque chaque animal pourra être prélevé à 4 time-points différents. Une analyse statistique sera réalisée à l’aide d’un test non paramétrique. Un nombre de 4 animaux par groupe est requis pour obtenir une puissance statistique minimale et décrire précisément l’évolution de la disponibilité systémique du composé et/ou de ses métabolites en fonction du temps et du sexe.
Raffinement
Les conditions d’hébergement respecteront le respect de l’animal ; il y aura 2 à 3 rats ou 5 à 6 souris par cage selon le poids des animaux, avec nourriture et eau à disposition et présence d’un enrichissement. Pour les produits injectés présentant des caractéristiques fluorescentes ou bioluminescentes, de l’imagerie non-invasive pourra être effectuée pour suivre le profil de distribution du produit, permettant d’augmenter la quantité d’informations recueillies sans dégrader le bien-être animal. Lors de l’imagerie, comme lors des administrations du produit par les voies les plus invasives ou lors des prélèvements sanguins intermédiaires (sur rats uniquement), les animaux seront anesthésiés avec un inducteur chimique ou gazeux. Lors d’une anesthésie chimique, cette dernière sera antagonisée pour favoriser le réveil et la récupération des animaux. En revanche, aucune analgésie n’est possible au cours des études, puisqu’elle pourrait modifier le profil pharmacocinétique du composé étudié. A la fin des procédures, lors des prélèvements de sang avant euthanasie, une analgésie sera cependant réalisée par l’ajout d’un collyre analgésique en plus de l’anesthésie gazeuse. Un tableau de suivi a été mis en place permettant de définir les points limites adaptés.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d'étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de pharmacocinétique en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat Sprague Dawley (SD) est un modèle de laboratoire bien connu, alimenté par de nombreuses données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6 et Balb/c représentent les souches de choix. Le choix de l'espèce utilisée dépendra en particulier de la molécule utilisée, des objectifs et des besoins de l'étude. Elle pourra être éventuellement testée dans les 2 espèces afin de montrer documenter une pharmacocinétique espèce-indépendante. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines au minimum, à un stade de jeune adulte pour permettre de déterminer le profil pharmacocinétique du traitement sur des animaux à maturité sexuelle dont les organes et le système immunitaire sont pleinement développés.
Identification des mécanismes de la réponse immunitaire innée dans les infections respiratoires
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Infectées par le nez avec des bactéries responsables de pneumonies, Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae, sous anesthésie, 5 778 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'infection peut entraîner une perte de poids et une dégradation de l'état général, un score clinique déclenchant l'arrêt pour les animaux les plus atteints. Les souris sont ensuite tuées pour dénombrer les bactéries dans les poumons, la rate et la moelle osseuse. Le porteur reconnaît disposer déjà de tests in vitro, mais juge la souris "nécessaire" pour reproduire la complexité de l'infection.
Objectifs
Les infections des voies respiratoires demeurent un problème de santé publique majeur. Les bactéries, en particulier Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae, comptent parmi les principales responsables d’infection du tractus respiratoire et peuvent induire une pneumonie. Celle-ci peut évoluer vers une maladie invasive lorsque les bactéries pénètrent dans la circulation sanguine. Dans le cas de Streptococcus pneumoniae, la sévérité de la maladie est exarcerbée chez les patients infectés par le virus de la grippe. Des vaccins existent contre Streptococcus pneumoniae, mais leur efficacité est limitée, tandis qu’aucun vaccin n’est actuellement disponible contre Klebsiella pneumoniae. Ces bactéries sont considérées comme prioritaires par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) en raison de l’apparition de souches très virulentes et/ou résistantes aux antibiotiques, qui rendent certains traitements inefficaces. Ces observations montrent la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Stimuler le système immunitaire apparaît comme une piste prometteuse pour surmonter les limites des traitements actuels. Pour se faire, il est donc essentiel de mieux comprendre comment l’organisme se défend contre les infections à Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae. Lors d'une infection bactérienne, les tissus détectent les pathogènes grâce à des récepteurs du système immunitaire et déclanchent rapidement de nombreux mécanismes de défense, contre lesquels les bactéries développent difficilement des résistances. Stimuler ces réponses représente donc une piste prometteuse pour traiter les infections respiratoires. Associée aux antibiotiques, l’immunothérapie pourrait offrir une stratégie plus durable, améliorant la prise en charge des patients tout en limitant la progression de l’antibiorésistance. Le projet comporte les objectifs suivants : 1- Identifier les mécanismes immunitaires activés par Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae, afin d'identifier ceux qui jouent un rôle protecteur. 2- Identifier les éléments de Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae qui déclanchent ou modulent ces réponses immunitaires 3- Utiliser ces connaissances pour proposer une nouvelle stratégie de traitement de ces infections respiratoires
Bénéfices attendus
Le principal objectif de ce projet est de mieux comprendre comment le système immunitaire réagit aux infections respiratoires. Identifier les composantes protectrices de cette réponse pourrait permettre de développer des immunothérapies capables de renforcer les défenses de l’organisme, utilisées seules ou en combinaison avec des antibiotiques. En parallèle, identifier les éléments des bactéries qui modulent cette réponse pourrait, à plus long terme, ouvrir la voie à de nouveaux vaccins. Ces avancées pourraient améliorer la prévention et la prise en charge des infections, réduire les complications et les décès, limiter l’usage des antibiotiques et ralentir l’antibiorésistance, avec un impact majeur pour la santé publique.
Procédures
Pour mimer l’infection pulmononaire, les animaux recevront la bactérie Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae par administration intranasale sous anesthésie par injection intrapéritonéale. Ce geste dure moins d’une minute et conduit à une anesthésie courte qui maintient l'animal en sommeil environ 20 minutes. Pour mimer l’infection invasive à Klebsiella pneumoniae, les animaux recevront la bactérie par administration intrapéritonéale, geste qui dure moins d’une minute. Certaines analyses nécessiteront un prélèvement sanguin, geste qui dure moins d’une minute, et qui sera réalisé sur des animaux sous anesthésie gazeuse. L’efficacité des immunomodulateurs associés ou pas à des antibotiques sera également testé contre une infection pulmonaire à Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae. Ces traitements peuvent être soit une injection intrapéritonéale soit un gavage oral, soit une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, chacun de ces gestes durant moins d’une minute. L’anesthésie gazeuse dure moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les expériences comprennent une étape d’infection pulmonaire avec la bactérie Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae. Des analyses seront effectuées à des temps précoces, avant la survenue d’effets indésirables dûs à l’infection. Néanmoins, à des temps plus tardifs, les bactéries peuvent provoquer une infection respiratoire chez la souris qui peut se traduire par une perte de poids et/ou une altération de l’état général. Des critères d’arrêts de l’étude, évalués grâce à un score clinique, ont été définis afin de contrôler le bien-être des animaux. Ainsi, la mesure du poids de l’animal et l’inspection des signes physiques (pelage, respiration) et du comportement (mobilité) seront effectués de façon quotidienne, afin de détecter le plus précocément possible l’apparition de signes de souffrance. Les expérimentateurs sont formés à ces observations et procèdent à l’euthanasie des animaux si ces paramètres sont significativement détériorés, quel que soit le groupe expérimental. La dernière partie du projet consiste à traiter les animaux avec un immunomodulateur associé ou pas à un antibotique, pour ralentir/prévenir la survenue d’une infection pulmonaire. Dans ce cas, on s'attend à une amélioration de l’état général des animaux traités en comparaison à des animaux non traités.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié afin d’analyser la réponse immunitaire dans différents tissus et/ou de déterminer le nombre de bactéries dans les poumons, la rate, la moelle osseuse. Les animaux développant des signes sévères d’infection seront euthanasiés.
Remplacement
Des études in vitro sont déjà en place pour étudier les interactions entre les cellules immunitaires et les bactéries. Néanmoins, à ce jour, la complexité des processus infectieux et immunitaires ne peut pas être intégralement reproduite dans des tests in vitro et l’utilisation de souris sera donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet, dans le respect des stratégies de réduction et de raffinement ci-dessous.
Réduction
- Modélisation in vitro : Des approches sont déjà en place pour analyser les interactions entre les cellules immunitaires isolées d’animaux et les bactéries. Une veille bibliographique sera réalisée afin d’identifier d’éventuels nouveaux protocoles d’isolement de cellules immunitaires, pour étudier leur interaction avec les bactéries. - L’utilisation de souris génétiquement identiques dans nos expériences permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats robustes. - La taille des groupes d'animaux dans les expériences réalisées est déterminée par des méthodes statistiques afin d’utiliser le strict nécessaire pour répondre à la question scientifique.
Raffinement
Lors de l’euthanasie, de multiples tissus (poumons, ganglions drainants, rate, moelle osseuse, sang) seront prélevés sur chaque animal afin de rassembler un maximum de données exploitables pour chaque animal. L’utilisation de techniques de mesures à moyen et haut débit (qui mesure plusieurs paramètres par échantillon) permettra également d’obtenir des données multiples sur chaque échantillon et de raffiner les analyses.
Choix des espèces
Le modèle de la souris est aujourd’hui l’un des plus utiles pour étudier comment le corps se défend contre les infections respiratoires. Nous disposons de nombreuses souris génétiquement modifiées, ce qui permet de mieux comprendre le rôle de certains mécanismes du système immunitaire. De plus, il existe des outils très performants pour analyser les cellules chez la souris, ce qui facilite l’étude détaillée de ces défenses. Pour les souris obtenues auprès de fournisseurs agréés, des animaux adultes âgés de 7 à 12 semaines en début d’expérience seront utilisés. Pour les animaux provenant de l’élevage local, les animaux pourront être âgés de 7 à 20 semaines. A ces âges, le système immunitaire des souris est considéré comme compétent. Enfin, la détermination des doses de bactéries nécessaire à l’infection pulmonaire a déjà été établi par l’ensemble de la communauté scientifique.
Restauration des fonctions effectrices des lymphocytes T CD8 épuisés par modulation épigénétique dans les infections virales chroniques (LCMV) et le carcinome hépatocellulaire (CHC)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Réparties entre un modèle d'infection virale chronique et un modèle de cancer du foie, 4 660 souris vont être utilisées pour étudier l'épuisement des lymphocytes T, 2 950 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 1 710 sévère, toutes tuées à l'issue. Chaque animal ne subit qu'une procédure, entre transfert de cellules, infection virale, immunothérapie et croissance tumorale, avec des atteintes de l'état général et une gêne progressive selon la localisation de la tumeur. Les animaux atteignant les points limites, comme ceux qui guérissent, sont tués pour prélever organes et sang. Le porteur écarte cultures cellulaires et modèles informatiques, jugés incapables de reproduire un "organisme entier".
Objectifs
Ce projet vise à améliorer la compréhension fondamentale de l’immunité T CD8 en contexte de pathologie chronique et à identifier de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des immunothérapies, afin d’en faire bénéficier un plus large spectre de patients.Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines cellules du système immunitaire deviennent moins efficaces lors de maladies chroniques comme le cancer ou certaines infections virales persistantes. En temps normal, ces cellules permettent de combattre les cellules tumorales ou infectées. Cependant, lorsqu’elles sont stimulées trop longtemps, elles s’épuisent et perdent leur capacité à agir efficacement. L’objectif est d’identifier les mécanismes internes qui contrôlent cet épuisement, en particulier le rôle de certaines protéines qui régulent l’activité des cellules. Le projet vise également à tester si un médicament récent, seul ou en combinaison avec des traitements d’immunothérapie déjà utilisés chez les patients, permet de restaurer l’activité de ces cellules immunitaires. L’objectif général est de déterminer comment les facteurs de transcription et régulateurs épigénétiques de la famille IKZF contrôlent la différenciation, la fonction et la plasticité des lymphocytes T CD8 PD-1⁺ épuisés au cours d’une stimulation antigénique persistante , telle qu’observée dans les infections virales chroniques et le cancer. Nous chercherons également à évaluer l’efficacité antitumorale de la modulation pharmacologique de ces facteurs (iberdomide ), utilisée seule ou en association avec des immunothérapies actuellement employées en clinique (anti-PD-L1 et/ou anti-CTLA-4 ).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire dans les maladies chroniques. À court terme, il contribuera à mieux comprendre pourquoi certaines immunothérapies, pourtant très prometteuses, ne sont efficaces que chez une minorité de patients. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à rendre les traitements anticancéreux plus efficaces, en réactivant les défenses naturelles de l’organisme. Les résultats pourraient bénéficier à des patients atteints de cancers, notamment du foie, mais aussi potentiellement à d’autres maladies où le système immunitaire est affaibli. Enfin, ce projet permettra d’évaluer un médicament actuellement en cours d’étude chez l’homme, ce qui pourrait faciliter le développement de nouvelles approches thérapeutiques combinées. Même en cas de résultats négatifs, les connaissances acquises seront utiles pour orienter les recherches futures.
Procédures
Chaque animal ne participe qu’à UNE seule procédure. Les animaux recevant un transfert adoptif ne reçoivent pas de modulateur pharmacologique, et inversement. Procédure 1 – Modèle d’infection virale Procédure Voie État de l’animal Fréquence Durée du geste Transfert adoptif de cellules intraveineuse Vigile, contention en tube 1 seule fois ~1 min Infection virale intraveineuse Vigile, contention en tube 1 seule fois ~1 min Prélèvement sanguin Sous-mandibulaire Vigile 100 µL/semaine ou 150 µL/2 semaines ~30 sec Immunothérapie intrapéritonéale Vigile 2×/semaine pendant 2 semaines ~30 sec Déplétion de cellules intrapéritonéale Vigile 1 injection avant infection ~30 sec Modulateur pharmacologique Per os Vigile 1× tous les 2 jours pendant 2 semaines ~1 min Procédure 2 – Modèle de carcinome hépatocellulaire autochtone Procédure Voie État de l’animal Fréquence Durée du geste Transfert adoptif de cellules intraveineuse Vigile, contention en tube 1 seule fois ~1 min Injection hydrodynamique intraveineuse Vigile, contention en tube 1 seule fois ~2 min Imagerie tumorale luciférine intrapéritonéale + anesthésie gazeuse Anesthésié 2× (immunophénotypage) ou 1×/semaine × 3 semaines (thérapie) ~5 min Immunothérapies intrapéritonéale Vigile 2×/semaine pendant 2 semaines ~30 sec Déplétion de cellules intrapéritonéale Vigile 1 injection avant injection hydrodynamique ~30 sec Modulateur pharmacologique Per os Vigile 1× tous les 2 jours pendant 2 semaines ~1 min
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales incluront principalement des injections (cellules, virus, plasmides, traitements), des prélèvements sanguins et le suivi de maladies expérimentales (infection chronique ou croissance tumorale). Les animaux infectés de manière chronique peuvent présenter une altération modérée et transitoire de l’état général durant la phase aiguë de l’infection (5-15 jours après le début de l’infection), incluant une perte de poids, une fatigue ou une légère diminution de l’activité. Dans les modèles tumoraux, la croissance de la tumeur peut entraîner une gêne progressive en fin d’expérience. Des points limites précoces et stricts seront appliqués afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel formé, et tout animal présentant des signes de détresse, de perte de poids excessive ou d’altération marquée de l’état général sera euthanasié immédiatement.
Devenir
Dans ce projet, deux axes de travail sont prévus. Le premier axe vise la caractérisation fonctionnelle des cellules T CD8 ainsi que leur sensibilité à l’immunothérapie. Les animaux utilisés dans ce cadre seront tous euthanasiés au point d’analyse défini expérimentalement. Dans les approches évaluant l’efficacité thérapeutique, les animaux atteignant les points limites en lien avec la pathologie seront euthanasiés comme précédemment décrit. Les animaux présentant une guérison à long terme seront également euthanasiés, et des prélèvements d’organes et de sang seront réalisés afin d’évaluer la mémoire immunitaire antitumorale.
Remplacement
Les objectifs de ce projet nécessitent l’étude du système immunitaire dans un organisme entier, car ils reposent sur des interactions complexes entre différents types de cellules et les tissus. À ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives (comme des cultures de cellules en laboratoire ou des modèles informatiques) capables de reproduire fidèlement ces phénomènes observés dans les maladies chroniques. Cependant, des approches alternatives sont utilisées dès que possible afin de limiter le recours aux animaux. Par exemple, certaines manipulations sont réalisées sur des cellules en dehors de l’organisme, ce qui évite la création de modèles animaux supplémentaires. De plus, des analyses approfondies sont effectuées sur les cellules prélevées, permettant d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque animal. Enfin, des études préliminaires sont menées sur un nombre limité d’animaux afin d’optimiser les conditions expérimentales avant la réalisation des expériences principales.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est strictement déterminé afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant toute utilisation excessive. Plusieurs stratégies sont mises en place pour réduire ce nombre. Tout d’abord, certains modèles expérimentaux présentant moins de variabilité sont privilégiés, ce qui permet de travailler avec des groupes plus petits. Ces modèles sont utilisés pour identifier les approches les plus prometteuses, qui seules seront ensuite étudiées plus en détail. Ensuite, différentes conditions expérimentales peuvent être comparées au sein d’un même animal, ce qui limite le nombre total nécessaire. Enfin, plusieurs types d’analyses sont réalisés à partir des mêmes animaux (différents organes et paramètres biologiques), ce qui permet de maximiser les informations obtenues et d’éviter l’utilisation de cohortes supplémentaires.
Raffinement
Toutes les procédures sont conçues afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Les gestes expérimentaux sont réalisés par du personnel formé et expérimenté, en utilisant du matériel adapté et des volumes conformes aux recommandations en vigueur. Les prélèvements sanguins respectent les limites réglementaires en termes de volume et de fréquence, et privilégient des techniques les moins invasives possibles. Les conditions d’hébergement sont adaptées aux besoins physiologiques et comportementaux des animaux : hébergement en groupes sociaux compatibles avec le protocole, enrichissement du milieu, et accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les animaux sont progressivement habitués aux techniques de préhension afin de réduire le stress lié aux manipulations. Un suivi clinique rigoureux est mis en place. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel animalier. Ils sont examinés au minimum trois fois par semaine par les techniciens impliqués dans l’étude, et de manière quotidienne si une variable de la grille des points limites indique une possible dégradation de l’état de l’animal (perte de poids, modification du comportement, altération de l’état général). Une attention particulière est portée au poids, à l’aspect du pelage, à la posture, à l’activité et au comportement alimentaire. Des points limites précoces sont définis (perte de poids significative, altération de l’état général, signes cliniques sévères) et conduisent, si nécessaire, à une euthanasie immédiate afin d’éviter toute souffrance prolongée. L’ensemble de ces mesures garantit que toute contrainte ou souffrance est strictement limitée au minimum compatible avec les objectifs scientifiques du projet.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle de référence pour l’étude du système immunitaire des mammifères. Les sous-populations de lymphocytes T CD8, y compris les cellules épuisées et les cellules progénitrices Tpex, y sont bien caractérisées et présentent de fortes similarités fonctionnelles et moléculaires avec celles observées chez l’humain. Des modèles murins d’infection virale chronique et de cancer sont disponibles et largement validés pour l’étude des mécanismes d’épuisement des lymphocytes T et de réponse aux immunothérapies. De plus, la disponibilité de lignées génétiquement modifiées et d’outils d’édition génétique permet d’analyser précisément le rôle de gènes d’intérêt dans des sous-populations cellulaires spécifiques. Aucune alternative in vitro ou in silico ne permet de reproduire la complexité des interactions entre cellules immunitaires, agents pathogènes ou tumeurs, et microenvironnement tissulaire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 à 12 semaines)pour le démarrage des expériences. À ce stade, le système immunitaire est pleinement développé et fonctionnel, ce qui est indispensable pour l’étude des réponses immunitaires adaptatives. L’utilisation d’animaux adultes permet également de limiter la variabilité liée à la maturation immunitaire observée chez les animaux plus jeunes.
Impact d’une exposition alimentaire à un herbicide chez la souris
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une partie d'entre elles finit remise à un service de formation aux gestes techniques : 351 souris exposées par leur alimentation à un herbicide très répandu vont être utilisées pour en étudier les effets indirects via le microbiote intestinal, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont suivies jusqu'à l'âge adulte avec pesées, mesures de glycémie et un modèle d'inflammation intestinale provoquant perte de poids et diarrhées. La plupart sont tuées pour prélever des échantillons ou fabriquer des organoïdes intestinaux, tandis que 45 reproductrices sont ensuite remises à un service de formation à la contention et aux gestes techniques. Le porteur présente cette réaffectation comme un moyen d'"optimiser leur utilisation".
Objectifs
Nous étudierons un des herbicides les plus utilisés dans le monde qui agit en bloquant un mécanisme essentiel chez les plantes, ce qui entraîne leur mort. Comme ce mécanisme n’existe pas chez les mammifères, cet herbicide a longtemps été considéré comme sans danger pour la santé humaine. Cependant, certaines bactéries présentes dans notre intestin possèdent ce mécanisme. Or, ces bactéries forment le microbiote intestinal, qui joue un rôle important dans la digestion, le système immunitaire et le bon fonctionnement de l’organisme. Des études chez la souris ont montré que l'herbicide peut modifier la composition de ce microbiote. Ces modifications pourraient avoir des conséquences sur la santé, notamment en favorisant des troubles digestifs ou métaboliques. Toutefois, on ne sait pas encore si l'herbicide peut réellement contribuer au développement de ces maladies via le microbiote. Ce projet vise donc à mieux comprendre ces effets en étudiant des souris exposées à l'herbicide par l’alimentation tout au long de leur vie, de manière à se rapprocher des conditions d’exposition humaine.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire à un herbicide et fournir des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde. Nous étudierons certains paramètres peu explorés dans les études toxicologiques réglementaires, à savoir les effets sur le microbiote intestinal, l'inflammation intestinale et le métabolisme. Ces données indépendantes pourront servir aux agences réglementaires et aux politiques pour formuler des recommandations sur l’utilisation de ce pesticide.
Procédures
Les animaux sont répartis en trois groupes (12 mâles et 12 femelles par groupe) et suivis jusqu’à l’âge adulte (J130). Les 3 groupes correspondent à des souris non exposées, exposées à une dose faible et exposées à une dose plus forte d'herbicide incorporé dans l'alimentation. Tous les animaux font l’objet d’un suivi régulier comprenant une pesée hebdomadaire et un suivi de la consommation alimentaire et hydrique (toute la durée de l’étude). Des prélèvements de fèces non invasifs sont réalisés toutes les deux semaines (environ 1–2 minutes par animal). Une mesure de la glycémie à jeun, similaire à celle réalisée chez l’Homme (prélèvement d’une goutte de sang), est effectuée une fois par mois (moins de 1 minute par animal). À partir de J84, trois interventions sont réalisées à deux semaines d’intervalle : • placement en cage individuelle spécifique pendant 23 heures pour la collecte des urines, • test de tolérance au glucose (durée totale d’environ 2 heures avec mesures répétées), • autre test de tolérance métabolique (durée totale d’environ 2 heures avec mesures répétées). En fin d’expérimentation, un prélèvement sanguin est réalisé (moins d’1 minute), suivi de la mise à mort des animaux. Dans un second groupe d’animaux, un suivi similaire est réalisé (pesée hebdomadaire, consommation, prélèvements de fèces toutes les deux semaines). Ces animaux reçoivent en plus un traitement de 7 jours visant à induire une inflammation intestinale, suivi d’une période de récupération de 5 jours, avec observation quotidienne de leur état général (quelques minutes par animal).
Impact sur les animaux
Aucun signe de toxicité notable n’a été observé dans des conditions d’exposition similaires lors d’études précédentes. Les interventions prévues peuvent néanmoins entraîner des effets indésirables modérés et transitoires, incluant un stress lié aux manipulations répétées et une gêne ponctuelle lors des prélèvements. L’hébergement temporaire en cage individuelle peut induire un stress léger à modéré. Le modèle d’inflammation intestinale induit entraîne des signes cliniques modérés à marqués sur une durée limitée, comprenant une perte de poids, des diarrhées et une altération de l’état général. Ces effets sont réversibles chez la majorité des animaux après la phase d’induction.
Devenir
Les souris F1 seront euthanasiées à la fin de l’expérimentation afin de prélever des échantillons qui seront analysés pour répondre à la question scientifique. Les souris F1 surnuméraires seront mises à mort au sevrage pour préparer des organoïdes intestinaux. Les souris F0 des deux sexes (10 femelles et 5 mâles par procédure, soit 45 souris au total) seront mises à disposition de la DAP de formation à la contention et aux gestes techniques de l’établissement déjà autorisée à cet effet, permettant d’optimiser leur utilisation.
Remplacement
Notre laboratoire utilise habituellement des modèles simplifiés (comme des cellules ou des tissus isolés) pour étudier les effets directs de certaines substances sur les organes. Cependant, dans ce projet, nous cherchons à comprendre des effets indirects d'un herbicide, qui pourraient passer par les bactéries présentes dans l’intestin, appelées microbiote intestinal. En effet, cet herbicide agit principalement sur une cible présente chez certaines bactéries, mais absente chez les cellules humaines, ce qui suggère que ses effets pourraient dépendre de ces micro-organismes. Pour étudier ces interactions complexes, il est nécessaire d’utiliser un organisme entier, car le microbiote, l’intestin, le système immunitaire et d’autres organes (comme le foie ou les tissus adipeux) communiquent entre eux et fonctionnent ensemble. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire fidèlement ces interactions dans leur globalité. Dans un second temps, les résultats obtenus permettront d’orienter des études complémentaires sur des modèles plus simples, afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu et de limiter à l’avenir le recours aux animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un outil de biostatistique (R), sur la base de données issues d’études préliminaires. Cette approche permet de définir l’effectif minimal nécessaire pour mettre en évidence des effets biologiquement pertinents tout en garantissant une puissance statistique suffisante. Ainsi, un effectif de 12 animaux par groupe a été retenu afin d’assurer la robustesse des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes de 4 dans des cages enrichies comprenant des dispositifs permettant l’isolement si nécessaire. Ils seront manipulés régulièrement afin de les habituer à la contention et de limiter le stress lié aux interventions expérimentales. Une surveillance régulière des animaux sera mise en place tout au long de l’étude afin d’évaluer leur état général et de détecter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Cette surveillance repose sur une grille de scoring intégrant plusieurs paramètres (poids, apparence physique, comportement spontané et réponse aux stimuli), permettant une évaluation globale et standardisée de l’état de l’animal. Une surveillance renforcée sera appliquée lors des phases expérimentales les plus sensibles, notamment lors de l’induction de l’inflammation intestinale. La grille de score, associée à des points limites prédéfinis et adaptés à chaque procédure, permettra de guider les décisions de prise en charge et, si nécessaire, de déclencher l’arrêt de l’expérimentation afin de préserver le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en recherche biomédicale, car son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain, notamment pour l’étude du métabolisme, du système immunitaire et du fonctionnement intestinal. De plus, de nombreux outils scientifiques permettent d’analyser précisément ces fonctions chez cet animal. Dans ce projet, des souris adultes seront utilisées pour permettre la reproduction, puis leurs descendants seront suivis jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet d’étudier les effets d’une exposition précoce, dès la vie avant la naissance, ainsi que ses conséquences à long terme sur la santé intestinale et métabolique.