Rongeurs
Effet bénéfique de l’environnement enrichi sur les altérations de la mémoire et des mécanismes associés dans un modèle de maladie du cerveau.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La moitié en cage enrichie, l'autre en cage standard : 192 souris vont être utilisées pour tester si un environnement enrichi limite les pertes de mémoire dans un modèle de maladie d'Alzheimer débutante, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal vit d'abord quatre mois dans son type de cage, puis passe une série de tests comportementaux en étant isolé 48 heures, 24 heures puis 4 heures. À la fin, 64 souris subissent un prélèvement de sang terminal et 64 une perfusion terminale sous anesthésie profonde. Le porteur justifie l'usage de souris par l'impossibilité de détecter ce stade précoce de la maladie chez l'humain.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie du cerveau encore incurable et irréversible. Elle est caractérisée par un déclin des fonctions cognitives telles que la mémoire. En novembre 2024, l’Agence européenne des médicaments a autorisé la commercialisation en Europe d’un traitement ciblant une des causes supposées de la maladie. Cependant, le rapport bénéfice/risque actuel de ce traitement destiné qu’aux patients en début de maladie, n’est pas suffisant pour le rendre accessible en France. Il est donc crucial de trouver d’autres approches thérapeutiques, en complément des approches existantes, pour mieux traiter la MA. Les approches non médicamenteuses comme une activité physique adaptée, la danse, la musicothérapie ou la médiation animale, sont de plus en plus utilisées pour accompagner les personnes atteintes de MA. Ces interventions non pharmacologiques exposent les malades à de nombreuses stimulations cognitives, sensorielles, motrices et sociales produisant un enrichissement de leur environnement capable de ralentir la progression de la MA, de maintenir plus longtemps l’autonomie de ces malades, et d’améliorer leur qualité de vie. Des études réalisées chez l’Homme comme chez l’animal (surtout rongeurs), indiquent qu’une exposition prolongée à un environnement enrichi améliore notamment les capacités mnésiques et stimule le système immunitaire. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets d’un enrichissement de l’environnement restent encore à élucider. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le bénéfice d’un hébergement en environnement enrichi sur un modèle de souris Alzheimer génétiquement modifié, notamment sur les déficits cognitifs, sur les biomarqueurs caractéristiques de la MA et sur les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet de recherche est la mise en évidence de modifications comportementales (capacités mnésiques), moléculaires et cellulaires (biomarqueurs MA, inflammation), qui sous-tendent les effets bénéfiques de l’enrichissement de l’environnement (EE) dans un modèle de maladie d’Alzheimer. Les analyses conjointes sur les deux sexes permettront d’étudier les différences entre mâles et femelles au niveau cognitif et permettront une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires/cellulaires, dépendants du sexe, qui sous-tendent les interventions non pharmacologiques telles que l’EE. Cela pourrait contribuer à développer des approches thérapeutiques personnalisées (Homme versus Femme) et à leur mise en place aux stades les plus précoces. En apportant des bases mécanistiques dans notre modèle animal de MA, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales sur la MA (pathologie amyloïde et déficit cognitif), sur les effets bénéfiques de l’EE et leur implication en santé humaine. Enfin, l’identification et le traçage biologique sanguin et cérébraux de marqueurs de la MA permettra le développement de stratégies thérapeutiques nouvelles, ou combinatoires soutenant des stratégies non pharmacologiques.
Procédures
Pour 192 animaux : 96 animaux seront hébergés en cage standard et 96 animaux seront hébergés en environnement enrichi pendant 4 mois (de 1 à 5 mois d’âge). Les tests comportementaux seront réalisés sur l’ensemble des animaux sur une période de 13 jours durant laquelle les animaux seront hébergés transitoirement en cage individuelle pendant 48h pour le premier test, 24h pour le second test et 4h pour le dernier test. Pour 64 animaux : Environ une semaine après le dernier test comportemental, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang terminal sous anesthésie profonde (durée totale de la procédure : environ 15 minutes) Pour 64 animaux : Environ une semaine après le dernier test comportemental, les animaux seront soumis à une perfusion terminale pour la fixation de tissus sous anesthésie profonde (durée totale de la procédure : environ 15 minutes).
Impact sur les animaux
Tous les animaux seront transférés en cage individuelle transitoirement avant de commencer chaque test, puis retourneront dans leur cage d’origine à la fin de chaque test (période d’isolement : 48h pour le premier test, 24h pour le deuxième test et 4h pour le dernier test). Cet hébergement en cage individuelle des congénères peut générer un stress. L’injection d’anesthésiques et/ou d’analgésiques aux souris, à l’aide d’une aiguille, entraîne une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. De plus, nous nous intéressons au stade prodromal de la MA difficilement détectable chez l’Homme. Nous ne pouvons, de ce fait, pas réaliser les analyses cellulaires et moléculaires sur l’Homme, ni utiliser d’alternative cellulaire ou de simulation par des techniques informatiques. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. De plus, nous nous intéressons au stade prodromal de la MA difficilement détectable chez l’Homme. Nous ne pouvons, de ce fait, pas réaliser les analyses cellulaires et moléculaires sur l’Homme, ni utiliser d’alternative cellulaire ou de simulation par des techniques informatiques. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Raffinement
Pour appliquer le principe de raffinement, un enrichissement environnemental est apporté dans les cages standards : dispositif de nidification (certifié contact alimentaire) chaque semaine. Dans le cas d’hébergement en cage individuelle (comportement), plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation pour ne pas créer d’isolement visuel, ni olfactif. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des tests comportementaux. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie. Une anesthésie générale et une analgésie adaptée sont utilisées pour les procédures qui le nécessitent.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront testés à l’âge de 5 mois, âge ou au moins un des déficits mnésiques est bien marqué (nos études antérieures ayant montré que les premiers déficits apparaissent à l’âge de 4 mois) dans ce modèle de souris transgéniques. De plus, ce modèle permet de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuroanatomiques comparables à celles du cerveau humain.
Rôle du microbiote humain dans le stockage lipidique hépatique.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Identifiées par un poinçon à l'oreille, traitées aux antibiotiques par quatorze gavages puis recevant des selles humaines par douze gavages supplémentaires, 60 souris vont être utilisées pour étudier l'effet du microbiote humain sur le foie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les gavages répétés, les pesées et le prélèvement sanguin à la queue provoquent stress et douleurs passagers. Toutes sont tuées à l'issue pour collecter leur sang et leurs tissus. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit les interactions entre microbiote transplanté et métabolisme du foie.
Objectifs
Des travaux précédents ont mis en évidence que : -chez l’Homme, plus l’accumulation de graisse dans le foie est sévère, plus le taux sanguin d’un métabolite, appelé ici X, est élevé ; -chez la souris, le métabolite X, lorsqu’il est administré par gavage, peut à lui seul provoquer l’accumulation de graisse dans le foie. Comme ce métabolite X est produit par le microbiote intestinal, nous souhaitons comprendre si le microbiote humain est directement responsable de sa production et donc de l’accumulation de graisse dans le foie. Pour répondre à cette question, nous allons réaliser des transplantations fécales chez la souris. Cela consiste à transférer le microbiote de donneurs humains (personnes en bonne santé ou patients atteints de foie gras, présentant soit de faibles soit de forts taux de métabolite X dans le sang) dans des souris dépourvues de leur propre microbiote. L’objectif est de vérifier si le microbiote humain suffit à reproduire chez la souris des taux sanguins similaires de métabolite X (faibles ou élevés) et s’il peut entraîner, selon l’origine des selles, une accumulation plus ou moins importante de graisse dans le foie. L’expérience comportera plusieurs étapes : 1. une phase d’acclimatation des animaux ; 2. une élimination du microbiote intestinal des souris grâce à un traitement antibiotique d’une semaine ; 3. la transplantation fécale, 4. un prélèvement de sang sous anesthésie pour mesurer les concentrations du métabolite X, suivi de la collecte des tissus nécessaires aux analyses.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de déterminer si le microbiote de patients avec la maladie du foie gras ayant des taux élevés de métabolite X peut, à lui seul, augmenter ce métabolite et provoquer une accumulation de graisse dans le foie chez la souris, comparé à des microbiotes de sujets sains ou de patients présentant de faibles taux. Cela établira un lien direct entre certaines bactéries, le métabolite X et les atteintes du foie. À plus long terme, ces résultats pourront guider le développement de stratégies visant à réduire les bactéries responsables de la surproduction du métabolite X, ouvrant la voie à de nouvelles approches pour prévenir ou traiter la maladie du foie gras.
Procédures
Identification : les 60 souris recevront un unique petit poinçon au niveau de l’oreille pour permettre leur identification (durée : < 30 s, contention comprise). Traitement antibiotique : les 60 souris seront traitées pendant 7 jours consécutifs par un cocktail d’antibiotiques administré deux fois par jour (à 8 h d’intervalle). Chaque animal recevra donc 14 gavages (durée : ~30 s par gavage, contention comprise). Transplantation fécale : les 60 souris recevront des suspensions de selles humaines par gavage 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs (lundi, mardi, mercredi), et ce durant 4 semaines, soit 12 gavages par animal (durée : ~30 s par gavage). Pesées : les 60 souris seront pesées 2 fois par semaine sur toute la durée de l’étude, soit 10 pesées par animal (durée : ~30 s par manipulation). Analgésie et anesthésie : les 60 souris recevront une injection d’antidouleur (durée : ~30 s, 1 seule fois avant euthanasie), suivie 30 minutes plus tard d’une injection d’anesthésiant (durée : ~30 s, 1 seule fois avant euthanasie). Jeûne : les 60 souris seront soumises à un jeûne nocturne avant la mise à mort afin de stabiliser les paramètres métaboliques et permettre au mécanisme identifié par lequel le métabolite induit un stockage de lipides de se mettre en place. Prélèvement sanguin : les 60 souris subiront une petite incision (< 1 mm) au bout de la queue permettant de recueillir quelques gouttes de sang (durée : ~1 min pour l’incision et le prélèvement).
Impact sur les animaux
L’identification par poinçonnement de l’oreille peut provoquer une douleur légère et transitoire. Le traitement antibiotique d’une semaine est susceptible d’entraîner une légère perte de poids. Les gavages induisent un stress et un inconfort temporaires. Les pesées génèrent un stress léger. Les injections nécessaires à l’anesthésie et à l’analgésie provoquent une légère douleur momentanée. La période de jeûne nocturne peut entraîner un inconfort supplémentaire, et le prélèvement sanguin à la pointe de la queue s’accompagne d’une douleur passagère. Aucun effet indésirable n’a été observé lors de protocoles similaires menés dans notre laboratoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de collecter le sang et les tissus nécessaires aux analyses.
Remplacement
L’objectif du projet est d’évaluer la capacité d’un microbiote humain à induire la production du métabolite X et à déclencher l’accumulation de graisse dans le foie. Aucune méthode alternative ne permet aujourd’hui de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre le microbiote transplanté, l’absorption intestinale, le métabolisme du foie et la régulation du métabolite X. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser le transfert des métabolites, la dynamique hôte–microbiote ni les conséquences. Le modèle souris reste donc le seul modèle pertinent pour établir un lien causal entre composition du microbiote, production du métabolite X et altérations du foie.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été déterminé à partir d’un calcul de puissance statistique, en utilisant des données issues de protocoles antérieurs menés chez des patients atteints de la maladie du foie gras pour lesquels le métabolite X a été mesuré en circulant. Ce calcul indique qu’un effectif de 20 animaux par groupe est nécessaire pour détecter une différence significative entre groupes. Par ailleurs, un maximum de tissus sera prélevé et conservé lors de la mise à mort, afin d’être utilisés pour des analyses complémentaires ou partagés dans le cadre de collaborations, permettant ainsi d’éviter la répétition inutile d’expérimentations animales.
Raffinement
Les animaux seront surveillés cinq fois par semaine, avec un suivi individuel du poids à J0 et deux fois par semaine et une mesure de la consommation alimentaire deux fois par semaine par cage. Ces suivis réguliers permettront d’identifier précocement tout signe de perte de poids excessive. Les gavages seront réalisés exclusivement par du personnel expérimenté, afin de garantir un geste précis et rapide minimisant stress et inconfort. Une sonde souple sera utilisée pour les gavages pour réduire le risque d’irritation ou de lésion de l’œsophage. Après chaque gavage, chaque animal sera observé durant au moins 5 minutes pour vérifier l’absence de douleur ou de détresse. Les volumes administrés par gavages seront strictement limités au minimum compatible avec la procédure pour réduire l’inconfort. Un enrichissement supplémentaire des cages sera mis en place durant la semaine de traitement antibiotique, ainsi que pendant la nuit de jeûne, afin d’atténuer le stress et maintenir un comportement normal. Les antibiotiques seront administrés par gavage plutôt que dans l’eau de boisson, afin de préserver une prise alimentaire et hydrique optimale et d’éviter une perte de poids excessive durant la phase d’antibiothérapie. Une seule incision de moins de 1 mm à l’extrémité de la queue sera réalisée pour recueillir les quelques gouttes nécessaires à l’évaluation du métabolisme du sucre. Les volumes injectés pour l’anesthésie et l’analgésie seront réduits au strict minimum efficace. Avant le prélèvement sanguin final, les animaux seront anesthésiés par injection avec analgésie complémentaire. La mise à mort sera ensuite réalisée par dislocation cervicale. Enfin, des points limites prédéfinis et adaptés au modèle seront appliqués afin d’interrompre la procédure dès l’apparition de signes précoces de souffrance ou de détérioration de l’état général.
Choix des espèces
La souris constitue l’espèce la plus appropriée pour répondre à la question scientifique posée. En effet, elle permet de réaliser des transplantations fécales dans des conditions contrôlées et reproductibles, tout en offrant une physiologie de l’intestin et du foie bien caractérisée et comparable à celle de l’Homme. Les modèles souris sont de référence pour étudier les interactions hôte–microbiote, la production de métabolites d’origine bactérienne et leurs conséquences. De plus, les procédures de traitements avec les antibiotiques et de transplantation de selles humaines sont validés dans cette espèce, rendant la souris le modèle le plus fiable pour établir un lien causal entre microbiote humain, métabolite X et altérations du foie. Des souris âgées de 10 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux ont terminé leur phase de croissance, présentent une physiologie stable et offrent une meilleure homogénéité des réponses. Par ailleurs, des souris de cet âge tolèrent bien les traitements antibiotiques nécessaires à l’élimination du microbiote, ce qui garantit la fiabilité et la reproductibilité du protocole.
Étude du rôle de la sénescence hépatique dans la cardiomyopathie diabétique via le métabolisme de la phénylalanine
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Nourries d'un régime destiné à imiter l'obésité humaine, 320 souris vont être utilisées pour étudier une atteinte cardiaque liée au diabète, dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des échographies cardiaques sur animal vigile, des mesures de glycémie par prélèvement à la queue et des tests métaboliques après six heures de jeûne. Le porteur écrit qu'aucun effet douloureux n'est prévu, alors que le niveau de souffrance déclaré du projet est modéré. La mise à mort sert à prélever plusieurs organes jugés "indispensables" à l'évaluation de la maladie.
Objectifs
Ce projet étudie comment un régime riche en graisses et sucres, comme chez les personnes en surpoids et en obésité, peut endommager le foie (stéatose) et le cœur chez des souris adultes mâles et femelles. Nous comparons ces souris dans deux conditions : un avec ce régime riche en graisses et sucre, et un avec un régime pauvre en graisse . L'idée est de mieux comprendre ces maladies hepatiques courantes liées à l'obésité.
Bénéfices attendus
Ces observations pourraient aider à identifier des signaux précoces de lésions cardiaques dues à un foie malade, pour prévenir ou traiter mieux ces affections chez l'homme. Cela profiterait à des millions de personnes touchées par l'obésité, et leurs complications cardiaques, en guidant de futurs médicaments ou conseils alimentaires. Le projet valide aussi un modèle fiable pour d'autres recherches, en comparant les résultats de deux laboratoires.
Procédures
Echocardiographie : Geste non-invasif permettant d’évaluer les fonctions cardiaques, réalisé sur animaux vigiles préalablement épilés, sur tous les animaux. Il s’agit de maintenir les animaux sur le dos pour une durée de 3-4 minutes, le temps d’appliquer la sonde d’échographie et de procéder à l’enregistrement de l’échocardiogramme. Glycémie : Mesure du taux de glucose sanguin de tous les animaux. Sur animaux vigiles, on prélève une goutte de sang à la queue que l’on récupère sur un glucomètre afin de procéder à la lecture de la glycémie. Insuline-tolérance test (ITT) et glucose-tolérance test (GTT) : Tests métabolliques permettant d’évaluer la résistance à l’insuline et la tolérance au glucose. Sur animaux vigiles mis à jeun pendant 6h, injection (quelques secondes moins de 5 secondes) soit d’insuline (ITT), soit de glucose (GTT) et de suivre la glycémie à T=0, T=15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min. La moitié des animaux seront soumis à un test GTT et l’autre moitié au test ITT en début et fin de régime (soit n=5 pour ITT et n=5 pour GTT).
Impact sur les animaux
Les animaux sont nourris avec un régime spécial pour imiter l'obésité humaine. Aucun effet douloureux prévu. On vérifie quotidiennement leur santé (poids, comportement). Lors des suivis métabolique et cardiaque, le moindre signe de malaise (ex. glycémie anormale, polyurie associé à diabète) entraîne un arrêt immédiat de l'analyse et exclut l'animal du protocole.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de plusieurs organes nécessaires à l’analyse de différents paramètres cliniques indispensables à l’évaluation du stade d’avancement de la maladie.
Remplacement
Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissus adipeux, intestins et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constituent le foie. Par conséquent, compte tenu de la nature multifactorielle, de la composition hétérogène du microenvironnement cellulaire et de la contribution du microbiote intrahépatique, seuls les modèles précliniques in vivo permettent jusqu’à présent de reproduire les diverses caractéristiques d’un organisme multicellulaire atteint par cette pathologie.
Réduction
La stratégie expérimentale a été définie de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs tout en évitant des réplicats inutiles. En se basant sur les données de la littérature scientifique utilisant des modèles murins nourris par un régime alimentaire hypercalorique, un test statistique de calcul d’effectif minimal a été réalisé. Ainsi, un effectif de 10 animaux par groupe permettra de déceler de faibles variations quantitatives entre les groupes expérimentaux tout en prenant en compte la variabilité inter-individuelle. Afin d’optimiser au maximun le protocole en cours, nous regarderons simultanément différents tissus d’intérêt dans un même animal (réduction importante du nombre d’animaux prévus).
Raffinement
Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime hypercalorique (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.
Choix des espèces
Cette espèce (souris) permet de modéliser la pathologie humaine sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cet animal. Par ailleurs, ce modèle murin permet de tester in vivo le developpement de la pathologie stéatohépatite. D’ailleurs, la souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme sur les paramètres liés au métabolisme du glucose et la surcharge pondérale. Les souris seront incluses aux protocoles expérimentaux au stade d’adultes (5 mois). En effet, la pathologie de la stéatohépatite se développe essentiellement chez les adultes.
Etude des effets de la progastrine sur le développement des métastases dans le cancer colorectal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour étudier le rôle d'une protéine dans les métastases du cancer colorectal, 1 148 souris vont être utilisées, 1 042 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 106 opérées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des injections répétées de molécules, subissent une chirurgie et des prélèvements sanguins, la formation de métastases pouvant induire un mal-être ou des souffrances de l'aveu du porteur. Les organes d'intérêt sont récupérés après la mise à mort pour analyse histologique. Le porteur écarte les modèles in vitro au motif qu'aucun ne reproduit la formation de métastases dans les organes.
Objectifs
Le cancer colorectal, troisième cancer le plus fréquent en France, se propage au foie ou au poumon (métastases) dans 15 % des cas, ce qui aggrave considérablement le pronostic des patients. Une molécule appelée progastrine, présente en grande quantité dans leur sang, favorise la croissance de la tumeur initiale, mais son rôle dans la formation des métastases reste inconnu. Ce projet vise à démontrer que la progastrine pourrait faciliter la survie de certaines cellules immunitaires (neutrophiles) et ainsi favoriser l’apparition de métastases au foie et aux poumons. Pour cela, des expériences sur des souris permettront d’abord d’identifier les mécanismes cellulaires puis de tester si le blocage de la progastrine réduit effectivement la formation de métastases. Ces recherches, essentielles pour développer de nouveaux traitements, justifient l’utilisation de modèles animaux, dans le strict respect des règles éthiques et de bien-être animal.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont d’ordre translationnel (applicable en clinique) puisque ce projet permettra de mettre en évidence la progastrine comme une nouvelle cible thérapeutique afin de bloquer la formation de métastases hépatiques et/ou pulmonaires chez les patients atteints de cancer colorectal avancé de mauvais pronostic. A court terme, ce projet nous permettra de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles thérapies pour traiter les patients et améliorer leur espérance de vie.
Procédures
Pour la première procédure, les animaux auront une injection d’anesthésique/analgésique (1 injection/animal, 10sec). Pour la deuxième et la troisième procédure : Les animaux auront des injections en intra-péritonéale de molécules 48h avant la chirurgie (1 injection/souris, 10sec), des injections en intra-péritonéale de molécules 24h avant la chirurgie (1 injection/souris, 10sec), tous les jours la première semaine après la chirurgie (1 injection /souris, 10sec) puis tous les 3 jours pendant 3 semaines (1 injection/souris, 10sec). Une chirurgie avec couverture analgésique sur 48h (2 injections par jour), injections d’anti-inflammatoires sur les deux jours suivants (2 fois par jour). Deux prélèvements sanguins espacés de deux semaines après la chirurgie. Une injection d’anesthésique/analgésique léthale (1 injection/animal, 10sec)
Impact sur les animaux
Les injections peuvent générer du stress à la manipulation et une légère et rapide douleur au site d’injection. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales et/ou de l’inconfort au réveil, pris en charge par des analgésiques. La formation de métastases peut induire un mal-être ou des souffrances. La collecte de sang sous anesthésie peut induire un léger inconfort localisé au réveil. Une infection oculaire peut apparaître.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les organes d’intérêts seront récupérés pour une analyse histologique post mortem.
Remplacement
L’objectif 1 de notre projet utilise les cellules immunitaires issues du sang frais de souris car il n’y a aucune lignée cellulaire qui peut les remplacer. Aussi, pour l’objectif 2, il n’y a aucun modèle in vitro qui permet l’étude de la formation de métastases dans les organes périphériques. Nous avons donc recours aux modèles métastatiques chez la souris.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaires en utilisant les données préliminaires.
Raffinement
En plus des bonnes conditions d'hébergement, nous éviterons les animaux isolés et si un mâle doit être isolé, une femelle de compagnie âgée sera rajoutée dans la cage. Les souris seront préalablement acclimatées aux manipulations et à l’induction anesthésique afin de limiter les réactions de stress. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Pour la chirurgie abdominale (procédure 2), les animaux seront habitués au chirurgien pendant quelques jours avant la chirurgie et des conditions d'asepsies seront rigoureusement appliquées pour éviter la perte d'animaux due à des infections post-chirurgies. Les prises en charge avant les chirurgies sont une analgésie locale, une analgésie générale et un traitement anti-inflammatoire. Après la chirurgie, les animaux recevront pendant 2j consécutifs un analgésique et un anti-inflammatoire. Les prélèvements sanguins seront réalisés selon des modalités visant à minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Chaque prélèvement sera effectué sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, permettant une induction et un réveil rapides, et réduisant la contrainte liée à l’immobilisation. Les volumes prélevés respecteront strictement les recommandations en vigueur pour des prélèvements répétés sur une période de quatre semaines, avec un espacement adéquat entre les prélèvements afin de préserver l’état physiologique des animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive après chaque procédure (comportement, reprise de l’activité, état général), et tout signe de mal être conduira à une prise en charge adaptée ou à la mise à mort.
Choix des espèces
Les souris présentent l’avantage d’être un très bon modèle pour l'étude des métastases hépatiques et pulmonaires. Les modèles sont bien établis et décrits dans la littérature et les cellules tumorales sont du même statut génétique, il n’y a donc pas de rejet et le système immunitaire peut donc être étudié. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 15 semaines, lorsque le système digestif est à maturité.
Effets individuels et combinés des checkpoints immunitaires sur les réponses neuroinflammatoires des lymphocytes T
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rendues paralysées par l'induction d'une encéphalomyélite auto-immune, 3 180 souris vont être utilisées comme modèle de sclérose en plaques, 2 460 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 720 opérées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des injections par voies rétro-orbitale, intradermique, intrapéritonéale et intracardiaque, et développent une dégradation de l'état général avec déshydratation, dénutrition et paralysie. Le porteur indique que les animaux ne peuvent être ni réutilisés ni adoptés du fait de la maladie induite, ce qui justifie leur mise à mort. Une partie des corps sert ensuite à des prélèvements d'organes pour des analyses complémentaires.
Objectifs
Les lymphocytes T sont des cellules clés de notre système immunitaire, mais lorsqu’ils sont mal régulés, ils peuvent attaquer nos propres tissus et provoquer des maladies auto-immunes. Ces cellules sont contrôlées par des « points de contrôle immunitaires » qui agissent comme des freins pour limiter leur activité. La sclérose en plaques est une maladie auto-immune du système nerveux central, touchant environ 2,8 millions de personnes dans le monde, où des lymphocytes T hyperactifs provoquent inflammation et destruction des neurones. Nous étudions deux points de contrôle immunitaires identifiés comme régulateurs de cette maladie dans des modèles animaux, qui permettent de reproduire rapidement la progression de la maladie et de tester de nouvelles interventions plus efficacement que chez l’humain. Ce projet vise à comprendre comment ces récepteurs modulent l’activité des lymphocytes T, en étudiant les effets de leur absence, seule ou combinée, sur l’évolution de la maladie et le comportement de ces cellules. Ces travaux devraient apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes fondamentaux des maladies auto-immunes et orienter le développement de thérapies ciblées.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de mieux comprendre les fonctions et mécanismes d’action des points de contrôle immunitaires BTLA et PD1 dans la régulation des pathologies auto-immunes du système nerveux central. Ce projet vise également à découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de pathologie telle que la Sclérose en Plaques. Les connaissances générées par ce projet pourront être transposées à d’autres contextes de maladies auto-immunes.
Procédures
1 – Injection rétro-orbitale. Injection par voie rétro-orbitaire à J0 et J2, 4-5 secondes/injection. Les animaux seront anesthésiés par isoflurane pendant 30 secondes. 2 – Injection intradermique. Injection par voie intradermique à la base de la queue à J0, 10-15 secondes/injection.Les animaux seront anesthésiés par isoflurane pendant 30 secondes. 3 – Injection intrapéritonéale Injection par voie intrapéritonéale, 4-5 secondes/injection. 4 – Injection intracardiaque Injection par voie intracardiaque, 30-45 secondes/injection. Les animaux seront anesthésiés avec une injection de kétamine/xylasine par voie intrapéritonéale (4-5 secondes/injection)
Impact sur les animaux
L’injection d’anticorps déplétants (anti LT CD8) par voie intra-péritonéale peut engendrer une douleur liée à la piqûre, ainsi qu’un stress dû à la contention (animaux vigiles), sur une durée de 10 secondes. Le développement de l’EAE entraîne une altération de l’état général des souris (déshydratation, dénutrition, anémie, perte de poids) ainsi qu’une paralysie. Les souris sont suivies quotidiennement et évaluées selon la grille de scoring clinique.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être éthiquement réutilisées, remplacées ou adoptées, du fait de l’induction de l'EAE. Toutefois, une partie des souris mises à mort permettra d’effectuer des prélèvements d’organes post-mortem, et ainsi mener des expériences ex vivo en plus des données pré-cliniques qu’elles fourniront.
Remplacement
L’étude des réponses cellulaires impliquées dans la physiopathologie de la sclérose en plaque nécessite l’utilisation du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) permettant d’intégrer à la fois activation, différenciation immunitaire, migration cellulaire, migration et activation dans le système nerveux central. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes alternatives à ce modèle permettant l’obtention de résultats scientifiques exploitables et se rapprochant au maximum des réponses cellulaires attendues chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet a été déterminé en se basant sur l’expérience de l’équipe mais également sur la base des connaissances issues d’études publiées dans des journaux de références et utilisant le modèle d’EAE. Le nombre de 10 souris par groupe pour l’étude clinique et 10 souris par groupe pour l’étude phénotypique devrait nous permettre d’obtenir des résultats robustes en termes de statistique. Etant donné que nos modèles sont susceptibles d’exacerber la sévérité de la maladie, des groupes restreints d’animaux seront initialement utilisés pour la mise au point et l’optimisation des différents protocoles expérimentaux, visant à induire des maladies de différente sévérité. Cette approche permettra alors la validation des différents protocoles et le renforcement de nos différentes procédures. Ces protocoles optimisés seront ensuite appliqués à l’ensemble des expérimentations, limitant ainsi les répétitions supplémentaires (sur un grand nombre d’animaux) pouvant être liées à des problèmes méthodologiques. Tout ceci contribue donc à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
En arrivant au service de zootechnie d’expérimentation, les souris sont soumises à une semaine d’acclimatation sans manipulation par l’utilisateur. Une deuxième semaine d’acclimatation aux manipulateurs et aux gestes de manipulation est ensuite mise en place. Cette deuxième semaine d’acclimatation permet de réduire le stress au cours de l’expérimentation. Quatre types d’enrichissements sont ajoutés aux cages des animaux (igloo, sisal, batonnet bois, coton). Comme indiqué précédemment, les modèles d’animaux que nous utilisons sont susceptibles de développer des pathologies sévères. L’utilisation de souris visant à l’optimisation de nos protocoles expérimentaux nous permettra de moduler la sévérité de la maladie et ainsi de limiter au maximum la souffrance des animaux immunisés.
Choix des espèces
Le modèle d’étude choisi est le modèle murin, dont la physiologie, notamment du point de vue du système immunitaire, permet la transposabilité des résultats précliniques à la médecine humaine. Les souris seront incluses en procédure à partir de l’âge de 7 semaines, à partir duquel leur système immunitaire est considéré comme mature.
MODIFICATION : Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Immunodéprimées puis dotées d'un système immunitaire humain, 14 400 souris vont être utilisées pour produire un modèle dit humanisé, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une irradiation, des greffes de tumeurs ou de tissus humains, des infections par le VIH ou d'autres pathogènes, et jusqu'à huit prélèvements ou injections chacune. Leur immunodéficience les rend très sensibles aux infections, et l'irradiation peut provoquer des tumeurs. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non humain, jusque-là "modèle de choix" pour ces études.
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines telles que le VIH (virus de l'Immunodéficience humaine) et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité anti-infectieuse ou anti-tumorale et/ou leur impact sur le système immunitaire humain et/ou d’autres tissus humains.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie luminescente intravitale (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois) - greffe de tissus humain (1 par animal, durée 20min)
Impact sur les animaux
Du fait de leur degré d’immunodéficience et après infection par le VIH, ces animaux sont très sensibles aux infections. Après irradiation certaines souris transgéniques peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. De potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection hydrodynamique. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort. Après injection cellules tumorales humaines les souris développeront des tumeurs.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain(HIS), générés dans la procédure « génération de souris HIS » pourront être inclus dans des procédures permettant de stimuler les cellules immunitaires humaines et/ou de valider l’activité d’immuno-modulateurs. Les souris HIS dont la population de cellules immunitaires aura été augmentée, pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme dans les procédures permettant de greffer des tumeurs ou des tissus humains et/ou d’infecter les souris par des pathogènes afin d’étudier in vivo la réponse immunitaire humaine contre des pathogènes humains ou des tumeurs humaines. Ces animaux pourront également être inclus dans la procédure permettant de valider l’activité d’immuno-modulateurs ou dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet. Certaines souris issues de la procédure « génération de souris HIS » pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris HIS issues de la procédure permettant de valider, dans ce modèle de souris, l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort par analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
MODIFICATION texte en majuscules Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 938 souris (75SOURIS/UTILISATEUR X10UTILISATEURS X1.25 car la greffe ne prend que dans 80% de cas) par an soit un total de 4690 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme. 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé en moyenne à 10 par an. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an). LE BESOIN DE NOS UTILISATEURS EN SOURIS IMMUNODEFICIENTES A 840 CHAQUE ANNEE, EST DE 4200 SUR 5 ANS EN TENANT COMPTE DE 1. NOMBRE D’OPERATEURS DE LA PLATEFORME. 2. NOMBRE D’UTILISATEURS INTERESSES PAR LES MODELES ESTIME A 8 PAR AN. 3. CE QUE LA PLATEFORME FOURNIRA 105 SOURIS IMMUNODEFICIENTES PAR UTILISATEUR ET PAR AN (15 POUR ETUDE PILOTE 30 POUR EXPERIENCE PRINCIPALE, 1 ETUDE PILOTE ET 3 EXPERIENCES PRINCIPALES /UTILISATEUR/AN). Pour produire ces souris POUR NOS COLLABORATEURS, nous maintenons, en continu, un élevage de 8 LIGNEES DE SOURIS immuno-déficientes. Les souris immunodéficientes seront hébergées en groupe dans un environnement protégé pour assurer leur bien-être, NOUS ESTIMONS POUVOIR FOURNIR 4690 SOURIS HIS ET 4200 SOURIS IMMUNO-DEFICIENTES ET MAINTENIR LES LIGNEES. NOUS UTILISERONS UN TOTAL DE 14400. Nous aurons 3 trios reproducteurs de chaque lignée en continu pendant les 5 années. Ce nombre est le minimum possible pour maintenir un élevage sans croiser les frères/sœurs EN TENANT COMPTE QUE CES LIGNEES PRODUISENT PEU DE PETITS. En partant du fait que chaque femelle d’un trio produit 5 petits par mois, chaque trio produit 10 petits/mois soit 10x12 = 120 petits/an. Ainsi pour chaque lignée, 120x3trios= 360 animaux seront produits chaque année. Pour chaque lignée, il y aura donc une production de 360x5ans = 1800 animaux/lignée sur 5 ans. Nous produirons donc, pour les 8 lignées, 1800x8 = 14400 animaux produits en 5ans. Parmi ces 14400 animaux produits en 5 ans, environ 3600 animaux (25%) seront sacrifiés pour mauvais génotype, 4690 seront humanisés, 4200 SERONT UTILISES POUR TESTER LES NOUVEAUX TRAITEMENTS DE NOS COLLABORATEURS, les 1910 animaux restants assureront le maintien des colonies.
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Un outil informatique de randomisation sera utilisé en amont des expériences pour garantir la répartition équilibrée entre les groupes de souris de variables susceptibles d'interférer (biais) avec la mesure ou l'analyse des résultats de l'essai. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de dermatite, les animaux seront placés sur une litière à base de cellulose et les lésions traitées avec un désinfectant. Après chaque intervention chirurgicale, les animaux seront placés dans des cages chauffées pendant la phase de réveil, et auront du gel hydrique à disposition pendant plusieurs jours. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. MODIFICATION texte en majuscules Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines dans des souriceaux nouveau-nés (
Modélisation et caractérisation de modèles murins précliniques d’infection par les virus respiratoire syncytial (VRS) : étude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 700 souris, toutes classées en souffrance sévère et toutes tuées à l'issue, vont être infectées par le virus respiratoire syncytial puis traitées par des molécules candidates administrées par voie orale, nasale, intraveineuse ou dans le muscle. Les manipulations répétées incluent gavages, injections et prélèvements sanguins, le gavage comportant un risque d'étouffement en cas de fausse route. Les fonctions respiratoires sont mesurées sur l'animal éveillé, et les organes prélevés après la mise à mort. Le porteur justifie le recours à la souris par l'incapacité des modèles in vitro à reproduire la complexité des réponses immunitaires d'un organisme vivant.
Objectifs
Ce projet a pour but de mieux comprendre les infections causées par le virus respiratoire syncytial (VRS), un virus responsable notamment de bronchiolites chez les nourrissons, et de développer de nouveaux traitements ou moyens de prévention. Pour cela, nous utilisons des modèles chez la souris qui permettent de reproduire la maladie observée chez l’être humain. Nous étudions comment le virus se développe dans l’organisme, comment il se propage et comment la maladie évolue au fil du temps. Nous analysons aussi la manière dont le corps réagit face à l’infection, en particulier au niveau des poumons, mais aussi dans d’autres organes. Cela nous aide à comprendre pourquoi certaines personnes développent des formes plus graves ou plus longues de la maladie. Le projet permet également de tester de nouveaux traitements et des vaccins potentiels afin de vérifier s’ils peuvent diminuer la gravité de l’infection, réduire les symptômes et éviter les complications. Enfin, nous appliquons les principes des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer), qui visent à limiter l’utilisation des animaux et à réduire leur inconfort. Avant toute étude chez l’animal, les traitements sont d’abord testés en laboratoire sur des cellules. Nous adaptons également nos méthodes pour utiliser le moins d’animaux possible et assurer leur bien-être.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre l’évolution de la maladie provoquée par les VRS et d’identifier les facteurs qui rendent certains individus plus sensibles à l’infection. Ces modèles permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches de traitement et de prévention contre ces virus. Les résultats attendus de ce projet visent à améliorer les modèles utilisés avant les essais chez l’Homme ainsi qu’à valider des stratégies médicales prometteuses, contribuant ainsi au devéloppement de solutions plus efficaces pour la santé humaine.
Procédures
Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : -Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours, -Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, -Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, -Par le muscle, -Par le nez, -Par voie intraveineuse. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Dans certains cas, un antidouleur (buprénorphine) sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement attendus dans le cadre de nos projets et procédures expérimentales sont principalement liés à la répétition des manipulations : gavage oral, injections (intramusculaire, intraveineuse, intranasale), prélèvements sanguins et mesures physiologiques. Ces interventions peuvent entraîner des effets transitoires, essentiellement dûs à la douleur locale, au stress de contention ou à des réactions tissulaires passagères. - Gavage oral : Un risque d’étouffement existe en cas de fausse route. Dans ce cas l’animal sera placé en position verticale et frictionné afin de dégager les voies respiratoires. Si ces mesures ne rétablissent pas la respiration de l'animal, une mise à mort immédiate sera réalisée. - Injection intramusculaire : La mise en place d’une réaction inflammatoire locale peut provoquer une sensibilité à la palpation, un léger gonflement ou une réduction temporaire de la mobilité des membres postérieurs. - Injection intraveineuse : L’injection par voie rétro-orbitaire peut entrainer un saignement localisé au niveau de l’œil. Une compression douce suite à l’injection est exercée afin de stopper le saignement et limiter la formation d’un hématome. - Injection intranasale : Une irritation locale transitoire peut être provoquée avec un écoulement nasal ou une respiration plus rapide suite à l’administration. Si une détresse respiratoire ou une fausse route surviennent l’animal sera placé en position verticale et frictionné pour dégager les voies respiratoires. Si ces mesures ne rétablissent pas la respiration de l'animal, une mise à mort immédiate est réalisée. - Equipement d'analyse des fonctions respiratoires : La restriction temporaire de mouvement et l’isolement de l’animal peut induire un léger stress pendant la mesure. Afin de limiter cet inconfort une période d’entrainement préalable est mise en place : par une habituation une à deux fois pendant 30 minutes, dans un délai de deux à trois jours avant les mesures. - Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin par voie submandibulaire est une procédure rapide. Le volume de sang prélevé est adapté au poids de l’animal. La ponction peut induire une douleur brève, une compression douce et immédiate est alors appliquée afin de stopper le saignement et limiter la formation d’un hématome.
Devenir
Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront euthanasiés conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet pas de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi, il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Pour tous les actes nécessitant une anesthésie, nous privilégions une anesthésie chimique par voie intrapéritonéale. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les actions nécessaires pour la soulager. Étant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d'anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l'expression des marqueurs d’intérêt, ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’Homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l’étude du système immunitaire dans les conditions d’infection grâce aux connaissances acquises et à l’arsenal d’outils existants. En effet, un vaste répertoire d’anticorps ciblant des marqueurs murrins sont disponibles, permettant de caractériser finement la réponse immunitaire par des méthodes à très haut contenu. Les lignées murines utilisées dans ce projet incluent des animaux génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de certaines mutations sur la susceptibilité à l’infection virale et sur les mécanismes de la réponse immunitaire. Ces modifications génétiques sont utilisées exclusivement dans un objectif de compréhension fonctionnelle des voies impliquées dans l’infection et la pathologie respiratoire. Il est important de préciser que ces lignées ne présentent pas, en conditions d’élevage standard, de phénotype dommageable spontané associé à la modification génétique. Elles possèdent un système immunitaire globalement fonctionnel et ne développent pas d’altération physiologique ou comportementale en dehors du contexte expérimental. L’utilisation de ces modèles permet néanmoins de reproduire ou de moduler spécifiquement des voies biologiques d’intérêt (par exemple des récepteurs ou voies de signalisation impliquée dans l’entrée virale ou la réponse immunitaire), afin d’évaluer leur rôle dans la susceptibilité à l’infection et dans la sévérité de la maladie. Ces approches sont indispensables pour établir un lien causal entre une fonction génique donnée et la réponse à l’infection. Ainsi, les lignées génétiquement modifiées sont utilisées non pas en raison d’un phénotype dommageable intrinsèque, mais comme outils expérimentaux permettant de disséquer les mécanismes de l’infection virale et de la réponse de l’hôte. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes âgés de 6 à 20 semaines, présentant un système immunitaire mature.
Mise en place d’un modèle murin de dépression chronique induite par la corticostérone et évaluation des performances cognitives associées.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour fabriquer un modèle de dépression, 592 souris reçoivent une hormone de stress dans leur eau de boisson afin de déclencher un comportement anxieux et dépressif ainsi que des troubles de la mémoire, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent ensuite jusqu'à huit tests comportementaux censés mesurer l'anxiété, la dépression et les performances cognitives. Le traitement peut aussi dégrader leur pelage et modifier leur poids. Le porteur affirme que la recherche de nouveaux médicaments contre la dépression "nécessite", scientifiquement et réglementairement, le recours à des rongeurs.
Objectifs
La dépression est une maladie fréquente qui touche environ 15 à 20 % de la population générale. Elle se traduit par une grande tristesse, une perte de plaisir ou d’intérêt, de l’anxiété, un isolement social, ainsi que des difficultés de mémoire et d’apprentissage. Les traitements actuellement disponibles présentent plusieurs limites importantes. Ils agissent souvent lentement, ne sont pas efficaces chez tous les patients, et certains symptômes persistent, ce qui favorise les rechutes. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie. Ce projet de recherche vise à participer au développement de nouveaux médicaments pour mieux traiter la dépression et limiter les rechutes. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux qui reproduisent certains aspects de la maladie humaine. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris qui repose sur l’administration prolongée d’une hormone de stress. Ce modèle permet d’induire des comportements anxieux et dépressifs durables chez le rongeur, similaires à ceux observés chez les patients souffrant de dépression. L’objectif principal de ce projet est d’adapter et de caractériser plus en détail ce modèle animal afin d’évaluer le risque de rechutes et les troubles de la mémoire associés à la dépression. Une meilleure compréhension de ces aspects permettra de développer, à terme, des stratégies thérapeutiques plus adaptées et plus efficaces. La dépression touchant environ deux fois plus les femmes que les hommes, des souris mâles et femelles seront utilisées afin de mieux refléter la diversité observée dans la population humaine. Le développement et l’amélioration de ce modèle constituent une étape clé de ce projet. Il servira ensuite à tester de nouveaux médicaments pour mieux traiter la dépression et prévenir les rechutes.
Bénéfices attendus
Cette étude a pour objectif de valider un nouveau modèle animal au sein de notre laboratoire, destiné à l’étude de la dépression et la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les différences entre mâles et femelles ont été très peu étudiées à ce jour. Ainsi, l’utilisation des 2 sexes permettra d’apporter de nouvelles données à ce sujet, d’autant que la dépression touche plus fréquemment les femmes que les hommes. Par ailleurs, l’évaluation des capacités de mémorisation des animaux permettra d’étudier le rôle des troubles de la mémoire et de l’apprentissage dans ce modèle. Ces données permettront d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans la dépression et pourront, à terme, orienter le développement de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, l’impact de la dépression sur le rythme biologique n’a, à ce jour, pas beaucoup été étudié dans ce modèle. L’analyse de ce paramètre apportera des informations complémentaires importantes, en lien avec les troubles du sommeil fréquemment observés chez les patients souffrant de dépression. En conclusion, le développement et la caractérisation de ce modèle constitueront une ressource durable pour le laboratoire. Ce modèle offrira un outil pertinent pour l’évaluation préclinique de nouveaux candidats-médicaments à visée thérapeutique, dans le cadre de ce projet et de futurs projets de recherche du laboratoire.
Procédures
Toutes les souris du projet seront exposées à un maximum de 3 expositions à 8 tests comportementaux d’une durée maximale de 48h selon le test utilisé. Les tests comportementaux choisis sont non invasifs et engendrent peu de nuisance chez l’animal. Ces tests ont pour but de tester le comportement anxieux et dépressif, les performances cognitives ainsi que le rythme biologique des animaux suite au traitement à l’hormone de stress.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, les animaux seront exposés à un traitement à une hormone de stress administré par eau de boisson visant à induire un comportement de type anxieux et dépressif ainsi que des troubles de la mémoire et de l’apprentissage. Ce traitement peut également entraîner des modifications physiques modérées, telles qu’un pelage de moins bonne qualité, lié à une diminution du toilettage, ainsi qu’une prise de poids (nuisance modérée)..
Devenir
A l’issue de ce projet, les 592 souris seront mises à mort.
Remplacement
Ce projet vise à développer et caractériser un modèle animal de dépression. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes des troubles dépressifs et d’en améliorer la prise en charge à travers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. La recherche de nouveaux médicaments nécessite (scientifiquement et règlementairement) l’utilisation d’espèces animales. De plus, seuls des organismes vivants complexes tels que les rongeurs disposent d’un répertoire comportemental suffisamment riche et élaboré pour permettre une évaluation fiable des comportements anxieux et dépressifs et des fonctions cognitives. Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou in silico (modèles mathématiques, bio-informatique) ne peut être réalisé.
Réduction
Un total de 592 souris sera nécessaire pour cette étude. Le nombre d’animaux prévus dans cette étude a été réduit au maximum – au regard des approches comportementales envisagées pour lequel le laboratoire possède une expertise internationale ainsi que sur la base de la littérature.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux auront une semaine d’habituation à l’animalerie. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation sera mis en place. Ainsi, avant le début des expérimentations, les animaux seront progressivement habitués à l’expérimentateur par des manipulations régulières. A noter que l’ensemble des évaluations comportementales sera réalisé exclusivement par un personnel qualifié. Les différents traitements seront administrés dans l’eau de boisson, permettant d’éviter toute injection. Enfin, des points limites précoces et compatibles avec les objectifs scientifiques de notre recherche ont été choisis afin d’éviter toute douleur et détresse de nos animaux.
Choix des espèces
L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. L’idée est en effet de mesurer l’impact des processus cognitifs sur la propension à la rechute après induction d’un syndrome anxio-dépressif. Le modèle dépression induite par administration chronique d’une hormone de stress dans l’eau de boisson a été développé et validé chez la souris. Le phénotype anxio-dépressif des souris dans les différents tests choisis est bien décrit et caractérisé dans la littérature. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines seront utilisées dans ce projet. Ce modèle animal a été décrit et publié avec des animaux à ce stade de développement.
Rôle des enképhalines produites par les lymphocytes T dans la douleur chronique induite par le cancer et la chimiothérapie dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 644 souris vont être utilisées pour étudier la douleur chronique liée au cancer et à la chimiothérapie, 1 350 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 294 sévère, toutes tuées à l'issue. Les animaux reçoivent des greffes de tumeurs, une chimiothérapie et une batterie de tests répétés de sensibilité, dont un test mécanique jusqu'à trente-trois fois sur la durée du projet et un test thermique entre 8 et 55 degrés. Le porteur qualifie ces tests de sensibilité de non douloureux, alors que les inductions tumorales peuvent provoquer une douleur modérée à sévère selon la localisation. À la fin, les souris sont tuées pour prélever leur rate, leurs ganglions, leur peau et les tumeurs.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment des molécules naturelles produites par certaines cellules du système immunitaire peuvent influencer la douleur chez la souris. Notre hypothèse est que ces cellules masquent la douleur directement par leur capacité à sécréter des analgésiques naturels. Nous utiliserons des lignées de souris mutantes et des tests de sensibilité à la douleur dans différentes conditions. Nous évaluerons particulièrement la douleur ressentie dans des modèles de cancers et de chimiothérapies. Nous mesurerons l'intensité de la douleur perçue par stimulation mécanique ou par des observations comportementales. L'ensemble des résultats de ce projet permettra de proposer un nouveau mécanisme de régulation de la douleur chez la souris avec de possibles implications cliniques chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Les cancers représentent un enjeu majeur de santé publique. En France, environ 433 000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année et plusieurs centaines de milliers de patients reçoivent une chimiothérapie. Au niveau mondial, près de 20 millions de nouveaux cas par an sont estimés. Les douleurs chroniques constituent une séquelle fréquente des traitements anticancéreux (30 pourcents des patients traités). Au-delà de leur impact sur la qualité de vie, les cancers représentent également un poids économique considérable, avec plus de 20 milliards d’euros de coûts directs pour le système de soins en France et un coût sociétal mondial estimé à plus de 500 milliards d’euros par an. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les douleurs chroniques associées au cancer et aux traitements par chimiothérapie, afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Pour moduler la génétique, certains animaux seront soumis à des administrations en début de projet (sur animal vigile, 2 fois maximum, 1 minute par geste OU sur animal anesthésié, 3 fois maximum, 3 minutes par geste). Afin de mesurer la sensibilité à la douleur, les animaux suivront tous une série de test sur animal vigile : un test de sensibilité à la température entre 8 et 55 degrés sans risque de brûlure (3 fois maximum avec 2 semaines de récupération minimum entre chaque test, 5 minutes maxmim), un test de sensibilité mécanique (33 fois maximum à raison de 3 fois par semaine pendant toute la durée du projet, 5 minutes maximum), un test de démarche (3 traversées maximum avec 2 semaines de récupération minimum entre chaque test, 5 minutes maximum) et un test d'observation (3 fois maximum avec 2 semaines de récupération entre chaque test, 8 minutes). Ces tests ne sont pas douloureux. Certains animaux auront une greffe tumorale sous anesthésie et analgésie suivant le type de tumeur (1 fois, 30 minutes maximum) ou un traitement de chimiothérapie sur animal vigile (30 fois maximum sur 1 mois, 1 minute). Le suivi tumoral sera réalisé par imagerie sur animal anesthésié (3 fois par semaine pendant 2 mois maximum, 5 minutes). Certains groupes pourront recevoir un traitement sur animal anesthésié (1 fois, 5minutes) ou sur animal vigile (30 fois sur 1 mois maximum, 1 minute).
Impact sur les animaux
L'administration d'un médicament pour activer un gène pourra engendrer une irritation de l'oesophage ou une douleur légère de courte durée au point d'injection. Les tests réalisés pour évaluer la sensibilité à la douleur pourront engendrer une gêne et un stress de courte durée. Les inductions de tumeurs pourront engendrer une douleur et une gêne modérée à sévère selon la localisation et la progression tumorale. L'administration de chimiothérapie pourra engendrer une douleur légère de courte durée ainsi qu'un risque d'inflammation au site d'injection et des effets secondaires comme la modification du transit intestinal. Les injections répétées pourront induire un risque de péritonite. L'administration d'une analgésie de récupération ou d'un anticorps pourra engendrer une douleur légère de courte durée au site d'injection. Enfin, l'anesthésie pour certains actes techniques pourraient engrendrer une hypothermie et un risque de détresse cardio-respiratoire. Les animaux immunodéprimés seront plus sensibles aux infections.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire car les organes (rate, ganglions, peau) et les tumeurs doivent être prélevés pour être analysés.
Remplacement
Le but de ce projet est d'évaluer la sensibilité à la douleur dans différentes conditions de cancers et de chimiothéapies. Il est par conséquent impossible de palier à l’utilisation d’animaux vivants car ce projet est basé sur la perception de la douleur chez l'animal. Il n'est pas possivle de remplacer cette utilisation par des expérimentations in vitro et la sensibilité à la douleur n'est pas quantifiable par des paramètres biochimiques connus.
Réduction
Ce projet nécessite l'utilisation de 1644 animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des analyses des résultats. Nous utiliserons 6 animaux par groupe pour toutes les procédures, sauf pour certains des groupes d'animaux témoins où 3 animaux seront suffisants. Des tests statistiques fiables et robustes seront utilisés pour analyser les résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Lorsque cela est nécessaire les animaux seront sous anesthésie et analgésie. Les animaux sous anesthésie de plusieurs minutes auront une application de gel occulaire pour éviter l'assèchement des yeux. Ils seront également maintenus sur tapis chauffant afin d'éviter une hypothermie. Afin de faciliter la prise alimentaire des animaux, des croquettes seront toujours disponibles au fond de la cage. Pour les tests, les animaux seront habitués à leur environnement. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris représente un très bon modèle pour réaliser des expériences de comportement, des études de neuroanatomie, de physiologie et de biologie cellulaire et moléculaire, de plus la disponiblité de souris génétiquement manipulées pour les gènes d'intérêt rend aussi l'utilisation de cette espèce indispensable à la réalisation de ce projet. Les souris pourront être utilisées à partir de l'âge de 8 semaines car le statut immunitaire doit être mature avec un niveau stable de cellules immunitaires.
Un changement de paradigme en transplantation faciale chez la souris par chimérisme hématopoïétique et tolérance induite par cellules T régulatrices
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Jusqu'à soixante-treize injections après l'opération pour les souris receveuses de greffe : 80 souris vont être utilisées dans un modèle de transplantation faciale, 40 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 40 soumises à des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Les donneuses subissent une chirurgie sans réveil et un prélèvement sanguin de grand volume, les receveuses une opération de deux heures et demie suivie de traitements immunosuppresseurs répétés sur plus de deux mois. Le porteur indique que les donneuses ne peuvent pas vivre sans souffrance une fois privées de mandibule, ce qui motive leur mise à mort. Le titre du projet revendique un "changement de paradigme" en transplantation faciale, quand la procédure repose sur la greffe entre souris.
Objectifs
Le projet vise à explorer de nouvelles approches permettant de favoriser une tolérance immunitaire durable tout en réduisant la dépendance aux traitements immunosuppresseurs, pourvoyeurs de complications (infections opportunistes, cancers…). Nous souhaitons développer un modèle préclinique fiable et pertinent de l'allotransplantation faciale murine pour adapter les thérapeutiques en allotransplantation faciale (d'un individu à un autre), en améliorer la tolérance et en diminuer les effets secondaires. Trois objectifs sont poursuivis : 1. établir un modèle chirurgical pertinent fiable et reproductible en minimisant la souffrance animale, 2. déterminer les conditions optimales pré, per et post opératoires pour la réalisation de transplantations faciales, 3. adapter ce modèle à la réalisation d'allotransplantations faciales en conditions allogéniques.
Bénéfices attendus
La transplantation faciale représente une avancée majeure de la chirurgie reconstructrice, mais demeure limitée par la nécessité d’une immunosuppression lourde et prolongée, associée à une morbidité importante. Les bénéfices attendus de ce projet comprennent l’élaboration d’un modèle préclinique d’allotransplantation faciale pertinent indispensable à la recherche de thérapeutiques favorisant la tolérance du greffon et diminuant le risque d’effets secondaires des traitements immunosuppresseurs traditionnels. Ce projet permettra, à court terme, d’établir un modèle préclinique fiable de transplantation faciale, d’élucider les mécanismes responsables de cette tolérance et à long terme d’établir un protocole adapté à la transplantation faciale chez la souris pour pouvoir poursuivre ces recherches et permettre in fine de généraliser cette pratique de reconstruction faciale de pointe chez l’humain. Ces patients souffrent d’une exclusion sociale profonde, d’une perte d’autonomie et d’une incapacité à reprendre une vie professionnelle, entraînant une dépendance durable aux aides sociales et aux dispositifs de soutien psychologique. À cela s’ajoutent des dépenses médicales récurrentes pour traiter les complications fonctionnelles, la douleur chronique et les troubles psychiatriques associés. Ces patients pâtissent fréquemment d’une impossibilité de s’alimenter par voie orale (gastrostomie définitive), de respirer par les voies naturelles ou de parler (trachéotomie définitive), ce qui entraine un coût déjà considérable en dispositifs d’alimentation artificielle, de trachéotomie et de soins locaux. En outre, la stigmatisation et l’altération de la communication verbale et non verbale entraînent marginalisation et appauvrissement des interactions sociales. Le coût sociétal lié aux patients présentant une défiguration sévère est considérable et dépasse largement l’impact individuel. Les traumatismes maxillo-faciaux touchent chaque année 150/100 000 habitants en France. Cependant, aucune étude épidémiologique ne tient compte de la gravité des atteintes or, d’après notre expérience, environ 10% de ces traumatismes sont la cause de défiguration sévères entrainant des séquelles respiratoires, fonctionnelles ou esthétiques majeures et nécessitent des interventions chirurgicales majeures.
Procédures
Les animaux donneurs pour la greffe seront soumis à une chirurgie sans réveil associé à un prélèvement sanguin de grand volume (animal sous anesthésie et analgésie, 1 fois, 120 minutes). Les animaux receveurs de la greffe seront soumis à une unique chirurgie (animal anesthésié et analgésie, 1 fois, 150 minutes) associés à des injections en post-opératoire d’analgésiques, d’antibiotique et d’immunosuppresseur (animal vigile, 2 fois par jour pendant 3 jours puis 1 fois par jour pendant 67 jours soit 73 fois au maximum, 1 minute). Les traitements analgésiques, antibiotiques et immunosuppresseurs seront regroupés pour limiter le nombre d’injection au maximum. Avant l’euthanasie des animaux, un prélèvement sanguin de grand volume sera réalisé (animal sous anesthésie générale, 1 fois, 1 minute).
Impact sur les animaux
Les animaux donneurs pour la greffe pourront subir un stress lié à la manipulation et un risque d’hypothermie et de détresse cardio-respiratoire liées à l’anesthésie. La chirurgie sous anesthésie pourrait engendrer de la douleur. Les animaux receveurs de la greffe subiront également un stress lié à la manipulation un risque d’hypothermie et de détresse cardio-respiratoire liées à l’anesthésie et ressentir de la douleur pendant la chirurgie. Ils pourront également ressentir de la douleur modérée après la chirurgie, un risque d’hémorragie ou de nécrose du greffon. Ils pourront également ressentir de la douleur légère de courte durée au site de prélèvement sanguin ainsi que la formation d’un hématome.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire car les souris donneuses ne peuvent pas vivre sans souffrance avec l’absence de mandibule et car des prélèvements d’organes sont nécessaires aux analyses sur les souris receveuses.
Remplacement
Les mécanismes immunologiques impliqués dans la tolérance des greffes composites, la vascularisation dynamique du greffon et les interactions cellulaires complexes ne peuvent pas être reproduits par des modèles in vitro, ex vivo ou in silico. Aucun modèle substitut ne permet actuellement : la reconstruction vasculaire complexe ; les anastomoses microchirurgicales (connexion chirurgicale entre deux structures) ; l’étude du rejet et de la tolérance à l’échelle tissulaire et systémique. Le recours à un modèle murin est donc indispensable à ce stade de développement préclinique. Bien qu’un modèle primate ou un grand animal offrirait une anatomie et physiologie plus proche de celle de l’être humain et une réalisation chirurgicale plus aisée, le choix du modèle murin reste un bon modèle en raison de la proximité phylogénétique de la souris et de l’humain.
Réduction
80 animaux seront utilisés dans le cadre de ce projet. Plusieurs mesures sont mises en place afin de limiter strictement le nombre d’animaux utilisés. Une phase technique préalable permet d’optimiser les gestes chirurgicaux et de réduire le taux d’échec. Les effectifs sont calculés au plus juste afin d’assurer une puissance scientifique suffisante sans surplus d’animaux. Enfin, des analyses multiparamétriques seront réalisées sur chaque animal, afin de maximiser l’information obtenue par animal. Les performances chirurgicales seront suivies à l’aide de méthodes de suivi dans le temps afin de vérifier la réussite de la technique, la survenue d’éventuels problèmes et la stabilisation de la durée de l’intervention. Des tests statistiques seront utilisés pour garantir une interprétation fiable des résultats. Si les conditions opératoires s’avèrent favorables et que les pertes sont inférieures aux estimations, les effectifs seront revus à la baisse ; les souris seront donc commandées progressivement.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Le temps opératoire sera réduit au maximum via la maîtrise technique acquise pendant la première phase du projet. Les interventions seront réalisées par deux opérateurs formés et expérimentés en microchirurgie. Les animaux seront sous anésthésie et analgésie pendant les chirurgies. Après la chirurgie les animaux seront sous analgésie et antibiothérapie. Un tapis chauffant est utilisé pour limiter l'hypothermie. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter l'assèchement occulaire. Une surveillance clinique rapprochée sera mise en place et application stricte des points limites. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Les souris présentent des mécanismes physiologiques et immunologiques assez proches de l’humain pour en constituer un objet d’étude transposable. Dans la littérature, les modèles de transplantation faciale chez la souris est bien décrit. Ces souris ont une circulation cérébrale bien organisée, ce qui permet de se raccorder à la carotide sans risque d’accident vasculaire cérébral pour l’animal. Les animaux utilisés seront des souris de 8 à 10 semaines car il s’agit de souris mature sexuellement. Il correspond également à l’âge des souris utilisées pour ce type d’expérience dans la littérature.
Développement d’anticorps thérapeutiques contre les orthoflavivirus.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Inoculées avec un virus sous anesthésie, 294 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 216 d'entre elles et sévère pour 78, toutes tuées à l'issue. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une maladie virale avec des atteintes neuro-musculaires modérées à sévères, pour mettre au point des anticorps contre les orthoflavivirus. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la réponse immunitaire complète d'un organisme vivant et en conclut que le modèle animal est "essentiel". À la fin de chaque procédure, les souris sont tuées afin de prélever leur sang, leur cerveau et leur rate.
Objectifs
Dans un contexte d’émergence croissante de virus transmis par les moustiques et de la multiplication des épidémies associées, ce projet vise à développer des anticorps thérapeutiques, c’est-à dire des protéines capables de neutraliser ces virus. L’objectif est double : d’une part, répondre au besoin de contre-mesures médicales efficaces ; d’autre part, étudier la réponse immunitaire antivirale. L’étude se concentre sur le virus West Nile (WNV), un virus pathogène pour l’Homme responsable notamment d’affections neurologiques sévères et ne disposant à ce jour en Europe d’aucune option thérapeutique spécifique et efficace. Plusieurs versions de ce virus seront testées afin d’étudier les anticorps neutralisants produits associés et de les caractériser.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à produire des données essentielles pour le développement de nouvelles immunothérapies antivirales. Elles permettront : -De valider un modèle d’infection murin non létal pour le virus West Nile (WNV), c’est-à-dire déterminer les conditions d’infection qui garantit la survie des animaux, tout en induisant une réponse immunitaire efficace -De générer des anticorps capables de neutraliser le WNV et identifier de nouveaux candidats thérapeutiques ; -De mieux comprendre les déterminants clés de la neutralisation virale lors de la réponse immunitaire ; -De proposer une nouvelle stratégie de développement rapide d’anticorps thérapeutiques applicable à des virus similaires. Plus généralement, ce projet apportera des connaissances fondamentales sur les mécanismes de la réponse immunitaire antivirale, tout en soutenant l’effort de préparation faces aux futures épidémies virales.
Procédures
L’ensemble des animaux seront soumis à une inoculation (infectieuse ou non) sous anesthésie, une unique fois : 3 à 5 minutes par animal, incluant l’induction anesthésique, l’injection et le réveil.
Impact sur les animaux
La pesée des animaux ainsi que les injections de véhicule ou du virus faites sous anesthésie peuvent provoquer un stress de courte intensité. Le virus injecté peut entrainer le développement d’une maladie virale avec des atteintes neuro-musculaires modérées à sévères.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes (sang, cerveau et rate) afin d’en isoler les cellules immunitaires et étudier la réplication virale.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative fiable pour reproduire la réponse immunitaire complète d’un organisme vivant. L’utilisation du modèle animal est donc ici essentielle pour notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été calculé pour correspondre au minimum requis pour une statistique de base, à l’aide d’une analyse réalisée avec un logiciel de calcul de puissance statistique. Les résultats obtenus lors de la première phase du projet serviront directement à limiter le nombre d’animaux engagés lors de la seconde phase.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés dès réception et hébergés en groupe avec de l’enrichissement. Ils bénéficieront d’un suivi clinique quotidien afin de détecter et prendre en charge tout signe de souffrance à l’aide de points limites prédictifs et d’analgésique. Toutes les manipulations se feront sous anesthésie et la totalité des prélèvements seront réalisés en post-mortem. Les données obtenues lors de la première procédure permettront d’établir un modèle d’étude, réduisant les atteintes cliniques des animaux par la suite.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de référence pour l’étude des maladies virales et la génération d’anticorps neutralisants. Les animaux seront adultes, commandés à 6 semaines et inoculés entre 7 et 8 semaines. Les modèles animaux décrits dans la littérature pour ce type d’expérience utilisent des animaux de cet âge.
Etude de l’efficacité des nouvelles cellules porteuses d’un récepteur antigénique chimérique dans le traitement des tumeurs hématologiques et solides dans un modèle murin immunodéficient. Établissement utilisateur 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
200 souris immunodéprimées se voient greffer des tumeurs humaines puis injecter des cellules CAR-T, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, y compris celles dont la tumeur a régressé, une reprise de croissance étant jugée toujours possible. Elles peuvent développer une gêne respiratoire ou une paralysie des membres arrière selon la tumeur implantée. Le porteur présente le passage in vivo comme "incontournable" après des essais sur cellules.
Objectifs
L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Malgré son efficacité dans le traitement de cancers sanguins comme la leucémie, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Ce projet vise donc à étudier l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient contribuer à améliorer les immunothérapies dans le traitement du cancer. . Le projet se déroule dans 2 EU différents.
Bénéfices attendus
La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du sein et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d’accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.
Procédures
Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue (EU1). Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions (EU1). Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Des imageries par bioluminescence nécessiteront des injections de luciférine qui se feront en IP sur animal vigile (EU2). Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse. À la fin de l’expérimentation, les animaux seront mis à mort après anesthésie générale à l’isoflurane (EU2).
Impact sur les animaux
L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peut occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisances comme une nécrose pourrait apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 1500 mm3 pour les tumeurs sous cutanées). L’apparition de gêne respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une parésie des membres arrière peuvent être observées (pour la tumeur Raji).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle ainsi que son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons utiliser un modèle murin afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.
Réduction
Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une puissance statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.
Raffinement
Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées trois fois par semaine pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur. De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.
Choix des espèces
Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.