Rongeurs

48 souris obèses et diabétiques vont être utilisées dans une prestation pour un industriel pharmaceutique, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit deux formulations à libération prolongée d'un médicament contre l'obésité, avec vingt-et-une pesées et dix-huit prélèvements de glycémie. Le but est de démontrer que le médicament garde son efficacité sous une forme réduisant les injections du patient à une par mois. Le porteur présente cette étude in vivo comme une étape réglementaire "incontournable" avant les essais cliniques.

Objectifs

En 2021, 537 millions de personnes dans le monde étaient touchées par le diabète de type 2 tandis que 800 millions d’adultes souffraient d’obésité. Ces chiffres alarmants concernent deux “maladies du siècle” qui dépendent de plusieurs facteurs génétiques, environnementaux ou alimentaires. Cette prévalence inquiétante s'accompagne en outre d'une mortalité importante : on attribut directement à l'obésité et au diabète de type 2 associé environ 3,5 millions de décès par an au niveau mondial. Face à ce contexte, l'armada thérapeutique s'avère particulièrement pauvre, et s'accompagne de posologies contraignantes et d'effets secondaires non négligeables. Récemment, des médicaments ciblant les récepteurs du GLP-1 (Glucagon like peptide 1) ont été autorisés sur le marché afin de traiter à la fois l'obésité et le diabète de type 2. Néanmoins, bien que très efficaces, ces traitements s'administrent par voie sous-cutanée et des recherches actives sont en cours afin d'améliorer la posologie et de réduire la fréquence d'administration de ces traitements. L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre d’une prestation contractuelle pour le compte d’un industriel pharmaceutique qui développe des composés thérapeutiques dans le domaine des troubles métaboliques. Cet industriel a notamment développé une nouvelle forme de galénique (matrice sous-cutanée) permettant une libération lente et prolongée du médicament X. Des études précédentes ont montré que cette galénique améliore largement la biodisponibilité du médicament X sur le long terme et diminue largement les effets de pics plasmatiques. Elle aurait ainsi l'avantage de permettre une réduction drastique des prises pour le patient (une administration par mois) améliorant ainsi largement son confort de vie. La matrice à libération prolongée de notre client a été testée in sillico et in vitro et sa bonne tolérance locale au niveau sous-cutané a également été démontrée. Différentes formulations à libération prolongée du médicament X ont été développées et l'objectif du présent projet vise ainsi à démontrer que, sous ces nouvelles formes galéniques, le médicament X conserve son efficacité. La procédure du présent projet se limitera ainsi à une administration unique des formulations à libération prolongée du médicament X et du médicament X sous sa forme galénique initiale suivies de pesées de poids corporel et de dosage glycémiques quotidiens pendant 8 jours.

Bénéfices attendus

Si les résultats obtenus sont positifs, les formulations du médicament X pourront entrer en phase d'étude clinique et être ensuite autorisé à être mis sur le marché en tant que traitements anti-obésité et anti-diabétiques, et dont la posologie serait bien moins contraignante pour les patients traités que le médicament actuel. Par ailleurs, un meilleur contrôle de la biodistribution du médicament X du fait de sa libération prolongée pourrait également améliorer l'efficacité des traitements actuels.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (21 mesures au cours de l'étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des composés (2 administrations ; durée : 1 minute); 3) Prélèvements sanguins pour mesure de la glycémie (18 prélèvements ; durée du prélèvement : 1 minute) ; 4) Anesthésie générale avant mise à mort (durée : 5 minutes).

Impact sur les animaux

L'hébergement en cage individuelle sera source de stress du fait d'un isolement partiel des animaux qui garderont néanmoins des contacts visuels et olfactifs. Les mesures de poids corporel, les administrations des traitements et les prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations des composés et les prélèvements sanguins occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

A l'issue de l'étude, l'ensemble des animaux sera mis à mort.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la glycémie dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 8 animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du faible nombre de traitements et du caractère faiblement invasif des procédures employées, nous avons choisi de tester 2 formulations par animal, en laissant entre chaque traitement une période de repos suffisante (minimum deux semaines). Cette précaution nous permet ainsi de réduire le nombre d'animaux employés pour atteindre les objectifs du projet.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les mesures de poids corporel, les administrations des traitements et les prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages glycémiques (un seule goutte de sang prélevée en bout de queue). Une période de repos d'au minimum 2 semaines sera appliquée entre deux séries de traitements afin de laisser les animaux récupérer. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris obèses et diabétiques est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 8 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

Isolées en cage individuelle pendant dix mois, dont une partie nourrie à 70 % de sa ration, 420 souris vont être utilisées pour étudier le vieillissement de l'ADN, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées au terme des dix mois pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît que ce logement individuel prolongé, qu'il juge nécessaire pour mesurer précisément les apports, induit un stress. Les enseignements espérés sur le vieillissement humain restent une projection.

Objectifs

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons comprendre comment les protéines qui contribuent à l'empaquetage de l'ADN dans les cellules évoluent à mesure que les humains vieillissent. Nous nous intéressons également à la manière dont l'alimentation et les habitudes alimentaires, comme le fait de manger moins ou uniquement à certaines heures, peuvent influencer ces protéines. Pour étudier cette question, nous comparerons des groupes de souris qui s'alimentent normalement à des groupes soumis à un régime alimentaire restrictif et à des horaires de repas limités. En observant ces différences, nous espérons en apprendre davantage sur la manière dont le vieillissement et le mode de vie affectent l'organisation de l'ADN dans notre corps.

Bénéfices attendus

Ce projet nous aidera à comprendre comment les protéines qui organisent l'ADN dans les cellules changent à mesure que les souris vieillissent, et comment ces changements affectent l'activation ou la désactivation des gènes. Nous étudierons également comment deux interventions connues pour favoriser la santé et la longévité, à savoir manger moins et seulement durant la phase active, peuvent influencer ces protéines. Les résultats pourraient fournir des informations sur le processus de vieillissement chez l'homme, identifier des marqueurs permettant de suivre un vieillissement en bonne santé et suggérer des moyens de ralentir les changements liés à l'âge en ciblant l'organisation de l'ADN.

Procédures

Toutes les souris seront hébergées en cage individuelle pendant 10 mois. Une partie des souris seront soumises pendant 10 mois à une restriction calorique associée à une alimentation à durée limitée, recevant 70 % de l’apport calorique individuel de référence, administré une fois par jour au début de la phase active.

Impact sur les animaux

Le logement individuel, nécessaire pour mesurer avec précision la consommation alimentaire et imposer une restriction calorique, peut induire un stress modéré chez les animaux. La pesée des animaux tous les 3 jours provoque un stress bref lié à la manipulation. Le régime alimentaire à restriction calorique et temporelle peut également induire un stress léger.

Devenir

Les animaux feront l’objet d’une mise à mort à la fin des 10 mois afin de prélever leurs organes et de réaliser les analyses ultérieures.

Remplacement

Cette étude examine comment l'organisme dans son ensemble réagit à une alimentation réduite et limitée dans le temps. De telles réponses complexes ne peuvent être reproduites dans des cellules ou dans de petites parties du corps seules, il est donc nécessaire de les étudier chez des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum tout en permettant une analyse statistiquement significative des résultats et en tenant compte de la variabilité interindividuelle des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en prenant en compte la puissance statistique souhaitée (80 %), la différence attendue entre les moyennes des groupes et l’écart type attendu d’après les données publiées. Dans une perspective de réduction, à la fin de l’étude, nous collecterons tous les organes d’intérêt (par exemple, cerveau, foie, poumons, cœur), y compris ceux que nous ne prévoyons pas d’analyser actuellement, et les conserverons au congélateur pour d’éventuelles analyses futures.

Raffinement

Pour limiter l’inconfort et garantir le bien-être des souris tout au long de l’étude, tout animal pesant moins de 20 g au début du protocole ne sera pas inclus. Les souris seront pesées tous les trois jours et leur consommation alimentaire sera surveillée afin de détecter tout signe de détresse. Les animaux seront logés individuellement dans des cages permettant un contact visuel avec les autres souris. Leur environnement sera enrichi afin de favoriser l’expression de comportements naturels, avec la mise à disposition de matériel de nidification et d’éléments d’enrichissement adaptés. Des points limites précis ont été définis, basés notamment sur la surveillance du comportement, de l’apparence physique et du poids corporel des souris.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères présentant de nombreuses similarités avec l’humain, notamment dans leur réponse physiologique à l’alimentation et aux rythmes alimentaires, ce qui en fait un modèle approprié pour étudier les effets d’une alimentation réduite et limitée dans le temps. Pour cette étude, des souris adultes, âgées de 8 semaines au début de l’expérimentation, seront utilisées, car nous souhaitons étudier les effets de la restriction calorique et de l’alimentation à durée limitée chez des animaux adultes.

4 474 souris vont être utilisées pour étudier le rôle de l'œstradiol à la puberté, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité tuée pour prélèvement du cerveau. Une partie subit une chirurgie cérébrale stéréotaxique, d'autres femelles une ablation des ovaires avec pose d'un implant hormonal. Le comportement sexuel des mâles est observé sur des sessions d'accouplement de neuf heures. Le porteur reconnaît que certaines femelles seront tuées sans même être prélevées, une fois leurs implants périmés.

Objectifs

L’infertilité est aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique dont les causes et les mécanismes d’action demeurent mal compris. La fertilité repose sur une régulation adéquate par le cerveau des régions impliquées dans les fonctions de reproduction. L'organisation de ces structures cérébrales, en particulier dans l’hypothalamus, est contrôlée par les hormones stéroïdes sexuelles, testostérone et estradiol, pendant des périodes critiques de développement, de la naissance à la puberté. Le but de ce projet de recherche est de comprendre le rôle de l’œstradiol au cours du développement pubertaire dans les changements de plasticité de l’hypothalamus. Des souris seront utilisées afin d’investiguer les mécanismes d’action de l’œstradiol dans l’organisation pubertaire des réseaux neuraux sous-jacents la régulation des fonctions de reproduction. Les données issues de ce projet aideront à mieux comprendre les troubles pubertaires et contribueront à élucider les mécanismes d’actions impliquées dans le contrôle des fonctions de reproduction mâle et femelle. Cela pourrait ainsi conduire à développer des stratégies thérapeutiques spécifiques au sexe et à l’âge pour remédier aux troubles de la fertilité.

Bénéfices attendus

La puberté est une période critique de la vie qui permet d’atteindre la maturité sexuelle et ainsi permettre la reproduction. C’est une période cruciale de transition entre l’enfance et l’âge adulte qui, en plus de l’apparition des caractères sexuels secondaires, s’accompagne d’importants changements psychiques et comportementaux. Néanmoins de manière surprenante les mécanismes cérébraux sous-tendant ces changements sont aujourd’hui encore mal compris. Les données obtenues dans ce projet contribueront à déterminer les mécanismes d’action qui contrôlent l’organisation pubertaire du cerveau par les hormones stéroïdes sexuelles. Ceci est particulièrement pertinent si nous voulons développer de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.

Procédures

Une partie des souris mâles et femelles subiront une chirurgie intracérébrale stéréotaxique sous anesthésie générale avec réveil qui durera entre 30 et 45 minutes maximum. Celle-ci sera réalisée avec analgésie pré et post-opératoire. Un lot de souris femelles subira un acte de chirurgie afin d’induire la réceptivité par retrait chirurgical des ovaires et pose d’un implant hormonal : procédure chirurgicale d’une durée maximale de 10 minutes sur animaux anesthésiés et recevant une analgésie pré et post-opératoire. Ces femelles subiront également 2 injections sous-cutanées d’hormones avant les tests de comportement sexuels. Le comportement des mâles et femelles sera analysé à l’âge adulte : - comportement spontané d’accouplement (2 tests séparés de 15 jours, d’une durée 9h pour les mâles ; 3 tests séparés de 10 jours d’un durée de 30 minutes pour les femelles, sur animaux vigiles). - test d’activité locomotrice spontanée (durée de 120 minutes sur animaux vigiles) et test d’anxiété spontanée (durée de 9 minutes sur animaux vigiles). Une partie des animaux subiront un acte unique de chirurgie terminale effectuée sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes. Les animaux restants seront anesthésiés profondément et euthanasiés. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.

Impact sur les animaux

Dans le cadre des injections de vecteurs viraux, les chirurgies sur les animaux se feront sous anesthésie générale pendant lesquelles une injection stéréotaxique d’un vecteur viral sera réalisée. Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont une hypothermie, un arrêt cardio-respiratoire liée à l’anesthésie, une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux ainsi qu’une perte de poids rapide. Les injections d’anesthésiques et d’antalgiques peuvent générer une douleur légère au point de piqure. Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs liés aux tests comportementaux. Un stress peut être lié à l’hébergement individuel des mâles avant les tests de comportements. L’anesthésie effectuée pour les ovariectomies est également associée à certains risques (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire…). De plus, un stress peut être lié à la chirurgie effectuée chez les femelles. Cette chirurgie peut également entrainer des douleurs.

Devenir

La majorité des animaux seront euthanasiées afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses histologiques et fonctionnelles. Une faible partie des animaux seront euthanasiés sans prélèvement à la fin des expériences de comportement car ces souris femelles ne peuvent être réutilisées au-delà de la période de validité des implants délivrant des hormones pour étudier le comportement sexuel des mâles.

Remplacement

L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.

Réduction

Le nombre total d'animaux utilisé est de 4474, ce qui permet une analyse combinée des mâles et des femelles et cela à différents stades du développement pubertaire. Des protocoles biologiques différents ne permettent pas d’effectuer toutes les analyses sur les mêmes échantillons. L’expertise scientifique de l’équipe dans l’étude neuroanatomique des fonctions de reproduction permet de connaitre le nombre d’animaux nécessaire par groupe afin d’obtenir des résultats fiables. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, nous déterminerons avec une première cohorte d’animaux les meilleures conditions d’injection des vecteurs viraux. Les effectifs utilisés ont été calculés au plus juste afin d'obtenir une analyse statistique significative le cas échéant, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs régions du cerveau seront analysées en même temps pour le même animal. Les autres organes seront proposés aux collaborateurs de l'équipe comme cela est fait habituellement. Par ailleurs, les résultats obtenus au fil de la réalisation de ce projet nous permettront d’affiner nos besoins et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires. En effet, nous envisageons de sélectionner les conditions induisant une perturbation du comportement sexuel à l’âge adulte, lors des premières expérimentations, afin de conserver uniquement celles-ci dans les expérimentations suivantes. Le nombre d’animaux indiqué dans cette demande correspond au nombre maximal d’animaux pouvant être utilisés dans cette étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Pour les mâles hébergés individuellement, un enrichissement avec du nid végétal et des buchettes en bois seront mis en œuvre pour réduire la contrainte de l’hébergement individuel. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées quotidiennement en post-opératoire, puis hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Pour gérer la douleur post-opératoire, un analgésique sera administré pendant les 3 jours suivant l’opération. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.

Choix des espèces

La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Des souris mâles et femelles adultes seront utilisées. De plus, des souris mâles et femelles seront utilisées à différents âges prépubertaires et pubertaires. Ce projet vise à étudier le rôle des hormones pendant le développement pubertaire, l’utilisation de ces différents âges permettra d’étudier le plus précisément possible les mécanismes au niveau du cerveau pendant cette période.

1 600 souris se voient greffer des cellules cancéreuses puis traiter par chimiothérapie et immunothérapie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont tuées lorsque la tumeur dépasse 1 500 mm³ ou s'ulcère, faute de quoi la masse au flanc gêne leurs déplacements. Le projet cherche à comprendre pourquoi certains cancers résistent aux traitements combinés, via une molécule de l'inflammation. Le porteur annonce n'attendre aucun effet secondaire sévère, ces traitements ayant déjà été largement administrés à des souris.

Objectifs

Les cancers du côlon, du pancréas et du poumon figurent parmi les cancers les plus fréquents et les plus létaux. Leur prise en charge repose en grande partie sur l’utilisation de chimiothérapies qui, en particulier aux stades avancés, ne permettent pas toujours d’obtenir une rémission complète. Il est désormais bien établi que le système immunitaire joue un rôle déterminant dans la réponse aux traitements chimiothérapeutiques. Dans ce contexte, des approches combinant chimiothérapie et immunothérapie ont été développées afin d’en améliorer l’efficacité. Toutefois, ces stratégies combinées restent peu efficaces dans certains cancers, notamment le cancer du pancréas et certains cancers colorectaux et pulmonaires. Il est donc essentiel d’identifier les mécanismes responsables de ces résistances thérapeutiques. L’inflammation peut influencer la façon dont les traitements contre le cancer fonctionnent. Le but du projet est d’évaluer l’impact de l’inflammation sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies utilisées en clinique. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de NLRP3, un acteur important de l’inflammation, dans l’efficacité des traitements associant chimiothérapie et immunothérapie utilisés contre le cancer. En étudiant des cellules tumorales et des souris avec ou sans NLRP3, nous pourrons déterminer si cette molécule agit principalement au niveau des cellules cancéreuses ou des cellules de l’organisme dans la réponse aux traitements. Ce travail permettra également de mieux comprendre comment NLRP3 influence le fonctionnement du système immunitaire au sein des tumeurs, notamment en analysant les cellules immunitaires présentes et leur activité après traitement. Les résultats obtenus permettront d’identifier les mécanismes expliquant pourquoi certains cancers répondent mal aux traitements actuels. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer à l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à améliorer l’efficacité des traitements, en particulier dans les cancers pour lesquels les options actuelles restent limitées.

Procédures

3 interventions : - Injection des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1600. - Traitements par chimiothérapie ou soluion contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 1600. - Traitements par immunothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 1600.

Impact sur les animaux

- L’injection sous-cutanée de cellules tumorales entraînera le développement d’une masse tumorale au niveau du flanc, susceptible d’induire une gêne locomotrice à mesure de sa croissance. Afin de limiter cette contrainte, la taille des tumeurs sera suivie régulièrement et des critères d’arrêt stricts seront appliqués. Les animaux seront euthanasiés en cas d’ulcération tumorale, de volume tumoral supérieur à 1500 mm³ (~250mm2), ou si la tumeur entrave significativement les déplacements. Une altération de l’état général des animaux est possible en lien avec la progression tumorale. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique régulière incluant le suivi du poids, de l’activité, de la posture (notamment signes de douleur), de l’aspect du pelage et du comportement (toilettage, interaction). Tout animal présentant des signes de détresse ou atteignant un point limite prédéfini sera euthanasié sans délai. Les traitements anticancéreux administrés (chimiothérapies et immunothérapie anti-PD-1) peuvent induire des effets indésirables modérés, tels qu’une perte de poids transitoire ou une altération de l’état général. Ces traitements ayant déjà été largement utilisés chez la souris, aucun effet secondaire sévère n’est attendu dans les conditions expérimentales prévues. Une surveillance rapprochée sera néanmoins mise en place afin de détecter précocement tout effet indésirable. Les souris déficientes pour Nlrp3 (Nlrp3-/-) ne présentent pas de phénotype dommageable en conditions basales. Aucune nuisance spécifique liée à ce génotype n’est donc attendue dans le cadre de ce projet.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, c’est-à-dire lorsque le volume tumoral excèdera 1500 mm³ (~250mm2).

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Le test statistique utilisé sera celui de Kruskal-Wallis en raison de la présence de nombreux groupes. Les différents modèles (cancers du pancréas, du poumon et du colon) utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon l’organe d’origine, les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements. De plus, selon le type de cancers, les régimes de chimiothérapies seront différents afin de se rapprocher de la clinique. Ces traitements affecteront également de manière différentielle les cellules du microenvironnement. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour un ou plusieurs modèles, les expériences d’immunomonitoring ne seront pas réalisées sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie et une analgésie, seront réalisées pour chaque opération. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvements présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Rasées et sensibilisées à répétition par patch ou grattage de l'abdomen sous anesthésie, 260 souris subissent ensuite un gavage déclenchant la réaction allergique, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour analyser organes et fluides. Le protocole compare la graine de chanvre à la noisette et à l'épinard, et peut provoquer démangeaisons, irritations, tremblements et chute de la température corporelle. Le porteur justifie le recours aux souris par l'absence de modèle in vitro reproduisant la réaction allergique.

Objectifs

Les allergies alimentaires sont un problème de santé publique qui connait une augmentation en termes de prévalence et de sévérité ces dernières années. Les allergies sont répandues et ont été classées comme la quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ce projet prend part dans un contexte de transition de régime alimentaire visant à utiliser de nouvelles sources de protéines comme la graine de chanvre. Il est possible de rentrer en contact avec la graine de chanvre par le biais de deux voies majeures : orale et cutanée. La consommation de la graine de chanvre est en plein essor de par son fort intérêt nutritionnel et peut se faire au travers de la farine, de barres énergétiques, de pâtes, de biscuits, de boissons ou encore de yaourts. D’autre part, un contact cutané est possible à travers l’huile ou des crèmes à base de graine de chanvre, utilisées en cosmétiques. La recherche sur les allergies à la graine de chanvre est essentielle, d’une part car les allergènes déjà connus dans les fleurs et le pollen de chanvre peuvent se retrouver dans la graine et d’autre part par la présence de protéines de stockage dans la graine, connues pour leur fort potentiel allergène. Afin de prévenir les possibles allergies qui pourront être liées à la graine de chanvre, il est alors nécessaire d’évaluer son potentiel allergique par rapport à un allergène fort, ici la Noisette ainsi qu’un allergène faible, l’épinard. Dans le cadre de l’allergie, deux manifestations majeures peuvent avoir lieu, i) une sensibilisation de novo, ce qui veut dire devenir allergique à la graine elle-même ou ii) une réaction dite croisée par le biais d’une similarité entre les protéines de la graine de chanvre et d’autres protéines allergènes. La connaissance de la capacité de sensibilisation de novo des protéines est importante pour appréhender et anticiper les risques allergiques futurs. Actuellement, il n'existe aucune connaissance sur la capacité de sensibilisation de novo de la graine de chanvre dans une population générale Non Allergique, malgré l'exposition croissante de la population à la graine de chanvre par le biais des aliments et des cosmétiques. Ce projet sera donc tourné sur le potentiel de sensibilisation de novo de la graine de chanvre.

Bénéfices attendus

[MODIFICATION] [Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel allergénique et plus précisément de sensibilisation de novo de la graine de chanvre (nature ou grillée) en comparaison avec un allergène fort, la Noisette connue pour induire des allergies et un allergène faible, l’Epinard qui n’est pas connu pour induire beaucoup d’allergies. Ceci permettrait de pouvoir prédire ou bien d’avoir une indication du niveau de risque encouru par les consommateurs de graine de chanvre ou de produits contenant des graines de chanvre et ainsi de prédire le risque de voir une personne devenir allergique à la graine de chanvre par la suite. De plus, ce projet permettra une compréhension plus approfondie des mécanismes immunologiques associés à une sensibilisation à la graine de chanvre.

Procédures

Toutes les souris seront anesthésiées et rasées au préalable de chaque sensibilisation. Les souris seront sensibilisées quotidiennement avec la pose d’un patch, ou 1 fois par semaine pendant 6 semaines avec la pose d’un patch pendant 3 jours ou bien par grattage et application transdermale de l’allergène sur l'abdomen. Le déclenchement des symptômes de l'allergie sera effectué par un gavage, respectivement 3, 10 ou 7 jours après la dernière sensibilisation. Pour un gavage oral, la durée des interventions correspond au temps d’administration (soit environ 10 secondes). Pour les applications épicutanées avec la pose du patch ou transdermale avec le grattage sur l’abdomen, la durée d’intervention correspond au temps d’anesthésie soit 15 à 20 minutes environ. Selon la procédure, les souris auront également un prélèvement d'une goutte de sang à l'extrémité de la queue 1 fois par semaine (de la sensibilisation 3 à la sensibilisation 6) soit 4 prélèvements au total. Ce geste dépend du débit sanguin et dure environ 30 secondes. Pour l’étude principale, les mêmes interventions que pour l’une des procédures de l’étude pilote seront réalisées et les temps d’interventions seront donc similaires.

Impact sur les animaux

Lors de ce protocole, il est possible que les souris aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués : les méthodes de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances en raison de la répétabilité des gestes (14 jours consécutifs ou 1x par semaine pendant 6 semaines) mais aussi de par la présence d’un patch sur le dos, des démangeaisons dues au rasage et des irritations dues au patch, un inconfort abdominal suite au grattage lors de la sensibilisation transdermale, des symptômes liés à la mise en place de l’allergie provoqués par le gavage oral (tremblements, chute de la température corporelle, douleurs stomacales), ainsi que les anesthésies gazeuses répétées. La prise de température par voie rectale peut également entrainer un inconfort pour les souris.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l’allergie et ainsi valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques complexes et en particulier le système immunitaire. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, l’allergie alimentaire est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire.

Réduction

[MODIFICATION] Des protocoles d’allergie alimentaire sont régulièrement réalisés au sein du laboratoire, mais aucun protocole utilisant la graine de chanvre ou la Noisette n’a encore été fait. De ce fait, il est impossible de faire un test de puissance. Néanmoins, en se basant sur des tests statistiques et sur la variabilité individuelle lors des anciens protocoles, le nombre de souris pour l’étude principale avec un allergène fort et un allergène faible a été déterminé à 12 souris par groupe soit 60 souris au total par sexe. Cette procédure sera répétée une deuxième fois avec les mêmes 5 groupes de 8 souris par sexe pour s’assurer de la reproductibilité du protocole. Pour l’étude pilote, le nombre de souris a été réduit à 10 par procédure soit 30 souris au total par sexe. Nous anticipons des écarts nets entre les différentes procédures testées, avec des réponses contrastées de type "tout ou rien". Cette amplitude attendue des effets justifie le recours à un effectif réduit, tout en permettant d’identifier le protocole le plus prometteur dès cette première phase. Pour l’étude principale, ce nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place des procédures expérimentales d’analgésie (avec notamment l'injection d'anti-inflammatoire) et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront hébergées avec au moins 3 enrichissements (dôme, tube et coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi une étude pilote sera effectuée sur un nombre de souris restreint pour appréhender les méthodes de sensibilisation, l’effet de l’application du patch et l’utilisation du papier de verre et afin d’affiner et de choisir au mieux, le protocole qui sera appliqué par la suite ainsi que pour appréhender la prise en charge de la douleur le cas échéant. Une attention particulière sera portée à la détection précoce des signes de douleur ou de mal-être chez les animaux. Des points limites adaptés ont été définis pour garantir que tout changement significatif d’état de santé d’un animal déclenche une réévaluation. Un arbre décisionnel encadre les actions à mener : surveillance renforcée, tentative de soulagement, puis prise de décision, avec le responsable du bien-être animal et le vétérinaire si l’état de l’animal ne s’améliore pas. En cas de souffrance persistante ou jugée irréversible, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort. Cette approche vise à limiter la souffrance et à respecter les principes éthiques de l’expérimentation animale.

Choix des espèces

La souche de souris utilisée constitue un modèle de choix, reconnue dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette souche. Aujourd'hui, il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent pour le moment reproduire adéquatement. Ainsi, le modèle animal ici est un élément nécessaire pour modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système lors d’une allergie. Les souris auront 3 semaines de vie à la réception et 4 semaines de vie en début de procédure. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.

4 620 souris subissent une chirurgie crânienne provoquant l'occlusion d'une artère cérébrale, pour reproduire un AVC ischémique, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit d'abord des injections de streptozotocine pour induire un diabète, puis passe des IRM répétées sous anesthésie et une batterie de tests comportementaux. Le protocole se termine par une ouverture du thorax et de l'abdomen et une ponction cardiaque. Les molécules testées viennent de partenaires industriels visant une mise sur le marché, un débouché que le porteur qualifie de recherche "indispensable".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

MODIFICATION Pour l’étude 3/ de cette DAP, les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale de streptozotocine permettant d’induire une hyperglycémie chronique. Une injection par jour, pendant 5 jours est prévue. Cette injection dure quelques secondes. Un prélèvement d’une gouttelette de sang sera également réalisé 2 fois par semaine pour ces animaux permettant de contrôler la glycémie sanguine. Ce prélèvement ne durera pas plus d’une minute. La mise à jeun des souris pour une durée de 4 heures sera nécessaire avant chaque prélèvement. Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la thrombine murine, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Ajout de prélèvements répétés à la veine saphène ou à la veine submandibulaire pour récolter du sang veineux, dans le but de récolter du plasma. Chaque veine ne subira qu’un seul prélèvement, la voie et le côté du prélèvement sera alterné entre le côté gauche et droit. Les animaux seront sous couverture analgésique à H+2 suivant le stroke, une seconde injection leur sera délivrée à H+6 et une injection à D1 avant le troisième prélèvement sera réalisée. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. MODIFICATION "A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Aucun test comportemental n’est voué à induire volontairement un stress ou une angoisse chez les souris. Les expérimentateurs sont formés et habitués à ces évaluations fonctionnelles, et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celles-ci (limitation du bruit et des vibrations, manipulation des animaux avec soin, vérification des points limites, etc..)." Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les PARTENAIRES INDUSTRIELS. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés à une par cage le temps de l’expérimentation pour éviter les conflits entre les souris et faciliter la phase de récupération post-opératoire. Au sein de chaque cage, les animaux auront accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, BUCHETTE EN BOIS et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès illimité à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine au minimum. Le jour de l’induction de l’AVC (J0), les animaux seront pesés et installés dans une armoire ventilée permettant de maintenir leur rythme nycthéméral. Pendant l’opération chirurgicale induisant l’AVC ischémique, l’animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine administrée en s.c ENTRE 30 MINUTES ET 1 HEURE AVANT LA PREMIERE INCISION CHIRUGICALE. L’ADMINISTRATION SERA REPETEE EN FIN DE JOURNEE DE FACON A PROLONGER LA DUREE D’ACTION JUSQU’AU LENDEMAIN MATIN OU UNE TROISIEME ADMINISTRATION SERA REALISEE. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Chaque site d’incision sera précédé d’une tonte du pelage et d’une désinfection à la CHLORISEPTINE ET D’UNE INJECTION EN SOUS CUTANEE DE LUROCAINE (5mg/kg). La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris EN CAS d’HYPOTHERMIE. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. MODIFICATION : AJOUT PARAGRAPHE Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil et pendant les jours suivant l’opération chirurgicale. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites de souffrance ou de stress fixés en amont de l’étude, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. MODIFICATION "Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 45g Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine."