Rongeurs
Evaluation de la fonctionnalité et de la stabilité de substituts de peau greffés chez la souris Nude
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
600 souris Nude vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Sous anesthésie, une plaie cutanée est créée puis recouverte d'un substitut de peau issu de cellules souches embryonnaires humaines, et chaque souris est ensuite isolée en cage individuelle de deux semaines à six mois pour éviter l'arrachage du greffon. Le porteur reconnaît que cet isolement prolongé est une source de stress par privation de contacts sociaux. Il décrit un objectif de production, sécuriser le lancement de lots cliniques de substituts cutanés, les souris étant tuées à quatre échéances pour analyser les greffes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés développés selon différentes méthodes de fabrication, en utilisant des banques de cellules dérivées de cellules souches embryonnaires humaines cultivées sur une matrice biologique, amplifiées et différenciées. Trois milieux de culture différents sont utilisés, qualifiés dans des tests in vitro de reconstruction épidermique, pour produire ces produits de thérapie innovante dans de nouveaux dispositifs médicaux afin d’obtenir des substituts cutanés de plus grande taille que dans des plaques de culture commerciale et en évaluant la stabilité des unités thérapeutiques produites au cours du temps, selon les normes concernant les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain et les lignes directrices de l’Agence Européenne du Médicament pour les médicaments à base de cellules souches. Un maximum de 30 substituts cutanés ainsi préparés selon différentes conditions expérimentales et sélectionnés sur la base d’essais préalables in vitro de stabilité et de fonctionnalité, seront greffés chez la souris Nude pour éviter un rejet. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions de fabrication optimales pour la production des lots de transfert de substituts cutanés et de sécuriser le lancement d’une production de lots cliniques dédiés à la production des unités thérapeutiques qui iront chez le patient.
Bénéfices attendus
Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les greffes où donneur et receveur sont la même personne, sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limitée de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes où donneur et receveur sont de même espèce ou d'espèces différentes peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau mais avec de forts risques de rejet, douleurs, infection, et la formation de cicatrices. De nombreux substituts cutanés biosynthétiques sont aujourd’hui disponibles, constitués de cellules humaines vivantes ensemencées sur une matrice et nourries de protéines et facteurs de croissance nécessaires pour mieux se développer et se multiplier dans le tissu souhaité, et des substituts cutanés à partir de cellules souches embryonnaires humaines sont produits par ingénierie tissulaire. Ils sont envisagés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions de fabrication optimales pour la production des lots de transfert de substituts cutanés et de sécuriser le lancement d’une production de lots cliniques dédiés à la production des unités thérapeutiques qui iront chez le patient.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour la réalisation des greffes de substituts cutanés. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau sera effectué avant la réalisation de la greffe de substitut cutané à cet emplacement. Un traitement analgésique des souris Nude greffées sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes cutanées seront protégées et elles seront observées régulièrement tout au long de l’expérimentation. Un suivi quotidien des souris greffées sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané. La durée de cet hébergement en cage individuelle sera variable, de 2 semaines à 6 mois pour la durée la plus longue.
Impact sur les animaux
L'induction d'une plaie cutanée avant la réalisation de la greffe cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation. Le processus cicatriciel est en effet long, passant par différentes phases, inflammation, néovascularisation, épithélialisation et surtout remodelage. La peau néoformée à partir d’un substitut cutané est une peau très fragile jusqu’à la finalisation du remodelage qui peut nécessiter plusieurs semaines voire plusieurs mois pour être finalisé. Cet hébergement en cage individuelle des souris peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris de voire au moins une de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.
Devenir
Procédure expérimentale 1 = Induction d’une plaie cutanée, greffe de substitut cutané et suivi de la greffe cutanée et des animaux : les 600 souris Nude greffées seront mises à mort à 4 temps différents après réalisation de la greffe cutanée, 2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois après, avec 5 souris par temps de prélèvement, afin de réaliser un ensemble d'analyses sur les prélèvements cutanés qui seront effectués.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de vaisseaux sanguins, régénération de la surface cutanée…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes et selon les recommandations internationales en vigueur. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée avec l'utilisation d'analgésique. Les animaux seront ensuite observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation. Une grille de score sera mise en place avec l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel conduisant si nécessaire à la mise à mort des animaux dans des conditions éthiques afin d'arrêter toute souffrance. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies chroniques à traiter chez l’Homme, et la souris Nude est une souris avec un système immunitaire très rudimentaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger telle que des substituts cutanés préparés à partir de cellules embryonnaires humaines. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).
Evaluation de l’activité protéolytique et de l’imunogénicité d’une IgG-degrading enzyme (IdeS) à demi-vie augmentée chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à six injections intraveineuses sous anesthésie et trois à quatre prélèvements sanguins au sinus rétro-orbital, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut léser l'œil, pour évaluer l'immunogénicité d'une protéase modifiée destinée à éliminer des anticorps chez l'humain. À l'issue, elles sont tuées pour prélever le sérum et les organes lymphoïdes. Le porteur annonce peu d'effets indésirables au motif que la protéase agit peu sur les anticorps de souris, et renvoie le bénéfice clinique à de futurs médicaments.
Objectifs
Une protéase nommée IgG-degrading enzyme ou IdeS est produite par la bactérie Streptococcus pyogenes afin d'échapper au système immunitaire de l’hôte. Cette protéase digère les anticorps de type Immunoglobulines G chez l’homme, le lapin ou les primates non-humains, mais n’a pas ou peu d’actions sur les Immunoglobulines G de souris. Plusieurs groupes de recherche ont montré que la protéase IdeS peut être utilisée dans des modèles précliniques de maladies autoimmunes ou chez certains patients, pour éliminer, de manière transitoire, les anticorps de type IgG pathologiques. Cependant, l’utilisation de cette protéase chez l’homme se heurte à deux problèmes: sa courte durée de vie dans l’organisme avec une demi-vie de 3-5 heures et son immunogénicité, c’est-à-dire sa capacité à induire des anticorps neutralisant. Pour cette raison, l’utilisation de la protéase IdeS comme traitement chronique n’est actuellement pas possible chez l’homme. Les objectifs de ce projet sont de générer des protéases IdeS ayant une durée de vie prolongée dans l’organisme, et d’évaluer l’immunogénicité de ces protéases à demi-vie augmentée chez la souris. L’avantage d’une étude d’immunogénicité chez la souris réside dans le fait que les Immunoglobulines G murines sont peu ou pas digérées par l’IdeS ; Ceci devrait donc permettre d’étudier en détail le mécanisme d’action des IgG murines anti-IdeS, et notamment leur capacité à neutraliser l’activité de la protéase IdeS, sans que l’étude ne soit biaisée par leur dégradation par IdeS.
Bénéfices attendus
L'intérêt de l'utilisation de la protéase IgG-degrading enzyme a été démontré afin de lutter contre certaines maladies auto-immunes (Purpura thrombocytopénique, arthrite rhumatoïde), contre le rejet de greffe ou encore afin d'améliorer l'efficacité de la thérapie génique utilisant des vecteurs rétroviraux. L'utilisation de cette enzyme en clinique se heurte toutefois à sa courte demi-vie et à son immunogénicité. La validation préclinique de nouvelles protéases IgG-degrading enzyme recombinantes à durée d’action optimisée ouvrira la voie à la préparation de nouveaux médicaments plus efficaces. Ceci devrait ainsi permettre de réduire les fréquences d’injection de la molécule aux patients et de réduire les doses de molécules injectées, ce qui devrait diminuer la probabilité de développer des réponses immunitaires neutralisantes.
Procédures
Les animaux subiront 1 à 6 injections intraveineuse. Ces interventions (injection) seront réalisées sous anesthésie gazeuse et ne durent que 10 à 20 secondes. Ils subiront également 3 à 4 prélèvements sanguins maximum. Ces prélèvements seront également réalisés sous anesthésie gazeuse et ne nécessitent que 20 secondes d'immobilisation maximum de l'animal anesthésié. Dans certaines conditions expérimentales, les animaux subiront en plus des gestes cités précedemment 1 injection intrapéritonéale en tout début de procédure. Cette injection nécessite 10 à 20 secondes d'immobilisation de l'animal.
Impact sur les animaux
Les risques de lésions au niveau de l'œil existent du fait des cycles d’injections/ prélèvements au niveau du sinus rétro-orbital, mais ce risque est limité. Par ailleurs, les lots d’animaux seront divisés en 2 afin de limiter le nombre de prélèvements par animaux. Il n'y a pas d'effets indésirables particuliers attendus suite à l'injection d'IdeS car celle ci est peu active sur les IgG murines (pas de risque d'infection) et nous validerons l'absence d'endotoxine avant injection (pas de risque d'inflammation). L'injection unique d'IVIg par voie intra-péritonale ne présente pas non plus d'effet indésirables attendus.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés. Le sérum et les organes lymphoïdes secondaires seront collectés pour l'évaluation de la réponse immunitaire anti IdeS ou pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Le projet fera appel à différents modèles expérimentaux chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment le catabolisme de l’IdeS et l’induction d’une réponse immunitaire anti-IdeS). Toutefois, toute information obtenue par l’expérimentation animale sera immédiatement transposée à des systèmes in vitro pour analyses ultérieures.
Réduction
Le nombre de répétition des expériences sera défini de manière rationnelle : si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs, elle ne sera pas répétée, sinon elle sera répétée une à deux fois maximum. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés; ainsi, aucune expérience supplémentaire ne doit-elle être faite si des questions nouvelles surviennent. Nous prévoyons d'utiliser pour ce projet un nombre maximum de 345 souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Les lésions au niveau de l'œil sont possibles du fait des cycles d’injections/ prélèvements au niveau du sinus rétro-orbital, mais ce risque est limité car nous maîtrisons ce geste et nous alternerons l'œil concerné. Différents groupes seront par ailleurs constitués afin de réduire le nombre de prélèvements par animal. Des points limites ont été définis, les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce qui permette d’avoir un nombre suffisant d’individus de même âge et de génotype homogène, qui permette l’obtention de résultats statistiquement fiables. Par ailleurs, les IgG de souris étant peu sensibles à l’action protéolytique d’IdeS, cela nous permettra d’étudier plus aisément l'immunogénicité des variants de l'IdeS et la capacité des IgG murines anti-Ides (si présentes) à neutraliser l’activité d’IdeS sans que l’étude ne soit biaisée par leur dégradation par IdeS. Des souris adultes, âgées de 7-12 semaines en début d’expérimentation (système immunitaire mature) seront utilisées.
Identification de nouveaux composés à visée thérapeutique dans un modèle murin de rétinite pigmentaire autosomale dominante
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
1 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation entraînant une dégénérescence de la rétine, elles reçoivent une injection intra-oculaire d'un composé à tester sous anesthésie, puis des examens du fond d'œil, une tomographie et un électrorétinogramme, avant d'être tuées au CO2 et par dislocation cervicale pour prélever les yeux. Le porteur signale que les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des décollements localisés de rétine et de petites hémorragies oculaires. Il présente le travail comme une preuve de concept dont le passage en clinique reste renvoyé au conditionnel.
Objectifs
L’objectif de ce projet de recherche est d’identifier des composés ayant un effet neuroprotecteur sur la dégénérescence des photorécepteurs dans un modèle murin de rétinite pigmentaire autosomale dominante. La finalité étant le développement de nouvelles thérapies pour le traitement de maladies rétiniennes héréditaires, pouvant bénéficier au plus grand nombre de patients possibles.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de mettre en avant la preuve de concept d’efficacité d’un ou plusieurs composés sur notre modèle de rétinite pigmentaire autosomale récessive. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique ce/ces composé(s) à visée thérapeutique pour des maladies héréditaires rétiniennes induisant une dégénérescence des photorécepteurs, pour lesquelles le développement de traitement spécifique à chaque mutation identifiée n’est aujourd’hui pas possible.
Procédures
- Injection intra-oculaire : tous les animaux de l’étude (1296) recevront une injection intra-oculaire (injection sous-rétinienne ou intravitréenne) de la thérapeutique à évaluer ; néanmoins l’injection est rapide (5 à 10 minutes) et se fera sous anesthésie générale. - Fond d’œil : suite à l’injection sous-rétinienne, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est très rapide (2 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude (1296) seront soumis à cet examen. - Tomographie à cohérence optique (OCT) : l’OCT permet de visualiser la structure anatomique de la rétine. L’acquisition d’images dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée 4 semaines et 12 semaines après l’injection intra-oculaire de l’élément thérapeutique d’intérêt sur les animaux dont l’injection a été évaluée « correctement réalisée » lors de l’examen du fond d’œil, soit un maximum de 1296 souris. - Electrorétinogramme (ERG) : l’ERG permet d’évaluer la fonction de la rétine en conditions photopique et scotopique. L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée 4 semaines et 12 semaines après l’injection intra-oculaire de l’élément thérapeutique d’intérêt sur les animaux dont l’injection a été évaluée « correctement réalisée » lors de l’examen du fond d’œil, soit un maximum de 1296 souris.
Impact sur les animaux
Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Les injections intrapéritonéales et sous-cutanées peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. L’anesthésie peut provoquer une hypothermie chez la souris qui est la première complication et cause de mortalité lors d’anesthésie de rongeurs. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). A l’issue de la procédure, les animaux seront sacrifiés par inhalation de CO2 et dislocation cervicale afin de prélever les yeux pour des analyses histologiques post-mortem.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé que dans un modèle in vivo car les propriétés pharmacologiques du traitement ne peuvent être évaluées que dans des conditions physiologiques, pour notamment étudier l’interaction entre les vecteurs AAV et le système immunitaire de l’hôte. De même que le fonctionnement de la rétine et la vision ne peuvent être évalués qu'in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés (12 souris/groupe x 108 groupes = 1296 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.
Raffinement
- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Une anesthésie gazeuse, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent, notamment pour les procédures courtes comme les injections sous-rétiniennes, les injections intravitréennes, les fonds d’œil et les OCT. Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections intra-oculaires et les ERG. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intrapéritonéales/sous-cutanées. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’ERG), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que nourriture et eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux commerciaux observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.
Choix des espèces
Le modèle murin transgénique utilisé dans ce projet reproduit la pathologie étudiée : la rétinite pigmentaire autosomale dominante. Comme chez l’Homme, la mutation induit une dégénérescence progressive des photorécepteurs. Ces souris présentent une dégénération sévère des photorécepteurs dès l’âge de 3 semaines et une quasi absence totale de photorécepteurs vers 2 mois. Le but de cette étude étant de tester l’effet neuroprotecteur de nouveaux composés thérapeutiques au cours de la dégénérescence rétinienne, l’intervention thérapeutique interviendra avant que la dégénérescence des photorécepteurs n’atteigne un stade avancé, soit chez des souris âgées de 7 jours, 14 jours ou un mois.
Evaluation d’une approche par traitement de thérapie génique utilisant un vecteur recombinant adéno-associé (rAAV) pour la polykystose rénale.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
506 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour développer une polykystose rénale, elles reçoivent un vecteur de thérapie génique par injection oculaire, intrapéritonéale puis directement dans le rein, avec prélèvements sanguins mensuels et IRM sous anesthésie, avant une mise à mort à vingt semaines pour prélever les organes. Le porteur indique qu'en cas de succès la recherche se poursuivra sur un "modèle félin", soit des chats. Il affirme l'usage de la souris "indispensable" pour évaluer l'effet à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
La polykystose rénale autosomique dominante représente l’une des principales causes de l’insuffisance rénale d’origine génétique et touche plus d’une naissance sur 400 -1000 et approximativement 13 millions de personnes dans le monde entier. La polykystose rénale est caractérisée par le développement bilatéral de kystes rénaux qui augmentent progressivement la masse de l'organe et conduit à la perte de la fonction rénale. L'insuffisance rénale chronique est la complication sévère la plus fréquente. Notre projet porte sur le développement d'une approche par thérapie génique pour traiter cette maladie. Les vecteurs virus adéno-associé recombinants (rAAV) ont récemment montré des résultats encourageants pour le traitement de maladies génétiques. En particulier, le sérotype AAV9 est décrit dans la littérature pour le ciblage des reins et du foie entre autre. Pour cela, notre choix s'est porté sur l'utilisation d'AAV9 pour le traitement de la polykystose rénale. Des études ont mis en évidence l'importance de l'adénosine monophosphate cyclique dans la croissance des kystes rénaux. La protéine kinase A est le majeur effecteur de dans la croissance des kystes rénaux. Notre stratégie est d'évaluer l'effet d'un vecteur portant le gène modifié de la protéine kinase A au stade précoce de la formation des kystes. Nous utiliserons les vecteurs AAV pour introduire le gène humain modifié de la protéine kinase A dans un modèle murin de polykystose rénale dans le but de bloquer partiellement la voie de la protéine kinase A.
Bénéfices attendus
Notre but est de développer une étude preuve de concept de thérapie génique pour la polykystose rénale. Notre but est de d’examiner l’effet du vecteur thérapeutique sur le nombre, la taille, et le développement des kystes. Si notre approche thérapeutique est efficace nous poursuivrons notre recherche sur de plus gros animaux (modèle félin)
Procédures
Injection du vecteur : - 1 fois par animal à J10 post-natal pour l'injection rétro-orbitale ou intrapéritonéale (durée 3 min), - et à l'âge de 4-6 semaines pour l'injection rénale (durée 45 min) . - Prélèvement sanguin: 1 fois par mois à partir du sevrage sous anesthésie. - Imagerie par résonance magnétique : 1 fois par animal, sous anesthésie, durée : 1 heure
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir une douleur passagère au site d’injection. Il existe également un léger risque d'hémorragie ou d'infection du site chirurgical, mais si l'un ou l'autre de ces phénomènes se produit, les animaux seront immédiatement euthanasiés et ne devraient donc pas ressentir ces effets pendant une longue période. L'anesthésie peut provoquer une légère gêne mais aucun autre effet indésirable n'est attendu.Les animaux peuvent ressentir une douleur passagère au site d’injection. Il existe également un léger risque d'hémorragie ou d'infection du site chirurgical, mais si l'un ou l'autre de ces phénomènes se produit, les animaux seront immédiatement euthanasiés et ne devraient donc pas ressentir ces effets pendant une longue période. L'anesthésie peut provoquer une légère gêne mais aucun autre effet indésirable n'est attendu. Chez le patient la présence de kystes reste longtemps indolore et imperceptible jusqu’à ce que le volume kystique devienne important et qu’il entraine une pesanteur et une douleur diffuse dans le flanc, le dos ou l’abdomen. Notre stratégie est d’évaluer notre thérapie au stade précoce cde la formation des kystes, lorsqu’ils ne présentent pas d’inconfort pour la souris.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures seront euthanasiés. Le but est de prélever les organes post-mortem des animaux, et d'effectuer des analyses biomoléculaires et histologiques.
Remplacement
La complexité du rein et de la polykystose rénale rénale nécessite l’utilisation d’un modèle animal. Mais, les constructions génétiques utilisées seront caractérisées in vitro avant leur utilisation chez l’animal. L'utilisation d'un modèle murin est indispensable afin d’évaluer l’efficacité des vecteurs pour corriger les manifestations cliniques de la maladie à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
Des calculs statistiques ont été effectués sur la base des résultats d'études similaires dans ce domaine. Dans la mesure du possible, les organes obtenus des souris seront conservés et stockés pour des tests ultérieurs, ce qui permettra de maximiser les données obtenues de chaque animal. Le nombre de souris nécessaires à cette étude est réduit en enregistrant autant de paramètres que possible à partir d'une seule souris, sans compromettre le bien-être des animaux.
Raffinement
Pour l'administration des vecteurs thérapeutiques, des protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés seront mis en place selon la procédure et validés par le vétérinaire. Les prélèvements sanguins se dérouleront sous anesthésie par isoflurane. Notre stratégie est d'évaluer l'efficacité d'un vecteur thérapeutiqque sur la formation des kystes rénaux au stade précode de la formation des kystes, lorsqu'ils ne présentent pas encore d'inconfort pour la souris. Néanmoins un suivi de la fonction rénale sera mis en place chez les souris susceptibles de développer la maladie. Les prélèvements bi-mensuels d'urine permettront de suivre l'évolution de la concentration de l'AMPc, la créatinine et les taux urinaires d'azote uréique. Une observation quotidiennne des animaux, des pesées hebdomadaires et l'application de critères d'arrêts permettent de veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique son bien connues. L’utilisation est justifiée par l’existence d’un modèle de souris transgéniques portant une délétion du gène Pkd1 et reproduisant des aspects cliniques de la polykystose rénale. L’apparition des premiers kystes rénaux est détectée entre 8 à 10 semaines d’âge. A l'âge de 20 semaines, 100% des souris malades non traitées seront porteuses de kystes rénaux. Nous euthanasierons les souris d'intérêt et leurs contrôles à l'âge de 20 semaines. Cela va permettre de mesurer l'effet thérapeutique du vecteur, et sa stabilité dans le temps.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs doses de vecteurs AAV, avec un nouveau procédé de manufacturing, dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Huntington, elles développent de quatre à douze mois une perte de poids et des défauts moteurs et cognitifs, après une injection stéréotaxique dans le cerveau (striatum) sous anesthésie de 70 minutes. À douze mois, un prélèvement de liquide céphalo-rachidien puis de sang précède la mise à mort et les analyses post-mortem. Le porteur teste des doses d'un vecteur de thérapie génique en vue d'un futur essai clinique et affirme que le recours aux modèles animaux est "essentiel", faute de culture cellulaire reproduisant l'architecture du cerveau.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Le but principal est de tester l’efficacité du gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, dans le cadre du futur essai clinique.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de tester l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale d’un virus adéno-associés (AAV) exprimant le gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin plus progressif pour la MH, en injectant un lot qui sera utilisé pour les recherches préclinique et clinique car à même d’être utilisé chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique. Ce modèle reproduit assez fidèlement l’évolution de la maladie par rapport à ce qui se passe chez l’homme.
Procédures
A partir de 4 mois d’age, les animaux développeront un phénotype dommageable jusqu’à 12 mois soit 10 mois. Ces souris reproduisent de maniere très progressive et fidèle, les atteintes pathologiques de la maladie d’Huntington, c’est-à-dire un perte de poids, des défauts moteurs et cognitifs. Les animaux seront soumis à 2 mois d’age à une injection stéréotaxique sous anésthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'adminstration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux seront soumis a tests comportementaux des 5 mois d’age. A 12 mois d’age, un prélèvement de liquide cephalo-rachdien suivi de sang sera effectue avant euthanasies pour l’analyse post mortem des tissus.
Impact sur les animaux
Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mecanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Une perte de poids dû a l’injection de AAV pourrait être observé, 5 à 7% du poids total de l’animal.
Devenir
Lors de l’élevage de la lignée dommageable, les animaux d’intérêt produits seront maintenus en vie et 3 semaines à 6 mois après les injections (délivrance du gene thérapeutique) suivi de l’analyse comportemtal jusqu’à l’euthanasie. Des prélèvements et analyses sont nécessaires en post-mortem, cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, le modèle de souris pour la maladie de Huntingtonles souris Huntington sont bien caractérisées. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (198) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique , et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. 6 h après l’acte chirurgical une injection d’analgesique est realisee pour éviter tout inconfrot de l’anima. 24 h après une deuxième injection d’analgesique est realisee. 4h/5h après cette injection les anaimaux seront observes par l’experimentateur et il sera verifie qu’aucun signe de douleur est detecte. Si besoin, une injection d’analgesique est realisee pour evoter tout inconfort e l’animal. Le protocole d’analgesie post-operatoire a été decide avec l’accord veterinaire clinicien.
Choix des espèces
L’objectif de cette étude est d'évaluer l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale d’un AAV exprimant le gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui sera utilisé par la suite chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique. Nous commencerons donc par valider son expression , qui a été produit avec un nouveau procédé de fabrication/qualité, dans des souris saines avant son utilisation future chez un modèle murin de la MH. Les souris qui seront utilisées sont des souris agée de 4 mois, dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnées d'injection dans le cerveau.
Elevage en insectarium de lignées de moustiques tropicaux et européens, transmetteurs potentiels de virus.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Anesthésiées jusqu'à une fois par semaine pendant quarante minutes, elles sont posées par deux sur des cages de moustiques pour servir de repas sanguin vivant destiné à maintenir six populations de moustiques en élevage. Le porteur décrit une réaction immunitaire à la salive des insectes et une anémie liée aux piqûres, surveillées par une pesée hebdomadaire. Il qualifie l'usage des souris de "gold standard" et affirme que les poches de sang ne produisent pas d'œufs en quantité et qualité acceptables.
Objectifs
Afin de pouvoir étudier la capacité de transmission de virus par différentes populations de moustiques, nous devons pouvoir maintenir en élevage ces insectes sur plusieurs générations. L’obtention d’œufs de moustiques et le développement ultérieur de ces œufs en larves, puis en nymphes et ensuite en adultes repose sur le prélèvement régulier de sang de mammifères par les moustiques femelles adultes (hématophages). La prise d’un repas sanguin leur est indispensable pour pouvoir pondre leurs œufs. Un moustique femelle prélève environ de deux à quatre microlitres de sang. Après un délai de 48 à 72 h, la femelle pond une cinquantaine d’œufs. Ces œufs peuvent ou ne peuvent pas, selon les espèces, être conservés un certain temps à sec avant d’être mis à éclore pour générer de nouveaux adultes.
Bénéfices attendus
Tous les projets de recherche de notre unité ont pour base l’étude de la capacité de certaines populations de moustiques à s’infecter, ou non, et transmettre des virus pathogènes pour l’homme ou des animaux. La compréhension de ces systèmes permet d’évaluer et d’anticiper la survenue d’épidémie. Notre époque, avec les dérèglements climatiques, la pollution, les déforestations, l’utilisations de pesticides et d’insecticides, entrainent des modifications qui impactent fortement les insectes et augmentent les risques d’émergence de virus. L’utilisation des souris comme source de sang pour les moustiques est un « gold standard » pour produire suffisamment d’œufs qui seront destinés aux études des systèmes vectoriels. En effet, chaque combinaison moustique-virus varie selon l’origine géographique de la population de moustiques et du génotype/sérotype de virus. La connaissance de l’efficacité de chaque combinaison est importante pour mesurer le risque épidémique. Même si une espèce de moustique a une distribution très large englobant la ceinture tropicale et parfois tempérée, chaque population géographique peut présenter une réceptivité différente vis à vis d’un même virus. De façon similaire, un virus existe sous forme de différents sérotypes et génotypes et tous ne présentent pas la même efficacité à infecter une même espèce de moustique. Donc la combinaison moustique-virus est unique. En général, les moustiques à l’origine des épidémies sont minoritaires (moins de 15% des 3500 espèces de moustiques) mais sont omniprésents dans l’environnement urbain. Ces moustiques sont des espèces invasives fortement adaptés à l’homme et qui voyagent avec l’homme et les marchandises. Ils ont la propriété de pouvoir se reproduire en cage et se nourrir en captivité sur animaux dont les souris. Ces caractéristiques ont permis des avancées majeures dans la connaissance des maladies vectorielles affectant la santé de l’homme (dengue, chikungunya, fièvre jaune et Zika) et de ce fait, il a été possible d’élaborer des stratégies de contrôle efficace.
Procédures
Les souris seront anesthésiées au maximum une fois/semaine pendant 40 min par injection d’un mélange de Xylazine + Ketamine, puis seront placés sur des cages de moustiques d’élevage pendant 30 min. Une injection de solution de chlorure de sodium 0,9% sera pratiquée après chaque anesthésie.
Impact sur les animaux
Les souris sont anesthésiées avant d’être positionnées sur les cages d’insectes dans l’insectarium à 25 ou 28°C, selon l’espèce. La piqure par les femelles de moustiques engendre une légère réaction immunitaire due au contact de la salive injectée par l’insecte au moment de la prise de sang. Il n’y a pas de démangeaison cutanée constatée. A son réveil, les souris ne se grattent pas et ont un comportement normal. L’anémie due au prélèvement du sang (2 à 4 µL / moustique) est prise en compte en limitant le temps de contact et donc le nombre de piqure. Une pesée hebdomadaire des animaux, au moment du change, permet de détecter une éventuelle perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Les moustiques femelles étant hématophages, il est impossible de les maintenir en élevage sans avoir recours à du sang. Le sang apporte les substances nutritives indispensables à la fabrication des œufs. Dans la nature, les sources de sang sont des vertébrés (oiseaux, mammifères ou humains) avec lesquels les moustiques cohabitent. Au sein du laboratoire, les sources de sang les plus biologiquement pertinentes sont les souris ou les lapins de laboratoire. Dans le présent projet visant à maintenir des populations de moustiques sains en élevage, les souris de laboratoire ont été identifiées comme des sources régulières de sang. Le recours à l’animal est nécessaire car l’utilisation d’autres sources de sang (poche de sang, globules rouges lyophilisés) ne permet pas la production d’œufs de qualité et en quantité acceptables pour les infections réalisées ultérieurement.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulement du projet tient compte : - des six espèces de moustiques de différentes origines à maintenir en élevage ; - des nuisances occasionnées par les piqures des moustiques femelles (anémie, réaction immunitaire à la salive) et par des anesthésies répétées. Dix cages de six souris femelles IOPS maintenues et renouvelées quatre fois/an est selon notre expérience la quantité minimale d’animaux pour un préjudice moindre. Il faut toujours mettre deux souris anesthésiées sur une cage pour laisser le « choix » de l’animal aux femelles (préférences d’attractivité) et diminuer le nombre de piqure par animal. Il y a en moyenne toujours 6 à 8 populations de moustiques en élevage. Un lot de six souris ne sera anesthésié qu’une fois par semaine. La présence de six lots permet un temps de récupération indispensable au bien-être des animaux.
Raffinement
Les souris sont déposées sur les cages une fois anesthésiées, toujours par deux, quel que soit la taille de la cage et le nombre de moustiques femelles, pendant un temps de contact variable, allant de cinq minutes à quinze minutes. Le temps de contact est décidé en fonction du nombre d’insectes par cage, de leur âge et de leur espèce (comportement de piqûre différent). Nos connaissances en entomologie nous permettent d’apprécier ces différents paramètres. Un même binôme de souris peut être déposé successivement sur deux cages au plus, soit trente minutes d’exposition maximum. La pommade Ocry-gel, un produit de soin oculaire destiné à la lubrification des yeux des animaux sera appliquée aux yeux des souris anesthésiées. Un volume de 0,15 mL d’une solution de chlorure de sodium à 0,9% sera injecté en sous cutané pour prévenir la baisse volumique. Ensuite, les souris sont placées dans une cage posée sur un tapis chauffant, avant leur réveil pour compenser la baisse de température de l’animal due à l’anesthésie. Les souris réveillées sont ensuite remises dans leurs cages. Il n’a jamais été observé de démangeaison chez les rongeurs mais l’application d’une crème apaisante type Quotane 0,5% sur les régions exposées sera faite si nécessaire,. Les animaux (marquage par traits sur la queue) seront pesés chaque semaine, au moment de leur change, afin de détecter une éventuelle perte de poids signe de mauvaise santé. Les cages d’hébergement sont pourvues d’enrichissement, avec eau et nourriture à volonté.
Choix des espèces
Le choix des souris est justifié par leur facilité d’approvisionnement, leur qualité sanitaire, l’absence de démangeaison (aucune observation de grattage des parties exposées) après piqûre par les moustiques, leur petite taille qui rend possible : - leur stabulation en nombre suffisant ; - leur mise en contact des insectes sur les cages. Les femelles sont âgées de 4 à 5 semaines et ont un poids de 20/22g à leur arrivée. Après la période d’acclimatation elles atteignent 30g, poids à partir duquel on peut les anesthésier et les présenter aux moustiques.
Etude des effets de la caféine sur le connectome cérébral dans un modèle de maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
126 souris génétiquement modifiées pour développer une pathologie de type Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont exposées à la caféine in utero ou à l'âge adulte, puis suivies pendant douze mois par IRM sous anesthésie, tests comportementaux (labyrinthe surélevé, reconnaissance d'objets), frottis vaginaux et prélèvements sanguins, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur nomme des atteintes possibles comme des blessures entre mâles après rasage du flanc et une défaillance cardio-respiratoire sous anesthésie. Il affirme le recours à l'animal "incontournable" et sans "alternative", et renvoie l'application chez l'humain au long terme.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer, plus fréquente cause de démence est responsable d’une morbidité et mortalité importante avec un impact économique majeur sur le système de santé. Les patients ayant la maladie présentent une altération du connectome cérébral qui est la cartographie de l’ensemble des connexions existant entre les différentes aires du cerveau, et généralement établie à partir de méthodes d’IRM. A ce jour, il n’existe pas de traitement préventif. De récents travaux chez la souris suggèrent qu’une exposition anténatale à la caféine constituerait un facteur de risque dans l’apparition précoce des déficits cognitifs. En revanche, administrée quotidiennement à de faibles doses à l’âge adulte, la caféine pourrait retarder ou réduire le risque d’apparition des déficits cognitifs. Notre objectif est d’étudier les effets de la caféine sur la connectivité cérébrale dans la maladie d’Alzheimer et de vérifier si les éventuels changements de connectivité sont corrélés aux performances cognitives. Afin de comprendre l’impact de la caféine sur le cerveau dans la maladie d’Alzheimer, nous caractériserons pendant 12 mois l’évolution des connectomes structural et fonctionnel chez des souris mâles et femelles génétiquement modiées de type Alzheimer. Les souris seront exposées à la caféine soit in utero, soit à l’âge adulte (dès 3 mois). Elles seront suivies par IRM fonctionnelle à l’état de repos et imagerie du tenseur de diffusion sous anesthésie générale légère et sédation. Nous comparerons les connectomes de ces souris à ceux de souris contrôles grâce à une approche classique de traitement des données d’IRM fonctionnelle de repos. Des études comportementales précéderont les explorations IRM. Elles permettront d’établir d’éventuelles corrélations entre modifications du connectome et performance cognitive sous les effets de la maladie et de la caféine. Une approche personnalisée se fera grâce à la plateforme neuroinformatique « The Virtual Mouse Brain ». Le connectome fonctionnel de chaque souris sera prédit à partir du connectome structural acquis en imagerie du tenseur de diffusion et comparé au connectome fonctionnel obtenu expérimentalement par IRM fonctionnelle de repos. Cela permettra, si les prédictions sont avérées, de prédire l’évolution de la maladie d’Alzheimer et l’efficacité des thérapies. L’approche par virtualisation permettra d’optimiser la plateforme sur le modèle étudié et de réduire le nombre d’animaux nécessaires dans des études futures.
Bénéfices attendus
Cette étude repose sur un modèle animal d’Alzheimer. Elle s’appuie aussi sur des méthodes avancées de neuroimagerie (IRM) transposables à l’homme qui permettent l’exploration non-invasive du cerveau. Ce travail investigue l’effet de la caféine sur la connectivité cérébrale et fournira des informations détaillées sur le développement de la pathologie dans le modèle expérimental étudié et éventuellement sa régression avec le traitement à la caféine. Nous nous attendons à identifier des biomarqueurs prédictifs de la détérioration, régression ou amélioration de la maladie d’Alzheimer. L’approche par virtualisation du cerveau de chaque souris grâce à la plateforme neuroinformatique nous permettra d’effectuer des prédictions du connectome fonctionnel pour chaque temps donné, ce qui sera vérifié expérimentalement au travers des acquisitions d'IRM fonctionnelle à l'état de repos qui seront effectuées et de l’évaluation cognitive de chaque animal. Ceci pourra à long terme être utilisé chez l’homme étant donné que la plateforme a été initialement développée chez l’homme. On pourra alors prédire en fonction du stade de prise en charge de la maladie d’Alzheimer, son évolution ainsi que l’impact des thérapies mises en œuvre.
Procédures
Exposition à la caféine des reproducteurs, des embryons, des fœtus via le cordon ombilical et des petits de la portée via le lait maternel : les parents reproducteurs seront exposés à la caféine par l’eau de boisson deux semaines avant l’accouplement. Les reproductrices seront exposées à la caféine durant toute la gestation et par conséquent, les embryons et les fœtus in utero. Après la mise-bas, les petits seront exposés jusqu’au 15ème jour postnatal par la prise du lait maternel. Exposition à la caféine à l’âge adulte : Un groupe de souris sera exposé à la caféine par l’eau de boisson après 3 mois de vie et de manière chronique jusqu’à 12 mois. Tests comportementaux : Le comportement sera étudié sur des animaux contrôles, exposés à la caféine soit in utero, soit à l’âge adulte. Chaque animal sera soumis à 2 tests différents avec des intervalles de récupération entre les tests. Le test du labyrinthe en croix surélevé dure en moyenne 5 min. Le test de substitution et de reconnaissance d’objets dure 35 minutes en moyenne par animal. Chaque test sera réalisé 4 fois sur un même animal (3, 6, 9 et 12 mois). Prélèvement vaginal : Le frottis vaginal sera réalisé sur des souris vigiles. Chaque femelle de l’étude aura 4 frottis au total sur une durée de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois). Les cellules seront prélevées en quelques secondes par lavage vaginal dans l’eau stérile contenue dans une fine pipette. Prélèvement sanguin : Il sera réalisé en quelques secondes sur des souris anesthésiées en vue de l’IRM. Chaque souris de l’étude aura 4 prélèvements sanguins au total au niveau de la veine saphène latérale ou de la veine submandibulaire sur une durée de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois). IRM : Les animaux seront explorés sous anesthésie générale légère et sédation. La durée de l’examen sera d’environ 1h30. Les animaux contrôles et les animaux exposés à la caféine in utero ou à l’âge adulte (dès 3mois) subiront 4 examens au total sur une période de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois).
Impact sur les animaux
Les souris traitées à la caféine peuvent présenter une baisse de la consommation de l’eau de boisson les deux premiers jours d’exposition. Les souris exposées à la caféine in utero par le biais de leurs mères peuvent avoir un poids plus faible à la naissance que les contrôles. Cependant, à l’âge adulte, leur poids n’est plus différent de celui des souris naïves. L’exposition in utero à la caféine a un effet délétère sur le cerveau. Les animaux seront soumis à 2 tests comportementaux différents et pourraient être plus anxieux lors du second test réalisé le lendemain du premier. L’effet indésirable lors des frottis vaginaux est de provoquer une stimulation induisant une pseudo-gestation. Bien que ce risque soit mineur chez les souris à l’inverse des rates, nous avons envisagé les dispositions permettant de minimiser cette éventualité (utilisation d’une micropipette et espacement des prélèvements de 3 mois). Les animaux seront aussi examinés par IRM tous les 3 mois (m3 à m12). A chaque IRM, ils seront rasés au niveau du flanc droit sur les faces dorsale et ventrale afin de faciliter le monitoring de la saturation en oxygène pendant l’examen. Ce geste est indispensable pour avoir des valeurs fiables sur les souris de notre étude car l’oxymètre étant associé à un capteur infrarouge, son pouvoir absorbant est atténué par leur pelage noir. Cependant, du fait du dos rasé, les souris mâles peuvent se blesser plus facilement lors des luttes entre congénères. Ils seront alors surveillés et nettoyés avec de la vétédine au besoin. La seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque le vetflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.
Devenir
Après la dernière IRM, les descendants des triades seront soumis à une perfusion intracardiaque en vue de prélèvements destinés à des analyses neuroanatomiques et immunihistochimiques. Les reproducteurs seront mis à mort à 12 mois du fait de leur âge et parce qu’ils ne seront plus réutilisés pour générer des colonies à la fin de l’étude.
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. L’étude de la connectivité cérébrale au cours de la vie nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative. De nombreuses études montrent que les dynamiques cérébrales globales sont analogues chez les mammifères, et le modèle de souris Alzheimer qui sera utilisé est très pertinent pour apporter de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux et mieux appréhender cette maladie.
Réduction
Le recours à l’animal étant incontournable, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum grâce à l’utilisation de méthodes non-invasives en IRM permettant le suivi longitudinal d’un même animal. Nous ne disposons pas de données préliminaires sur l’effet de la caféine sur les métriques IRM dans notre modèle de souris Alzheimer. Il ne nous est donc pas possible d’utiliser de tests statistiques pour évaluer la taille des groupes. En tenant compte des aléas possibles dans la mise en œuvre du projet et sur la base de notre expérience en IRM préclinique, nous avons donc réduit le nombre d’animaux au minimum permettant de répondre à la question scientifique.
Raffinement
Le raffinement concernera la diminution du stress par l’utilisation d’une anesthésie légère lors de l’IRM. Un délai d'acclimatation minimum de 10 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés lors de l’arrivée des animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés en vue de l’IRM. Pendant les sessions d’imagerie, les animaux seront plongés sous anesthésie légère avec sédation afin d’éviter tout stress. Ils bénéficieront d’un monitoring physiologique continu avec un système dédié au rongeur permettant d’adapter immédiatement l’anesthésie afin d’éviter toute situation de détresse cardio-respiratoire. Les études comportementales seront effectuées sous la conduite d’un opérateur expérimenté et les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en plexiglas, cartons à ronger, fast-track, balançoires). Des points limites adaptés et précoces seront mis en place pour la procédure. Des critères d’arrêt anticipé de l’expérimentation en cas de survenue d’une complication seront appliqués.
Choix des espèces
Ce projet utilise des souris génétiquement modifiées comme modèle animal de la maladie d’Alzheimer. Ce modèle est considéré comme pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine (lésions de type plaques amyloïdes, neuroinflammation, propagation de protéines tau et déficits cognitifs). Nous utiliserons des reproducteurs âgés de 6 à 8 semaines, exposés ou non à la caféine. Les descendants seront soit : exposés à la caféine in utero et pendant les 15 premiers jours de vie par le lait maternel ; soit non exposés pendant la gestation mais exposés de manière chronique à la caféine à l’âge adulte (de 3 à 12 mois) ; soit, jamais exposés à la caféine au cours de leur vie. Les différentes interventions se feront tous les 3 mois sur les souris adultes (à partir de 3 mois jusqu’à 12 mois). Cette étude permettra d’étudier les modifications induites par la maladie, la caféine et le vieillissement sur le connectome cérébral.
prestations de services permettant l’obtention de modéles transgèniques murins, leur cryopréservations ainsi que leurs cryopréservations en recherche fondamentale et appliquée
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
6 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'activité relève d'une "prestation de services" de production de lignées transgéniques, de redérivation et de cryopréservation, avec injections d'hormones et microchirurgies sous anesthésie (vasectomie, transfert d'embryons). Le porteur indique que toutes les femelles donneuses sont tuées pour récupérer un maximum d'ovocytes et les mâles fertiles pour récupérer leur sperme, les mâles vasectomisés étant renouvelés deux fois par an. Il présente la congélation des lignées comme une application des 3R alors qu'elle sert d'abord à maintenir un stock de modèles pour les équipes clientes.
Objectifs
Le but de la redérivation sera de maintenir les lignées de souris sous un statut sanitaire acceptable. Dans notre établissement, beaucoup de souris (60% environ) sont immunodéprimées. Par conséquent, la présence de certains microorganismes mettrait en péril leurs bien être. La congélation des lignées des souris permet de répondre à la règle des 3R (réduction du nombre de souris) tout en protégeant ces lignées d’une dérive génétique, d’une contamination génétique ou d’une catastrophe naturelle. La modification du patrimoine génétique des souris permet de répondre à des problématiques diverses et variées (recherche fondamentale ou appliquée).
Bénéfices attendus
La redérivation de nos souris permet de garder des souris immunodéprimées au sein de notre service. La congélation de nos souris répond à la règle des 3R , c'est à dire réduire au maximum le nombre de souris. La transgénèse permet aux équipes de recherche d'obtenir des modèles de recherche.
Procédures
Certaines souris subiront 2 Injections d'hormones à 48 heures d'intervalle, en sous cutané, réalisées en 5 secondes. Chaque chirurgie serat réalisée une fois, sous anesthésie générale. La souris reste sous anesthésie durant 40 minutes. La chirurgie dure 15 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours de nos procédures, nous réalisons des microchirurgies sous anesthésie générale. Les effets indésirables pourraient être des infections. Nous devons également conserver des mâles stériles individualisés. Ce type d'hébergement est une source de stress.
Devenir
Toutes les femelles donneuses d'ovocytes sont mises à mort afin de récupérer un maximum d'ovocytes. Les mâles fertiles sont mis à mort afin de récupérer un maximum de sperme lors de la congélation de sperme.
Remplacement
Notre structure propose la redérivation, la congélation et la modification du patrimoine génétique de la souris. Chaque chercheur justifie l'utilisation de la souris comme modèle de recherche.
Réduction
Nous utilisant des hormones non néfastes (PMSG, hyperOva et hCG) pour la souris, permettant d'obtenir un nombre maximal d'ovocytes et d'embryons, et par conséquent de réduire le nombre de femelles utilisées. La congélation des lignées murines est une méthode permettant de réduire au maximum le nombre de souris et limiter au maximum le maintient d’animaux respirant aux phénotypes dommageables non utiles immédiatement à une recherche expérimentale. Le maximum de mâles vasectomisés sera de 280 animaux (28*2*5). Nous avons en permanence 28 males vasectomisés qui nous permet de détecter 10 femelles en œstrus (chiffre empirique), c'est à dire les mères porteuses. A l'âge de 4 mois, ils sont mis en accouplement avec les futures mères porteuses. On les garde jusqu'à l'âge de 9 mois car, passé cette date, ils sont peu actifs et le nombre de femelle pluggée chute dramatiquement. Par conséquent, on les renouvelle, 2 fois par an. Un maximum de 2100 mères porteuses seront utilisées au cours des 5 ans à venir. Pour les redérivations, on prévoit 30 projets par an, incluant un lot de 4 mères porteuses soit 30 * 4 *5 souris. Pour les projets "transgénèse", on prévoit 15 projets par an, nécessitant un maximum de 5 expérimentations incluant à chaque fois un lot de 4 mères porteuses soit : 15*5*4*5 mères porteuses soit (30*4*5) +(15*5*4*5) = 2100 mères porteuses.
Raffinement
Toutes les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale. Les yeux des animaux sont protégés du dessèchement par du collyre "OcryGel". Au cours de la chirurgie, réalisée sous loupe binoculaire, les animaux sont placés sur une table chauffante thermostatée à 28°C. Tous les animaux sont ensuite accueillis dans une cage, elle-même chauffée par un tapis. Le tapis chauffant est retiré après le réveil de tous les animaux. De plus, des analgésiques adaptées (métacam ou doliprane) sont introduit dans l'eau de boisson durant 3 jours après l'intervention. Les mâles individualisés reçoivent un enrichissement supplémentaire, un igloo en carton.
Choix des espèces
Notre structure met à disposition une prestation de redérivation des souris afin de maintenir un statut sanitaire à l'élevage des souris immunodéprimées. La congélation des souris transgéniques permettra de garder ces modèle sous la forme congelée et non respirante. La création de modèles murins transgéniques permettra d'obtenir des modèle pertinents pour des études en recherche fondamentale, ainsi qu'en recherche clinique. Les mâles subiront une vasectomie seront âgés entre 8 et 10 semaines. On les gardera au maximum 10 mois. Les femelles donneuses d'ovocytes seront âgées entre 4 et 6 semaines. On utilise des femelles prés pubères afin d'induit facilement un cycle hormonal en injectant les hormones appropriées. Les souris mises en accouplement auront au minimum 5 semaines. Les mères porteuses seront matures, âgées entre 2 et 9 mois.
Projet pilote : Modèle de mouvements anormaux après privation en oxygène chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont privés d'oxygène pendant 1 à 30 minutes, dont 40 sans anesthésie et maintenus par contention, pour mettre au point un modèle de myoclonies reproduisant le syndrome de Lance-Adams humain. Le porteur décrit une possible détresse respiratoire, des secousses musculaires gênant déplacement et alimentation, et reconnaît que la mort pendant l'anoxie est une "possibilité expérimentale". Il s'agit d'une étude "pilote" visant à caler les paramètres d'un futur modèle, et il revendique la "nécessité" d'expériences animales au motif qu'on ne peut provoquer ces atteintes chez l'humain.
Objectifs
Chez l’homme, l’arrêt de l'oxygénation du cerveau (ou anoxie cérébrale) peut être liée à des causes variées : arrêt cardiaque, crise d’asthme ou infection des poumons très sévère, noyade, pendaison, etc. Elle entraîne chez les survivants des maladies neurologiques chroniques comme le syndrome de Lance-Adams (LAS). Le LAS apparait dans les jours ou semaines suivant le manque d'oxygène, après retour des patients à un état de conscience normal. Le LAS est caractérisé par des secousses musculaires involontaires (appelées myoclonies) très importantes. Ces secousses musculaires, non qualifiées comme douloureuses par les patients, apparaissent spontanément ou sont induites par les mouvements ou des sons par exemple. Elles rendent impossible la réalisation de nombreux gestes de la vie quotidienne : marcher, s’alimenter, se laver ou aller aux toilettes. Les patients sont le plus souvent traités par de multiples médicaments qui exposent à de nombreux effets secondaires et aux risques d’interactions entre médicaments. Dans le LAS, l'efficacité de ces médicaments est souvent insuffisante. Les mécanismes à l'origine du LAS restent peu connus. A ce jour, deux modèles de LAS ont été développés chez le rat, soit par arrêt des contractions cardiaques après une injection de toxiques dans le coeur, soit par arrêt de la circulation sanguine par compression des gros vaisseaux sanguins situés dans le thorax à la sortie du coeur. Cependant, ces deux modèles présentent plusieurs limites, notamment une approche expérimentale lourde, un taux de mortalité élevé et l’induction de lésions cérébrales par ischémie (interruption brutale du flux sanguin) et non pas par anoxie (manque pur d'oxygène). L’objectif de notre projet pilote est donc de mettre au point un nouveau modèle animal de myoclonies après un manque d'oxygène reproduisant le phénotype de LAS chez l’humain. Avec une procédure expérimentale plus simple, moins invasive et plus représentative du mécanisme de LAS chez l’humain, nous souhaitons identifier les divers paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un modèle fiable et reproductible tout en limitant la mortalité et la douleur chez l’animal, indispensable pour vérifier nos hypothèses concernant les mécanismes à l'origine du LAS.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints de LAS est aujourd’hui limitée avec des traitements à l’efficacité assez faible dans cette pathologie. L’amélioration de la prise en charge des patients passe avant tout par une meilleure compréhension des mécanismes aboutissant aux secousses involontaires (appelées myoclonies) du LAS. Cela repose donc notamment par l’exploitation des modèles animaux qui reproduisent cette pathologie. Comme évoqué précédemment, les modèles déjà publiés de LAS ont des points faibles. Nous souhaitons donc développer ce nouveau modèle de LAS chez le rongeur pour ensuite l’explorer finement afin d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes pathologiques du LAS. Les études animales déjà réalisées donnent des résultats assez hétérogènes. Chez l’homme, les études cliniques semblent indiquer que les secousses des patients avec un LAS pourraient provenir de l'écorce du cerveau appelée cortex. Dans notre groupe de patients atteints de LAS, les premiers résultats sont très en faveur d’une atteinte du cortex pouvant être à l'origine des secousses. Par ailleurs, certains neurones spécifiques du cortex sont très consommateurs d'oxygène. Le manque d'oxygène pourrait donc en priorité affecter le fonctionnement de ces neurones-là. Nous faisons donc l’hypothèse que les secousses musculaires du LAS sont, au moins en partie, dues à un souffrance de ces neurones au sein du cortex responsable des mouvements. A court terme, cette étude pilote permettra d’établir les différents paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un nouveau modèle animal de LAS. A long terme, le bénéfice de la mise en place de ce nouveau modèle sera d’approfondir, dans un projet ultérieur, les connaissances déjà acquises sur le LAS, en particulier par des méthodes électrophysiologiques et immunohistochimiques afin de tester notre hypothèse.
Procédures
Le protocole d'anoxie transitoire sera réalisé à une seule reprise sur les 50 rats. Sur un premier groupe de 10 rats (groupe 1), cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale. Pour les 4 autres groupes de rats (de 10 rats chacun), cette procédure sera réalisée sans anesthésie. Le protocole d’anoxie durera entre 1 et 30 minutes. Pour chacun des rats, des électrodes sous-cutanées de surveillance ECG et une pince oxymètre de pouls de surveillance de la saturation en oxygène seront placées avant la procédure d’anoxie et seront retirées ensuite. De plus, une voie veineuse sera posée dans la veine caudale. Pendant cette procédure d’anoxie transitoire sur le groupe 1, le risque anesthésique est à prendre en compte. Par ailleurs, pour les animaux non anesthésiés (groupes 2, 3, 4 et 5) pour la procédure d’anoxie transitoire, le système de contention pourra représenter une nuisance pour l’animal car cela va nettement restreindre sa mobilité. Au cours de la procédure d’évaluation de la survenue des myoclonies, des injections de molécules anti-épileptiques (durée d’injection et temps de maintien : 1 minute) seront réalisées une fois pour chaque animal par voie intra-péritonéale. Pour tous les animaux, le phénotype induit sera surveillé très attentivement du fait de la possibilité de perte de motricité et d’apparition de myoclonies et de crises d’épilepsie. Enfin, les animaux seront euthanasiés par une méthode de mise à mort réglementaire.
Impact sur les animaux
Ce projet pilote va permettre d’évaluer les différents effets indésirables possibles de ce protocole expérimental. La phase de manque d'oxygène pourra être à l’origine d’un stress pour les animaux du fait de potentielles difficultés à respirer. Cette privation d'oxygène sera réalisée dans une cage contenant un système de contention permettant d’immobiliser l’animal, pendant 1 à 30 minutes. Certains animaux seront endormis pour la réalisation de cette procédure par l'utilisation de médicaments anethésiques, donc le risque de l'anesthésie est également à prendre en considération. La mort des animaux au cours du manque d'oxygène est une possibilité expérimentale. Les secousses musculaires involontaires engendrées par le manque d'oxygène pourront entrainer des difficultés de déplacement pour les animaux ainsi que des difficultés d’alimentation. Il nous semble également important de rappeler que, chez l’humain, les secousses musculaires ne sont pas considérées comme étant douloureuses.
Devenir
Les mêmes animaux sont impliqués dans les manipulations d’anoxie et d’évaluation des myoclonies/suivi du phénotype dommageable. A l’issue de ces manipulations, les animaux seront euthanasiés par une méthode de mise à mort réglementaire, l’euthanasie étant requise pour réaliser des prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Certaines questions d’intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que de nombreuses procédures alternatives existent, ni les processus aboutissant à la mort des neurones ni les processus favorisant l'apparition de crises d'épilepsie ou de secousses musculaires involontaires (appelées myoclonies) ne peuvent être légitimement bien étudiés chez l’homme ou dans d’autres modèles non animaux. De plus, il n’est pas légitime de provoquer une crise d’épilepsie ou des myoclonies chez un patient pour des études scientifiques. Enfin, lors des expériences sur les animaux, l’environnement est mieux contrôlé et la qualité des données est nettement supérieure.
Réduction
Nous sommes sensibles au besoin d’utiliser le moins d’animaux possible et de diminuer la souffrance animale tout en respectant la rigueur scientifique. C’est dans cette objectif que nous conduisons cette étude pilote afin d’établir les paramètres du protocole permettant de réduire au maximum la mortalité du protocole donc le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire (50) pour produire une conclusion scientifique et statistique tenable. Afin de réduire ce nombre d’animaux, nous réaliserons la procédure d’anoxie sur un premier groupe d’animaux qui seront anesthésiés afin de bien définir les paramètres techniques (design intérieur des cages d’induction, paramètres physiologiques limites, temps d’exposition critique à de faibles % en oxygène, débit de gaz nécessaire).
Raffinement
Une période d’acclimatation, d’une semaine minimum, à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. De façon à réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront maintenus au sein de groupes sociaux de plusieurs individus. Les conditions d’hébergement, incluant température, éclairage, bruit et espace ainsi que les conditions d’enrichissement de l’environnement, d’alimentation et soins si nécessaire, seront adaptées aux animaux et à leur âge. Un soin particulier sera apporté à la réduction de l’inconfort, de la douleur ou du stress des animaux. Un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). Une période, d’une semaine minimum, d’habituation à la manipulation humaine et à tous les outils utilisés pendant nos procédures expérimentales est respectée avant la réalisation de nos procédures. Avant le début de chaque expérience, une période d’acclimatation de 30 minutes sera observée au cours de laquelle les animaux, laissés dans leur cage, ne seront pas manipulés. Cela leur permettra de s’habituer à leur nouvel environnement et éviter toute forme de stress. Les animaux bénéficieront alors de nourriture et d’eau à volonté ainsi que d’un environnement enrichi à l’aide de tunnels. Pendant la procédure d’anoxie, les paramètres physiologiques (électrocardiogramme et saturation en oxygène) seront surveillés constamment.
Choix des espèces
Notre projet s’intègre dans la thématique du laboratoire qui s’intéresse aux processus physiopathologiques d’épileptogenèse et d’ictogénèse. Le rat est l’espèce choisie pour ce projet. Les méthodes d’investigations électrophysiologiques et immunohistochimiques (qui seront utilisées dans un deuxième temps au cours d’un projet ultérieur) sont maîtrisées au laboratoire et ont déjà permis la publication d’études sur d’autres modèles d’anoxie et d'épilepsie réalisées sur des rats adultes. Par ailleurs, les études déjà publiées sur les modèles animaux de LAS précédemment citées ont été faites chez le rat. Nous allons utiliser des rats adultes à 8 semaines de vie. Le LAS chez l’humain est en effet décrit uniquement chez des adultes. Par ailleurs, les études électrophysiologiques d’anoxie cérébrale et d’épilepsie réalisées dans l’équipe dans d’autres projets ont été faites chez des rats adultes. Ces mêmes techniques seront utilisées dans un deuxième temps sur un projet ultérieur.
Formations universitaire et réglementaire pour la réalisation de procédures expérimentales sur des animaux
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 420
1 540 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées en partie sous anesthésie sans réveil, en partie avec un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent contention, gavage, injections répétées par plusieurs voies et des prélèvements sous anesthésie (carotidien, intracardiaque, rétro-orbitaire, vésical), non pour produire des connaissances mais pour former des techniciens de laboratoire. Le porteur mentionne des tests comportementaux sans préciser lesquels et signale que des surcharges anesthésiques provoquent des arrêts cardio-respiratoires tuant un ou plusieurs animaux par session. Il présente les vidéos et modèles inertes comme une préparation, mais affirme qu'il reste "indispensable" que les étudiants pratiquent sur animaux vivants.
Objectifs
Depuis 2010, l’Europe fait reposer la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sur quatre points : l’agrément des établissements, le contrôle de leur origine, l’autorisation des projets et la formation des personnels. Notre formation universitaire a pour objectif de former des techniciens de laboratoire dans divers domaines de la biologie incluant le métier de technicien en expérimentation animale. Notre nouvelle offre de formation est basée sur une spécialisation dès le premier semestre, une approche par compétences et des mises en situation professionnelles. La formation des étudiants au métier de technicien de laboratoire en expérimentation animale a été particulièrement accentuée avec notamment l’intégration en tout début de la première année, de la formation réglementaire pour les personnes appliquant les procédures expérimentales chez les rongeurs. Notre formation universitaire dispense donc les cours théoriques réglementaires, des cours spécifiques sur les rongeurs et des visites d’animalerie. Par ailleurs, les travaux pratiques sur animaux sont destinés à l’acquisition de deux compétences : l’observation et la quantification du comportement des souris et l’acquisition de différents gestes techniques de base chez le rat et la souris (contention, prélèvements, injections). Avant de commencer les travaux pratiques, l’utilisation de vidéos et de modèles animaux inertes est proposée aux étudiants afin de les mettre dans les meilleures conditions avant l’utilisation de l’animal. Cependant, pour une formation efficace, les étudiants doivent ensuite être confrontés à l’animal. La formation réglementaire pour les personnes appliquant les procédures est également dispensée au personnel extérieur à notre établissement. L’objectif est de former les étudiants à la réglementation et l’éthique en expérimentation animale, au bien-être animal et à l’acquisition des compétences techniques de bases afin de pouvoir les appliquer dans le monde professionnel dans les meilleures conditions possibles en veillant au respect des animaux.
Bénéfices attendus
La formation théorique et technique du personnel est l’un des piliers de la réglementation concernant l’expérimentation animale. Notre établissement forme des techniciens de laboratoires pouvant exercer dans le domaine de l’expérimentation animale. La formation réglementaire destinée aux personnes appliquant les procédures que notre établissement propose depuis presque 20 ans est maintenant intégrée au programme en tout début de cycle de notre nouvelle offre de formation. Cela permet aux étudiants d’être sensibilisés à la réglementation et à l’éthique (et d’obtenir l’attestation de formation) avant toute manipulation sur les animaux. Des vidéos exposant les techniques et l’utilisation de modèles inertes permettent de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux. Cependant, nous estimons indispensable que les étudiants pratiquent sur animaux vivants afin d’acquérir pleinement les compétences nécessaires à la pratique de l’expérimentation animale. Cela garantit des gestes réalisés plus sereinement, au bénéfice de l’animal, de l’expérimentateur et de l’expérimentation. La formation est donc axée sur deux points essentiels : - l’observation du comportement des animaux pour déceler tout comportement anormal le plus rapidement possible. - l’acquisition de gestes techniques de base : l’approche de l’animal, la préhension, la contention et les techniques d’injections et de prélèvement les plus courantes Ces séances sur l’animal sont dispensées par des enseignants expérimentés, fortement impliqués dans la pédagogie et particulièrement attentifs au bien-être des animaux.
Procédures
Sur animaux vigiles : préhension, contention, gavage et techniques d’injections et de prélèvement les plus courantes : injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, à la veine de la queue, dans la veine mandibulaire. Quantification du comportement par différents tests comportementaux. Sur animaux anesthésiés : pose de cathéters, prélèvements carotidien, intracardiaque, au sinus rétro-orbitaire, dans la vessie.
Impact sur les animaux
Les séances d’observation n’induisent aucune nuisance chez l’animal. Les séances avec contention et gestes techniques avant anesthésie impliquent un stress chez l’animal. Ce stress est minimisé par l’acclimatation des animaux à leur environnement une semaine avant les séances de travaux pratiques, l’apprentissage théorique de la réglementation et de l’éthique ainsi que l’utilisation de vidéos et de modèles inertes au préalable afin de préparer au mieux les étudiants aux manipulations. L’effet indésirable le plus fréquent est l’accident de surcharge anesthésique induisant un arrêt cardio-respiratoire, particulièrement chez les souris. En premier lieu une réanimation est effectuée par un enseignant, il arrive cependant qu’un ou plusieurs animaux meurent lors de la session. Les procédures de cette saisine sont effectuées au moins depuis 2011. L’expérience des enseignants sur les différents anesthésiques, le suivi de l’anesthésie, la gestion de la douleur, les stratégies de réanimation et les erreurs des étudiants permettent de limiter fortement les accidents.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Des vidéos exposant les techniques et l’utilisation de modèles inertes permettent de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux. Cependant, nous estimons qu’il est indispensable que les étudiants pratiquent sur animaux vivants afin d’acquérir pleinement les compétences nécessaires à la pratique de l’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans cette nouvelle offre de formation sera fortement diminué par rapport au projet d’enseignement précédent. En effet, suite à l’utilisation de vidéos et au recentrage des procédures strictement nécessaires, nous passons de 9 à 6 procédures par rapport à l’ancienne saisine. Par ailleurs, les travaux pratiques sur animaux ne concernent désormais que la moitié de la promotion (56 étudiants) contrairement à l’ancienne saisine pour laquelle certaines procédures concernaient l’ensemble de nos étudiants (112). Dans le projet d’enseignement précédent, il y avait 712 souris et 272 rats par an soit 3560 souris et 1360 rats sur 5 ans. Dans ce nouveau projet, nous proposons 224 souris et 84 rats par an soit 1120 souris et 420 rats sur 5 ans. Cela correspond à une réduction de 69 % du nombre de souris et de rats. Par ailleurs, certains lots de souris font l’objet de plusieurs séances de travaux pratiques (les souris de la procédure 1 auront en amont été utilisées pour une séance d’approche de l’animal et une séance de comportement général et seront utilisées en aval pour une séance de dissection). Enfin, il est à noter que certains organes seront prélevés après mise à mort des animaux pour être utilisés dans les travaux pratiques de biologie cellulaire, biochimie et biologie moléculaire.
Raffinement
Des vidéos exposant les techniques et l’utilisation de modèles inertes permettent de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux. Cela garantira des gestes réalisés plus sereinement, au bénéfice de l’animal. Par ailleurs, un certain nombre de gestes sont réalisés sur animal anesthésié. Une antalgie est également proposée lorsque cela est nécessaire. Enfin, les animaux sont acclimatés une semaine dans l’animalerie avant toute utilisation. Ils sont hébergés, en groupe, en présence de tubes en carton, de buchettes en peuplier pour les rats et de papier kraft pour les souris pour enrichir l’environnement. Une surveillance quotidienne est assurée par l’ensemble du personnel concerné : technicienne, enseignants et enseignants-chercheurs.
Choix des espèces
Le rat sprague Dawley et la souris Swiss sont des animaux très utilisés en recherche. Par ailleurs, ces souches sont intéressantes pour leur faible agressivité permettant un apprentissage plus serein. Les animaux sont des mâles avec un poids compris entre 20 et 40 g pour les souris et 175 et 199 g pour les rats. Les animaux ont un poids compris entre 20 et 40 g pour les souris et 175 et 199 g pour les rats, pour une meilleure gestion de l’anesthésie.
Etude des potentiels effets indésirables d’une vésiculothérapie CD146 dans l’athérosclérose
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en intraveineuse des vésicules extracellulaires portant la molécule CD146 sous anesthésie gazeuse, subissent une mesure du temps de saignement à la queue, avant mise à mort pour prélever la moelle osseuse. Le porteur indique attendre un stress physique ou thermique et une douleur légère, et présente l'étude comme la vérification des effets indésirables d'une thérapie déjà jugée efficace contre l'athérosclérose. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne permet d'évaluer les effets hors cible d'une thérapie sur l'organisme.
Objectifs
Ce projet permettra d'étudier les effets indésirables d'une thérapie constituée de vésicules portant une molécule d'adhésion ; le CD146. En effet, un protocole précédemment accepté a testé le bénéfice d'une nouvelle thérapie dans l'atherosclérose. : l'apport de CD146 sur les macrophages de la plaque d'athérosclérose par des vésicules extracellulaires. Nos études en cours montrent un effet significatif des ces vésicules dans la régréssion de la maladie athéromateuse. Les vésicules extracellulaires étant décrites comme pouvant être pro-coagulantes ou pro-inflammatoires, il est essentiel de vérifier que la vésiculothérapie proposée n'entraîne pas de phénomènes de coagulation ou d'inflammation qui pourraient être délétères dans l'athérosclérose. Ainsi, nous allons étudier l'effet de ces vésicules sur le phénotype inflammatoire des macrophages qui sont leurs cellules cibles privilégiées. Nous étudierons également le temps de saignement des modèles expérimentaux soumis à cette thérapie.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique dans la lutte contre l'athérosclérose.
Procédures
1/ injection dans la veine de vésicules extracellulaires après anesthésie gazeuse 2/Temps de saignement : Prélèvement de quelques gouttes de sang à la queue après anesthésie gazeuse 3/Extraction des cellules de la moelle osseuse sur animal euthanasié.
Impact sur les animaux
L'animal subit une injection, une anesthésie ainsi qu'une biopsie de la queue. Cela pourra entrainer par exemple : un stress physique léger, un stress thermique ou une douleur légère chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, en effet il est necessaire d'avoir un animal euthanasié pour récolter la moelle osseuse des tibias et des péronés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune autre alternative à l'utilisation d'un modèle murin pour tester le bénéfice global d'une thérapie dans l'athéroslérose, l'évaluation des effets indésirables hors-cibles ne pouvant pas se faire in vitro.
Réduction
Les souris seront observées avant d’initier le protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, deux protocoles différents seront testés sur le même animal sans que cela ne perturbe les données scientifiques. Ainsi, les souris qui seront soumises à un test de saignement pour évaluer l'effet de la thérapie sur l'hémostase, seront ré-utilisées pour leur extraction de moelle osseuse afin d'isoler et de mettre en cuture les macrophages in vitro.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages contenant de l'enrichissement. Aussi, si les animaux présentant des symptômes type infection, ils seront écartés des protocoles. Nous serons attentif à toute souffrance animal lors de l'élevage. En effet, si l'animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait l’analgésie peut être envisagée par administration d'un médicament anti-inflammatoire tant que les signes de douleur persistent.
Choix des espèces
La meilleure façon d'appréhender les effets indésirables et 'hors cibles' d'une nouvelle stratégie thérapeutique est de l'étudier dans un modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, seul le modèle murin adulte développe des plaques d'athérosclérose semblables à celle de l'homme.
Moduler l’expression des gènes dans le tissu adipeux des souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des vecteurs viraux ciblant le tissu adipeux, par injection intrapéritonéale ou par chirurgie, certaines étant rendues lipodystrophiques par le tamoxifène ou obèses par un régime gras, puis subissent échographies, mesures de glycémie et tests de tolérance mensuels. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque d'infection et que les prélèvements répétés à la queue causent une douleur légère. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" pour observer les réponses physiologiques intégrées, les cibles ayant été identifiées en culture cellulaire.
Objectifs
L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que des altérations de la fonction du tissu gras dit tissus adipeux jouent un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. En effet, chez l'obèse, le tissus adipeux a dépassé sa capacité de stocker du gras, et ce gras va aller se déposer dans différents organes comme le coeur et le foie. Le tissu gras est composé de cellules spécialisées appelées les adipocytes. Notre équipe cherche à décrire les mécanismes qui font qu'un adipocyte en bonne santé devient malade. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé des adipocytes. Afin de moduler l’expression de ces cibles dans le tissu adipeux (TA) nous collaborons avec une équipe américaine qui a développé des vecteurs viraux spécifiques du tissu adipeux.
Bénéfices attendus
Le premier but de ce projet est de tester si les vecteurs viraux spécifiques du TA sont des bons moyens pour exprimer des protéines d’intérêt dans le TA dans une visée thérapeutique. D'autre part, plusieurs travaux s'intéresse à des structures qui se trouve dans les adipocytes et qui participe à la comunication intra cellules. Ces structures sont des points de contact entre deux organelles cellulaires majeurs, les mitochondries et le réticulum endoplasmique. Ces structures sont appellées les MAM. Nous émettons l'hypothése que ces structures sont noeuds de comunications importants qui contôlent l'état de santé des adipocytes. Ainsi, le deuxième but est de savoir si la modulation des MAM peut être une cible thérapeutique contre les dysfonction métaboliques associées à l’obésité.
Procédures
La lipodystrophie partielle est induite par 5 jours d’injection intrapéritonéale d'un agent pharmaceutique, le tamoxiféne. Pour les souris HFD nous commençons à nourrir des C57bl6 avec un régime gras à l’âge de 8 semaines. Nous nourrissons les souris pendant 1 mois puis nous démarrons les interventions génétiques. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, 100 µl d’une solution d’AAV sera injectée en intrapéritonéal. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, l’injection se fait directement dans le dépôt par une chirurgie. Cette procédure a lieu1 fois pendant et dure 20 minutes Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Pour l'induction de la lipodystrophie partielle, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour les souris HDFD, le régime gras entraîne une prise de poids mais n’a pas d’effet néfaste sur le bien être des souris. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, la chirurgie comporte un risque du fait des infections possibles. Pour les test de tolérance, les prélèvements multiples à la queue entraine une douleur légère. L'administration du glucose par gavage oral qui entrainne un léger stress sur les souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir le rôle physiopathologique des acteurs étudiés.
Remplacement
Le but de notre projet est de valider l’importance de certains acteurs protéiques dans le maintien de la bonne santé du tissu adipeux et de la bonne santé métabolique de l’animal au niveau systémique. Ces cibles ont été identifiées in vitro et ce travail est parallèle à des études cellulaires complémentaires. Cependant, une validation in vivo est indispensable, notamment pour l’étude des conséquences de la modulation de l’état du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les cibles testées ici ont toutes étaient identifier par des expériences réalisées sur des lignées de cellules. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement tester dans des lignées cellulaires. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.
Réduction
Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 1120 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests non paramétriques de Mann and whitney pour tester la valeur statistique de nos données.
Raffinement
Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se feront avec des anesthésiques, des analgésiques et en condition de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.
Choix des espèces
Les 3 modèles murins utilisés sont bien maîtrisés au laboratoire et ont été largement étudiés. Notamment, ces modèles permettent d’étudier les conséquences de la dysfonction adipocytaires sur d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Pour les BSCL2K0, nous utiliserons des souris de 8 semaines, âge auquel elles sont déjà sévèrement lipodystrophiques. Pour les iATSKO, nous utiliserons des souris de 8 semaines lors de l’induction de la délétion par le tamoxifène en accord avec nos résultats précédents. Pour les souris HFD, des souris sauvages seront mises sous régime gras à l’âge de 8 semaines.