Rongeurs

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein ou du poumon, puis un traitement par gavage pendant trois à six semaines, pour comparer un dosage adaptatif des anticancéreux au dosage maximal habituel. Le porteur indique que la greffe provoque une douleur modérée sous anesthésie et que la tumeur sera limitée à 2 000 mm3, toutes les souris étant tuées pour analyser les cellules tumorales. Il affirme avoir déjà travaillé sur cellules en culture et par modélisation mathématique, mais juge le passage à l'animal nécessaire pour reproduire la formation des tumeurs.

Objectifs

Le cancer du sein est la première cause de mortalité des femmes par cancer en France, avec plus de 12.000 décès par an. Chez l’homme, le cancer du poumon est le plus mortel avec > 22.000 décès / an. L’échec thérapeutique dans les deux cancers est causé par le développement d’une résistance cellulaire aux drogues. L'approche conventionnelle d'administration d'anti-cancéreux consiste à donner les Doses Maximales de drogues Tolérées par les patients (MTD). Toutefois, en raison du grand nombre de cellules cancéreuses et de leur hétérogenéité, cela conduit inévitablement à une sélection de cellules qui sont adaptées pour résister aux traitements, et qui sont responsables des rechutes. Cette sélection des cellules résistantes par les thérapies est un problème d’écologie, et les écologistes ont conclu que le meilleur moyen de limiter les effets néfastes des éléments nuisibles est de les contrôler plutôt que de tenter de les éradiquer. Transposé au cancer, cela consisterait à appliquer des régimes adaptatifs de drogues où l'on diminue la dose si la charge tumorale diminue. Cela permettrait de maintenir une compétition cellulaire entre cellules sensibles aux traitements et cellules résistantes, tout en limitant les effets secondaires des drogues. Bien que cette "Thérapie Adaptative" (AT) connait déjà des succès dans la clinique, les paramètres essentiels pour l’implémenter, et les mécanismes cellulaires et moléculaires en jeu, restent inconnues. Nous avons récemment montré par une combinaison de modélisation mathématique et d'expériences à partir de cellules cancéreuses en culture, que la compétition entre cellules sensibles et résistantes est réelle et détermine l’efficacité de l’AT. Dans nos expériences, des régimes avec des faibles doses de drogues contrôlaient mieux la croissance des cellules cancéreuses dans le temps que des doses plus élevées, tout en évitant l'apparition de cellules résistantes. Ces expériences sont publiées dans une revue internationale. Comme il s'agit d'utilisation exclusive de cellules en culture, notre stratégie est conforme à la première règle des 3R (remplacement). Cependant, il est important de maintenant procéder aux expériences chez l’animal pour mieux reproduire la tumorigénèse, afin de mieux comprendre comment implémenter l’AT chez l’homme. Le but de ce projet est de tester les avantages et mécanismes de l'AT in vivo chez la souris dans des modèles cliniquement relevants de cancers du sein et du poumon.

Bénéfices attendus

La réussite de ce projet serait d'une importance majeure, car il permettrait d'envisager des essais cliniques avec des drogues déjà autorisées mais jusqu'à présent inefficaces pour lutter contre la résistance. Les avantages de l'AT seraient un gain de temps de survie des patients et la diminution des effets secondaires. L’AT est potentiellement applicable à n'importe quel cancer et n'importe quelle drogue.

Procédures

Greffes de cellules cancéreuses une fois, et traîtement avec des inhibiteurs de kinases par gavage orale une fois par jour pendant 3 à 6 semaines.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales chez la souris engendrait une douleur modérée mais sera réalisée sur souris anaesthésiées. La croissance des tumeurs sera limitée à une taille maximale de 2000mm3, ce qui n'engendre pas de douleur. L'application des drogues par le gavage des animaux implique une nuisance transitoire mas pas de souffrance sévère ni durable. Les drogues utilisées n'ont pas d'effets secondaires chez la souris aux doses utilisées.

Devenir

L'intégralité des animaux sera mise à mort pour éviter de dévélopper des souffrances et pour permettre l'analyse des cellules cancéreuses des tumeurs.

Remplacement

Nous avons déjà analysé in vitro des paramètres relevants des cellules de cancer mammaire (4T1) et du poumon (PC9) sensibles ou résistants aux drogues, et avons également réalisé la modélisation mathématique de ces données. L'ensemble de ces études nous a permis d'identifier et préselectionner les conditions d'intérêt. Mais il n'existe pas d'approches, autre que l'expérimentation in vivo chez l'animal, pour évaluer l'efficacité des différents régimes de drogues sur la diminution de la progression tumorale et de la résistance.

Réduction

Nous avons conçu les expériences pour utiliser le minimum d'animaux permettant de tirer des conclusions statistiquement robustes. Dans chaque expérience, nous comparerons la progression tumorale dans les souris nude entre deux groupes. Chaque expérience prévoit l'utilisation de 10 souris dans le bras AT et 10 dans le bras MTD, à répéter une fois si les résultats sont prometteurs. Ceci donne lieu à 80% puissance pour détecter un effet de différence de 10% avec une confiance p

Raffinement

Les expériences sont conçues pour éviter la souffrance des animaux, selon la règle 3R (raffinement): par exemple en arrêtant les expériences avant les signes de souffrance et en surveillant quotidiennement les animaux pour les points limites correspondant à des signes de souffrance. Les conditions d'hébergements sont les suivantes: 5 animaux par cages (501 cm2) avec pour litière un mélange de sciure de peuplier et de copeaux de peuplier

Choix des espèces

Les modèles choisis (greffe sous cutanées dans des souris nude) sont cliniquement relevants, ayant conduit à des essais cliniques qui ont permi l'approbation des drogues utilisées chez les patients. 8 semaines : il faut des souris adultes jeunes et du même stade pour les expériences de tumorigénèse afin de réduire la variance et diminuer le nombre d'animaux utilisés.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces rats porteurs de la dystrophie musculaire de Duchenne reçoivent 26 injections sur douze semaines et deux prélèvements de sang au sinus de l'œil sous anesthésie, et passent des mesures de force et de fonction cardiaque, pour tester un composé censé renforcer la membrane des fibres musculaires. Le porteur indique que la maladie provoque spontanément une perte de masse et un comportement de "freezing", une immobilité inhabituelle, et que tous les rats sont tués pour les analyses. Il affirme que cette question ne peut être tranchée que chez l'animal vivant, le rat reproduisant la maladie "beaucoup plus fidèlement" que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire, en raison de l'absence de la protéine dystrophine dans les muscles striés. La dystrophine connecte l’intérieur de la fibre musculaire à la matrice moléculaire à l’extérieur de la fibre. En l'absence de dystrophine, les fibres musculaires sont affaiblies et fragiles, au point de rompre lors d’une contraction musculaire qui agit comme un stress mécanique. Cela conduit à des cycles répétitifs de régénération et de dégénérescence des fibres, accompagnés d'une inflammation chronique douloureuse, d’une fibrose et d’une perte permanente des fibres musculaires par épuisement de la capacité régénérative des cellules souches. Dans les muscles squelettiques et cardiaque, la liaison à la matrice se fait essentiellement via une protéine appelée intégrine. En condition DMD, les intégrines sont surexprimées par un mécanisme compensatoire. La présence massive d'intégrines à la surface de la fibre musculaire favorise le relarguage de molécule de l’inflammation, à l’origine d’une boucle vicieuse favorisant la fibrose. La stratégie pharmacologique proposée ici consiste à exploiter la présence des nombreuses molécules d'intégrines à la surface des fibres musculaires DMD. L'objectif du projet est d'activer les molécules d'intégrines par une modification de leur forme induite par la fixation spécifique du composé testé. On sait que l'activation des intégrines promeut leur fixation aux molécules de la matrice extracellulaire. Nous posons l'hypothèse que sur notre modèle de DMD, la fragilité de la membrane cellulaire des fibres musculaires initialement induite par la déficience en dystrophine sera compensée par une stabilité renforcée de la membrane, résultant de sa connexion avec la matrice qui agit comme une gaine externe protectrice, avec pour conséquence de réduire la mort des fibres musculaires et pour conséquence fonctionnelle d'accroître le nombre de fibres musculaires actives et ainsi, la force du muscle.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la DMD pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle de rat qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Nous proposons ici de traiter des rats malades avec un composé mimant l'activation d’un mécanisme protecteur de la membrane des fibres musculaires, dont nous espérons qu'il améliorera le fonctionnement de l'ensemble des muscles du rat. Ce composé agit en facilitant la résistance de la membrane protectrice qui entoure les fibres musculaires, réduisant ainsi leur mort qui est toujours accompagnée d’une inflammation douloureuse. Le composé réduit aussi la fibrose du muscle, accélérant la récupération motrice. Nous projetons ainsi d'identifier une piste innovante qui pourrait devenir un traitement utilisable chez l’enfant en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux vigiles sont injectés deux fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie préalable au prélèvement sanguin (au démarrage de la procédure puis en fin de procédure). Ils sont injectés par voie sous-cutanée pour recevoir le traitement ou le contrôle 2 fois par semaine pendant 12 semaines. Au total, chaque rat recevra 26 injections, chacune d'une durée maximale de 2 minutes, réalisée par une personne très expérimentée et soucieuse de réduire l'impact négatif pour l'animal. L'injection sera réalisée plutôt au début ou en fin de journée pour éviter de réveiller l'animal. Les animaux seront également prélevés deux fois au sinus rétro-orbitaire pour obtenir du sang permettant d'évaluer le bénéfice espéré de la thérapie (biomarqueurs), sous anesthésie générale et locale. La séquence de prélèvement dure au total 1 heure (jusqu'au réveil). Le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes. La durée d'un enregistrement ECG est de 15 minutes. La durée d'un enregistrement pléthysmographie est de 30 minutes. La durée d'une séquence de grip test est de 20 minutes. La durée d'un enregistrement de force est de 90 minutes, anesthésie comprise. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

Il a été montré que le produit administré à une dose 3 fois supérieure à celle que nous administrerons n’est pas toxique chez le rat. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. La procédure de ce projet inclut des animaux chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont très limitées et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques, cellulaires et moléculaires nécessaires. Tous les animaux, même morts précocement au cours de la procédure, pourront être inclus pour les analyses prévues.

Remplacement

L'efficacité du composé testé sur l’activation des intégrines a déjà été confirmée in vitro et sur des modèles de souris. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé permet-elle de protéger suffisamment la membrane de la fibre musculaire pour que la masse des muscles des rats DMD traités augmente, que cela confère un bénéfice fonctionnel quantifiable à l’échelle du cœur et des muscles squelettiques, associée à une diminution également quantifiable du remodelage délétère à l’échelle histologique ?

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Les muscles des animaux âgés d’un à 6 mois sont affectés par la maladie. Il est donc attendu que les différences entre animaux WT et DMD seront marquées et instructives, et que l'évaluation de l'efficacité du composé testé sera pertinente puisqu'intervenant à un moment où la déviation de la trajectoire fibrotique permettra une moindre myonécrose, facilement quantifiable.

2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante des électrodes dans le cerveau, puis des stimulations électriques répétées de l'amygdale provoquent des crises d'épilepsie, pour tester des molécules antiépileptiques développées par des industriels du médicament. Le porteur indique que ces stimulations quotidiennes peuvent induire un stress accru et une absence de prise de poids, et que l'hébergement en cage individuelle peut aggraver ce stress. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les circuits neuronaux impliqués et que les tests sur l'animal vivant sont "indispensables" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les désordres épileptiques représentent l’une des atteintes cérébrales les plus importantes avec une incidence de 0.6 % de la population mondiale. Malgré le développement de plusieurs antiépileptiques ces 30 dernières années, plus de 30% des patients épileptiques n’ont pas leur épilepsie contrôlée par ces traitements qui provoquent de plus de nombreux effets secondaires. Il est donc critique de développer de nouvelles molécules antiépileptiques afin de traiter les patients résistants aux traitements déjà existants et d’améliorer le contrôle de la maladie et la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de tester, sélectionner et valider de nouvelles molécules développées par les professionnels du médicament dans un modèle de rat mimant une épilepsie chronique focale secondairement généralisée. Cette approche repose sur la stimulation électrique répétée afin de reproduire les principales caractéristiques électrophysiologiques d’une forme d’épilepsie humaine : l’épilepsie du lobe temporal. Des études pharmacologiques ont montré l’utilité de ce modèle reposant sur la méthode de l’embrasement, pour le criblage de molécules grâce à la bonne stabilité du modèle une fois établi . Il apparait donc comme un modèle pertinent pour la sélection et la validation de nouvelles molécules antiépileptiques. Ce projet facilitera le développement de nouvelles molécules antiépileptiques plus efficaces et ayant moins d’effets secondaires pour des patients souffrant d’épilepsies non contrôlées efficacement par les traitements actuels.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouvelles molécules antiépileptiques afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles. L’utilisation du modèle de rat embrasé pourrait également permettre d’identifier des cibles potentiellement impliquées dans la génération et/ou la propagation des crises d’épilepsie. Ce projet ajoute une analyse électrophysiologique (en sus de l’évaluation comportementale classiquement décrite) de l’effet sur ce modèle d’épilepsie des molécules testées en caractérisant notamment : les durées, latences d’apparition et amplitudes des crises, et les variations potentielles de seuil d’excitabilité des réseaux observés. Une attention particulière sera portée sur l’effet sur la généralisation ou non des crises induites par la stimulation. L’utilisation de ce modèle dans ce projet pourrait donc permettre d’identifier le potentiel thérapeutique de nouveaux traitements antiépileptiques ou bien leur capacité à ralentir voire arrêter la phase d’épileptogénèse.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une chirurgie d’implantation d’électrodes corticales et sous-corticales, procédure réalisée sous anesthésie générale. Puis des stimulations électriques amygdaliennes de faible intensité et de courte durée (1s) seront réalisées sur l’animal vigile. Une stimulation quotidienne (5 jours sur 7) sera appliquée pendant la phase d’établissement du modèle (2 à 4 semaines). Lors des tests pharmacologiques en aïgu, une administration sur animal vigile maintenu en contention précèdera la stimulation. Ces administrations seront espacées de 72h minimum et ne pourront pas excéder le nombre de 20. Lors des tests pharmacologiques en administration chronique, les injections peuvent être réalisées jusqu’à trois fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Quatre lots de 25 animaux pourront être implantés avec une pompe osmotique sous anesthésie générale, permettant une administration continue des molécules testées. Lors des protocoles de tests pharmacologiques, 4 stimulations électriques maximum auront lieu dans la même journée, deux fois par semaine maximum. En fin d’étude, selon la demande des clients, les animaux subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Ce modèle animal implique l’utilisation de stimulations électriques répétées permettant d’abaisser progressivement le seuil d’excitabilité cérébrale. L’intensité de stimulation est progressivement augmentée jusqu’à générer les premières crises épileptiques détectées sur le signal électroencéphalographique. Une fois cette intensité fixée par animal, elle est maintenue pour l’ensemble des stimulations appliquées par la suite. L’animal va présenter à chaque stimulation un ou plusieurs des signes décrits par l’échelle d’évaluation comportementale (échelle de Racine) : ces effets sont observés sur un cours laps de temps uniquement dans les minutes post-stimulation (maximum 2 minutes). En dehors de cette courte période, les animaux ne présentent pas de crises ni de comportements anormaux observables. L’amygdale basolatérale est impliquée dans les mécanismes de défense et les comportements de fuite chez les rongeurs, il est donc envisageable que la stimulation de cette zone aie un impact émotionnel sur l’animal, même si ce potentiel effet n’est pas décrit dans la littérature sur ce modèle. Au cours de la phase de génération du modèle (~15 jours), ces stimulations quotidiennes peuvent induire un stress accru et une absence de prise de poids. De plus, la nécessité d’hébergement en cage individuelle des animaux (afin de préserver l’intégrité des systèmes d’enregistrement) peut potentiellement exacerber ce stress. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une myorelaxation, une sommnolence ou à l’inverse des myoclonies du fait des mécanismes d’action des molécules testées.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs de stimulation et d’enregistrement de signaux électroenécephalographiques et la mise en place d’un modèle pathologique. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Ce projet a pour but de démontrer l’efficacité de molécules à la fois sur l’épileptogénèse et sur la génération de crises épileptiques. Actuellement, il n’existe aucune alternative in vitro ou modèle computationnel reproduisant les circuits neuronaux impliqués dans leur globalité et pouvant se substituer à ce modèle. De plus, toute demande de mise sur le marché nécessite de prouver l’innocuité et l’efficacité de la molécule testée, les tests in vivo préalables aux essais cliniques sont dans ce contexte indispensables. L’utilisation d’un organisme vivant est donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées. Les protocoles d’études sont basés sur des procédures d’études cliniques en utilisant un plan d’étude croisé permettant de réduire le nombre d’animaux et d’augmenter la puissance statistique puisque chaque animal est son propre contrôle. Un nombre minimum final de 16 animaux pour les protocoles pharmacologiques est nécessaire pour obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur avec une stimulation électrique répétée de classe modérée. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et l’état général de l’animal. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soins sont optimisées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Le poids des animaux est également contrôlé de manière continue et hebdomadaire. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles contenant un enrichissement composé de briquettes en bois, de nichoirs en papier kraft et de bâtonets en nylon dédiés spécifiquement aux rongeurs. Afin de minimiser la détresse sociale liée à l’isolement, les animaux sont régulièrement regroupés dans une grande enceinte avec différents éléments (tunnels, briquettes en bois, objets divers). Cette étape d’enrichissement social est réalisée au moins une fois par semaine sous la supervision d’un membre du laboratoire afin d’éviter tout endomagement des dispositifs d’enregistrement.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer la compréhension des épilepsies. De précédentes études ont montré la très bonne sensibilité des rats vis-à-vis des protocoles d’embrasement afin de modéliser l’épilepsie humaine. Les activités neurologiques visibles sur les signaux électroencéphalographiques ont des profils similaires à ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie- : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues : suppression ou réduction des crises avec le valproate, le diazepam et l’éthosuximide. Des rats adultes de 5 à 7 semaines seront utilisés dans ce projet. Les procédures seront réalisées au minimum une semaine après l’arrivée des animaux dans notre établissement. L’implantation des électrodes corticales et profondes impose l’utilisation d’un cerveau mature afin que le positionnement des électrodes soit correct, que les connections neuronales soient bien établies et que les animaux puissent récupérer facilement de la chirurgie.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique, une forme agrégée d'alpha-synucléine qui déclenche une maladie proche de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que cette inoculation conduirait de toute façon à la mort par paralysie progressive, et que les souris sont tuées dès l'apparition d'une démarche saccadée et de troubles de l'équilibre, avant la paralysie du train arrière. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui de remplacer l'expérimentation animale pour décrire l'extension de ces lésions.

Objectifs

Le projet vise à caractériser la maladie chez la souris génétiquement modifiée M83 après injection dans le cerveau d’une forme particulière d’alpha-synucléine agrégée, non détéctable par les méthodes de laboratoire jusqu'à présent utilisées. L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions des maladies humaines assocciées (maladie de Parkinson et démence à corps de Lewy , atrophie multisystématisée), au sein desquelles elle se présente sous une forme agrégée.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et des caractéristiques moléculaires observées chez les souris.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 40 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation d’alpha-synucléine agrégée est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les lots expérimentaux conduits jusqu’au stade clinique sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, homozygotes et hémizygotes. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d'incubation de la maladie, de la distribution des lésions dans les différentes régions du cerveau et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine pathologique. Un lot de 14 souris permet de disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour les analyses des lésions du cerveau, prélevés lorsque la maladie apparaît chez la souris. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs périphériques de la maladie dans ce modèle transgénique.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines, permettant l’inoculation stéréotaxique des fibrilles dans le striatum, qui sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie avant son délai d’apparition normale lors du vieillissement spontané de cette lignée, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques Townes développent une drépanocytose avec anémie et atteintes du foie, des reins et de la rate, et reçoivent des candidats médicaments ainsi que des prélèvements de sang répétés au sinus de l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que la complexité de la maladie impose d'en faire la preuve dans un "organisme intégré" et que le remplacement total par la culture cellulaire est impossible.

Objectifs

Il est aujourd’hui estimé qu’il naît chaque année dans le monde, plus de 300 000 enfants atteints de drépanocytose, une forme grave d’hémoglobinopathie à transmission autosomique récessive touchant le gène codant pour l’hémoglobine. La drépanocytose se caractérise par une altération de la forme native du globule rouge suite à la formation de polymères d’hémoglobine S mutée. Elle se manifeste des crises vaso-occlusives récurrentes et douloureuses ainsi que par une anémie hémolytique notamment dues à une inflammation vasculaire et un stress oxydant chroniques. Le caractère imprévisible des crises vaso-occlusives et les dommages tissulaires sévères et multifocaux subséquents rendent extrêmement difficile l'établissement d'un traitement efficace, expliquant pourquoi, à ce jour, il n'existe encore aucun traitement curatif applicable à l'ensemble de la population drépanocytaire. Il est donc nécessaire de continuer de développer des médicaments ciblant mieux les mécanismes d'action de la pathologie. Pour cela nous devons évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques pour mieux traiter la drépanocytose. La complexité de cette maladie nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme intégré comme l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de nouvelles molécules sur la physiopathologie de la drépanocytose dans un modèle murin transgénique développant la maladie. Dans ce contexte, nous évaluerons l'impact des molécules à tester sur l'érythropoièse, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'hématocrite, la falciformation des globules rouges, ou encore le dosage de l'hémoglobine. L’utilisation de la souris se fera en accord avec la règle des 3R (réduire, raffiner, remplacer). Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort et la douleur des souris seront mis en place dans chaque procédure afin de veiller à leur bien-être. Une étude préliminaire pilote permettra de s’assurer de la faisabilité des mesures des paramètres listés ci-dessus et sera suivie d’études principales dont l’objectif sera d’évaluer l’efficacité de futurs candidats médicaments, seuls ou en combinaison avec l’hydroxyurée. Ce projet de recherche nécessitera au total 380 souris sur 3 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients drépanocytaires. Ce projet permettra également de comparer de futurs candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, l’hydroxyurée. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression de la drépanocytose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins au sinus rétro-orbital, sous anesthésie isoflurane 3% et suivant une cinétique de prélèvement définis par le sponsor (en sachant qu'un prélèvement sanguin de 7,5% du volume total nécessite une semaine de récupération). Dans l'étude principale, les animaux recevront l'administration des composés à tester. La fréquence, la durée et la voie d'administration dépendra de la demande du sponsor (détails dans le rubrique Procédure 2). Sur animal anesthésié à l'isoflurane 3%, un prélevement en point final de sang sera effectué au sinus rétro-orbital. Puis un prélèvement d'organes (selon la demande du sponsor) aura lieu après mise à mort de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex- vivo.

Impact sur les animaux

Les effets indésiréables attendus sont ceux induits par le phénotype drépanocytaire spontanné des souris transgéniques Townes. Les souris Townes présentent une anémie, une demi-vie érythrocytaire raccourcie, une atteinte hépatique, rénale et splénique ainsi qu'une augmentation de l'érythropoïèse. Ces souris présentent un phénotype drépanocytaire dont l’ensemble des manifestations cliniques de la maladie serviront de paramètres d’évaluation d’efficacité de l’ensemble des composés pharmacologiques à tester, en les comparant et ou les combinant au traitement de référence, l’hydroxyurée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure et des prélèvements sont réalisés pour étudier l'effet du composé testé sur la physiopathologie de la drépanocytose.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la drépanocytose. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la maladie sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents (modèle Townes) pour permettre une recherche fondamentale et appliquée tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire pilote permettra de valider les paramètres à évaluer avant d'administrer les composés à tester dans l'étude principale et de confirmer la robustesse du modèle, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience, tout en prenant en compte la disponibilité du modèle transgénique Townes.

Raffinement

Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 6 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leur sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement en accord avec le comité de suivi du bien-être animal de notre établissement. et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Dans ce projet, les expériences in vivo sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance des composés mais également leur efficacité sur la physiopathologie de la drépanocytose. La souris a été choisie car le modèle Townes a été développé afin de reproduire au mieux génétiquement et cliniquement la pathologie drépanocytose. Les souris utilisées auront 7-8 semaines au début de la procédure afin d'avoir des souris adultes avec un système immunitaire mature et ayant développé la pathologie.