Rongeurs

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, puis elles subissent des prélèvements de sang hebdomadaires à la queue et des explorations auditives sous anesthésie, par otoémissions acoustiques et potentiels évoqués, pour mesurer l'atteinte de l'audition. Le porteur indique qu'une souris perdant plus de 20 % de son poids ou montrant un mal-être sera tuée, et que toutes seront tuées en fin d'étude pour prélever les os de l'oreille. Il affirme que ces tests fonctionnels sur l'audition ne peuvent se faire que sur l'animal vivant et qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer ce protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche CBA/J Rj (ayant une fonction auditive stable sur près de 2 ans).

Bénéfices attendus

Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.

Procédures

- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives sont effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).

Impact sur les animaux

Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).

Devenir

A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie de tous les animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).

Remplacement

Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez deux souches de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la STZ fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris CBA/J Rj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.

Raffinement

Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. Les explorations fonctionnelles seront effectuées sous anesthésie gazeuse. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, -une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence au document « points limites » (The reporting of clinical signs in laboratory animals), tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2. Les animaux seront habitués à la zone d’expérimentation et aux expérimentateurs la semaine suivant leurs arrivées avant la réalisation des tests et des injections. C’est une procédure habituelle avant toute expérmentation.

Choix des espèces

La souris de souche CBA/J Rj est connue pour posséder une fonction auditive stable sur près de 2 ans. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.

312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de tumeurs murines ou humaines, sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine MIF dans la réponse à l'immunothérapie anticancéreuse. Le porteur indique que la croissance tumorale sera limitée à 300 mm2 pour les tumeurs solides et que les animaux seront tués lorsque les points limites seront atteints, celles qui n'y parviennent pas étant considérées comme "protégées" et tuées elles aussi. Il justifie le recours à la souris par l'impossibilité de reproduire fidèlement l'environnement tumoral et par l'accès aux modèles transgéniques et humanisés.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur l’inhibition des points de contrôle immunitaires qui permet d’activer le système immunitaire et sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Ce projet est dans la continuité de nos études précédentes au cours desquelles nous avons montré que l’une protéine du système immunitaire, appelée MIF, peut contrôler les réponses anticancéreuses de type immunitaire du patient. Ce projet comporte deux parties : 1) Évaluation de la qualité du système immunitaire dans un contexte d’immunothérapie bloquant les immuno-checkpoints chez des souris avec une expression plus ou moins forte de MIF. 2) Étude de l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient donner des informations pour améliorer les immunothérapies en cancer.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a par objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant l’effet bénéfique de MIF dans l’activité des cellules T . Nos résultats ont démontré que la cytokine pro-inflammatoire MIF est essentielle pour la réponse à l’immunothérapie anti-PD-1 et l’immunothérapie par transfert adoptif en cancer. Nous avons aussi montré que cette réponse est potentiellement dépendante de l’expression élevée de MIF et que la basse expression de MIF pourrait avoir un effet délétère. Nous avons des agents thérapeutiques qui peuvent reverser l’effet d’une basse expression de MIF et potentiellement reverser l’effet délétère. Les résultats qui découleront de ce projet et permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Toutes les procédures seront réalisées lorsque les points limites seront atteints comme décris dans les procédures.

Impact sur les animaux

Les souris seront soit injectées avec des tumeurs murines (MC38,B16) dans les cas des souris 5CATT et 7CATT ou avec des tumeurs humaines (NALM6, Raji ou A549 ) pour les souris NSG. L’injection des tumeurs se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 300 mm2 pour les tumeurs solides et plus de 25% des cellules tumorales dans le sang (~3 semaines) dans le cas des tumeurs sanguines.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, lorsque les points limites seront atteints, tous les animaux seront mis à mort. Lorsque l’effet thérapeutique est étudié, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront considérés protégés et seront mis à mort également par anesthésie à l’isoflurane et dislocation cervicale.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’importance de MIF dans notre modèle et le potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats nous devons passer dans un modèle de souris pour étudier notre hypothèse dans l’environnement tumorale

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon univarié en raison de la taille des groupes. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permettant d’avoir une réelle puissance statistique. Les expériences ne seront réalisées que deux fois et les rates, et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les jours pour limiter leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolation du groupe, absence de toilettage). De plus les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également des points limites spécifiques seront appliqués. Ces mesures assureront le raffinement de l’étude

Choix des espèces

Il est impossible de nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique pour améliorer la maladie, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature

590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau sous anesthésie pour bloquer localement l'expression d'un gène ou implanter une canule, puis des séances d'imagerie fonctionnelle, une partie ayant les vibrisses d'un côté coupées pendant deux semaines. Le porteur indique que le blocage de ces gènes peut provoquer des troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs, et que la privation des vibrisses induit de l'anxiété et une altération de la mémoire à court terme. Il présente ce travail comme un moyen de mieux comprendre des maladies rares comme les syndromes de Rett, d'Angelman ou de l'X fragile, les souris étant tuées pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Les pathologies du système nerveux central ne sont que faiblement couvertes par les molécules thérapeutiques actuelles et l’efficacité des traitements est parfois limitée. Ce constat est d’autant plus flagrant en ce qui concerne les maladies neurologiques rares, qui sont des pathologies très sévères et handicapantes et particulièrement mal comprises. Mieux comprendre les symptômes observés dans ces pathologies constituerait une étape importante afin de guider le développement de nouveaux traitements, adaptés au fort besoin médical chez ces patients. Dans ce contexte, nous nous focalisons ici sur des pathologies orphelines neurologiques liées à la perte de fonction d’un gène, en particulier le syndrome de Rett, le syndrome d’Angelman, le syndrome de l’X fragile et la maladie de Niemann-Pick de type C. Ces maladies se développent dès l’enfance et provoquent des symptômes très invalidants (des troubles cognitifs, moteurs, sensoriels ou épileptiques notamment). Les traitements existants sont extrêmement limités actuellement et ne couvrent que peu de symptômes. Notre objectif est d’étudier par différentes techniques de neuroimagerie l’impact du blocage de l’expression des gènes responsables de ces maladies de manière locale dans le cerveau chez la souris. Cette étude permettra à la fois de répondre à des questions cruciales concernant le rôle respectif des gènes d’intérêt dans ces maladies, et de disposer de modèles animaux ainsi que de biomarqueurs d’imagerie permettant l’évaluation de futurs candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du systeme nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques pour lesquelles les rôles des gènes impliqués sont encore mal connus, et les mécanismes cérébraux conduisant aux symptômes sont peu établis. Notre stratégie consiste à étudier quelles sont les altérations de l’activité cérébrale qui sous-tendent les symptômes de ces pathologies. Les bénéfices attendus sont donc une meilleure compréhension de ces pathologies orphelines, et permettront de guider le développement de candidat-médicaments futurs grâce à l’identification des paramètres qui sont altérés de manière significative en imagerie.

Procédures

La quasi-totalité des animaux utilisés dans l’étude auront une unique intervention de chirurgie stéréotaxique, toujours sous anesthésie générale et analgésie d’une durée d’1h30 environ pour permettre : - L’injection stéréotaxique d’un vecteur permettant le blocage de l’expression d’un gène - Et/ou l’implantation stéréotaxique d’une canule pour l’imagerie par photométrie à fibre A la suite de cette intervention de chirurgie stéréotaxique des souris seront utilisées pour un unique examen d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui est non-invasif mais réalisé sous anesthésie générale (durée d’une heure). D’autres souris seront utilisées pour un total de deux examens d’imagerie fonctionnelle ultrasonore, toujours sous anesthésie générale, séparés par deux semaines. Pendant ces deux semaines, ces souris seront anesthésiées tous les deux jours pendant 5 minutes par isoflurane ; des souris auront les vibrisses coupées du côté gauche pendant cette anesthésie. Enfin, les souris implantées avec canule seront utilisées pour un unique examen d’imagerie photométrique, avec pour la plupart un examen de tomographie par émission de positons réalisé dans la foulée. La photométrie et la captation du radiotraceur se font chez la souris éveillée et libre de ses mouvements, puis l’imagerie par tomographie se fait chez la souris anesthésiée (pendant 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le blocage de l’expression des gènes en question sera susceptible de provoquer des symptômes neurologiques (troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs) chez les animaux. Néanmoins, comme ce blocage n’aura lieu que dans une petite zone (contrairement aux patients) nous prévoyons des troubles légers survenant quelques jours après l’injection, similairement à de précédentes études utilisant des approches similaires (par exemple des atteintes transitoires des réflexes, ou encore des troubles de la mémoire et des interactions sociales dans des modèles rongeurs du syndrome de Rett avec déficience localisée du gène). Concernant la privation des vibrisses d’un côté pour une des procédures, il est rapporté qu’une privation chronique des vibrisses droites et gauches produit des symptômes légers d’anxiété et d’altération de la mémoire à court terme. Des symptômes similaires pourraient survenir durant les 2 semaines de privation que nous envisageons. Les chirurgies telles que l’injection stéréotaxique des vecteurs ou l’implantation de la fibre peuvent causer une douleur, elles seront donc réalisées dans un état d’anesthésie générale, et sous analgésie.

Devenir

De part la nécessité de prélever les cerveaux pour des analyses post-mortem, tous les animaux à la fin des procédures seront mis-à-mort.

Remplacement

La complexité des pathologies étudiées ne peut pas être reproduite exclusivement par des modèles in vitro, dont l’utilisation est préalable à cette étude (l’efficacité des séquences shRNA est notamment évaluée au préalable sur des cultures cellulaires). Pour comprendre l’impact du blocage de l’expression des gènes d’intérêt dans le cerveau en conditions réalistes, il nous faut travailler chez l’animal vivant, afin de pouvoir établir des parallèles avec les maladies observées chez les patients et évaluer des processus physiologiques pertinents tels que la connectivité fonctionnelle entre aires cérébrales, ou encore la sensibilité à des stimulations sensorielles extérieures. De plus, ces travaux permettront d’établir des modèles animaux et des biomarqueurs in vivo pour l’évaluation de futurs candidats-médicaments, dont l’efficacité devra être vérifiée chez l’animal avant passage à l’humain.

Réduction

Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, le nombre d’animaux par groupe a été estimé à 8 sur la base d’un calcul de puissance statistique et nous prévoyons 2 animaux supplémentaires en cas d’échec éventuel de la chirurgie. Puis les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests statistiques selon les paramètres évalués. La validation du déficit local d’expression des gènes d’intérêt sera systématiquement effectuée au démarrage de l’étude pour vérifier l’impact des vecteurs sur les gènes d’intérêt avant toute utilisation des animaux en imagerie. Les mêmes animaux effectueront les examens d’imagerie comme la photométrie et la Tomographie par Emission de Positons de manière à réduire le nombre d’animaux final.

Raffinement

L’injection stéréotaxique sera réalisée sous anesthésie générale et locale, et analgésie générale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce a une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés au modèle. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boites ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce pour laquelle l’impact comportemental d’une inactivation des gènes d’intérêt est connu, parfois en lien avec des régions particulières du cerveau, ce qui nous apporte des informations précieuses sur les régions à cibler dans notre approche locale, et permettra une comparaison des données de la littérature avec nos propres résultats. A l’inverse, nos résultats seront intéressants pour la communauté scientifique car ils apporteront des informations spatiales et temporelles plus précises sur le rôle des gènes d’intérêt. De plus, la souris est une espèce idéale pour l’utilisation de notre dispositif d’imagerie cérébrale ultrasonore, car l’épaisseur restreinte du crâne permet un passage des ultrasons et une qualité d’imagerie suffisante dans des conditions non invasives. Des études précliniques ont montré que l’inactivation tardive de certains gènes chez la souris adulte produit un décours de la pathologie similaire à une inactivation embryonnaire. Pour d’autres gènes, plusieurs arguments suggèrent également une importance du maintien à l’âge adulte de ces gènes notamment pour le maintien de la plasticité synaptique. Cette question est cruciale sur le plan clinique étant donné que le diagnostic de ces pathologies survient habituellement tardivement par rapport au stade de développement du cerveau. Il est donc important de savoir si corriger le déficit d’expression du gène après une maturation avancée du cerveau peut suffire à améliorer la qualité de vie des patients. C’est pourquoi nous souhaitons utiliser des souris adultes afin de mieux caractériser le rôle de ces gènes d’intérêt à ce stade. Notre approche par injection locale de vecteurs est particulièrement adaptée à cette problématique puisqu’elle permet de contrôler à la fois la localisation et le moment où le gène devient déficitaire.

80 souriceaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À l'âge de deux jours, ils reçoivent une injection dans le cerveau de bleu de méthylène ou de solution saline sous anesthésie par hypothermie sur la glace, 60 étant tués juste après l'injection et 20 gardés jusqu'au sevrage. Le porteur indique que des pertes sont attendues du fait du jeune âge et du rejet des petits par la mère après l'injection. Cette étude ne teste aucun traitement, elle sert à caler le geste avant une future recherche de thérapie génique contre la sclérose latérale amyotrophique, et le porteur affirme que la souris reste un modèle "indispensable".

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre cette maladie, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent des troubles moteurs associés à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de la stabilité à long terme de l’expression des gènes thérapeutiques dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est donc de mettre en place des injections dans le cerveau chez la souris à l'âge de deux jours, pour permettre la libération de matériaux génétiques dans l'ensemble du système nerveux central. Dans cette étude pilote nous utiliserons du bleu de méthylène pour confirmer nos sites d'injections. Après la mise au point de ces injections, des injections avec des AAV seront réalisées dans un modèle de souris SLA, afin de valider l'effet thérapeutique (cette étude fera l'objet d'une demande d'autorisation séparée).

Bénéfices attendus

Ce projet méthodologique permettra de mettre en place un protocole pour des injections intracérébrales chez la souris à un stade de développement précoce. Cette étude pilote précède une étude de thérapie génique reposant sur l'injection de virus AAV dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique. A long terme, ce projet permettra de mettre en place de nouveaux traitements contra cette maladie incurable.

Procédures

Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec du bleu de méthylène ou une solution saline chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec

Impact sur les animaux

Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l'aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable.

Réduction

Cette étude pilote vise à acquérir le geste technique ainsi, pour la reproductibilité du geste technique et la justesse des coordonnées d'injections ainsi que l'étude de la survie des animaux, nous utiliserons 80 souriceaux : 60 sacrifiés immédiatement après les injections et 20 maintenus en vie jusqu'au sevrage. Il n'y aura pas d'analyse statistique.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites suivants : -Si une souris présente des difficultés respiratoires, se réveille et/ou présente des signes de douleur durant l'injection ou au réveil, elle sera mise à mort. Les animaux maintenus en vie jusqu'au sevrage seront surveillés quotidiennement. -Si 24h après les injections une souris ne présente pas de "poche de lait" dans l'abdomen, c’est-à-dire qu'elle n'a pas pu s'alimenter avec le lait de sa mère, elle sera mise à mort -Si une souris ne retrouve pas une température corporelle normale c’est-à-dire présente une couleur bleue/violacée après les injections ou lors du retour à la mère, elle sera mise à mort. Durant le développement des souris nous contrôlerons la présence de signes cliniques d’affaiblissement (poil hirsute, prostration, difficultés à se déplacer, difficultés à s’alimenter...) Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, pour valider notre protocole et confirmer les sites d'injection.

136 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses humaines dans la glande mammaire sous anesthésie, puis un gavage répété d'une molécule, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à établir un lien entre sénescence cellulaire et invasion tumorale, avec des retombées thérapeutiques renvoyées au long terme et à une "preuve de concept". Le porteur affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

La sénescence cellulaire ou vieillissement cellulaire est associée à un arrêt de la croissance cellulaire. Le cancer est considéré le plus souvent comme une maladie du vieillissement. La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) au cours de la cancérogenèse consiste à faire passer les cellules cancéreuses d’un état non agressif à un état agressif caractérisé par la capacité des cellules cancéreuses à se déplacer dans l’organisme et à former des métastases. La formation des métastases est responsable de 90% des décès des patients atteints de cancer. La sénescence et la TEM pourraient ainsi se produire dans les mêmes cellules cancéreuses, ce qui nous fait penser que la sénescence pourrait être un prérequis à la TEM. Notre projet vise à démontrer que la sénescence et la TEM peuvent se produire dans les mêmes cellules cancéreuses, à disséquer les régulateurs communs à ces deux processus, et à étudier si l'élimination des cellules en sénescence empêchera la TEM. Nous utiliserons différents types de cellules cancéreuses que nous cultiverons et que nous injecterons à la souris de façon à reproduire le développement d’un cancer dans un organisme entier. Les résultats obtenus seront validés à l'aide d'échantillons de cancers humains présentant une TEM. Différentes approches de biologie cellulaire seront utilisées pour manipuler la sénescence et la TEM.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet devraient établir fermement le lien entre la sénescence des cellules tumorales et la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), et fournir de nombreuses informations critiques sur le processus impliqué dans l'étape précoce de dissémination et d'invasion des cellules tumorales. Les travaux pourraient conduire à la découverte que la TEM et la sénescence cellulaire, pourraient être deux processus coexistant qui apparaissent et participent à une réponse biologique commune impliquée dans la dissémination et l'invasion précoces des cellules tumorales. La « preuve de concept » d'un lien direct entre la TEM et la sénescence cellulaire, aura un impact sur la biologie du cancer en reliant divers domaines d'investigation et en ouvrant de nouvelles voies de recherche. Ces travaux devraient également ouvrir la voie au développement de stratégies innovantes pour prévenir la progression précoce des tumeurs en ciblant la sénescence cellulaire. Les travaux devraient donc fournir des pistes prometteuses pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prévenir ou à retarder la progression tumorale et les métastases, augmentant ainsi la durée de vie des patients atteints de cancer. Ce projet devrait donc permettre de décrypter le rôle de la sénescence dans la TEM. À long terme, cela pourrait aider à identifier des médicaments ciblant les cellules en sénescence pour bloquer l’agressivité d’un cancer et ainsi la formation des métastases. Comprendre comment les métastases se forment est un enjeu majeur de santé publique, et notre projet devrait apporter des éléments dans la compréhension de la formation des métastases.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - une injection unique de cellules cancéreuses humaines dans la glande mammaire sous anesthésie générale (10-12 minutes/animal) ; - un gavage d’une molécule (ou son solvant) qui intervient 3 semaines après l’injection des cellules à raison de 5j/7 ou 3j/7 durant 1 à 7 semaines selon les groupes de traitements (1 minute/animal). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être une inflammation au site d’injection des cellules tumorales, une détresse respiratoire lors de l’anesthésie de l’animal, un amaigrissement de l’animal ou une gêne de l’animal en raison du développement de la tumeur. Les traitements seront administrés par gavage pouvant induire un stress léger mais non traumatique.

Devenir

A l’issue des temps de traitement prévus, les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans la progression tumorale qui est au cœur de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Le modèle d’injection intraductale des cellules tumorales à la souris SCID reste un des meilleurs modèles à ce jour pour étudier spécifiquement l’invasion tumorale in vivo

Réduction

Le projet impliquera un total de 136 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique (test de comparaison des portions binomiales) a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation (surveillance quotidienne 7j/7, contrôle des températures/hygrométrie, nombre d’animaux par cage, etc.), les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude la progression tumorale. Description du ou des modèle(s) : La souris SCID est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets d'anti-tumoraux sur des cellules humaines. Stade de développement : Les souris seront utilisées à 10 semaines d'âge après 1 à 2 semaines d’acclimatation au sein de l’établissement utilisateur. Cet âge est optimal pour notre étude. En effet, la formation des tumeurs in situ à 4 semaines et des tumeurs invasives à 10 semaines a été rapportée après injection intraductale des cellules tumorales mammaire à des souris SCID femelles âgées de 10 semaines.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation corporelle totale, une injection de cellules leucémiques ou de moelle humaine, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des cures de traitement injectées dans l'abdomen sur animal vigile, puis sont tuées pour analyser leur moelle osseuse. Le porteur indique que les souris porteuses de leucémie peuvent présenter des signes de souffrance selon la progression de la maladie. Il affirme que le modèle murin reste "indispensable", le contrôle d'une moelle saine traitée étant selon lui impossible à obtenir autrement.

Objectifs

Le génome silencieux (qui ne permet pas la production de protéines) représente plus de 50% du génome. Il est composé de fragments d’ADN capables de se déplacer dans le génome. Chez l’homme comme dans d’autres espèces animales, il est démontré que ces séquences peuvent interférer avec le génome codant pour des protéines avec un retentissement fonctionnel. Dans le cancer, les insertions de ces séquences dans des gènes suppresseurs de tumeurs peuvent être responsables de la cancérogénèse mais elles peuvent également interagir avec des séquences codantes de l’ADN pour produire de nouveaux antigènes (néoantigènes) spécifiques de la tumeur. Lorsqu’une séquence d’ADN ne doit pas être exprimée, la cellule le signale en marquant cette séquence avec une étiquette appelée méthylation. Ce phénomène de marquage est très présent sur le génome silencieux dans des maladies comme les leucémies aigues myéloïdes (LAM) limitant sa capacité d’interaction avec le reste du génome. A l’heure actuelle une partie des traitements utilisés dans ces maladies est connu pour avoir la capacité de retirer ce marquage. Notre hypothèse principale soutenue par des travaux préliminaires est que ces traitements pourraient favoriser l’interaction du génome silencieux avec le reste de l’ADN induisant des erreurs qui seraient faciles à repérer par le système immunitaire afin d’éliminer la maladie. L’objectif de ce projet est d’étudier de manière systématique l’expression du génome silencieux dans les leucémies aigues myéloïdes (LAM) soumis à un traitement. Il permettra tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes d’actions de ces traitements mais les erreurs favorisées par le traitement peuvent également constituer une source de cibles pour des thérapies spécifiques et contribuer à améliorer le pronostique effroyable de ces hémopathies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Sur le plan scientifique, il permettra la description fine des mécanismes d’action des traitements qui retirent les marquages sur l’expression du génome silencieux dans les LAM et permettra une comparaison à des moelles saines traitées, impossibles à obtenir en dehors du cadre murin. Il permettra également d’établir un modèle de souris atteintes de LAM d’origine humaine afin de pouvoir tester d’éventuels traitements spécifiques des cibles identifiées dans le cadre d’un autre projet. Sur le plan médical, il peut permettre la découverte de cibles thérapeutiques permettant l’amélioration du pronostic de ces hémopathies.

Procédures

Les souris seront soumises à une irradiation corporelle totale (1 fois) suivie d’une injection de cellules tumorales ou de moelle saine. Des prélèvements sanguins hebdomadaires seront réalisés sur une partie des animaux. Des traitements seront administrés aux autres animaux. Ces traitements seront injectés directement dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Deux cures seront réalisées avec 2 jours de repos entre chaque cure. Tous ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles. Les gestes seront inférieurs à 2 minutes pour les injections/prélèvements. L’irradiation des animaux n’excédera pas 5 minutes au total

Impact sur les animaux

La réalisation des injections et prélèvements peut être source de douleur pour les animaux au moment de la piqûre. Les souris étant irradiées, le risque de toxicité en particulier digestive est présent avec une durée de quelques jours. Cependant, la dose d’irradiation étant faible, ce risque est très modéré. Les souris étant injectées avec des leucémies aigues myéloides, elles peuvent présenter des signes de souffrance dans le cas d’une progression de la leucémie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences pour analyse post mortem de la composition de leur moelle osseuse

Remplacement

L’analyse transcriptomique sera au préalable réalisée sur les mêmes lignées de LAM traitées in vitro. Cependant, le contrôle nécessaire qui est celui d’une moelle saine traitée par les mêmes agents est impossible à obtenir en dehors de la souris, ce traitement n’étant administré qu’à des patients malades. Par ailleurs, ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement auquel est soumis la cellule tumorale. L’utilisation du modèle Souris reste donc indispensable pour le projet.

Réduction

Le nombre d’expériences et donc d’animaux utilisés seront réduits au minimum pour permettre la reproductibilité des phénomènes observés en assurant la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale du modèle employé. L’analyse statistique entre les différentes conditions s’appuiera sur l’étude de l’expression différentielle des gènes en utilisant des modèles de régression linéaires. Les organes hématopoïétiques (moelle osseuse et rate) seront analysés chez toutes les souris après mise à mort.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les 2/3jours afin d’assurer leur bien-être et pour monitorer les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des points-limites ont été établis et une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux.

Choix des espèces

Dans le cadre de notre projet, la souris est le modèle de choix pour ces expériences qui étudient la cancérogénèse et la recherche en thérapeutique du cancer. C’est la seule espèce présentant une souche exprimant les facteurs de croissances hématopoïétiques humains permettant une bonne prise de cellules myéloïdes à partir de moelle osseuse humaine saine dans un environnement médullaire proche de celui de l’être humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 12 semaines après la naissance). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris sur la croissance tumorale.