Rongeurs

3 000 micromammifères sauvages vont être capturés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés sur leur lieu de capture. Sur chaque animal vigile le porteur prélève du sang dans le sinus rétro-orbitaire, une biopsie d'oreille et des tiques, en moins de cinq minutes. Il indique un taux de mortalité de 1 à 2 % lors des captures, par hypothermie, choc cardiaque ou prédation dans les pièges. Le projet suit sur quinze à vingt ans l'exposition de ces rongeurs aux agents transmis par les tiques, dont la bactérie de la maladie de Lyme, et le porteur affirme que le remplacement ne peut être envisagé.

Objectifs

Les micrommamifères sauvages sont réservoirs de nombreux agents pathogènes transmis par les tiques qui peuvent entraîner des maladies chez l'homme, dont la borréliose de Lyme, l'encéphalite à tique (appelée aussi TBE), l’anaplasmose granulocytaire, la rickettsiose ou la neoerhlichiose. La densité de tiques infectées par ces différents agents pathogènes présente dans l’environnement est généralement utilisée comme une approximation du risque d’expositition de l’homme vis-à-vis de ces agents pathogènes. Elle varie en fonction de la saison et des années, en lien avec les variations des conditions météorologiques et des populations des hôtes. Très peu d’études de terrain ont été réalisées sur du long terme pour étudier les variations temporelles de la densité de tiques infectées par les différents agents infectieux et comprendre l’influence respective des conditions météorologiques et de la dynamique intra- et inter-annuelle des populations de micromammifères sur les densités de tiques infectées et donc sur le risque d’exposition à l’homme vis-à-vis de ces agents infectieux. L’objectif du projet est de réaliser un suivi long terme des populations de rongeurs (par espèce), de leur infestation par les tiques, de leur exposition aux agents infectieux étudiés et de la densité de tiques infectées par ces agents infectieux afin (i) d’étudier l’influence des conditions météorologiques et des densités de rongeurs sur les variations inter-annuelles de densités de tiques infectées et (ii) de modéliser le risque de contact et de transmission de l’Homme vis-à-vis de ces agents infectieux.

Bénéfices attendus

L’objectif long terme de ce projet est de déterminer l’influence respective des facteurs météorologiques et de densités de micrommamifères sur les variations inter-annuelles des densités de tiques infectées par différents agents infectieux d’intérêts afin de mieux prédire le risque d’exposition de l’Homme, en particulier pour Borrelia burgdorferi sl. (bactéries responsables de la maladie de Lyme). A moyen terme, il est prévu que les données collectées soit utilisées pour paramétrer un modèle mathématique de la transmission de Borrelia burgdorferi sl. à l’Homme. De plus, les données collectées permettront également d’apporter plus d’informations sur l’épidémiologie d’agents infectieux pour lesquelles les données existantes sont faibles (Anaplasma phagocytophilum, Rickettsia spp., Neoerhlichia mikurensis, TBEV), si ceux-ci sont présents dans la zone étudiée.

Procédures

Chaque animal, une fois par session, est immobilisé entre deux doigts au niveau de la nuque. Les prélèvements suivants sont réalisés sur animaux vigiles : prise de sang effectuée dans le sinus rétro-orbitaire, une biopsie de peaux d’oreille, prélèvements de tiques et identification par une puce. Le temps de manipulation n’excède pas 5 minutes, et l’animal est relaché au plus vite dans le milieu naturel sur son lieu de capture.

Impact sur les animaux

Les animaux sont soumis à un certain stress lors de la capture et de la manipulation (pesée, marquage, prise de sang rétro-orbital, biopsie, collecte de tiques). Pour limiter ce stress, la durée maximale de manipulation n’excèdera pas 5 minutes et les manipulateurs sont attentifs à la détection de points limites. Les animaux sont manipulés dans la matinée et sont relachés le plus rapidement possible sur leur domaine vitale grace à un quadrillage précis de la zone d’étude. Dans nos expériences précédentes de piégeage par méthode de capture-marquage-recapture, il est fréquent que des animaux soient recapturés trois nuits consécutives lors d’une même session de capture et durant plusieurs sessions, ce qui peut indiquer que la manipulation et les prélèvements réalisés n’ont pas induit d’effets négatifs à long terme sur certains individus. Un faible taux de mortalité (1-2%) lors des captures est généralement observé. La mortalité peut être liée à de l’hypothermie, un choc cardiaque lors de la manipulation et très ponctuellement à de la prédation dans les pièges par des martres ou fouines.

Devenir

Les animaux sont relachés sur leurs lieux de capture, dans le milieu naturel

Remplacement

Le but étant d’étudier la circulation des agents pathogènes au sein des populations de micromammifères dans leur milieu naturel pour mieux comprendre leur épidémiologie et le risque d’exposition pour l’Homme, le remplacement ne peut-être envisagé pour ce type de projet.

Réduction

Nous avons choisi de piéger sur trois sites différents distants de 1.5-2.5 km afin d’avoir trois réplicats au même moment. L’objectif est de réaliser ce suivi sur du très long terme (15-20 ans) sur ces trois sites afin d’avoir suffisamment de données pour l’analyse et mettre en évidence certains effets. Le nombre de pièges par site (100 par site), correspondant à un nombre attendu d’individu capturés variant de 30 à 300 individus pour une session selon les années de pullulations de micromammifères, a été défini afin d’avoir suffisamment de rongeurs capturés pour estimer leur exposition aux agents infectieux et leur infestation par les tiques au regard des contraintes matérielles et avec suffisammement de précision au moins pendant les phases de pullulation de rongeurs. Le nombre d’animaux maximum pour lesquels des prélèvements seront réalisés par session de capture est fixé à 300, nombre suffisant pour répondre aux objectifs de l’étude. Il permettra d’estimer des niveaux d’infestation par les tiques et des prévalences d’infection avec des précisions de 2 à 5% pour des prévalence d’infection attendues variant entre 5 et 30%.

Raffinement

Les animaux sont capturés la nuit par des pièges qui permettent de les maintenir à l’abri des intempéries et nous mettons à disposition des carottes et des graines de tournesol permettant un apport d’énergie (graines de tournesol) et d’eau (carottes) aux animaux capturés. Quand les animaux sont sortis des pièges, ils sont mis dans des gants de fouille (un individu par gant). Du papier est ajouté dans ces gants pour que les animaux puissent se blotir dedans et pour permettre d’absorber l’humidité (urines, …), de maintenir la température des animaux et de réduire leurs stress. Les animaux sont manipulés et relachés le plus rapidement possible sur leur domaine vitale grace à un quadrillage précis de la zone d’étude. Si les animaux sont capturés plusieurs fois au sein d’une même session, ils ne sont prélevés qu’une fois au sein d’une même session.

Choix des espèces

Cette demande porte sur l’étude dans le milieu naturel de la circulation des agents pathogènes vectorisés par les tiques au sein des populations de micromammifères. Le stade de développement influence le niveau d’infestation des tiques et le statut d’infection, et pour en tenir compte dans l’analyse à l’échelle individuelle et populationnelle, les animaux de tous les stades de développement seront étudiés.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour pendant dix jours un gavage ou une injection intrapéritonéale, subissent deux tests de tolérance au glucose, une coupure d'un à deux millimètres au bout de la queue et un prélèvement sanguin, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le projet vise à comprendre l'effet anti-hyperglycémiant de paraprobiotiques en vue d'un complément alimentaire pour l'homme. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "nécessaire", aucun modèle in vitro ne simulant selon lui les interactions entre organes qui règlent la glycémie.

Objectifs

Des résultats préliminaires ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de bactéries non pathogènes naturellement présentes dans l’intestin, inactivées par la chaleur (appelé paraprobiotiques) et d’un métabolite dérivé de la sérine (présent chez les bactéries et les plantes) dans un modèle in vivo de prédiabète induit par un régime riche en graisse mais également dans un modèle de souris saine. Un des objectifs de notre projet est de déterminer le mécanisme biologique impliqué dans cet effet anti-hyperglycémiant. Ce projet a pour objectif final le développement d’un complément alimentaire pour prévenir le prédiabète et ainsi le développement du diabète. Pour ce faire, plusieurs paraprobiotiques ainsi que des métabolites dérivés de la sérine seront administrées par gavage ou injection intrapéritonéale à un modèle de souris saines afin d’élucider le mécanisme d’action et les tissus cibles mis en jeu.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de determiner le mécanisme mis en jeu par les bactéries sélectionnées ou le métabolite bactérien dérivé de la sérine pour obtenir cet effet anti-hyperglycémiant. La mise en evidence de ce mécanisme est incluse dans un projet de maturation qui vise, à terme, à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir de ces paraprobiotiques et/ou de ce métabolite. Ce complément alimentaire jouerait un rôle anti-hyperglycémiant au stade de pré-diabète et permettrait ainsi de prévenir le développement du diabète.

Procédures

Les animaux seront gavés ou recevront une injection en intra-péritonéale quotidiennement pour une durée totale de 10 jours (deux fois 5 jours). Les animaux seront soumis également à deux tests de tolérance au glucose (test de tolérance orale (gavage oro-gastrique du glucose, de quelques secondes) ou test de tolérance avec injection de glucose en intra-péritonéale (de quelques secondes). Pour ces tests de tolérance au glucose les souris subiront une petite coupure unique à l’extrémité de la queue de 1 à 2mm (1 seconde). Un prélèvement de sang sera effectué sur animaux vigiles, au niveau de la veine submandibulaire une seule fois avant de l’euthanasie (15 secondes). Les animaux seront mis à jeun des animaux avant les tests (6h) en période diurne.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur un temps très court (moins de 10 secondes) au cours de la contention nécessaire lors des gavages et à de l’injection en IP sur une période de 5 jours. Les gavages et l’IP seront réalisés par du personnel expérimenté. D’après les résultats préliminaires du laboratoire, ces gavages avec les différents composés n’induisent pas de perte de poids. Le poids des souris sera de plus contrôlé deux fois par semaine. Comme nous devrons mettre les souris à jeun avant les tests de tolérance orale au glucose, afin d’éviter une période de jeûne trop drastique, celui-ci ne sera pas réalisée durant la phase nocturne mais en phase diurne durant 6h.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de chaque procédure et certains de leurs organes et tissus seront prélevés pour des analyses, ncessaires au projet.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans la régulation de la gycémie d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus du système digestif (l’intestin) et des organes internes impliqués dans la régulation des taux de glucose dans le sang (pancréas, foie et muscle).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80%) compte-tenu de la variabilité connue du paramètre « glycémie » mesuré. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris contrôles et de souris traitées avec la metformine pour les deux expériences de la procédure 1 et le même groupe de souris contrôles pour les deux expériences de la procédure 2 afin de réduire le nombre d’animaux utilisés : au total 2 groupes de 12 souris contrôles et 2 groupes de12 souris traitées avec de la metformine sur les deux procédures = 48 souris au lieu de de 4 groupes de 12 souris contrôles et 4 groupes de souris 12 traitées avec de la metformine sur les deux procédures, soit 96 souris (nombre divisé par 2). Des études de biochimie sur des bactéries disponibles au laboratoire nous ont permis d’identifier des protéines de la surface des paroies bactériennes potentiellement intéressantes dans le contexte de la régulation de la glycémie (ces protéines ont des structures proches d’une autre protéine bactérienne connue pour ses effets améliorateurs de la glycémie). Ces protéines sont présentes sur huit souches d’intérêt (alors que nous disposons d’une collection de 40 souches donc cela nous a permis de réduire le nombre de paraprobiotiques à tester). Des points limites ont été définis pour chaque procédure.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d’un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés 2 fois par semaine (surveillance visuelle plus suivi du poids). Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limites entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie. Les souris seront 3 par cage pour éviter l'isolement et réduire le stress.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques en raison de ses réponses reproductibles due à une moins grande variabilité individuelle. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons choisi de travailler sur des animaux de 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.

40 souris vont être utilisées, gardées vivantes pour être réutilisées ensuite dans d'autres expériences, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant six jours un régime supplémenté en tamoxifène, qui peut leur faire perdre du poids, puis passent un test de mémoire consistant en une tâche motrice d'environ une heure deux jours de suite. Le porteur admet ne pas savoir si la perte de poids tient à l'appétence des aliments ou à des effets métaboliques. Il affirme qu'il n'est "pas possible" d'étudier la mémorisation pendant le sommeil autrement que sur des animaux vivants.

Objectifs

Le TNFα produit par les microglies contrôle l'activité des synapses inhibitrices dans le cortex et de ce fait, modifie certains paramètres du sommeil comme la structure des ondes lentes. Les ondes lentes sont necessaires à la consolidation de la mémoire par le sommeil. L'objectif de ce projet de montrer le TNFα microglial est necessaire à la consolidation de la mémoire par le sommeil

Bénéfices attendus

Quasiment toutes les pathologies du cerveau sont accompagnées de troubles du sommeil. D'autre part, toutes ces pathologies présentent des signes d'inflammation du cerveau, c'est-à-dire d'activation des cellules microgliales. Notre projet propose d'étudier le lien entre l'activation microgliale et les troubles du sommeil.

Procédures

Les souris seront exposées pendant 6 jours à un régime supplémenté en tamoxifen. Il est possible qu'elles perdent du poids pendant cette période. Nous n'avons pas identifié si cette perte de poids est due aux aliments qui seraient moins appétant ou à ses effets métaboliques. Les animaux feront ensuite un test de consolidation de la mémoire qui consiste en une tache motrice pendant environ 1h deux jours de suite

Impact sur les animaux

Il est possible que les animaux perdent du poids de manière transitoire lors du changement de régime. La manipulation des souris et le test d'apprentissage lui même sont susceptibles d'engendrer du stress et de l'inconfort aux souris.

Devenir

À l'issue des tests comportementaux, les animaux seront remis en cage de maintien sans autre manipulation. Aucune euthanasie ou prélèvements ne sera nécessaire dans le cadre de ce projet. Les animaux pourront être réutilisés par la suite dans d’autres expériences.

Remplacement

Il n'est pas possible d'étudier la mémorisation pendant le sommeil autrement que sur des animaux vivants.

Réduction

Nous utiliserons 40 souris soit deux groupes de 20 animaux. C'est selon l'article sur lequel nous fondons notre étude et les expériences précédentes d'apprentissage réalisées dans le laboratoire, le nombre minimal pour arriver à des résultats significatifs. Les resultats seront analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les souris sont stabulées en cages ventilées et leur milieu est enrichi par des copeaux de carton. Elles sont controlées tous les jours par du personnel compétent et seront sorties du protocole si elles atteignent un point limite. Pour réduire au maximum l'inconfort et le stress des souris, elles seront habituées à être manipulées tous les jours de la semaine précédent l'experience. Le jour de l'expérience, elles seront introduites dans la salle d'expérimentation 1h avant le début du test et celui-ci ne dure pas plus d'un heure, pour ne pas perturber trop leur sommeil. Enfin, l'appareil sur lequel se fera le test est concu pour que les souris qui ratent leur essai ne tombent que de quelques centimetres pour diminuer le stress lié à l'essai et les risques de blessures.

Choix des espèces

Travailler sur la souris permet de travailler dans la continuité de nos études précédentes. Puisque notre but est ici d'étudier le role du TNFα produit par la microglie, nous n'avons comme seul outil disponible les outils génétiques chez la souris. Les expériences se feront sur des jeunes adultes entre 2 et 5 mois qui est une période classique d'étude des comportements d'apprentissage liés au sommeil.

972 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie appartient à des lignées privées d'une ou deux copies des gènes CYP24A1, SLC34A1 ou SLC34A3, et les souris subissent avant le sevrage l'amputation de phalanges, une au plus par patte, puis jusqu'à trois isolements de 96 heures en cage métabolique, jusqu'à six anesthésies par injection, quinze administrations orales en un mois et jusqu'à trois prises de sang, avec un suivi jusqu'à 12 mois. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu chez les souris homozygotes, pourtant hypercalcémiques, et prévoit malgré tout des points limites comme l'incapacité à s'alimenter ou un poids inférieur de plus de 15 %. Le bénéfice qu'il met en avant est de "faciliter les études de toxicité préclinique de notre molécule", et il écarte le remplacement en affirmant que la souris est un "organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique".

Objectifs

Ce projet de recherche transversale vise à caractériser l'évolution d'une maladie rare, l'hypercalcémie induite par des excès de vitamine D, et de déterminer l'effet d'un nouveau traitement pour cette maladie sans traitement efficace à ce jour. Pour cela nous caractérisons les souris ayant une inactivation homozygote des gènes dont les variants homozygotes (CYP24A1, ou SLC34A1 ou SLC34A3) ont été identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des excès de vitamine D. De plus, les effets de la perte d'un seul allèle seront déterminés pour la 1ère fois dans cette étude.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans ce projet permettront d'améliorer le diagnostic et la prise en charge clinique des patients portants des variants homozygotes. De plus, cela permettra de conclure sur l'effet de l'état hétérozygote de ces gènes, la litterature étant très discordante sur ce point. Enfin, les résultats obtenus chez les souris traitées permettront de faciliter les études de toxicité préclinique de notre molécule, et donc accélérer le developpement de ce candidat médicament.

Procédures

Phalangectomie avant sevrage (10 sec), isolement pendant la mise en cage métabolique (minimum 96h ; maximum 3*96h sur 3 mois) administrations IP pour anesthésie (minimum 1, maximum 6 sur 3 mois, 15 sec par administration), administrations per os (15 sur 1 mois, 15 sec par administration), prélevements sanguins sur animaux anesthésiés (minimum 1, maximum 3 sur 3 mois, 30 sec par prise)

Impact sur les animaux

Les animaux homozygotes sont hypercalcémiques, mais d'après nos expériences précedentes, aucune nuisance ni d'effet indésirable ne sont attendus (e.g. pas de perte de poids, pas de difficulté motrice, pas de signe de souffrance). A ce jour, les souris hétérozygotes n'ont pas été décrites comme hypercalcémiques. Durant la collecte des urines, un stress sera lié à l'isolement dans les cages métaboliques. Aucun effet indésirable n'a été observé précedement chez les souris traitées avec notre molécule.

Devenir

Afin de caractériser l'évolution de la maladie et les effets de notre molécule sur les paramètres biochimiques urinaires et sanguins, l'expression de gènes/protéines et au niveau histologique, tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés et conservés pour des analyses.

Remplacement

L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. La compléxicité de ce réseau ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.

Réduction

L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux par groupe (6 males et 6 femelles) est le nombre d'animaux optimale afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%. Les tests utilisés seront soit paramétriques soit non paramétriques, dépendant de la normalité des valeurs obtenues. Au maximum, 4 doses seront utilisées. Si la molécule n’est pas efficace à une dose donnée, les doses inférieures ne seront pas testées. Les facteurs comparés seront les paramètres biochimiques urinaires et sanguins et l'expression de gènes/protéines.

Raffinement

Afin de minimiser le stress des souris qui seront isolées en cage métabolique, une phase d’habituation de 3 jours précède le test de 24h à proprement dit. Une partie des souris utilisées dans cette étude étant hypercalcémiques, des modalités de suivi de l’état de santé, des critères d’arrêts ainsi que des points limites seront mis en place (i.e. absence de gain de poids à la puberté, incapacité à s’alimenter, poids inférieurs de plus de 15 %, poils hérissés). Si nécessaire, des analgésiques pourraient être administrés selon les recommendations vétérinaires. L’expertise du laboratoire sur l’étude des voies de signalisation de la vitamine D chez la souris permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Le nombre d’amputations sera limité à une seule phalange par patte, ne concernera pas le pouce et autant que possible, les pattes postérieures seront privilégiées pour ne pas compromettre la préhension fine que l’animal exerce avec ses pattes antérieures pour manger, se toiletter, interagir et grimper à la grille du couvercle de la cage. Afin de limiter le stress des animaux lors des études longitudinales, ces derniers ne seront placés que 3 fois maximum dans les cages métaboliques, avec une distance de 28 jours entre 2 prélèvements. Lors des prises de sang, un volume équivalent de sérum physiologique sera administré en sous cutanée.

Choix des espèces

L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes finement régulés régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leur similitude avec les mécanismes chez l'Homme. De plus, les variants identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des exces de vitamine D induisent également cette pathologie chez la souris. Ainsi, le modèle murin est un modèle pertinent pour cette étude. Après le sevrage (4 semaines) et jusqu'à 12 mois, l'objectif étant de déterminer l'évolution de la maladie. Pour le traitement, cette pathologie étant une maladie affectant les enfants dès leur naissance, les souris seront traitées après le sevrage pendant 1 mois.

32 souris vont être infectées par Plasmodium berghei, un parasite du paludisme des rongeurs, et chacune des souris du second lot subit une prise de sang à la queue et une pesée tous les deux jours pendant 30 jours, soit une quinzaine de piqûres. Le jour de leur mise à mort, elles reçoivent une injection intrapéritonéale de bleu Evans qui marque les tissus endommagés, puis sont anesthésiées et tuées par dislocation cervicale, tandis que les 2 souris du premier lot sont vidées de leur sang sous anesthésie dès 7 % de parasitémie, puis décapitées pour récupérer leur cerveau. Le porteur classe ces procédures à un niveau de souffrance modéré, indique que le parasite tue les souris BALB/c au-delà de 80 % de parasitémie et situe les bénéfices attendus dans la "confirmation des résultats in vitro" pour des molécules conçues contre la tuberculose ou des vers parasites. Le second lot compte 35 souris dans la description des procédures et 30 dans la justification de leur mise à mort, et seul ce dernier chiffre s'accorde avec le total de 32.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans un repositionnement médicamenteux. Il vise à déterminer l'efficacité de molécules initialement utilisées pour traiter la tuberculose, des fascioloses ou bien encore des helminthiases, en tant qu'antipaludiques. Lesdites molécules ont préalablement été testées in vitro et sont issues des dernières générations de molécules produites pour les infections précédemment mentionnées. Elles présentent un intérêt chimique car elles n'appartiennent à aucune des familles chimiques antipaludiques déjà utilisées. L’injection au niveau abdominale de bleu evans permet, 1H avant la mort des souris, de marquer les tissus ayant subi des dommages et de les quantifier. Ces tissus sont récupérés après l’euthanasie et soigneusement conservés dans du formamide.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus résident dans la confirmation des résultats in vitro. Une évaluation de la quantité de molécules candidates restantes dans le sang après injection totale est un point important de l'évaluation in vivo pour savoir si ces molécules sont plus ou moins éliminées pendant l'infection. Ce projet permettra de mettre en évidence l'efficacité de nouvelles molécules dans la thérapeutique antipaludique

Procédures

Un premier lot de 2 souris subit un prélèvement veineux à la queue - tous les 3 jours pendant 10 jours et à partir de 7% de parasitémie, une anesthésie et un prélèvement rétro orbitaire seront réalisés - la totalité du sang sera prélevé. Les souris seront euthanasiées (durée 30 minutes) et décapitées pour récupérer les cerveaux intacts. Un autre lot de 35 souris subiront des prélèvements veineux à la queue - tous les 2 jours à compter de J2 (post infection) pendant 30 jours accompagnés de pesée tous les 2 jours à compter de J1 (post infection) pendant 30 jours - Jour de l'euthanasie injection de bleu Evans en ip 50 µL à 50mg/kg, incubation 1h maximum puis anesthésie et dislocation cervicale permettant de collecter le cerveau, le sang et les autres organes. Cocktail kétamine xylasine pour des souris de 18g ; tel que : 100 mg/kg de Kétamine et 10 mg/kg de xylazine.

Impact sur les animaux

Les molécules évaluées sont des molécules qui ont déjà été testées sur des rongeurs ou lagomorphes pour la cytotoxicité et la reprotoxicité et ayant conduit à leur autorisation de mise sur le marché dans le cadre de traitement humain (sutézolide) et vétérinaire (triclabendazole). Les doses utilisées sont en dessous du seuil de toxicité décrits dans la littérature. L'infection par Plasmodium berghei conduit à la mort chez les BALB/c pour des parasitémies supérieures à 80% néanmoins le choix de ce modèle réside également sur le fait que ces souris résistent très bien à des parasitémies élevées en affichant un tableau clinique facile à suivre. Les nuisances correspondent à des contentions, des piqures au niveau de la queue pour prélèvement, des injections intrapéritonéales et l’injection de médicaments candidats pour l’expérience. Dans le modèle de paludisme murin, les souris auront des parasitémies qui à taux elevé (>75%) peuvent entrainer une anémie donc une perte de mobilité et une perte de poids transitoire

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées. L’euthanasie se justifie par le prélèvement de la totalité du sang infecté pour le premier lot de 2 souris - il est également justifié pour le second lot de 30 souris ce qui permet de récupérer rapidement les organes vitaux des souris et le sang pour dosage médicamenteux. Les souris ne peuvent plus être infectée en raison des restes de médicaments et de la prise de poids

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de solution viable de remplacement pour le moment. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée par la complexité de la pathologie étudiée, le paludisme. Cette infection parasitaire touche les hématies et l’augmentation de la parasitémie entraine un tableau clinique complexe au niveau des différents organes en raison de l’anémie progressive et l’inflammation croissante liées à l’infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être d’étudié dans des systèmes in vitro, ou des bioréacteurs élaborés.

Réduction

La réduction fait partie de notre stratégie d'étude. Elle repose sur une étude bibliographique pour connaitre les dernières études pharmacologiques et antipaludiques en paludisme simple. Le calcul du nombre de sujets dans des groupes de même effectif est donné par une formule mathématique, pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux groupes avec un risque de première espèce alpha égal à 5% et une puissance de 80% Nous prenons 6 souris, tq trois mâles + trois femelles par groupe

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet puisqu’ il est évalué dans notre grille de score. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Les animaux seront hébergés en conditions standard d’animalerie, avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Ils bénéficieront d’une période de stabulation de 5 jours post livraison dans l’animalerie de l’Etablissement utilisateur, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. La Kétamine (100 mg/Kg) et la Xylazine (10 mg/Kg) avec une injection de 100µL pour 20 grammes de masse corporelle seront utilisés afin de limiter la douleur, notamment pour le retro orbitaire (procédure 1) et les anesthésies avant dislocations cérébrales en fin de procédure 2. De façon générale, Des aiguilles plus fines 29 gauge pourront être utilisées en complément d’une pommade (lidocaine) si les sites d’injection en intrapéritonéal deviennent sensibles pour les souris. En cas de difficulté d'alimentation des croquettes imbibées et des biberons aux tétines plus faciles d'accès peuvent etre également mis en place.

Choix des espèces

Le modèle murin (Mus muculus) est choisi car il est un support idéal pour l'infection par Plasmodium berghei. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris BALB/C pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 60 à 70%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. la simplicité et l'efficacité du modèle {BALB/c+Plasmodium berghei} en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique.

288 souris transgéniques développant une maladie du foie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant 28 jours, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît que le gavage sur animal vigile peut provoquer un stress et, rarement, des lésions de l'œsophage. Il vise une "preuve de concept" de l'effet d'un probiotique sur la cholangite sclérosante primitive, dont la transposition à l'homme reste hypothétique, et affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

La cholangite sclérosante primitive (CSP) est une maladie chronique du foie affectant les voies biliaires, souvent associée à une maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI). Plusieurs études ont démontré l’importance du microbiote intestinal dans le développement des MICI et de la CSP. Nous avons identifié une bactérie commensale du microbiote intestinal possédant des propriétés anti-inflammatoires, qui utilisée comme probiotique de nouvelle génération, a un effet bénéfique sur les MICI. Le but de cette étude est d’évaluer l’effet de cette bactérie sur la CSP, en utilisant un modèle murin transgénique qui développe spontanément une pathologie du foie qui mime la CSP. Nous traiterons ces souris en leur administrant le probiotique quotidiennement par voie oral. Nous analyserons leur microbiote intestinal avant et après administration du probiotique afin d’évaluer l’impact de ce traitement sur le microbiote. Nous comparerons le foie des souris traitées par le probiotique au foie des souris traitées par placebo pour évaluer l’effet de la bactérie sur les manifestations de la CSP. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP.

Bénéfices attendus

La cholangite sclérosante primitive (CSP) est une maladie grave exposant au risque de cirrhose et de cholangiocarcinome. Actuellement, le seul traitement efficace de la CSP est la transplantation hépatique. Or ce traitement est réservé aux patients avec une maladie avancée et n’est pas toujours possible en cas de cancer. Il est donc primordial d’étudier d’autres pistes thérapeutiques. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP et son éventuelle transposition à l'homme dans le cadre du traitement de la CSP.

Procédures

Les animaux seront produits au sein de l’établissement. A 4 semaines, ils seront soumis à un gavage quotidien sur animal vigile (15 secondes/animal) durant 28 jours. A l’issue de la période de traitement (4 semaines), les animaux subiront un prélèvement sanguin terminal unique sous anesthésie profonde (5 minutes) puis seront immédiatement euthanasié sans réveil de l’animal.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris transgénique développe une cholangite sclérosante primitive avec le temps, nous utiliserons ici des animaux jeunes adultes dans lesquels les lésions du foie sont déjà présentes mais à un stade débutant n’entrainant aucun symptôme pour l’animal. Le gavage quotidien sur animal vigile peut être source de stress et d’inconfort pour l’animal. De façon extrêmement rare, il peut induire des lésions traumatiques de l’œsophage. L’administration de la bactérie ne devrait pas entrainer de nuisance en dehors du geste technique (gavage).

Devenir

L’ensemble des animaux (n=288) sera euthanasié à la fin de la période de traitement afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements d’organes et analyser le potentiel effet bénéfique du traitement sur la CSP.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour reproduire les interactions foie-intestin mises en jeu dans le développement de la CSP, et l’effet bénéfique potentiel d’un probiotique. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec ces interactions inter-organes et tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec modèle animal (souris transgéniques) reconnu pour cette maladie biliaire afin d’évaluer les effets bénéfiques in vivo d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 288 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie si les actes le nécessitent). Dans ce projet, l’administration de la bactérie ne devrait pas entrainer de nuisance en dehors du geste technique (gavage sur animal vigile) mais plutôt un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression de la maladie du foie. De plus, le fait que ce geste soit pratiqué par une personne formée et expérimentée ainsi que l’utilisation de matériel adapté permettent de réduire significativement les nuisances liées au geste technique lui-même.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Le projet a pour objectif d'évaluer le potentiel bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération dans la CSP. Afin de répondre à cet objectif nous allons utiliser le modèle animal reconnu pour cette maladie biliaire qui est représenté par un modèle de souris invalidé pour un gène qui modifie la composition de la bile (modèle préclinique le mieux validé de CSP). Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP et son éventuelle transposition à animal/homme dans le cadre du traitement de la CSP. Justification des stades : Dans la grande majorité des études précliniques, les souris transgéniques modélisant la CSP sont traitées entre l’âge de 4 semaines, stade des lésions débutantes, et 8 semaines, stade auquel les lésions atteignent un plateau. Nous suivrons ce schéma validé dans de nombreuses études et débuterons ainsi le traitement chez des souris âgées de 4 semaines lorsque les lésions hépatiques sont débutantes, et ainsi accessibles à un traitement qui permettrait de freiner leur évolution. Justification du sexe : Chez la souris, comme chez l’Homme, la gravité des lésions hépatiques est variable en fonction du sexe. De plus, le même traitement peut avoir une efficacité variable en fonction du sexe. En effet, dans un projet précédent nous avions obtenu des résultats différents chez les souris mâles et les femelles. C’est pourquoi, il est nécessaire d’inclure dans ce projet 50% de souris mâles et 50% de souris femelles.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins sur animal vigile, une irradiation destinée à les rendre aplasiques, des greffes de cellules souches, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et une induction de lymphome par des globules rouges de mouton et du tamoxifène, les animaux étant tués dès une perte de poids de 20 % ou un gonflement abdominal. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans un cancer du sang humain et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le porteur affirme que la souris est un modèle "irremplaçable" et qu'"aucun autre système" ne peut s'y substituer.

Objectifs

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) est un groupe de cancers du sang qui se disséminent dans les organes lymphoïdes. Il est très agressif et la survie du patient atteint de DLBCL se compte en nombre de mois en absence de traitement. Malgré des traitements standards efficaces, environ 30 à 40 % des patients atteints de DLBCL meurent de leur maladie. Ce manque d'efficacité thérapeutique contre le DLBCL a été attribué entre autres par la présence de cellules immunitaires d’origine myéloïde. Ces cellules myéloïdes pourraient participer à la survie et au maintien des cellules tumorales chez des patients atteints de DLBCL, et pourraient aider les cellules tumorales à échapper à la reconnaissance immunitaire, donc pourraient contrecarrer les bénéfices des thérapies administrées aux patients. Jusqu’à présent, toutes les études visant à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans le DLBCL portaient sur des échantillons prélevés sur des patients atteints de DLBCL. Cependant, les accès aux biopsies sont limités : les biopsies ne sont pas fréquentes, et pour celles qui nous parviennent, elles ne contiennent que peu très peu de cellules myéloïdes et tumorales, et ne nous permettent pas de poursuivre des analyses expérimentales poussées. Ainsi, ce projet vise à développer des modèles de DLBCL chez la souris afin de déterminer comment, au cours de la progression tumorale, les cellules myéloïdes alimentent l’expansion des cellules tumorales. Les objectifs de ce projet sont : 1) Analyser les populations de cellules myéloïdes infiltrant les organes atteints par les cellules tumorales ; 2) Déterminer le rôle des populations myéloïdes dans le maintien de la survie des cellules tumorales ; 3) Identifier des cibles thérapeutiques exprimées par les cellules myéloïdes, et les valider expérimentalement. Ce projet en expérimentation animale est critique pour avancer sur notre compréhension du lymphome agressif DLBCL chez l’homme, contre lequel les traitements actuels ne sont pas efficaces à 100%.

Bénéfices attendus

Ce projet en expérimentation animale est essentiel pour plusieurs raisons : - il permet de mieux comprendre comment les cellules myéloïdes favorisent la persistance des cellules tumorales, et la résistance des patients atteints de DLBCL aux thérapies anti tumorales utilisées actuellement en clinique. - il participe à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques présentes sur ces cellules myéloïdes, qui pourraient être spécifiquement ciblées et/ou neutralisées en clinique pour améliorer les traitements actuellement appliqués, et qui restent sans effet chez des patients DLBCL. - il permet de valider l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements de DLBCL sur des modèles précliniques murins.

Procédures

En ce qui concerne les interventions, aucune intervention chirurgicale n’est prévue dans ce projet. Des prélèvements sanguins via la veine sous maxillaire sont effectués sur animaux vigiles (540 animaux). 560 animaux seront irradiés. Quant aux gestes techniques, le projet comprend des injections intraveineuses et sous-cutanées sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane et oxygène) (972 animaux), des injections par voie intrapéritonéale (772) sur animaux vigils selon la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Dans ce projet d’expérimentation animale, nous réalisons plusieurs gestes techniques nous amenant à : 1) administrer de cellules de lymphome d’origine murine; 2) irradier des animaux pour les rendre aplasiques et pouvoir reconstituer leur système immunitaire avec des cellules souches hématopoïétiques modifiés; 3) effectuer des administrations par voie intraveineuse de cellules immunitaires purifiées; 4) administrer un inhibiteur du développement des cellules myéloïdes par la voie intra-péritonéale, ou administrer des inhibiteurs de la vascularisation des tumeurs par la voie sous-cutanée; 5) induire des lymphomes B par administration de globules rouges de mouton et de tamoxifène. Toutes ces procédures nécessitent de la contention à l’origine d’un stress passager de l’animal (5 minutes). Les procédures impliquant l’administration d’un traitement par voie intrapéritonéale sur animaux vigils entrainent une douleur locale de 2 secondes causée par la piqure de la seringue. Toute autre administration (voie intraveineuse ou sous-cutanée, prélèvements sanguins) se réalise sur animaux anesthésiés et ne provoque pas d’inconfort le temps de la manipulation. Les injections intraveineuses et les prélèvements sanguins par voie rétro-orbitales entrainent un inconfort passager (5 minutes) de l’oeil qui est soignée par l’application d’un gel oculaire dès la fin de la procédure. L’irradiation n’entraine aucun effet indésirable dès lors que les animaux reçoivent une greffe de cellules souches hématopoïétiques suivie d’un traitement antibiotique continu de 4 semaines. L’immunisation par des globules rouges de mouton et le transfert adoptif n’entraine aucun effet indésirable sur le long terme. L’administration de tamoxifène peut entrainer une perte de poids de 10% le temps du traitement (ici, 9 jours). La croissance tumorale du lymphome peut entrainer une perte de poids dans 10% des cas ou un gonflement abdominal. La mise à mort des animaux concernés sera appliquée dès lors que la perte de poids atteindra 20% du poids total, ou qu’un gonflement abdominal est observé.

Devenir

Les animaux (mus musculus) sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements de plusieurs organes, et effectuer des analyses biologiques en laboratoire.

Remplacement

Il nous est à ce jour impossible de recréer grâce à des modèles informatiques ou des modèles de culture cellulaire tous les facteurs physiologiques et environnementaux permettant à une tumeur de se développer, d’être irriguée par le sang, drainée par la lymphe, de modifier son environnement, et d’interagir avec les cellules du système immunitaire. Ainsi aucun autre système ou modèle actuellement disponible ne peut se substituer au modèle murin, modèle animal irremplaçable pour notre projet.

Réduction

Des résultats fiables sont obtenus avec 5 animaux par groupe expérimental, et pour des expériences répétées deux fois. Tous les animaux ont un fond génétique uniforme pour limiter les variations entre les individus et assurer la reproductibilité des résultats. Nous appliquons des analyses statistiques spécifiques à chaque expérience pour déterminer si les différences que nous observons entre nos groupes d’animaux sont exactes et suffisamment fiables pour conclure sur les effets observés, établir de nouvelles hypothèses et avancer dans notre recherche de potentielles molécules candidates pouvant être ciblées dans les lymphomes de type DLBCL.

Raffinement

Les animaux sont gardés en groupes sociaux, avec nids et dômes protecteurs, et suivis quotidiennement. Les analgésiques administrés régulièrement en systémique modifiant les réponses immunitaires étudiées, leur utilisation n’est pas recommandée. La totalité des animaux utilisés dans ce projet et porteurs de cellules tumorales sont mis à mort avant l’apparition de signe de stress ou de souffrance. Cependant, un animal présentant des signes de trouble du comportement et/ou de douleur fera l’objet d’une surveillance accrue, disposera de nourriture humidifiée au fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire, et sera mis à mort dès lors qu’il présente simultanément une perte de poids, des troubles du comportement, une déshydratation, et une baisse d’activité. Dans les expériences nécessitant des injections sous-cutanée, intraveineuse et des prélèvements sanguins, les souris sont anesthésiées par voie gazeuse (un mélange oxygène/isoflurane), ou chimiquement.

Choix des espèces

La physiopathologie de la souris est proche de celle de l’homme : une étude de la souris nous permet de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire chez l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle d’étude le plus simple et le mieux approprié pour 1) Analyser l’impact des mutations génétiques à l’origine des pathologies des lymphomes agressifs de type DLBCL chez les patients, et 2) Visualiser et analyser des cellules myéloïdes qui participent à l’émergence et à la persistance des cellules tumorales dans les tissus tels que la rate, la moelle osseuse et les ganglions grâce à des techniques d’imagerie de pointe (cytométrie, microscopie). Dans ce projet, les animaux utilisés ont atteint l'âge adulte (> 8 semaines d’âge).