Rongeurs

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées en cage individuelle dès l'âge de 20 jours, elles subissent une batterie de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, un placement en obscurité constante pendant deux à trois semaines et des chirurgies cérébrales avec ou sans réveil, injection d'un traceur dans l'œil ou d'un virus dans le cerveau, pour étudier les effets d'une exposition lumineuse à l'adolescence. Le porteur nomme l'isolement, la privation de lumière et la chirurgie comme sources de stress et de douleur. Il affirme que ces tests ne peuvent pas être menés in vitro et exigent des expériences à l'échelle de l'animal entier.

Objectifs

Depuis un siècle, l'éclairage environnemental est passé d'un rythme solaire naturel à un cycle lumineux artificiel et souvent irrégulier. Les sources d'éclairage moderne (LED) sont de plus en plus répandues et sont utilisées dans de nombreux appareils électroniques de notre vie courante (smartphone, tablette, etc...). Selon la fondation nationale du sommeil, 75% des enfants laissent un appareil électronique dans leur chambre quand ils dorment, et 60% des adolescents déclarent interagir avec leur écran durant l’heure précédant leur coucher. L’exposition à la lumière le matin a un effet bénéfique en synchronisant le système circadien avec le cycle environnemental jour/nuit, en augmentant la vigilance et la cognition et dans le traitement de la dépression. A l’inverse, une exposition anormale à la lumière (ALE), la nuit, altère nos rythmes biologiques, la cognition et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'Homme. Cet effet est médié par une cellule photosensible spécifique de la rétine : la cellule ganglionnaire à mélanopsine. Les adolescents sont très sensibles à divers facteurs de l’environnement, y compris la lumière. Ils représentent donc une population particulièrement à risque car 1) l'apparition de la plupart des maladies mentales survient avant l'âge de 25 ans et 2) ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Ce projet propose une analyse multidimensionnelle allant de la cellule au comportement de l’animal. Nous proposons d'étudier si l'exposition anormale à de la lumière, pendant la période de l'adolescence, contribue à l’altération des fonctions circadiennes (rythmiques), affectives et cognitives à l'âge adulte.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet aura des résultats déterminants tant au niveau fondamental que clinique. Il permettra tout d'abord de décortiquer la relation entre une exposition aberrante à la lumière à l’adolescence et le développement des troubles circadiens / affectifs / cognitifs à l’âge adulte. A plus long terme, de nouvelles stratégiespourront être élaborées et proposées pour limiter les effets négatifs d’une surexposition à la lumière chez les adolescents.

Procédures

Les interventions prévues sont listées ci-dessous : 1) Tout d'abord, les animaux seront isolés dans des cages individuelles à partir de 20 jours d’âge et jusqu’à la fin de l’expérimentation (P20 à l'âge adulte, procédures 1-4). 2) Ensuite, à l'âge adulte, les animaux subiront une série de tests comportementaux pour évaluer le système circadien, l'humeur et la cognition. Ces tests seront réalisés d'un degré de sévérité légère à sévère et séparés les uns des autres d'au moins 48 h (procédure 1). 3) Les animaux subiront une chirurgie avec (procédures 2 et 4) ou sans réveil (procédure 3) . Différents groupes d'animaux seront définis. Un groupe d'animaux recevra une injection intraoculaire d’un traceur antérograde (procédure 2) sous anesthésie générale et locale renforcée si besoin et l'expérimentation durera environ 30 min ). Un second groupe d'animaux recevra, sous anesthésie générale, l’injection d’un virus en intracérébral (30 à 45 min) pour activer spécifiquement les neurones d'intérêt (procédure 4). Enfin, un dernier groupe sera anesthésié par voie générale afin de mesurer l’activité neuronale par éléctrophysiologie dans les structures cérébrales d’intérêt. Cette intervention durera entre 2 à 2h30, et est sans réveil (procédure 3).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Stress lié à l'isolement des animaux en cage individuelle à partir de 20 jours d'âge et jusqu’à l'âge adulte afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. 2) Stress lié à la réalisation d'une batterie batterie de tests comportementaux permettant d'évaluer le système circadien, l'humeur et la cognition. Ces tests, réalisés chez les souris adultes, seront espacés les uns des autres de 48 h minimum et réalisés d'un degré de sévérité moindre à élevé. 3) Stress lié au placement des animaux adulte à l’obscurité constante pendant 15-20 jours . Le placement de l’animal en condition constante (obscurité constante) est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien (période endogène, décalage de phase comportemental). 3) Douleur éventuelle liée à la réalisation d'une chirurgie avec ou sans réveil et qunatifiée à l'aide d'une grille de score de la douleur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélévements de tissus post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d'évaluer l'impact d'une exposition aberrante à la lumière durant l'adolescence sur le système circadien, la cognition et l'humeur. Ces études ne pouvant êre reproduites in vitro, le projet nécessite la réalisation d'expériences dans un environnement intégral, à l'échelle de l'animal. De plus, ce projet fait appel à des modèles murins sauvages et transgéniques sélectionnés car ils permettent d'aborder différents aspects scientifiques de notre projet.

Réduction

Pour réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons des approches non invasives (comportement) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Les animaux utilisés lors des approches non-invasives seront utilisés dans le cadre d'une procédure ex-vivo. - Plusieurs prélèvements de tissus sont réalisés chez le même animal, et certaines mises au point techniques seront réalisées en utilisant le même animal.

Raffinement

Durant toute la durée des procédures et afin de mesurer le rythme de l'activité locomotrice, les souris,à partir de 20 jours d'âge, seront placés individuellement dans des cages et mis dans une armoire avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent voir leurs congénères et ont aussi accès à leurs odeurs et bruits. De plus, pour palier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton). Un igloo ne peut être mis car il interfère avec le signal enregistré par les capteurs infrarouges pour mesurer l'activité. Les procédures utilisées sont de sévérité légère à sans réveil. Une grille de score de la douleur sera utilisée.

Choix des espèces

L’objectif du projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition aberrante à de la lumière bleue chez l’adolescence sur le système circadien, l’humeur et la cognition. Cette période de stimulation lumineuse aura lieu entre 20 à 40 jours d'âge (stades postnataux P20 à P40). L’impact de cette exposition sera ensuite évalué chez des animaux au stade adulte (entre 2 à 4 mois). Ce projet fait appel à un modèle murin sauvage et un modèle murin transgénique déficient en une opsine, la mélanopsine (Opn4-/-). Cette espèce a été sélectionnée car 1) elle est nocturne et sera comparée à une espèce de rongeur diurne et 2) elle permet d'accéder à un modèle transgénique déficient en mélanopsine, photorécepteur connu pour son implication dans le traitement de l'information lumineuse. Elle représente donc un modèle privilégié pour notre projet.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties entre quatre variants du SARS-CoV-2, elles reçoivent deux injections de virus inactivés et subissent des prélèvements de sang à la queue faits au scalpel, pour évaluer une méthode d'inactivation virale mise au point au laboratoire. Le porteur indique que les souris perdant plus de 20 % de leur poids seront mises à mort, les autres l'étant pour récupérer le sérum. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne permet d'induire une réponse immunitaire complète.

Objectifs

Notre étude s’inscrit dans une démarche de recherche de nouveaux vaccins pour lutter contre la pandémie de COVID19. Elle cherche à évaluer chez la souris l'efficacité de la réponse immunitaire vis-à-vis de virus SARS-CoV-2 inactivés et rendus inoffensifs par une nouvelle méthode développée dans notre laboratoire. Les vaccins actuels contre le SARS-CoV-2 visent tous à préparer le système immunitaire à se défendre, en utilisant un élément de l'enveloppe du virus : la protéine virale "Spike". Le systéme immunitaire identifie cette protéine "Spike" comme un antigène, puis réagit en fabriquant des anticorps. Cette réponse immunitaire permet au corps de se préparer à lutter contre le virus. Parmi les stratégies vaccinales, on retrouve des stratégies classuques (virus iactivés, protéines "Spike" seules ou présentées par des vecteurs viraux, comme le vaccin Astra Zeneca) et plus modernes (vaccin ARNm, vaccin ADN). Les virus inactivés peuvent être produits rapidement dans un contexte épidémique. Ils engendrent peu de problèmes de tolérance (exemlpe du Sinovac, Chine). Notre laboratoire a établi qu’un traitement chimique nouveau, basé sur un détergent, permet de détruire des virus SARS-CoV-2 et de les rendre inoffensifs. Après ce traitement, les virus apparaissent comme des particules cassées, avec une membrane déchirée, mais qui contient toujours les protéines virales majeures : "Spike", "Membrane" et "Enveloppe". L’innocuité chez la souris et l’efficacité de cette nouvelle méthode dite de ‘fractionnement’ viral ont été démontrées auparavant avec le virus de la grippe, induisant une production importante d’anticorps après injection. Cette nouvelle méthode présente de gros avantages : rapidité, facilité de mise en œuvre et application à tous les variants du SARS-CoV-2. Notre objectif est de développer de nouvelles applications de cette formulation adaptée à la prévention de la COVID19. Dans ce cadre, l’étude de l’efficacité de cette formulation nécessite une approche in vivo, chez un modèle murin très bien caractérisé pour identifier la réponse immunitaire après l'injection des coronavirus inactivés par notre détergent. Nous souhaitons vérifier que cette nouvelle méthode générant des SARS-CoV-2 inactivés mais potentiellement immunogènes permettra d'améliorer l'intensité et la qualité de la réponse immunitaire induite chez la souris. Nous réaliserons ces essais sur les quatre variants les plus importants du SARS-CoV-2.

Bénéfices attendus

Dans le cas du SARS-CoV-2, le développement de vaccins repose aujourd'hui principalement sur la reconnaissance de la protéine "Spike" par le système immunitaire. Cette stratégie a montré ses limites avec l’apparition de variants viraux présentant des mutations sur la protéine "Spike", qui permettent aux variants viraux de s'échapper en partie de la réponse immunitaire. Deux autres protéines membranaires, E (enveloppe) et M (glycoprotéine membranaire), elles aussi immunogènes, sont présentées par le coronavirus. Notre méthode permet de produire des particules virales inoffensives (non infectieuses) enrichies des protéines Spikes et des protéines membranaires "Enveloppe" et "Membrane", lesquelles présentent très peu de mutations chez les variants du coronavirus. Cette stratégie apparaît plus pertinente pour contrôler précocement l’infection virale en multipliant les cibles protéiques immunogènes, dans le cadre de la lutte urgente à mettre en place contre la COVID19.

Procédures

Dans le cadre du projet, les types et durée d'intervention auxquels seront soumis les animaux sont : - Juste avant inoculation (J0) : prélèvement de 10µl de sang (45 secondes y compris contention); - Injections (J0 et J21) de 100µl de suspension virale (5 à 6 secondes, y compris contention). Le nombre total d’animaux s’élèvera à 144 au maximum soit 36 souris par virus inactivé testé (Wuhan, Beta, Delta et Omicron). En fin d'expérimentation, une anesthésie sera utilisée afin de permettre une sédation complète de l’animal avant prélèvement sanguin puis mise à mort par du personnel formé (2-3 minutes de l'injection d'anesthésique à la mort de l'animal)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues peuvent concerner : - Les injections réalisées au niveau du péritoine, qui induisent une douleur légère au moment de l’injection et/ou un léger inconfort très limité dans le temps. - Le prélèvement de sang à la queue réalisé le même jour sur les animaux ce qui induit une douleur de très courte durée au moment de l’incision avec la lame de scalpel. - L’injection de virus inactivés (immunogène) devrait induire chez la souris une réponse immunitaire pouvant conduire à un léger inconfort (limité dans le temps) résultant de la stimulation du système immunitaire, à une éventuelle diminution de l’activité de l’animal ainsi qu’à une légère perte de poids les premiers jours post-injection.

Devenir

Tout animal inclus dans la procédure sera euthanansié soit parce qu'il aura atteint l'un des points limites de l'étude, soit pour récupération du sang en vue de l'analyse de la réponse immunitaire dans le sérum.

Remplacement

L’objectif du projet est d’induire une réponse immunitaire, principalement une réponse en anticorps neutralisant. L’utilisation de modèle in vitro ne permet pas d’induire une réponse immunitaire complète. Aucune alternative à l’utilisation des animaux n’est possible pour ce projet. Nous utiliserons un modèle de souris C57/Bl6, communément utilisé pour l’évaluation de composés immuno- thérapeutiques et de la réponse immunitaire suite à l’injection de virus inactivés. Des études in vitro ont été réalisées en amont et le seront en aval de cette étude afin de limiter au strict minimum les étapes sur animal vivant.

Réduction

Le nombre de souris a été déterminé en utilisant des outils statistiques adaptés permettant de démontrer ou non une différence significative entre le groupe de souris traité et le groupe de souris contrôle. Nous obtenons un nombre de 6 souris par groupe pour cette étude. Un total de 12 souris est donc nécessaire pour chaque type d'étude.

Raffinement

Durant ce projet, les souris seront suivies quotidiennement et une grille de scoring permettra de déterminer si un analgésique est nécessaire pour assurer le bien-être animal. De plus une euthanasie sera programmée dès que l’un des point limite sera atteint. Les points limites principalement retenus sont : - Perte de poids supérieure à 20% du poids initial - Réaction inflammatoire sévère et irréversible au point d’injection - Diminution d’activité prolongée ou difficultés à se nourrir ou à boire

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est la souris car elle est l’espèce qui est la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence sont nombreuses. Les animaux nécessaires à cette étude devront être des adultes de 8 à 10 semaines afin de garantir un système immunitaire mature.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

Gavées de sucrose ou injectées d'insuline, maintenues environ trois heures dans un tube de contention pour cinq prises de sang à la queue, puis isolées 72 heures pour une mesure de calorimétrie, les souris de ce projet subissent jusqu'à trois fois cette série de tests en 20 à 30 semaines. 900 souris, porteuses d'un gène inactivé ou témoins, vont être utilisées, toutes tuées en fin de protocole pour l'analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit un régime enrichi en graisses ou en sucre, qui peut provoquer des lésions cutanées par toilettage excessif, et certaines passent jusqu'à deux fois 30 minutes sous anesthésie pour un enregistrement cardiaque par électrodes piquées dans la peau des pattes. Aucun des gènes visés n'est nommé, le protocole devant être répété sur cinq lignées différentes chaque année, et le résumé ne dit rien des effets que leur suppression peut avoir sur les souris elles-mêmes.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de gènes potentiellement impliqués dans la régulation du métabolisme chez les mammifères. Chaque projet se focalisera sur un gène d'interêt disposant d'éléments de la littérature justifiant son analyse dans un modèle physiologique complet. Afin de déterminer ce rôle, nous disposons du modèle Souris qui permet des modifications génétiques capables d'annuler la présence de ce gène chez l'animal. En retirant le gène de l'organisme, nous pouvons ainsi étudier comment les réponses à différentes variables métaboliques sont impactées. Ainsi, nous souhaitons comparer des souris contrôles à des souris génétiquement modifiées pour un gène, en présence ou non d'un régime enrichi en graisses et/ou en sucre, selon les mécanismes d'actions supposés du gène ciblé. Le facteur sexe pourra aussi être étudié, selon le gène cible. La mise en place d'une obésité ou d'une affection du foie liée à ce régime enrichi sera suivie par différentes analyses au cours du temps, et les données générées permettront de déterminer l'impact de la modification génétique dans ce cadre. Pour chaque gène analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 9 animaux pour chaque condition, soit 36 animaux par gène étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 36 animaux * 5 projets * 5 ans, soit 900 souris au maximum. Chaque projet contiendra 4 groupes expérimentaux de 9 animaux : Deux schémas expérimentaux sont ainsi possibles : 1) étude de l'effet de la diète, en se focalisant sur un seul genre male ou femelle controle avec une diète classique / controle avec une diète enrichie / animal mutant avec diète classique / animal mutant avec une diète enrichie 2) étude de l'effet du genre : controle male avec une diète enrichie / controle femelle avec une diète enrichie / animal mutant male avec une diète enrichie / animal mutant femelle avec une diète enrichie. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur les gènes étudiés, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies liées à la régulation de la glycémie (diabete) et de l'obésité ainsi qu'aux comorbidités cardiaques. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicament chez l'Homme.

Procédures

Durant ce protocole, des cohortes de 36 animaux suivront une série de protocoles qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un test de tolérance au glucose, dans lequel l'animal reçoit un gavage de sucrose suivi de 5 prélevement d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes) ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un test de sensibilité à l'insuline sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes). Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contension afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 72h, ce qui peut être un stress d'isolement. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. Enfin, des prélevements sanguins seront effectués pour suivre l'évolution des paramètres biochimiques. Ces prélevements se font en quelques minutes. Là encore, nous définissons des volumes réduits pour éviter un impact sur le bien-être des animaux. Et une durée de récupération d'au moins deux semaines est appliquée après un prélevement sanguin. L'ensemble des ces procédures expérimentales pourront être répétées au maximum trois fois durant la durée du protocole durant les 20 à 30 semaines de durée du protocole, en espacant chaque geste pour éviter un stress cumulatif et donc un effet négatif sur l'animal. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités. Cette évaluation cardiaque pourra être effectuée deux fois au maximum et implique une anesthésie gazeuse de 30 minutes environ. L'ensemble du protocole sera réalisé environ 5 fois par an sur des lignées différentes durant une période de 5 ans (soit un total maximal théorique de 900 animaux)

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront des prélevements sanguins, des mesures de la glycémie et de la sensibilité à l'insuline. Dans ce cadre, ils seront immobilisés durant quelques heures et prelevés de gouttes de sang. Durant la mesure de calorimétrie, les animaux seront isolés durant 72h ce qui peut créer un stress temporaire d'isolement. Les animaux prendront du poids du fait du régime enrichi, ce régime peut apporter aussi des lésions cutanées qui sont liées à un hypertoilettage des animaux. Ces lésions sont traitées localement et se résolvent rapidement. Si la fonction cardiaque est évaluée, les animaux seront anesthésiés durant environ 30 minutes et de fines électrodes seront piquées en surface de la peau des pattes pour obtenir le signal électrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés histologiquement afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation sur les organes.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification génétique d'un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (homéostasie glucidique et lipidique et fonction cardiaque). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Le modèle Souris nous permet d'accéder à une première approche de ces phénomènes physiologiques complexes afin de comprendre comment ceux-ci se transposent chez l'Homme. Par ailleurs, il permet des modifications génétiques ce qui facilite la compréhension du rôle des différents gènes que nous prévoyons d'étudier.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, paramètres cardiaques) qui seront analysées à l'aide d'analyses de variances à deux facteurs, répétées pour les mesures ayant lieu dans le temps (suivi du poids ou de la glycémie). Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seul cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Durant les prélevements sanguins, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleurs conditions d'hébergement possible avec la présence d'un enrichissement. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adpatée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques..)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement de modèles d'intérêt porteurs de modifications génétiques sur les gènes d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 6 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

670 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Celles des deux premières procédures, âgées de 8 semaines ou de 12 mois, reçoivent un régime riche en graisses, des composés libérant du monoxyde de carbone par voie orale ou intrapéritonéale, et des prises de sang à la queue sans anesthésie. Les 220 autres, dont 110 souris diabétiques db/db, subissent sous anesthésie l'ablation d'un morceau de peau pour créer une plaie, et leurs organes sont prélevés 21 jours plus tard. Le porteur affirme que ce régime "n'implique pas de procédures invasives" et, avec l'une de ses molécules, ne provoque "aucun stress ni impact sur la santé des animaux", alors qu'il l'emploie pour rendre les souris obèses et qu'il qualifie lui-même leurs prises de sang d'"intervention invasive".

Objectifs

Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz produit par les cellules à de très faibles concentrations. Il a été démontré qu'il régule d'importants processus physiologiques chez les mammifères, y compris les humains. Plusieurs études ont mis en évidence les actions pharmacologiques polyvalentes du CO et les scientifiques ont donc commencé à exploiter ce gaz pour des applications thérapeutiques. Dans ce contexte, une nouvelle génération de composés capables de libérer du CO a été développée. Le grand avantage de ces composés est que la quantité de CO qu'ils libèrent peuvent être mieux contrôlés en comparaison au CO gazeux. En fait, dans des expériences utilisant des rongeurs, il a été rapporté que ces composés exerçaient des actions thérapeutiques prometteuses contre diverses maladies telles que l’infarctus du myocarde, l’inflammation et les dysfonctionnements métaboliques. Plus récemment, il a été publié que l'administration orale de ces composés qui libère du CO avec une très grande efficacité chez des souris nourries avec un régime riche en graisses mène à une réduction significative du gain de poids corporel associée à une amélioration de la glycémie et à une diminution de la résistance à l'insuline. Le présent projet consiste à utiliser le même modèle d'obésité pour tester l'effet de nouvelles molécules développés récemment et qui ciblent plus efficacement le tissu adipeux. L'objectif principal est d'évaluer l'action thérapeutique de ces nouvelles molécules chez les jeunes souris et les souris âgées, puis d'évaluer si le CO possède également un effet thérapeutique sur l'obésité au cours du vieillissement. De la même manière, seront étudiés les effets protecteurs de ces nouvelles molécules, mais aussi une nouvelle technique générant localement du gaz CO dans le traitement des plaies cutanées. En effet, il est bien connu que la cicatrisation cutanée est altérée dans les maladies affectées par un dysfonctionnement métabolique tel que le diabète.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques de composés novateurs. Les résultats de cette étude nous fourniront des notions importantes sur le mécanisme d'action et l'applicabilité thérapeutique de ces molécules dans le contexte du dysfonctionnement métabolique et des plaies cutanées.

Procédures

Dans les modèles de régime riche en graisses, les animaux seront soumis à plusieurs reprises (0, 7 et 14 semanines) à un prélèvement de sang sans anesthésie (cela ne prend que 5 minutes) au niveau caudale, en tant qu'intervention invasive. Dans le modèle de plaie cutanée, les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour retirer un morceau de peau afin de créer la plaie. Cette chirurgie est très rapide, modérément invasive et ne nécessite pas plus de 20 à 30 minutes. Pour cette intervention, 220 animaux seront utilisés (110 souris C57BL/6 + 110 souris C57BLKS/J db/db). Après 21 jours à compter de la création de la plaie, un prélèvement de sang sans anesthésie (20 μl) sera effectué avant le prélèvement des organs.

Impact sur les animaux

Le modèle de régime riche en graisses est un modèle largement utilisé, il est sans douleur pour les animaux et n'implique pas de procédures invasives. Le degré de sévérité de la procédure de plaie de la peau, bien maîtrisée, est considéré de classe modérée. Cette procédure est réalisée sous anesthésie et les animaux se rétablissent complètement avec peu ou pas de douleur puisque la cicatrisation de la peau est très rapide. Concernant le prélèvement sanguin sans anesthésie, nous recueillerons un très faible volume et l’adéquation volume/méthode permet de respecter le bien-être animal.

Devenir

Comme nous avons besoin de collecter les organes pour une analyse fonctionnelle, génique et biochimique, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Avant de finaliser et d'optimiser les 3 protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés pour déterminer leurs effets bénéfiques sur le métabolisme dans des adipocytes en culture remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Tous les 20 composés avaient la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer un effet positif sur la respiration mitochondriale et la glycolyse mais seulement 4 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont permis de sélectionner les 4 meilleurs en fonction également de leur structure chimique diversifiée. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses (procédures 1 et 2), nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée (procédure 3), nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

Réduction

Pour chacun des groupes étudiés (groupes contrôles vs groupes traités) dans les procédures 1 et 3 (souris jeunes), nous utiliserons 10 souris, en raison de la variabilité entre les différents animaux, et ce afin d’obtenir des données significatives. Chaque protocole nécessite son propre contrôle. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d’autres molécules aux mêmes propriétés. Après collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Deux types de tests seront utilisés en fonction des groupes comparés : le test Student si nous comparons deux groupes et le test Anova si nous comparons plus de deux groupes. Ce dernier sera suivi d’un post test de type Bonferroni. Les résultats seront considérés significatifs si la P-valeur est inférieure à 0.05 et si la différence entre les lots témoin et traité est inférieure ou égale à 2 avec une puissance de 0.9, comme déjà publiée, et ceci avec des effectifs de 10 animaux dans chaque groupe. Notez que la stratégie expérimentale implique l'administration par voie orale ou i.p. de différentes doses aux souris, suivi par le prélèvement de tissus. Et ce, dans le but d’effectuer des mesures de paramètres fonctionnels et biochimiques et de déterminer quelle voie d'administration et quelle dose fournit les effets thérapeutiques les plus efficaces. Dans la procédure 2, nous avons besoin d'un minimum de 30 souris par groupe pour obtenir une puissance significative afin d’étudier la longévité et la survie de souris âgées.

Raffinement

En optimisant les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons essayé autant que possible d'utiliser des approches qui ne sont pas trop invasives et ainsi minimiser la douleur, la souffrance et la détresse que peuvent ressentir les animaux. Nous avons déjà montré que le régime alimentaire riche en graisses pendant 14 semaines et le traitement avec l'une de nos molécules ne provoquent aucun stress ni impact sur la santé des animaux. Par contre, si nous remarquons que pour une raison quelconque les animaux vont perdre plus de 15% de leur poids en 1 semaine nous procéderons à leur sacrifice. Concernant le protocol de plaie de la peau, les animaux subiront une euthanasie compassionnelle pour éviter la souffrance s'ils présentent une surinfection de la plaie ou un des signes suivants: prostration, dos voussé, pelage terne et hérissé, animal ne se nourrissant ou ne s’abreuvant plus, et ayant une perte de poids >15%.Nous avons également sélectionné un nombre limité de composés en utilisant moins de doses pour chacun. Nous sommes assurés que le logement et l'élevage seront effectués en prenant en compte le bien-être des animaux. Nous utiliserons des anesthésiques appropriés, et, en cas de nécessité, des analgésiques efficaces afin de minimiser la douleur des animaux. Les souris seront logées à 3 par cage, en nettoyant la cage une fois par semaine et en s'assurant qu'elles ont accès à de la nourriture et de l'eau ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle souris C57BL/6 est un modèle largement utilisé pour étudier l’effet des régimes alimentaire riche en graisse (« High Fat Diet », HFD). De manière analogue, les modèles de cicatrisation de la peau chez la souris ont été établis et bien décrits dans la littérature. Les souris diabétiques (C57BLKSJ db/db) et les souris avec un régime alimentaire riche (HFD) ont été largement utilisées pour déterminer l’effet des drogues et des réponses inflammatoires suite à des désordres métaboliques liés au diabète et á l’obésité. Le choix de cette espèce de souris se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses (procédures 1 et 2), nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée (procédure 3), nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

2444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux et des adultes reçoivent des vaccins, des injections d’anticorps et une infection nasale par un grand nombre de bactéries de la coqueluche, avant le prélèvement de leur nez, de leurs poumons et de leurs organes lymphoïdes, pour identifier des anticorps maternels protecteurs. Le porteur indique que l’infection peut tuer l’animal, souiller son pelage et gêner sa respiration, la perte de poids survenant juste avant la mort. Il précise que les mères sont tuées au sevrage et affirme qu’aucun modèle in vitro ne peut remplacer cette étude.

Objectifs

Prévenir les maladies infectieuses chez l’enfant par l’immunisation maternelle et l’immunisation de l’enfant s’avère être une nécessité pour les maladies à taux infectieux (R0) élevé. Le nombre de maladies que l’on peut prévenir par la vaccination a considérablement chuté ces dix dernières années. Néanmoins, les maladies infectieuses constituent la première cause de mortalité chez les enfants de moins de 5 ans, en particulier dans les pays en voie de développement. Le développement de nouveaux vaccins fondés sur l’identification d’anticorps protecteurs est nécessaire pour parvenir à réduire la mortalité infantile. La coqueluche figure parmi les maladies avec un R0 très élevé et pour lesquelles le taux de mortalité infantile est élevé. Les formes graves de la coqueluche touchant les nouveau-nés sont associées à une augmentation du nombre de globules blancs dans le sang (hyperleucocytose) entraînant une hypertension artérielle pulmonaire, conditionnant le pronostic vital notamment lorsqu’une défaillance cardiovasculaire apparaît. Par le passé la mise en place d’un modèle d’hyperleucocytose chez le souriceau a permis de montrer le rôle de la toxine pertussique (PT) dans ce phénomène. Les objectifs de ce projet sont les suivant : - Objectif 1 : Identification d’anticorps anti-PT conférant une immunité contre la coqueluche. - Objectif 2 : Etude du passage sélectif des anticorps de la mère à la progéniture et de la contribution des anticorps à la clairance du pathogène chez la progéniture infectée. - Objectif 3 : Immuno-modulation de la réponse immune de la progéniture par les anticorps maternels.

Bénéfices attendus

Les bénéfices apportés par ce projet seront multiples. Nous caractériseront les anticorps anti-PT protecteurs contre la coqueluche et contribuant à la clairance du pathogène. Nous déterminerons l’impact du transfert d’anticorps anti-PT sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination contre la coqueluche ou à un challenge infectieux. Dans cette optique, nous étudierons l’effet de différents vaccins anticoquelucheux dans le but d’identifier la meilleure stratégie vaccinale et de concevoir des vaccins plus performants.

Procédures

Les vaccinations seront réalisées sur animaux vigiles, par injection sous-cutanée, qui est l'injection la plus indolore ayant prouvée son efficacité. L'injection en sous-cutané dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection). Deux séries de vaccinations à 4 semaines d'interval sont réalisées. Cela concerne 174 animaux. Les injections d'anticorps sont réalisées sur des souriceaux vigiles, en intrapéritonéal et dans un volume minimal de 50 uL ou bien à des souris adultes endormies, en retroorbital, dans un volume minimal de 100 uL de façon à limiter la douleur de l'animal. L'injection dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection) Une seule injection par animal est réalisée. Cela concerne 1860 animaux. Les infections en intranasal sont réalisées sur des souris endormies et dans des volumes minimaux pour éviter que l'animal se noie. L'injection en intranasal des bactéries prend 2 minutes/animal (temps de la contension et du maintien de l'animal après inoculation pour éviter qu'il se noie et vérifier son rythme cardiaque). Un animal est infecté une seule fois au cours des expériences. Cela concerne 2444 animaux. Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sur des animaux euthanasiés à l'issu des expériences. L'euthanasie dure 1 à 2 min/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection et le temps que le produit fasse effet). Cela engage la totalité des animaux inclus dans les expériences (2444).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, seule l'infection est susceptible d'induire de fortes nuisssances aux animaux. En effet, pour induire une hyperleucocytose chez les souris nous devrons inoculer un nombre élevé de bactéries virulentes ce qui peut causer la mort de l’animal. Les souris malades ont le pelage souillé et des difficultés à respirer et elles perdent du poids.

Devenir

Pour évaluer la protection des anticorps glycosylés anti-PT contre la coqueluche dans le modèle murin nous devons euthanasier l'animal et prélever son sang afin de mesurer l'augmentation du nombre de leucocytes circulants, symptôme le plus précoce associé à la maladie dans le modèle murin. La perte de poids apparaît tardivement et quasi de façon concommitente avec la mort de l'animal. De plus, nous récolterons le nez et les poumons des animaux euthanasiés pour mesurer la charge bactérienne ou la réponse immune locale. Des organes lymphoides primaires ou secondaires tels que la rate et le thymus seront également prélevés pour étudier la réponse immune en périphérie. Les mères sont euthanasiées au moment du sevrage (4 semaines) et leur sang est collecté pour mesurer le taux d'anticorps circulant et les caractériser.

Remplacement

L’étude des effets de la vaccination maternelle sur la réponse immune de la progéniture ne peut être substituée par des modèles in vitro.

Réduction

Différentes mises au point seront réalisées afin d’identifier les conditions optimales pour répondre aux problématiques posées; ce qui permettra de réaliser les expériences de grande échelle (telle que le criblage d’une banque d’anticorps glycosylés) sur un nombre minimal d’animaux.

Raffinement

Des points limites ont été définis, qui seront surveillés quotidiennement tels que le comportement apathique des souris, leur pelage souillé, leur difficulté à respirer et la perte de poids. Les souris gestantes ne seront pas transportées pour limiter le stress à l’animal. Les souris gestantes auront un régime alimentaire adapté (croquettes enrichies). Du coton sera mis dans les cages pour permettre aux souris de faire un nid.

Choix des espèces

Dans un but d'étude de potentialité vaccinale et d'immunorégulation induite par les anticorps, il n'existe pas d'autres possibilités que le recours à l'In vivo, et donc aux souris dans notre cas puisqu'elles représentent un bon modèle adapté à nos études. Il est connu que la coqueluche touche tous les âges de la population et elle est mortelle chez les nourrissons non encore correctement protégés par la vaccination. Pour faire le parallèle avec le modèle murin, nous travaillerons sur des souriceaux de 7 à 9 jours, âges auquels le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un nouveau-né. Nous emploierons des souris de 4 semaines, âge auquel le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un enfant pour étudier l'effet des anticorps maternels sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination. Des souris adultes de 7 semaines, au système immunitaire mature, seront également employées comme outil de criblage, la reproductibilité et la faisabilité des expériences étant meilleure comparé au modèle d'infection néonatale.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des chocs électriques pour induire un état de stress post-traumatique, d’autres subissent une chirurgie du cerveau de plus de trois heures pour implanter une fibre optique, avec un isolement de quatorze jours et des tests de peur et d’anxiété, pour tester une stimulation cérébrale censée accélérer l’extinction de la peur. Le porteur reconnaît que l’isolement prolongé ajoute un stress et que le modèle n’est pas transposable directement à l’humain. Il affirme qu’aucune méthode in vitro ne permet d’étudier ce trouble reposant sur le comportement de l’animal vivant.

Objectifs

Il existe plusieurs modèles murins permettant de mimer différents aspects du trouble de stress post-traumatique (PTSD). Le plus utilisé est basé sur le principe de conditionnement de peur au contexte où un contexte nouveau est associé à un événement aversif (chocs électriques). Les souris se rappelleront que l’évènement aversif a eu lieu spécifiquement dans ce contexte et en auront peur lorsqu’elles y seront réexposées. Dans le cas d’un évènement aversif léger, en réexposant l’animal de façon répétée au contexte sans choc électrique, l’expression de la peur associée devrait diminuer jusqu’à disparaitre. Les souris comprennent qu’il n’y a plus de danger dans ce contexte. Ce processus, nommé extinction de peur, est défaillant dans le cas du PTSD. Il est donc important que, chez la souris, la peur associée au contexte persiste après plusieurs réexpositions au contexte. De plus, des traits caractéristiques du PTSD (anxiété, trouble de la mémoire, évitement, hypervigilance, freezing ou immobilité lié à la peur) peuvent être observés à l’aide de différents tests comportementaux. Pour cette étude, nous voulons montrer qu’en activant le cortex infralimbique (zone du cerveau responsable de l’extinction de peur chez la souris) lors du rappel de l’évènement, nous arrivons à accélérer et accentuer l’extinction et que cette amélioration engendrerait une diminution des symptômes associés au PTSD.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, nous démontrerons que les symptômes du PTSD persistent après plusieurs rappels de l’évènement aversif confirmant la qualité du modèle murin de PTSD. De plus, Le cortex infralimbique a été montré comme responsable de la diminution de l’expression de la peur après l’occurrence d’un évènement aversif léger et que, dans le cas d’un PTSD, son activité est largement diminué. Pourtant un nombre très limité d’étude cherche à rétablir cette activité. La technique de stimulation choisie nous permettra d’être spécifique quant à la région ainsi que les neurones stimulés, à l’inverse d’autres techniques de neurostimulations. La stimulation pouvant être effectuée sur l’animal libre de ses mouvements, nous pourrons montrer son importance au cours du rappel de l’évènement aversif. En clinique, parmi les techniques thérapeutiques utilisées aujourd’hui, les thérapies d’exposition semblent être de plus en plus pratiquées. En mettant le patient dans une situation où il est obligé de se remémorer le traumatisme de façon répété dans le temps tout en étant dans un endroit où il se sent en sécurité, les psychiatres cherchent à diminuer l’expression des émotions négatives associées. Malheureusement ces thérapies peuvent prendre du temps et ne sont pas aussi efficaces pour tous les patients. Nous voulons monter qu’en stimulant la région responsable de l’extinction, nous pouvons accélérer le processus. Même si non transposable chez l’Homme directement, cette étude nous permettra ainsi l’obtention de résultats nécessaires pour montrer l’importance de venir stimuler le cortex infralimbique pendant le rappel de l’évènement. Enfin, à ce jour, on constate qu’aucune étude sur le PTSD chez l’animal n’a pris en compte des animaux femelles, posant un problème majeur dans la mise au point de thérapie chez l’Homme

Procédures

Le projet est composé de 3 expériences ayant des objectifs différents. Au cours de la première expérience, les souris vont être divisées en 3 groupes, en fonction du fait qu’elles sont exposés à un l’administration de chocs électriques (intensité moyenne, intensité faible, pas de choc) dans un lieu donné. Trois semaines plus tard, toutes les souris sont réexposées au même lieu pendant 20min par jour sur 3 jours. Enfin, le comportement des souris est évalué à l’aide de tests évaluant la peur, l’anxiété, la mémoire, l’activité. Les souris effectueront 2 tests comportementaux par jours maximum. Pour les expériences 2 et 3, les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de 3h-3h30 sous anesthésie gazeuse. Elle consiste en une injection dans le cerveau et la mise en place d’une fibre optique permettant d’activer les neurones à l’aide d’une stimulation lumineuse (LED). Au cours de la chirurgie, les souris recevront une injection d’anesthésique local au niveau du crâne, d’analgésique et d’anti-inflammatoire. Pour la troisième expérience, deux semaines après la chirurgie, les souris suivront un protocole de PTSD puis de 3 réexpositions au contexte 3 semaines plus tard. Les jours de réexpositions, les souris suivront ou non un protocole pour activer les neurones : celui-ci se fera sur l’animal éveillé . Il s’agira d’une session unique de 10 min (expérience 2) ou de 3 sessions de 10min (1 session par jour sur 3 jours ; expériences 2 et 3). Cette stimulation n’est pas ressentie par l’animal et n’aura aucun effet néfaste.

Impact sur les animaux

Le PTSD est caractérisé en psychiatrie par une persistance (au moins un mois) de différents symptômes envahissants comme une peur prolongée lorsque l’individu est confronté au stimulus qui a causé le PTSD. Lors de la mise au point du modèle, nous devrons vérifier ce point, et donc confronter à nouveau les animaux avec la source du stress, ce qui peut générer de l’inconfort. Toutefois, les souris ne devraient pas montrer de perte de poids importante lié à l’induction du PTSD ni de signes de mal-être dans la cage d’hébergement. Le modèle de PTSD a montré son efficacité dans plusieurs études antérieures, en particulier lorsque les souris sont hébergées seules au moins 14 jours. Nous devrons donc reproduire ces conditions d’élevage, ce qui risque d’induire un stress supplémentaire prolongé. Toutefois, les cages seront transparentes, rangées les unes à côté des autres : Les souris pourront donc se voir, s’entendre et se sentir. De plus, cette étude nécessite d’effectuer des chirurgies au niveau du cerveau. Les souris auront besoin de quelques jours pour se remettre de la chirurgie. Le cerveau n’étant pas sensible, la douleur liée à la chirurgie sera due uniquement à des aspects périphériques. Enfin, la stimulation lumineuse ne sera pas ressentie par les animaux et n’aura aucun effet néfaste mais demandera d’établir une connexion avec l’appareil de mesure à l’aide d’un câble, ajoutant une gêne dans les déplacements tant que l’animal n’y est pas habitué. Les souris seront donc habituées à cette technique dans leur cage d’hébergement plusieurs jours avant la stimulation. Cette habituation sera accompagnée d’une récompense alimentaire.

Devenir

Les 210 animaux de l’expérience 1 seront euthanasiés car ils ont été isolées ce qui peut déclencher des comportements agressifs après regroupement des animaux. En fin de d’expérience 2 et 3 tous les animaux seront destinés à l’étude anatomique et cellulaire. Pour cela, nous devons traiter le cerveau avec une solution de préservation des tissus injectée dans la circulation sanguine de l’animal euthanasié. Cette solution est nécessaire pour éviter la dégradation ou les modifications post mortem. Nous pourrons ainsi confirmer le site d’injection lors de la chirurgie et faire d’autres analyses post-mortem. Sans cela nous ne pourrons pas montrer que les résultats obtenus sont une conséquence de l’activation de la zone cérébrale visée.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le PTSD chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.

Réduction

Les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectif suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=35 sujets par groupe). Ne pouvant nous appuyer sur aucune étude conte tenue de la variabilité entre mâle et femelle, nous sommes obligé de les considérer comme des groupes séparés. Les procédures 1 et 2 sont des procédures préliminaires qui nous permettront d’arrêter l’étude si les résultats ne vont pas dans le sens attendu et nécessaire pour la suite.

Raffinement

Les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectif suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=35 sujets par groupe). Ne pouvant nous appuyer sur aucune étude conte tenue de la variabilité entre mâle et femelle, nous sommes obligé de les considérer comme des groupes séparés. Les procédures 1 et 2 sont des procédures préliminaires qui nous permettront d’arrêter l’étude si les résultats ne vont pas dans le sens attendu et nécessaire pour la suite. Les souris reçoivent un injection de buprénorphine à 0.1mg/kg en IP en début de chirurgie pour une injection de Métacam à 5mg/kg en sous-cutanée après la chirurgie. Une injection de Métacam en sous-cutanée sera effectué une fois par jour pendant les deux jours qui suivent la chirurgie. Les souris seront monitorée tous les jours pendant la semaine qui suit afin de vérifier que nous n’atteignons pas le point limite.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et la neurobiologie murine, par l’expérience du laboratoire dans l’évaluation comportementale des rongeurs ainsi que dans la mise en application de la stimulation optogénétique. La zone ciblée dans cette étude (cortex infralimbique) est un équivalent fonctionnel du cortex préfrontal ventromédian chez l’Homme. Les souris C57/BL6N seront adultes (âgées de 10 semaines) à J0 de l’expérimentation afin de comparer les effets chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).