Rongeurs
Implication d’un canal potassique dans la sensibilité douloureuse inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Génétiquement modifiées pour ne pas exprimer une protéine, elles reçoivent dans une patte une injection d'agent inflammatoire, formaline, carraghénane ou adjuvant complet de Freund, puis subissent des tests de sensibilité douloureuse thermique et mécanique avec possibilité d'échappement, avant d'être tuées pour prélever cerveau, ganglions et poumons. Le porteur étudie le rôle de cette protéine dans la douleur, avec l'espoir de nouveaux antidouleurs pour l'humain. Il affirme qu'il "n'existe pas d'alternative" à l'expérimentation animale pour observer la sensibilité douloureuse.
Objectifs
Les protéines que nous étudions sont connus pour leur implication dans la régulation des messages nerveux, notamment des neurones. Nos recherches nous mènent à penser que la protéine que nous étudions est impliquée dans la transmission de messages douloureux. Elle pourrait donc représenter une cible pharmacologique importante pour l'Homme dans le domaine de la douleur. Disposant déja d'une lignée de souris transgénique n'exprimant pas cette protéine, nous étudierons les effets de de l'absence de cette protéine sur la sensibilité de ces souris. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les cerveaux/ganglions/poumons dans le but de réaliser des analyses de ces organes.
Bénéfices attendus
Cette étude pourrait mettre en évidence le rôle de cette protéine dans la régulation de la douleur. Ainsi, ce projet pourra apporter des informations nouvelles sur le fonctionnement de la douleur et ouvrirait la voie à la recherche de nouveaux anti-douleurs chez l'Homme.
Procédures
Les seules interventions que subiront les animaux sont des injections d'agents inflammatoires. Il y aura 4 procédures. Dans une procédure, un total de 96 animaux mâles et femelles seront soumis à l'injection intra-plantaire unique d'un agent inflammatoire appelé formaline dans une patte, cette injection sera réalisée en quelques secondes. Dans deux autres procédure, un total de 192 animaux mâles et femelles seront soumis à l'injection unique d'un agent inflammatoire appelé carraghénane dans une patte, cette injection sera réalisée en quelques secondes. Dans une dernière procédure, un total de 48 animaux mâles et femelles seront soumis à l'injection unique d'un agent inflammatoire appelé adjuvant complet freudien dans une patte, cette injection sera réalisée en quelques secondes. Les animaux seront âgées de 7 à 8 semaines dans le but d'éviter les variations de perception douloureuse dues à l'âge. Ces tests seront réalisés sur animaux mâles et femelles dans le but de déterminer s'il existe une différence lié au sexe.
Impact sur les animaux
Après injection d'un agent inflammatoire, les animaux sont susceptibles de présenter différents troubles comme une altération de la locomotion, une absence de toilettage ou encore du stress, c’est pour cela qu’une attention particulière sera accordée à chacun de ces animaux tout au long de la période de test inflammatoire. Des tests de sensibilité douloureuse thermique et mécanique avec possibilité d'échappement seront réalisés sur les animaux, les nuisances sont donc limitées par la possibilité d'échappement du test par l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever leurs cerveux, ganglions de la racine dorsale et poumons. Ceci nous permettra de pouvoir analyser ces organes, c'est la seule façon de pouvoir obtenir des informations essentielles pour l'étude de notre protéine dans les voies de la sensibilité et de la douleur.
Remplacement
Ce projet a pour but de déterminer le fonctionnement d'une protéine dans les voies de la douleur. Il n’existe pas d’alternative à l’expérimentation animale pour observer la sensibilité douloureuse, il nous est donc impossible de remplacer les animaux pour étudier les voies de la douleur.
Réduction
Nous avons pris des mesures de réduction du nombre d'animaux. Tout d'abord, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les cerveaux/ganglions/poumons dans le but de réaliser des analyses de ces organes. Nous nous limitons à analyser les organes des animaux testés et nous n'utiliserons donc pas d'autres animaux pour ces analyses. Nous avons également conçu nos procédures de manière a utiliser le moins d'animaux possibles, nous utiliserons notamment les mêmes animaux pour les 2 tests de sensibilité inflammatoires chroniques, divisant ainsi par 2 le nombre d'animaux pour cette procédure.
Raffinement
Plusieurs facteurs sont susceptibles de moduler la sensibilité, c’est pourquoi une attention particulière sera apportée à l’hébergement et aux bien-être des animaux tout au long de leur vie. Un des principaux enjeux sera de diminuer le niveau de stress des animaux, afin d’améliorer les conditions de vie des animaux et de maitriser les facteurs pouvant influencer la sensibilité. Nous avons concu des procédures les plus courtes possibles pour étudier la douleur inflammatoire, allant de 45min à 3h dans le but de diminuer au maximum l'inconfort et la souffrance potentielle des animaux.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce constitue le meilleur modèle pour notre étude car les caractéristiques des souris de la souche utilisée sont largement documentées. La souris possède également une reproductibilité rapide et fiable, constituant un atout pour développer efficacement notre projet. Les tests de sensibilité sont bien adaptés pour les souris et suffisamment documentés. Nous possédons déjà les souris génétiquement modifiées indispensables à notre étude, nous n'auront donc pas besoin de générer de nouveaux modèles. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 12 semaines. Ce choix est motivé par la volonté de nous soustraire des variations dues aux processus développementaux ou liés au vieillissement.
Mécanismes moléculaires du vieillissement prématuré des cellules souches hématopoïétiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 538 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections répétées et des transplantations de cellules après baisse de leur immunité, avec trois prélèvements sanguins chacune, avant d'être tuées pour isoler leurs cellules souches du sang. Le porteur décrit des risques d'infection et de rejet de greffe et fixe la mise à mort à une perte de poids de plus de 20 %. Il affirme qu'il n'existe pas de système in vitro comparable au corps du mammifère pour étudier l'hématopoïèse, ce qui rend selon lui les expériences in vivo "essentielles".
Objectifs
Le vieillissement de la population, en particulier au sein de la population occidentale, est aujourd’hui l’un des principaux problèmes socio-économiques. Le vieillissement du système sanguin et en partie de la population de cellules appelée cellules souches hématopoïétiques entraîne un dysfonctionnement de la formation de sang. Ceci accroit le risque de développer diverses maladies du sang malignes telles que la myélodysplasie, un ensemble de maladies caractérisées par une production insuffisante de cellules sanguines matures saines par la moelle osseuse, la leucémie ou encore le lymphome. Au sein de notre laboratoire, nous supposons que le vieillissement "sain" ou "physiologique" est une succession de moments de stress. Notre hypothèse est donc de vérifier si des signaux de stress provoquent des changements dans l’ADN ou les ARNm constituant ainsi une signature du vieillissement des cellules souches hématopoïétiques. Pour répondre à cette hypothèse nous 1) vérifierons si les cellules sont capables de se souvenir d’un stress subi et donc de répondre plus rapidement ou plus fortement à un second stress ; nous 2) évaluerons si cette mémoire contribue au vieillissement ; et finalement nous 3) déterminerons si le vieillissement à un impact sur la réponse au stress en laissant des marques permanentes et potentiellement héréditaires sur l’ADN et les ARNm.
Bénéfices attendus
L'objectif de cette étude est d’identifier de futures cibles thérapeutiques qui permettront de développer de nouvelles thérapies dans le but d’améliorer la qualité de vie de la population vieillissante.
Procédures
Un traitement sera injecté aux souris une, deux ou trois fois pour une durée de 15sec environ par injection. Les souris seront également soumises à des transplantations de cellules, impliquant une diminution de l'immunité et une injection de 15sec environ, ainsi qu'à des prélèvements sanguins (prélèvement de 15s environ, 3 prélèvements sanguins par souris à 4, 8 et 12 semaines après la transplantation).
Impact sur les animaux
Les injections du traitement peuvent induire des rougeurs et des gonflements. La diminution de l'immunité des souris receveuses de la transplantation peut entrainer des infections. La transplantation peut induire un rejet de greffe.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure dans le but d’isoler et d’étudier les cellules souches hématopoïetiques.
Remplacement
Nous avons envisagé la possibilité de modéliser les mêmes processus in vitro. Cependant, il n'existe pas de système in vitro approprié pour étudier l'hématopoïèse, qui soit comparable au corps du mammifère. Seules certaines expériences peuvent être réalisées in vitro, comme les tests d'unités de formation de colonies, que nous allons mettre en place. Par conséquent, les expériences in vivo utilisant des souris sont essentielles.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour la quantité de matériel nécessaire à l'expérience et pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Nous effectuerons 3 répétitions pour vérifier si la variation est importante. Si les deux premières expériences donnent le même résultat, la troisième expérience sera annulée pour réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de prévenir les infections bactériennes, les souris transplantées recevront un traitement antibiotique dans l'eau de boisson. Lors des prélèvements sanguins une pression sera appliquée sur le site de prelevement pour arrêter l'hémorragie. Les souris seront surveillées pour détecter tout signe d'inconfort 10 à 15 minutes après la procédure. Un manque de soin ou un isolement de l’animal entrainera une surveillance quotidienne. Un deplacement anormal nécessitera l’administration d’eau gélifée et de nourriture directement dans la cage. Une respiration haletante entrainera une surveillance quotidienne. L’animal sera mis à mort dans tous les cas si les symptomes persistent plus de 3 jours. Une perte de poids de plus de 10% sans récupération sur 2 semaines entrainera une vigilance accrue des autres paramètres. Une perte de poids supérieure à 20% entrainera la mise à mort de l’animal. Des rougeurs ou gonflements au niveau des sites de prélèvement ou d’injection entraineront l’utilisation quotidienne de solution antiseptique non colorée. Les animaux seront mis à mort s’il n’y a pas d’amélioration après 3 jours.
Choix des espèces
La souris est le système idéal pour étudier l'hématopoïèse car le système hématopoïétique est hautement conservé entre la souris et le système hématopoïétique humain. En outre, le vieillissement du système hématopoïétique est bien défini et l'approximation des âges pertinents entre les humains et les souris est connue. Enfin, la capacité d'isoler les CSH de la souris est bien définie et les CSH peuvent être préservées dans un système normal où elles sont situées dans leur niche et peuvent donc conserver leur quiescence. Des procédures telles que la transplantation sont également facilement réalisables chez la souris puisque des protocoles d'irradiation sont en place. Les âges des animaux utilisés (très jeune de 4 à 8 semaines ; jeunes de 4 à 6 mois ; âgés de 10 à 14 mois) ont été choisis car ils simulent les humains très jeunes, jeunes et d'âge moyen. Une attention particulière sera portée aux groupes, afin d'équilibrer autant que possible les âges dans chaque expérience.
Caractérisation phénotypique de modèles murins du syndrome de Rett
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses de quatre mutations du gène MECP2 modélisant le syndrome de Rett, elles enchaînent des tests comportementaux nommés dans le résumé, dont le rotarod, la barre crantée, l'enfouissement de billes, la reconnaissance d'objet, un test de sensibilité sur plaque à 52 °C et un test de crises épileptiques déclenchées par injection d'un agent convulsivant. Le porteur indique que ces mutations entraînent une mortalité précoce et n'utilise que des mâles alors qu'il rappelle que le syndrome touche les filles. Il décrit cette caractérisation comme une étape "indispensable" avant d'envisager une thérapie génique, objet d'une demande séparée.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. Seules les filles sont atteintes de cette pathologie, les garçons étant très rares et mourant d'une encéphalopathie néonatale sévère. Ce syndrome entraine un polyhandicap avec déficience intellectuelle sévère et infirmité motrice, ainsi qu'une sensibilité accrue aux crises épileptiques, des troubles respiratoires et cardiovasculaires. Il se manifeste par une régression rapide des acquis après 6 à 24 mois de développement normal. Aujourd’hui, une prise en charge globale des symptômes permet à ces patients de vivre plusieurs dizaines d’années, mais il n'existe malheureusement pas de traitement curatif à ce jour. La thérapie génique est une approche prometteuse visant à corriger le gène muté MECP2. Afin d'envisager cette approche thérapeutique, nous allons caractériser quatre modèles de souris portant des mutations dans le gène MECP2 représentatives de la pathologie humaine, plus spécifiquement dans le domaine du comportement et de la cognition. Cette caractérisation et compréhension des modèles dans nos conditions nous permettra de sélection le ou les modèles les plus pertinents pour évaluer une approche de thérapie génique (cette étude fera l'objet d'une demande d'autorisation séparée).
Bénéfices attendus
La caractérisation des modèles de souris du syndrome de Rett, notamment une caractérisation des symptomes observés chez la souris dans nos conditions en comparaison à la clinique humaine, nous permettra d’avoir une meilleure compréhension du déroulement de la pathologie et des méchanismes impliqués dans la maladie. Cette caractérisation nous permettra d'évaluer dans un deuxième temps une approche de traitement par thérapie génique et la correction du phénotype, en suivant le même protocole.
Procédures
Nous allons réalisé les tests d'exploration fonctionnelle suivants à 7-12 semaines d'age, chacun des tests étant réalisé une seule fois: activité circadienne pour suivre l'activité locomotrice, ainsi que la consommation en eau et en nourriture durant un cycle complet jour-nuit (durée 32h); labyrinthe en croix surélevé pour évaluer l'anxiété (5 minutes); observations cliniques (15 minutes); test de coordination (rotarod) (2 sessions de 15 minutes); barre crantée: test proprioceptif dépendant de la coordination motrice et de la fonction vestibulaire (10 minutes); test d'enfouissement de billes pour évaluer l'anxiété et/ou des troubles compulsifs (10 minutes); test de reconnaissance d'un nouvel objet pour évaluer la cognition (30 minutes); étude de la sensibilité thermique ( 30 secondes); test de susceptibilité aux crises épileptiques (injection de PentyleneTetraZole (agent convulvisant): 5 sec; durée du test:20 minutes); le suivi du poids des animaux (1X/semaine). Maintien d'une lignée à phénotype sévère.
Impact sur les animaux
Les mutations dans le gène MECP2 induisent une mortalité précoce des animaux, avec une médiane de survie de 10 à 30 semaines selon la mutation. Durant le test de sensibilité à la douleur thermique, les souris sont exposées à une température de 52°C sur une plaque chauffante. Au premier signe pouvant indiquer une souffrance (retrait de la patte, cri...), le test est arrêté et la durée est enregistrée. Au cours du test de sensibilité aux crises épileptiques par injection d'un agent pro-convulsivant, des crises myocloniques (contractions rapides et brutales des muscles), cloniques (spasmes rythmés), et toniques (augmentation accrue du tonus musculaire et raideur) surviennent; la durée et la latence sont enregistrées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences par inhalation croissante de CO2, notamment après le dernier test qui peut potentiellement induire des crises épileptiques.
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de souris portant des mutations dans le gène MECP2 représentatives de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, de déficit intellectuel et de susceptibilité aux crises épileptiques. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptomes de la maladie de Rett, étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 15 males mutants et 15 males controles pour évaluer le phénotype des animaux, pour chacune des 4 mutations MECP2. Ce nombre de souris tient compte d'une probabilité de perte des animaux au cours de l'étude en raison de la mortalité précoce associée à ces mutations, tout en permettant d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes et fiables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin d’améliorer leurs conditions de vie, elles seront ainsi stabulées dans des conditions optimales pour l’espèce : en groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de "nestlets" ou de maisonnettes en carton. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Lors du test de sensibilité thermique, l’animal est retiré du test dès la première réaction de douleur observée au niveau des pattes arrière. Si aucune réaction n’est observée, le test s’arrête au bout de 30 sec. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal.
Choix des espèces
Le modèle souris portant des mutations dans le gène MECP2 permet de reproduire les symptomes du syndrome de Rett observés en clinique humaine. Il permettra ainsi dans un deuxième temps d'évaluer un traitement par thérapie génique et de suivre la correction des phénotypes. Nous utiliserons des animaux "adolescents" / adultes jeunes (7-12 semaines d'age pour réaliser l'ensemble de la procédure), age où s'installent les phénotypes (stade symptomatique similaire au stade retenu en vue d'applications en clinique humaine, chez des sujets jeunes présentant des symptomes du syndrome de Rett).
Caractérisation de GPR55 dans le cadre du vieillissement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées jusqu'à 20 mois, elles subissent des tests comportementaux dont le résumé ne précise pas la nature, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever cerveau et cellules. Le porteur étudie le rôle des oméga-3 et d'un récepteur sur l'humeur et la plasticité synaptique, et renvoie les applications thérapeutiques et nutritionnelles chez l'humain au long terme. Il affirme que le recours à des animaux vivants reste une "nécessité expérimentale majeure" et qu'aucune approche sur cellules, modèle informatique ou chez l'humain ne permet ces mesures.
Objectifs
D’après l’OMS, les troubles de l’humeur (dépression, troubles bipolaires) sont la première cause d’incapacité dans le monde et concernent 350 millions de personnes chaque année. Outre l’impact sur la qualité de vie des patients et de leurs familles, les troubles de l’humeur représentent des coûts de santé considérables. De plus, ~30% des patients demeurent résistants aux traitements pharmacologiques et autres approches thérapeutiques existants à ce jour. Ainsi, une alternative consisterait à développer des stratégies préventives, et notamment nutritionnelles, pour limiter ou retarder l’apparition des troubles de l’humeur. Au laboratoire, le rôle des oméga-3 sur le fonctionnement cérébral et la santé mentale est étudié depuis presque 10 ans. Le laboratoire a notamment démontré qu’une carence en oméga-3 exacerbe les comportements de type anxieux et dépressif chez l’animal, tandis qu’une supplémentation en oméga-3 les diminue. Ces études précliniques sont en accord avec les données chez l’homme, des essais cliniques montrant qu’une supplémentation en oméga-3 améliorerait certains symptômes dépressifs. Ainsi, une supplémentation en oméga-3 peut constituer une alternative intéressante dans la prévention des troubles de l’humeur, mais les mécanismes qui sous-tendent les effets positifs des oméga-3 dans les troubles de l’humeur restent encore très mal connus. Le laboratoire a récemment ouvert une nouvelle hypothèse, en démontrant que les apports en oméga-3 avaient un impact direct sur la plasticité synaptique ainsi que l'arborisation dendritique. La plasticité synaptique regroupe les phénomènes qui confèrent au cerveau sa capacité de s’adapter à l’environnement, par des modifications de la connectivité entre les neurones, au niveau des synapses. Les différentes formes de plasticités synaptiques sont indispensables aux mécanismes d’apprentissage et d’évolution. De plus en plus d’études suggèrent que les troubles de l’humeur sont associés à des dysfonctionnements dans les processus de plasticité synaptique et ces dysfonctionnements pourraient être à l’origine des symptômes neuropsychiatriques des troubles de l’humeur. Les oméga-3 sont des modulateurs importants des fonctions synaptiques, car, faisant partie des éléments structurels des membranes plasmiques, ils modulent la dynamique membranaire ainsi que la fonctionnalité et le trafic des protéines transmembranaires présentes à la synapse.
Bénéfices attendus
L’objectif de notre projet est désormais d’aller plus loin dans la compréhension des mécanismes neurobiologiques par lesquels les oméga-3 contenus dans l’alimentation permettent de protéger les animaux. L’objectif à long terme de ce projet est de transférer les connaissances acquises chez le rongeur à l’homme pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et nutritionnelles. Ces données pré-cliniques nous permettrons de comprendre un peu plus en quoi la nutrition influence les fonctions cognitives et la physiologie de la transmission synaptique. De plus, des applications thérapeutiques peuvent être envisagées, en particulier pour déterminer si une thérapie nutritionnelle peut atténuer les pathologies liées au stress chronique, comme par exemple les troubles de stress post-traumatiques. De façon similaire, des stratégies préventives, liées à une nutrition adaptée et équilibrée en lipides, pourraient être envisagées afin de limiter, réduire ou même d'endiguer l'apparition de troubles dépressifs et/ou anxieux.
Procédures
Les animaux subiront des tests comportementaux qui ne durent que 5 à 10 minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées , mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les piqures d'analgésique et anesthésique avant la perfusion intracardiaque durent quelques secondes et la contention peut stresser les animaux.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les piqures d'analgésique et anesthésique avant la perfusion intracardiaque durent quelques secondes et la contention peut stresser les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et rôle des acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la prévention des altérations cognitives et émotionnelles suite à un stress chronique. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées sur des cultures cellulaires ou dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de l’humeur reste une nécessité expérimentale majeure.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. Statistiquement, des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, 15 souris C57Bl6/j sont nécessaire par groupe.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui peut s’avérer nécessaire pour la poursuite à long terme de notre projet. Les expériences de comportement se feront sur des animaux adultes (6mois) et âgés (20 mois).
Travaux pratiques de la formation réglementaire concepteur de projets utilisant des rongeurs à des fins scientifiques
- Formation professionnelle
Rats : 45
90 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée pour d'autres formations, le reste tué. Ils servent de support à une formation réglementaire pour concepteurs de projets, avec préhension, contention, injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins, puis un travail pratique de mise à mort et d'autopsie sous anesthésie. Le porteur affirme que la formation pratique est "indispensable" à l'acquisition de bases solides et qu'une partie des travaux pratiques "doit" passer par des animaux non-humains, malgré le recours annoncé à des démonstrations filmées et des outils de substitution. Il privilégie des individus de réforme et enchaîne les enseignements pour réutiliser les mêmes animaux d'un exercice à l'autre.
Objectifs
L'utilisation d'animaux à des fins scientifiques en France est réglementée par le décret 2013-118 et cinq arrêtés datés du 1er février 2013, publiés le 7 février 2013, en application de la directive 2010/63/UE. Ainsi, des règles strictes, basées sur le principe des 3Rs, encadrent le fonctionnement de la recherche dans le domaine. De ce fait, les personnes utilisant des animaux se doivent d'être formées et qualifiées pour travailler dans ce domaine. Différents niveaux règlementaires permettent donc de définir les taches que les personnels seront à-même de réaliser ainsi que les niveaux de responsabilité par rapport au projet donné. De ce fait, afin d'assurer une formation complète à la direction d'études utilisant des animaux, l'université de Caen a mis en place un diplôme universitaire pour la formation reglemenatire obligatoire et spécifique à la conception de projets utilisant des animaux à des fins scientifiques, approbée par le CNEA. La formation est réservée aux personnes disposant d'une formation initiale bac +5 minimum (études scientifiques, médicales, pharmaceutiques, vétérinaires) ou bac +2 avec 5 ans d'expérience. Une capacité maximale de 15-20 stagiaires est prévue. La formation se déroulera sur deux semaines en 71 heures : 58 heures de cours théoriques et 13 heures d'aspects pratiques en une séance par an. Cette formation a pour but de former les étudiants à la conception de projets scientifiques nécessitant d'animaux à des fins de recherche tant sur le plan théorique (réglementation, méthodes alternatives, anatomie comparée, recours aux procédures expérimentales faiblement invasives) comme théorique et pratique (anesthésie, douleur et analgésie, stress et enrichissement du milieu, ...) Cette formation privilégie autant que possible le recours aux méthodes alternative par l'utilisation de démonstrations filmées, organisations en groupes de travail et/ou réutilisation quand il est possible. L'enchainement des enseignements a été réfléchi afin de pouvoir effectuer des formations sucessives sur les mêmes animaux. L'utilisation d'outils pédagogiques de substitution est prévue de façon qu'un minimum d'animaux est utilisé par séance et se limite à 9 rats et 9 souris par an pour tous les stagiaires. Les stagiaires auront une base solide théorique et pratique pour la conception de projets utilisants des rongeurs à des fins scientifiques.
Bénéfices attendus
Les stagiaires qui auront réussi l'examen écrit auront un diplome universitaire de l'université de Caen "Formation à Expérimentation animale appliquée à la Recherche Biomédicale : conception des projets utilisant des rongeurs à des fins scientifiques" Formation spéciale destinée aux personnes assurant la responsabilité scientifique directe d’expérimentations conformément à la directive 2010/63/UE relative à l’expérimentation animale.
Procédures
5 rats et 5 souris suivront des procédures non invasives pendant 4 heures maximum (gestes zootechniques pour la préhension et contention; administration de produits; prélèvements sanguins). Ces gestes sans anesthésie étant réalisés par des personnes non habituées, nous ne considérons pas la possibilité de réutiliser ces animaux pour le reste de la formation, privilégiant une récupération du stress subi. 4 autres rats et 4 autres souris suivront également le TP de physiologie pendant 2h : techniques de surveillance de la physiologie normale sous anesthésie générale. Ces 4 rats suivront le TP d'anesthésie et analgésie avec les méthodologies exérimentales pendant 3h maximum. Ils suivront sans réveil le TP de mise à mort et autopsie. Les 4 souris suivront également le TP de mise à mort et autopsie. Un rat et une souris sont prévus en plus pour anticiper au cas ou un problème subviendrai rapidement après anesthésie par exemple pour ne pas handicaper un groupe de stagiaires si ce cas apparaissait. Si non utilisés, ces animaux pourront être réutilisés dans des formations du laboratoire en comportement.
Impact sur les animaux
Nuisances du TP 1 : Les animaux seront manipulés et contenus par du personnel non formé : du stress est à prévoir. Il y aura également des douleurs légères et de courte durée (injections de liquide physiologique) dues aux injections intrapéritonéales et aux prélèvements sanguins. Nuisances du TP 2 : Les animaux seront anesthésiés et ne souffriront pas de gestes invasifs, nous ne nous attendons pas à des nuisances. Nuisances du TP 3 : les animaux seront seront anesthésiés et auront une couverture analgésique nous ne nous attendons pas à des nuisances.
Devenir
La première procédure est légère mais réalisée par du personnel non habitué. Nous préférons laisser ces animaux récupérer et les inclure dans des apprentissages de tests comportementaux au lieu de les réutiliser cinq jours après pour une autre procédure (5 rats et 5 souris par année). La deuxième procédure inclut des démonstrations pour l'observation de la physiologie cardiaque et respiratoire sous anesthésie générale. Les animaux sont prévus d'être reutilisés le lendemain pour une démonstration procédure (4 rats et 4 souris par année). La troixième démobstration consiste au TP sur l'anesthésie et analgésie avec l'utilisation de méthodologies expérimentales fréquentes en recherche préclinique chez le rongeur (4 rats par année). A la suite de cette procédure et sans réveil entre deux, le TP de mise à mort et autopsie utilisera les 4 rats et les 4 souris de la procédure 2 qui seront anesthésiés profondément comme décrit dans la procédure avant mise à mort.
Remplacement
La formation pratique est indispensable à l'acquisition de bases solides pour les concepteurs de projets utilisant des rongeurs à des fins scientifiques. Bien que le maximum d'approches seront réalisées sur des systèmes de substitution et l'utilisation d'outils pédagogiques qui ne nécessitent pas l'utilisation d'animaux, une partie des travaux pratiques doit être pratiquée sur des animaux. De ce fait les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie par du personnel formé et expérimenté et sous la supervision dans chaque atelier d'enseignants experts dans les domaines abordés. Une partie des démonstrations est réalisés sur des techniques non invasives (comportement, techniques de préhension) et ne nécessitent donc pas de méthodes d'anesthésie.
Réduction
Les stagiares sont regroupés en groupes de travail afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire. Les thématiques de formation sont enchainées permettant la réutilisation des animaux d'un TP à l'autre. Néanmoins, un minimum de 9 rats et 9 souris par an est prévu pour la totalité des enseignements pour 20 stagiaires.
Raffinement
Les animaux sont anesthésiés par anesthésie gazeuse à l’isoflurane. L’induction est effectuée à 5% isoflurane dans un mélange gazeux 30%O2 / 70%N2O pendant 3minutes. Ils sont ensuite maintenus sous anesthésie par inhalation d’isoflurane (2% dans 30%O2 / 70%N2O) en respiration spontanée ou en ventilation mécanique (TP correspondant). Une vaporisation de Lidocaïne sera faite au larynx pour soulager tout incorfort. Une couverture analgésique est assurée par injection sous cutanée de buprénorphine (0.1mg/kg, 200μL) avant la manipulation et pose de cathéter (TP correspondant). La thermorégulation (37.5 ± 0.5°C) est assurée par une couverture chauffante (groupes anesthésiés) rétrocontrôlées par une sonde de température rectale.
Choix des espèces
La formation est destinée specifiquement aux concepteurs de projets nécessitant l'utisation de rongeurs. Cette formation est donc basée sur l'utilisation de rats et des souris. Nous privilégions de préférence l'utilisation d'animaux de réforme. Les animaux seront des adultes, aucune incidence d'age ou de sexe. Nous privilégions si possible l'utilisation d'animaux de réforme.
Caractérisation d’un modèle de rat pour la Dystrophie Musculaire de Becker.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
193 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Génétiquement modifiés pour développer une dystrophie musculaire de Becker, ils passent des examens présentés comme non invasifs (électrocardiogramme, échocardiographie, pléthysmographie, test de préhension, tapis roulant) puis sont tués à des âges échelonnés jusqu'à trente-deux mois. Le porteur précise qu'une partie des animaux est laissée jusqu'à la mort naturelle pour établir une courbe de survie. Il espère que ce rat deviendra le "modèle animal de référence" de la maladie, aucun modèle n'existant à ce jour, et renvoie les bénéfices thérapeutiques au moyen terme.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Becker est une pathologie affectant les muscles cardiaque et squelettiques, liée à des mutations dans un gène situé sur le chromosome X. Ces mutations entrainent des anomalies de l'expression d'une protéine appelée, la dystrophine, qui a pour rôle de protéger la membrane de la cellule musculaire lors de la contraction. Cette pathologie est liée au même gène que celui de la dystrophie musculaire de Duchenne mais la symptomatologie en est globalement moins sévère car la protéine n'est pas complètement absente dans ce cas-là mais anormalement courte. La dystrophine anormale fragilise les cellules musculaires qui sont de fait plus sensibles aux contraintes mécaniques. La maladie débute pendant l'enfance, souvent après l'âge de 7 ans, mais parfois plus tardivement. Les symptômes caractéristiques chez les enfants sont la marche sur la pointe des pieds ou des crampes pendant l'exercice, accompagnées ou non d'un signe de la dégénérescence des fibres musculaires détectable par la présence de myoglobine dans les urines. Au fur et à mesure que la pathologie évolue, la faiblesse musculaire peut entraîner des difficultés fonctionnelles : difficulté à monter les escaliers ou à se lever d'une chaise. La maladie progresse lentement et environ 40 % des patients affectés finiront par devenir dépendants du fauteuil roulant. Chez les patients en fauteuil roulant, la faiblesse des muscles intercostaux et du diaphragme engendre une insuffisance respiratoire. Les anomalies cardiaques sont rarement observées au début de la pathologie mais lorsqu'elles surviennent, l'atteinte cardiaque est alors caractérisée par une augmentation de la cavité cardiaque et est disproportionnée par rapport à l'atteinte des muscles squelettiques. À ce jour, il n'existe pas de modèle animal pour la dystrophie musculaire de Becker, ni aucun remède, mais de nouveaux traitements sont en cours d’élaboration. L’objectif de ce projet est de caractériser le phénotype d'un modèle animal unique pour cette maladie que nous venons de créer en espérant qu'il mime parfaitement la pathologie humaine et ceci afin de l'utiliser par la suite pour le développement de traitements efficaces.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à caractériser un modèle unique de dystrophie musculaire de Becker qui pourrait être utilisé pour mieux étudier cette maladie. A moyen terme nous espérons que ce modèle sera utile à la communauté scientifique pour développer et tester de nouvelles thérapies comme c'est le cas avec notre modèle de rats de la dystrophie musculaire de Duchenne.
Procédures
Les prélèvements ne seront réalisés qu'après la mise à mort dans la procédure de caractérisation du phénotype dystrophique du modèle BMB. Il n'y a pas de procédure chirurgicale prévue dans la présente saisine. Les tests fonctionnels auxquels sont soumis les animaux pour la caractérisation du phénotype sont non invasifs, ne seront pas faits les mêmes jours et s'ils doivent être combinés ils le seront par deux: un test passif (ECG par holter - 12h, echocardiographie - 20min, plethysmographie - 15 min) et un test actif (grip test -10min, tapis roulant - jusqu'à arrêt spontanné de l'animal ou analyse de la démarche - 15min).
Impact sur les animaux
La procédure d'elevage n'engendre aucune nuisance. En procédure de survie, il n'y a pas de manipulation sur les animaux pouvant générer stress ou douleur, il n'est attendu aucun effet indésirable majeur sinon que les rats BMD développement spontanément d'une dystrophie musculaire faible à modérée. Dans la procédure de caractérisation du phénotype, les animaux pourraient être stréssés par les manipulations et la contention liée aux examens comme le grip test, la plethysmographie et l'echocardiographie.
Devenir
En dehors de la procédure pour établir la courbe de suivie où nous devons aller jusqu'au décès naturel des animaux BMD, dans les procédures d'élevage et de caractérisation du phénotype du modèle BMB, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale d'une dose létale de pentobarbital sodique après l'induction d'une anesthésie 20 à 30 minutes avant, soit lors du remplacement des couples reproducteurs dans la procédure d'élevage soit à chaque point d'observation défini dans la procédure de caractérisation du modèle (6, 9, 12, 18, 24, 28 et 32 mois).
Remplacement
Nous souhaitons avec ce projet répondre à des questions qui ne peuvent être obtenues que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante les uns avec les autres ce à quoi l'utilisation des cultures cellulaires ne peut pas répondre intégralement.
Réduction
Chez l’homme la variabilité entre patients atteints d’une dystrophie musculaire de Becker est plus importante que chez les patients atteints d’une dystrophie musculaire de Duchenne, c'est pourquoi dans cette étude de caractérisation nous souhaitons utiliser des groupes de 10 rats BMD et 5 rats sauvages pour nos analyses afin d'être en mesure d'avoir des résultats significatifs. En fonction des statistiques obtenues, si cela est possible nous affinerons à la baisse ce nombre pour les saisines expérimentales ultérieures tout comme nous l’avons fait pour le modèle de rats DMD pour lequel il nous faut maintenant entre 6 et 8 rats DMD pour obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour étudier l'évolution de la maladie et l'effet des traitements que nous testons.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en portoirs dans de grandes cages ventilées et éclairées 12h par jour, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, le nombre d'individus par cage étant fonction de l'âge et du poids des animaux. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. Pour ce qui est de la gestion d'une douleur potentielle liée au développement de la maladie, nous utiliserons des points limites adaptés au développement de la maladie avec un suivi de l'état général des animaux et si nécessaire une injection d'un antalgique sera réalisée pour prévenir la douleur et en dernier lieu la mise à mort compassionelle si l'animal ne peut être soulagé.
Choix des espèces
Le rat phylogénétiquement proche de l'homme constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle rat a les atouts des rongeurs : courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants. Nous espérons que notre modèle rat de la dystrophie musculaire de Becker reproduira fidèlement la symptomatologie observée chez les patients et qu'il deviendra le modèle animal de référence en la matière dans la communauté scientifique puisqu'il n'existe à ce jour aucun animal modèle pour ce type de dystrophie. Pour l'élevage, nous utiliserons des femelles porteuses de la mutation et des males sauvages de l'âge de 8 semaines (maturité sexuelle) jusqu'à l'âge de 8 mois (les femelles auront fait 4 à 6 portées). Pour établir la courbe de survie, nous utliserons des animaux de l'âge de 6 mois (début potentiel des premiers symptômes de la maladie) jusqu'à leur décès donc potentiellement 32 mois (durée de vie d'un rat sauvage étant de plus ou moins 36 mois, nous estimons que les rats BMD devraient décéder un peu plus tôt). Pour la caractérisation du phénotype du modèle, nous utliserons des animaux de l'âge de 6 mois jusqu'à 32 mois, ainsi nous pourrons suivre la progression du dévéloppement de la maladie à différénts âges ce qui nous permettra d'établir s'il existe une bonne corrélation avec la pathologie humaine et de valider notre rat BMD comme modèle pré-clinique pour le développement de thérapies.
Etude pilote d’injection de virus adéno-associé par différentes voies intraveineuses chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Des femelles gestantes reçoivent une injection de virus dans la veine de la queue, et quatre d'entre elles subissent une laparotomie pour injecter directement leurs fœtus, l'objet étant de vérifier si le virus franchit le placenta. Le porteur reconnaît que la laparotomie peut être douloureuse et présenter un risque d'infection, et prévoit de tuer les petits à trois ou huit semaines après observation sous lampe UV. Il présente l'étude comme un test de faisabilité sans approche statistique, dont dépend l'application future à des souris modèles de myopathies.
Objectifs
Ce projet est une étude pilote permettant d'évaluer la capacité de certains virus à traverser la barrière placentaire. Pour étudier ce passage, des souris gestantes seront injectées en intraveineux avec des virus porteurs d'un composé vert fluorescent. Le passage placentaire sera évalué en étudiant la fluorescence des petits. Si les virus ne passent pas la barrière placentaire, les foetus seront injectés directement via leur veine vitelline au cours de la gestation. Si les virus sont capables de passer dans le système sanguin des embryons de souris, ceci permettrait à l'avenir de traiter de la même façon des souris malades avant la naissance, notamment des souris atteintes de maladies musculaires sur lesquelles nous travaillons au sein de l'équipe. Les virus pourraient alors être utilisés comme vecteurs pour délivrer des molécules thérapeutiques durant la gestation. Ce traitement in utero permettrait d'éviter ou d'atténuer notablement les phénotypes musculaires sévères dès la naissance.
Bénéfices attendus
Chez l'Homme, le diagnostic prénatal des maladies génétiques offre de plus en plus de possibilités d'envisager une thérapie génique in utero. Ces techniques d'injection prénatale représenteraient une solution de traitement pour certaines maladies musculaires et présenteraient de nombreux avantages. Tout d'abord, chez l'Homme, les traitements postnataux sont coûteux et durent souvent toute la vie. De plus, traiter la maladie avant la naissance serait très probablement davantage efficace de par la petite taille du foetus, la possibilité de transduire des cellules souches (cellules mères à partir desquelles les autres se développent) et l'absence de défense anti-virale. Si cette étude pilote s'avère positive, c'est-à-dire que la transduction foetale est efficace, nous pourrons envisager d'administrer (par l'une ou l'autre des 2 voies d'injection) un traitement à différents modèles de souris myopathes que nous possédons déjà au laboratoire. Ceci nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie de ces maladies musculaires.
Procédures
24 femelles gestantes seront soumises à une injection intraveineuse unique dans la veine de la queue (compter 3 minutes pour la réalisation du geste). A la naissance, les petits seront séparés de leur mère 5 minutes le temps d'être observés sous lampe UV. 4 femelles seront anesthésiées et une laparotomie sera effectuée. Les embryons de ces femelles seront injectés au jour embryonnaire 15.5 avec le virus en intraveineux. Cette procédure dure une trentaine de minutes au total de l'anesthésie de la femelle à son réveil. Les femelles seront soumises à une seule laparotomie et les petits à une unique injection au stade foetal. A la naissance, les petits seront séparés de leur mère 5 minutes le temps d'être observés sous lampe UV.
Impact sur les animaux
Les souris gestantes qui seront injectées dans la veine de la queue seront immobilisées dans une chambre de contention le temps de l'injection intraveineuse, il y a à ce moment un risque d'anxiété/stress. Suite à l'injection, les souris peuvent présenter un problème d'hémorragie, d'inflammation ou d'infection au site d'injection ou s'automutiler. Les petits des femelles injectées seront manipulés à la naissance le temps de l'observation sous lampe UV, ils seront séparés de la mère un court instant ce qui peut la perturber. En ce qui concerne les femelles qui seront anesthésiées afin d'exposer les foetus, l'opération de laparotomie peut s'avérer douloureuse et il y a un risque de mauvaise cicatrisation, d'inflammation ou d'infection.
Devenir
Une fois le sevrage des souriceaux effectué, les femelles seront euthanasiées et les petits seront observés à la naissance sous lampe UV puis euthanasiés à 3 ou 8 semaines pour prélever 4 organes différents ce qui nous permettra d'évaluer l'expression de fluorescence.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées in vitro car nous ne pourrons pas observer le passage ou non de la barrière placentaire sur des cellules ni le passage dans le système sanguin des embryons. De plus, si cette étude pilote s'avère concluante, nous pourrons appliquer ce protocole à des modèles animaux qui mimiquent bien les myopathies. Ceci nous permettra donc de mieux comprendre la physiopathologie de ces maladies musculaires.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au minimum, d'autant plus qu'il s'agit ici d'une étude pilote dépourvue d'approche statistique. Il s'agit d'évaluer la faisabilité d'un protocole. Au total pour les deux procédures, 28 femelles gestantes sont nécessaires ainsi que leurs petits (168). Pour la première partie du projet, il s'agit d'évaluer la capacité des virus à traverser le placenta. Pour cela, différentes conditions seront testées. 5 virus différents seront injectés (ayant des affinités pour des tissus différents) en duplicat, c'est-à-dire 2 femelles par injection (cela permet d'écarter la possibilité de différences inter-individus). De plus 2 femelles seront injectées avec le virus supplémenté d'une hormone permettant d'augmenter la perméabilité vasculaire afin d'optimiser le passage des composés. Ces injections (12) seront menées sur deux fonds génétiques différents car les souris peuvent présenter des différences génétiques qui peuvent être à l'origine de différences placentaires. Cette première partie du projet concerne l'injection de 24 souris et l'observation de leurs petits (144). En cas de résultat négatif, les foetus seront injectés directement. Pour cela, 4 femelles seront nécessaires (2 par fond génétique). Les femelles donnent en moyenne 6 embryons par portée, ce qui représente 24 embryons. 28 animaux seront donc utilisés au total lors de cette deuxième partie de projet.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Les souris seront hébergées par groupe de 2 par cage afin d'être sociabilisées et non isolées et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Tout inconfort de la souris détecté durant la gestation ou la mise bas sera traité en fonction des symptômes détectés. Tout signe de douleur sera pris en charge en prenant des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (soit un analgésique sera administré, soit les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire). Durant les expériences, les souris seront anesthésiées sous isoflurane et analgésiées par métacam (pendant et après la procédure). Pour l'injection IV des femelles, celles-ci seront placées dans la chambre de contention pendant quelques minutes durant les deux jours précédents l'injection, ce qui permettra à la souris de s'habituer à cette chambre et ainsi réduire son niveau de stress. Toutes les précautions adéquates seront prises pour assurer le bien-être des animaux lors des procédures expérimentales (plaque chauffante jusqu'au réveil, gel ophtalmique pendant l'anesthésie pour éviter le dessèchement de la cornée, surveillance des points limites).
Choix des espèces
La souris est très utile en recherche car l'expression de ses gènes est très similaire à celle de l'humain. Des modifications génétiques faites chez la souris ont permis d'obtenir des modèles de maladies musculaires affectant l'humain et ainsi d'étudier la pathologie et tester des pistes thérapeutiques. D'autre part, les souris présentent plusieurs avantages comme celui d'avoir un cycle de développement court, un élevage facile à bas coût, elles se reproduisent rapidement et donnent plusieurs petits par portée. Enfin, les études antérieures sur ces maladies musculaires ayant été conduites sur le modèle murin, l'utiliser à nouveau nous permettra de compléter nos résultats et de mieux comprendre la maladie. Ces analyses ne peuvent pas être faites sur cellules car il s'agit d'étudier le transport sanguin d'un composé et le passage à travers le placenta. Pour la première partie du projet les femelles seront injectées dès le premier jour de gestation afin d'assurer une diffusion optimale du composé dès la formation de l'embryon. L'injection des foetus sera quant à elle menée 15.5 jours après le début de gestation car la veine doit être suffisamment visible et accessible pour une injection précise. De plus, les embryons seront déjà bien développés ce qui réduit le risque de les endommager. Les petits seront observés dès la naissance pour voir si la transduction a eu lieu avec une lampe UV puis euthanasiés à 3 ou 8 semaines afin d'observer l'expression de fluorescence dans des organes spécifiques en fonction du temps. A 3 semaines les organes sont développés et faciles à identifier/isoler. L'observation à 8 semaines permettra de voir si l'expression de fluorescence persiste ou non.
Evaluation du portage d’agents zoonotiques spécifiquement des variants du SRAS-CoV-2 par les rongeurs sauvages commensaux de l’homme ou susceptibles de pulluler massivement dans les zones de culture ou d’élevage
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Rats : 500
Autres rongeurs : 4000
5 000 rongeurs sauvages vont être capturés puis tués sous anesthésie avant tout réveil. Rats, souris et campagnols sont piégés vivants, anesthésiés, soumis à une ponction de sang au cœur puis mis à mort pendant l'anesthésie, pour prélever leurs tissus. L'objet est de surveiller le portage du SRAS-CoV-2 et d'autres agents pathogènes par les rongeurs commensaux de l'homme ou proliférant dans les zones agricoles. Le porteur affirme qu'aucun remplacement n'est possible puisque le projet suppose de capturer ces animaux dans leur milieu.
Objectifs
Dès le début de la pandémie de COVID-19, la question de la contamination des animaux proches de l'homme susceptibles de pulluler massivement a été posée. S'il a été démontré que la famille des Muridae, qui comprend les rats et les souris, n'était pas réceptive à l'infection par la souche originelle du SRAS-CoV-2, l'émergence des nouveaux variants du SRAS-CoV-2 a modifié cette situation. En effet, il a été démontré que certains nouveaux variants peuvent infecter expérimentalement de jeunes souris et il a été suggéré que le variant Omicron se serait développé chez certains animaux, notamment chez la souris, avant d’être retransmis à l’homme. Un autre rongeur, le hamster, de la famille des cricitidés a été d'emblée de jeu réceptif à la souche originelle du SRAS-CoV-2 et a été utilisé comme modèle expérimental du SRAS-CoV-2. Ces éléments justifient la nécessité de surveiller le risque que les rongeurs sauvages deviennent des réservoirs de ce virus, à partir desquels il pourrait évoluer et se propager à l'homme. L'objectif principal de ce projet est donc d'évaluer le portage du SRAS-CoV-2 par les rongeurs prairiaux (campagnols) et urbains (rats, souris). En parallèle, le portage éventuel d'autres agents pathogènes zoonotiques (Leptospires, Hantavirus, HeV, autres coronavirus, etc) sera évalué, ainsi que leur résistance et leur exposition aux anticoagulants rodonticides (molécules utilisées pour gérer les populations).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer le portage du SRAS-CoV-2, selon l'émergence de nouveaux variants, par les rongeurs sauvages commensaux de l'homme et/ou subissant des périodes de pullulation importantes. Ce projet permetrra d'évaluer également le portage par ces mêmes rongeurs sauvages d'autres agents zoonotiques pathogènes . Ce projet permettra d'appréhender les facteurs de variations géographiques, climatiques, saisonniers, annuels de ce portage. Ce projet permettra d'évaluer la résistance et l'exposition de ces rongeurs aux anticoagulants raticides, principales molécules utilisées pour gérer les populations de rongeurs
Procédures
piégeage à l'aide de pièges à capture vivante, anesthésie, ponction sanguine intracardiauqe sous anesthésie, puis mise à mort par dislocation terminale pendant le temps de l'anesthésie
Impact sur les animaux
Un stress pourrait être induit par le piégeage et/ou l'anesthésie
Devenir
Tous les individus piégés seront mis à mort lors de la procédure afin de prélever les tissus biologiques pour les analyses génomiques de laboratoire.
Remplacement
L'objectif du projet a pour but d'évaluer le portage de variants du SRAS-CoV-2 par les rongeurs sauvages commensaux de l'homme (rats et souris) et/ou présents dans le zones de cultures et d'élevage et pouvant subir des pullulations massives (campganols, mulots). Cet objetcif implique le piégeage de ces rongeurs sauvages dans leur milieu. Aucun remplacement n'est donc possible
Réduction
Afin de permettre une détermination raisonnable de la prévalence de portage des variants du SRAS-CoV-2 et autres agents pathogènes zoonotiques et d'étudier les facteurs (géographique,climatique, écosystémique, urbanisation, age, sexe, etc) influençant ce portage, un nombre suffisant d'animaux par espèce doit être inclu pour permettre les analyses statistiques.
Raffinement
Afin de permettre les analyses sérologiques et génomiques, les rongeurs doivent être capturés vivants afin de disposer de tissus biologiques en très bon état de conservation. Une période de préappâtage sera mis en place pour habituer les rongeurs à rentrer dans les pièges et minimiser leur angoisse. Des aliments hautement appétants seront placés dans les pièges et permettront de minimiser le stress induit. Les pièges utilisés sont des nasses, pièges INRA avec abri/nichage ou sherman assurant à l'animal un espace suffisant. Les animaux seront anestésiés pour réaliser le prélèvement sanguin intracardique et seront mis à mort pendant le temps de l'anesthésie.
Choix des espèces
Le projet consiste en l'étude du portage zoonotique (variants du SRAS-CoV-2 et autres agents pathogènes zoonotiques) par les rongeurs sauvages vivants proches de l'homme (Rattus norvegicus, Rattus rattus, Mus musculus, Apodemus flavicollis, Apodemus, sylvaticus)) et/ou présents dans les zones de cultures et d'élevage et pouvant subir des pullulations massives (arvicola terrestris, microtus arvalis, microtus agrestis, Microtus duodecimcostatus, Myodes glareolus). La prévalence sera évaluée selon la zone géographique, climatique, le niveau d'urbanisation, le type d'élevage, l'espèce, le stade de développement et le sexe, et bien entendu selon l'émergence de nouveaux variants . Tous ces facteurs pourraient avoir un impact sur le portage par les rongeurs sauvages concernés par ce projet. Tous les stades de développement et sexes seront concernés.
Evaluation de différents candidats médicaments sur la mémoire traumatique dans un modèle de conditionnement aversif chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
930 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 180 réutilisés ensuite et les autres tués. Ils reçoivent des chocs électriques d'intensité modérée pour induire une mémoire traumatique, puis passent des tests comportementaux (interaction sociale, labyrinthe en croix surélevé, open field) et reçoivent des candidats médicaments. Le porteur reconnaît que les effets indésirables des produits testés ne sont pas prévisibles et que certains animaux seront tués à la suite de ces effets. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne remplace l'évaluation d'une molécule sur le conditionnement à la peur et que l'animal reste un "passage obligatoire" avant l'homme.
Objectifs
Chez l'Homme, l'exposition à un stress intense et traumatique peut induire un syndrome de stress post-traumatique chez certains individus. Ce trouble neuropsychiatrique est caractérisé par plusieurs symptômes : une agitation, de l'anxiété, des souvenirs et pensées traumatiques envahissant(e)s, des troubles du sommeil... etc. D'un point de vue neurobiologique, le syndrome de stress post traumatique semble venir d'un disfonctionnement du mécanisme appelé "conditionnement à la peur" permettant dans des conditions normales d'éviter des situations dangereuses et/ou traumatisantes. Le traumatisme associé à une situation particulière (l’environnement) entraine une réponse conditionnée de peur (tremblement, évitement) lorsque le sujet est de nouveau exposé à l’environnement sans la présence du traumatisme. Après plusieurs expositions à l’environnement sans le traumatisme, la réponse de peur diminue et disparait (phase d’extinction). Chez les patients atteint de cette maladie, ce phénomène d’extinction de la peur devient anormalement long. Un mécanisme de sensibilisation à la peur, où l'anxiété du patient face à des situations peu stressantes normalement devient alors exacerbée et durable après le traumatisme, se rencontre également chez certains patients. Chez l'animal, ce type de mémoire traumatique et l'anxiété associée due à la sensibilisation à la peur peuvent être étudiés en utilisant le test de conditionnement à la peur et différents protocoles comportementaux (comme test de l’anxiété et de l’interaction sociale) suivant une exposition à un stress modéré. Le but de ce projet est de démontrer la capacité de différents candidats médicaments à atténuer efficacement, à bloquer cette mémoire traumatique, faciliter l'extinction de la peur et réduire l'anxiété associée chez le rat en vue de faciliter l'extinction des souvenirs traumatiques et de l'anxiété chez le patient.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter l'anxiété liée au syndrome de stress post traumatique, une pathologie humaine touchant 5 à 12% de la population générale (données de l'Inserm https://www.inserm.fr/dossier/troubles-stress-post-traumatique/). A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendus.
Procédures
Les animaux seront soumis à des chocs électriques d'intensité modérée, puis remis dans le même environnement pour évaluer leur comportement (immobilité); ensuite au test d'interaction sociale et/ou test du labyrinthe en croix surélevé et/ou au test de l'open filed, à des prélèvements sur animal vigile et/ou anesthésiés. Les animaux seront aussi adminsitrés avec les candidats médicaments.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des chocs électriques d'intensité modérée afin d'induire chez l'animal une mémoire traumatique. Plusieurs test comportementaux seront réalisés afin d'évaluer l'anxiété: remise dans l'environnement stressant, test des interactions sociales, test du labyrinthe en croix surélevé et test de l'open field. De plus ils seront administrés avec les candidats médicaments. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques.
Devenir
Sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Et/ou Sacrifice des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le conditionnement à la peur). Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques: en général 10 animaux / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur ce type de mémoire émotionnelle car il présente une réponse d'immobilité robuste et reproductible. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
REALISATION DE TESTS REGLEMENTAIRES SUR LES INSULINES (lapins et souris)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Lapins : 750
2 550 souris et lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les animaux servant aux tests étant tués et les autres pouvant être réutilisés pour d'autres projets. Les lapins subissent un jeûne alimentaire d'environ quatorze heures et un jeûne hydrique de trois heures, deux injections sous la peau et six prélèvements de sang à l'oreille, les souris deux injections et un prélèvement à la joue. L'objet n'est pas la recherche mais le contrôle libératoire de lots commerciaux d'insuline exigé par les pharmacopées américaine et chinoise. Le porteur indique qu'un test sans animaux existe mais n'est accepté par ces pharmacopées que pour certaines insulines, et que le nombre d'animaux est fixé par la réglementation.
Objectifs
L’objectif de ces tests de contrôle de la qualité est de pouvoir mettre à disposition de patients des lots contrôlés d’insuline utilisés notamment pour le traitement de maladies métaboliques comme le diabète. En effet ce projet supporte la réalisation de tests de contrôle qualité dits « libératoires » pour des produits pharmaceutiques. La référence réglementaire appliquée à la réalisation de ces tests est la Pharmacopée (Américaine – USP et Chinoise – CH). Deux procédures sont décrites dans ce projet : L’une utilisant des lapins (Pharmacopée Américaine - US) et l’autre utilisant des souris (Pharmacopée Chinoise - CH). Ces essais permettent de vérifier l’activité hypoglycémique du médicament après son injection à un groupe de lapins ou de souris, en comparaison avec une solution d’insuline de référence injectée à un groupe témoin de lapins ou de souris. La glycémie est ensuite mesurée grâce à différents échantillons de plasma prélevés à différents temps après l’injection.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments à des patients. Ces tests (Insuline – USP et Insuline – CH) sont demandés pour la libération des lots de médicaments à base d’insuline ou homologue à destination des marchés Américain et Chinois (obligation réglementaire pour libération sur le marché). Ces tests sont décrits dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques.
Procédures
Procédure avec les lapins (vigiles) : - Animaux : Les lapins seront séparés en 4 groupes de 2 lapins - Mise à jeun alimentaire effectuée +/- 14h avant chaque jour de test - Mise à jeun hydrique : au moment des injections, les animaux subissent une mise à jeun hydrique qui durera +/- 3h - Injections : Chaque lapin recevra 2 injections en sous-cutanées en un point d’injection. Volume d’injection maximum 0.3 mL/kg. Les 2 injections se font entre 2 et 7 jours d’intervalle. - Prélèvements : Chaque lapin se vera prélever 1mL de sang via la veine marginale (oreille) : avant injection ; 1h après injection et 2h30 après injection. Procédure avec les souris (vigiles) : - Animaux : Les souris seront séparées en 4 groupes de 5 souris - Injections : Chaque souris recevra 2 injections en sous cutanée en un point d’injection. Volume d’injection maximum 10 mL/kg. Les 2 injections se font avec à minima 3 heures d’intervalle. - Prélèvements : Chaque souris se fera prélever environ 150 μL de sang via la voie submandibulaire : 40 minutes après injection. - Après le premier prélèvement une réhydration est effectuée par injection de NaCl (300 μL) en sous cutanée.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour l’animal sont : l’administration répétée des produits pharmaceutiques (2 injections par lapin et 2 injections par souris), prélèvements de sang (6 prélèvements par lapin et 2 prélèvements par souris), l’euthanasie en fin de protocole. Pour la procédure avec les lapins la mise à jeun alimentaire (+/- 14 heures) et hydrique (+/-3 heures) (procédure avec les lapins),
Devenir
Procédure avec les lapins : Les lapins non utilisés pour le test type Insuline pourront être utilisés pour d’autres projets après une période de 3 semaines de repos et si aucun signe clinique anormale est détecté ou être réutilisé pour un projet simialire (dégré de sévérité modéré). Procédure avec les souris : Les souris utilisées seront mises à mort et les souris non utilisées pour le test type Insuline pourront être utilisées pour d’autres projets.
Remplacement
Ce test est réglementaire et rentre dans le cadre de la pharmacopée Américaine et Chinoise. Ce test permet de valider l’activité des médicaments à base d’insuline. Aucun test équivalent sans animaux n’est proposé par la pharmacopée Chinoise. Le test équivalent sans animaux proposé par la pharmacopée Américaine n’est réglementairement accepté que pour certains types d’insuline à libérer (e.g. Insuline Lispro).
Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser est fixé par les pharmacopées CH (souris ) et USP (lapins ). Au regard des contraintes opérationnelles liées à l’exécution de ces procédures des animaux supplémentaires peuvent être commandés : 2 lapins en plus et 4 souris en plus. En effet – la pharmacopée CH demande une différence de poids de 3g maximum entre toutes les souris utilisées pour tester un produit à J0. A noter que le transport des souris inhérent à la réalisation de ce test peut leur faire perdre jusqu’à 10% de leur poids à réception. Également, les 2 procédures demandes des timings entre les injections et les prélèvements serrés. En cas d’incident (opérationnel ou sur l’animal), un autre congénère pourra être utilisé. Cela permettra d’éviter le renouvellement d’un test en entier et donc d’éviter d’utiliser plus d’animaux in-fine. Les animaux non utilisés lors de ces procédures pourront être utilisés à des fins de formation ou dans d’autres projets éthiques approuvés.
Raffinement
Lors des essais : - Les animaux sont hébérgés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre d’individus et à l’âge de ceux-ci, - Le milieu d’hébergement sera enrichi avec des moyens adaptés à l’espèce, - Des points limites sont définis et appliqués durant l’étude, - Une observation journalière des animaux est réalisée dès leur réception jusqu’à la fin de l’étude afin de garantir leur bien-être et d’identifier au plus tôt l’apparition de potentiel point limite, - Durant le test les animaux sont surveillés en permanence par les techniciens animaliers - Un poids minimal pour les souris utilisées a été validé avec le vétérinaire - Une réhydratation par injection (300 µL) de NaCl 0,9 % en sous-cutané des souris est effectuée après le premier prélèvement (bien que non demandée par la Pharmacopée CH) - Les prélèvements des souris sont effectués via la voie submandibulaire alors que la pharmacopée CH demande un prélèvement par la voie sinus rétro-orbitale.
Choix des espèces
Les espèces des animaux à utiliser sont fixées par les pharmacopées USP (lapins – procédure 1) et CH (souris – procédure 2). Les critères de sélection des animaux sont : -Lapins (USP) : poids supérieur ou égal à 1.8kg au début du protocole (requis pharmacopée) -Souris (CH) : poids supérieur ou égal à 35g à J0 (décision interne) et 3g maximum d’écart entre les souris (requis pharmacopée)
Caractérisation des changements fonctionnels cérébraux dans la migraine et impact des anti-migraineux par une nouvelle approche d’imagerie fonctionnelle ultrasonore ultrarapide chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
488 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils subissent des chirurgies de deux heures, une induction de crises de migraine par injections répétées et des séances d'imagerie de quatre à cinq heures sous anesthésie, la sensibilité de la face étant mesurée par application de filaments. Le porteur écrit qu'il ne soulagera pas les animaux pendant les crises migraineuses, dont il attend l'apparition chez tous les animaux induits, sur une durée allant jusqu'à dix jours dans le modèle chronique. Il affirme que les approches sur "l'animal entier" restent "incontournables" et qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'existe pour ces mécanismes de douleur.
Objectifs
La migraine est une pathologie neurovasculaire touchant près de 15% de la population mondiale qui se caractérise par des maux de tête (céphalées), associés à une hypersensibilité au bruit, à la lumière et aux stimuli tactiles, comme les caresses. La phase douloureuse est déclenchée par l’activation des terminaisons nerveuses innervant les méninges qui entourent le cerveau. Puis différentes régions du cerveau et des ganglions trigéminés seront activés à leur tour. Les modifications fonctionnelles et structurelles des réseaux neuronaux cérébraux impliquées dans la migraine, en particulier l’impact des antimigraineux, sont encore, à l’heure actuelle, mal connues. L’une des limitations est le manque de résolution des techniques d’imagerie disponibles pour les recherches sur le petit animal. Grâce à l’utilisation d’une technique innovante de neuroimagerie, nous proposons d’étudier les changements fonctionnels et structurels des différentes regions cérébrales impliquées dans la douleur associée aux crises migraineuses. De plus, nous voulons mieux comprendre les mécanismes d’action des antimigraineux et comme la migraine est plus fréquente chez la femme que chez l’homme nous voulons comparer des rats males et femelles. Pour cela, nous utiliserons différents modèles de migraine pertinents cliniquement. L’induction des modèles sera validé grâce à suivi étroit du comportement douloureux de nos animaux, avec la mesure de sensibilité mécanique faciale de l’ensemble des rats (contrôles et migraineux) avant, pendant et après la mise en place du modèle de migraine et lors des crises migraineuses. Ce test respecte les règles éthiques établies par l’IASP (International association for the Study of Pain) puisqu’il permet l’échappement de l’animal vis-à-vis du stimulus qui est de courte durée (3 secondes par stimulation mécanique).
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de mettre en evidence les changements fonctionnels au niveau cerebral et des ganglions trigéminés associés à la migraine. La comparaison des changements en contexte de crise aigüe ou chronique apportera des informations clés sur la le développement à long terme de la douleur migraineuse. De plus, l’évaluation de l’effet des traitements antimigraineux apportera des informations concrètes sur les changements fonctionnels cérébraux en réponse aux différents traitements. Enfin, les propriétés intrinsèques de la technologie de neuroimagerie utilisée apporteront de nouvelles informations pertinentes sur la composante neurovasculaire dans la migraine, qui joue un rôle clef dans sa physiopathologie. A plus long terme, les résultats de ce projet permettront d’envisager de futures études cliniques interventionnelles chez l’humain avec pour objectifs : 1) d’une part la confirmation des résultats obtenus chez l’animal chez l’humain et 2) d’autre part d’utiliser la neurostimulation d’une (ou des) zones identifiée(s) par notre technique innovante de neuroimagerie qui permettra la stimulation des structures cérébrales, même profondes, impliquées dans la physiopathologie de la migraine. Cette technique viendrait révolutionner la prise en charge thérapeutique des patients migraineux.
Procédures
Nous nous attendons à certaines nuisances et effets indésirables directement associés aux différents gestes techniques que nous allons réaliser : 1) Chirurgie pour permettre l’administration du mélange pro-inflammatoire en aigu. Cette chirurgie réalisée sous anesthésie générale (durée moyenne de 2h) sera réalisée sur 64 rats mâles et 64 rats femelles, une seule fois pour chaque animal. 2) Chirurgie de mise en place de la canule pour le modèle de mélange pro-inflammatoire chronique. Cette chirurgie réalisée sous anesthésie générale (durée moyenne de 2h) sera réalisée sur 64 rats mâles et 64 rats femelles, une seule fois pour chaque animal. 3) Chirurgie d’amincissement du crâne pour permettre la neuroimagerie. Cette chirurgie réalisée sous anesthésie générale (durée moyenne de 2h) sera réalisée sur l’ensemble de nos rats soit 244 rats mâles et 244 rats femelles, une seule fois pour chaque animal. 4) Modèle de migraine induit par l’administration d’un donneur de monoxyde d’azote en chronique : 4 injections intrapéritonéales réalisées sur animal vigile tous les jours pendant 4 jours et la 5ème injection sera réalisée sous anesthésie générale le 5ème jour : le jour de l’imagerie, sur 86 rats mâles et 86 rats femelles. 5) Modèle de mélange pro-inflammatoire aigu : injection sous anesthésie générale (10 minutes). Injection réalisée une seule fois sur 64 rats mâles et 64 rats femelles. 6) Modèle de mélange pro-inflammatoire chronique : 5 injections au total réalisées tous les deux jours sous anesthésie générale (10 minutes) via la canule guide sur 64 rats mâle et 64 rats femelle. 7) Neuromagerie: séance d’imagerie réalisée une fois pour chaque animal sous anesthésie générale (durée moyenne de 4 à 5h) par inhalation d’anesthésique gazeux pour l’ensemble de nos animaux soit 244 rats mâles et 244 rats femelles. 8) Mesure des seuils de sensibilité mécanique : mesure sur animal vigile pour l’ensemble de nos animaux soit 244 rats mâles et 244 rats femelles. Le test dure entre 60 minutes à 75 minutes mais l’application des filaments ne dure que 3 secondes et cette application n’est répétée qu’entre 5 et 8 fois. Cette mesure sera réalisée plusieurs fois selon les modèles, en amont, pendant et après les crises migraineuses.
Impact sur les animaux
Suite aux chirurgies, malgré l’utilisation d’antalgiques pendant et après ces procédures chirurgicales, les animaux peuvent présenter une activité réduire et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Ainsi, la période post-opératoire de 48h après une chirurgie d’amincissement avant la séance d’imagerie et d’une semaine après une chirurgie de mise en place d’une canule guide avant l’induction des modèles permettra une récupération complète de l’animal. Comme nous voulons étudier les mécanismes cérébraux associés aux douleurs migraineuses, nous ne soulagerons pas les animaux pendant les crises migraineuses. Il est donc attendu le développement de douleurs migraineuses pour l’ensemble de nos animaux induits. Cependant un suivi étroit sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal). Pour nos modèles, la durée moyenne des douleurs migraineuses sera de 1h30 pour une injection de soupe inflammatoire en aigu à 10 jours sur un modèle chronique avec des pic de douleur sous forme de crise d’1h à quelques heures et des phases moins douloureuses. Un suivi étroit de la douleur orofaciale sera réalisé dans chacun des modèles chroniques. Notons que nos analyses en imagerie se feront sur animal anesthésié, limitant ainsi la perception douloureuse de l’animal. Néanmois, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront monitorées grâce au suivi des fréquences cardiques et respiratoires. Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’anesthésique gazeux pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).
Devenir
L’issue de chacune des procédures n°1 à n°5 est la mise à mort des animaux par injection d’euthanasiant chimique pour les animaux utilisés pour la mise en place des modèles au sein du laboratoire ou par perfusion intracardiaque pour l’ensemble des animaux inclus dans notre étude.
Remplacement
Notre projet porte sur la mesure et le suivi des changements fonctionnels et structurels des différentes regions cérébrales impliquées dans la douleur associée aux crises migraineuses par une nouvelle approche de neuroimagerie. Dans ce contexte, les approches intégratives sur l’animal entier restent incontournables. A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur des processus cognitifs complexes et pour l’étude et l’analyse des mécanismes de la douleur.
Réduction
Pour ce projet et afin de respecter la règle de reduction, nous utiliserons un nombre limité de rats et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée (analyse de variance suivi d'un test post-hoc paramétrique si la distribution est normale ou un test non paramétrique dans le cas contraire). Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Un suivi quotidien sera assuré contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture. Les animaux seront hébergés à deux par cage dans le respect des surfaces réglementaires avec enrichissement (tunnel, bois à ronger). Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental et aux procédures. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous définirons un score décisionnel en fonction des observations quotidiennes permettant de modifier la procédure en cours avec administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou de metre à mort l’animal en dernier recours. Les chirurgies seront réalisées en conditions aseptiques. Pour réduire la douleur pendant la chirurgie, elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse et l’animal sera injecté avec des antalgiques. De plus, toute infection suite aux chirurgies prévues dans nos procédures, non maitrisable par traitements médicamenteux entrainera un arrêt immédiat du protocole en cours et l’euthanasie de l’animal par une dose létale d’euthanasiant chimique sous anesthésie gazeuse. Pendant toute la durée des actes sous anesthésie, les constantes vitales seront suivies : température corporelle, pression partielle en O2 et fréquences cardiaque et respiratoire. Aucun acte ne sera entreprit avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement la mise à mort de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’euthanasiant chimique.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour les études comportementales et des bases physiologiques du cerveau car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionnelle transposable aux humains. Le modèle rat est en particulier adapté aux études comportementales pour sa rapidité d’adaptation. Son poids et sa taille permettent d’avoir une bonne flexibilité expérimentale sans avoir recours à une miniaturisation ayant un coût prohibitif. De plus, les modèles de migraine choisis ont déjà été développés chez le rat et diminueront le nombre d’animaux utilisé pour la mise en place des modèles de migraine. Les rats seront reçus au poids choisi de 150-200g, correspond à celui d’un jeune adulte. Ainsi après une semaine d’habituation et une semaine de comportement, les animaux seront aux poids d’environ 250-300 g pour les mâles et 200-250 g pour les femelles pour démarrer les chirurgies. Notons que plus les animaux sont âgés, plus le crâne est épais et donc la chirurgie d’amincissement longue et susceptible de créer des dommages.
Implication du MIcrobiote dans les maladies CARdiométaboliques (MICAR)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des transferts de microbiote humain par gavage puis des prélèvements de sang, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans les maladies cardiométaboliques. Le porteur précise qu'une souris en inconfort sera sortie du protocole et tuée plutôt que soignée, un traitement pharmacologique risquant de fausser le microbiote étudié. Il qualifie la compréhension du microbiote d'"indispensable" et juge le modèle murin "incontournable" pour ce transfert fécal.
Objectifs
Nos objectifs sont de déchiffrer (i) le rôle physiopathologique du microbiote intestinal dans les pathologies cardiométaboliques, (ii) de découvrir des biomarqueurs liés au microbiote intestinal dans ces maladies (qui pourraient être utilisés soit pour la prédiction ou le pronostique) et enfin (iii) d'effectuer des études sur la preuve du concept de développement thérapeutique pour modifier la dysbiose dans ces maladies et améliorer ainsi la santé de tous. Le premier objectif est de mieux comprendre comment le microbiote intestinal est impliqué dans les maladies cardiométaboliques. À cette fin, nous utilisons l'approche suivante : nous identifions les différences de microbiote intestinal en termes de composition, de fonction ou de production de métabolites chez des cohortes de patients humains à différents stades de gravité de la maladie pour identifier la signature de cibles bactériennes potentielles d'une maladie. Ensuite nous confirmons plus spécifiquement les cibles dans des modèles de souris humanisées dans lesquels nous pouvons transférer les selles de patients bien phénotypes et évaluer le phénotype clinique induit de façon différenciée (la glycémie, la cholestérolémie, la prise de poids, la stéatose, l'inflammation et l'athérosclérose). Ces transferts fécaux chez la souris compareront les patients avec ou sans les maladies ou à différents stades de gravité ou encore avec ou sans un médicament spécifique (en évaluant si le médicament a un impact sur le microbiote intestinal et par la suite sur la santé métabolique ou si le médicament est plus actif chez les patients avec une composition spécifique en microbiote intestinal).
Bénéfices attendus
Les travaux menés depuis 15 ans positionnent le microbiote à l’interface entre organismes vivants et leurs environnements et démontrent son influence considérable sur le fonctionnement de multiples voies métaboliques et d’un grand nombre d’organes, intestin, foie, système immunitaire, cerveau, mais aussi poumons, système cardiovasculaire, rein, os. 50% des métabolites circulants seraient issus du métabolisme bactérien. Le microbiote apparaît ainsi comme un déterminant clé au carrefour de la physiologie et de multiples pathologies en attente de progrès thérapeutiques. Il émerge aussi comme une puissante courroie de transmission des changements environnementaux et ceci en interface directe avec notre horloge biologique. En effet, sa composition en bactéries mais aussi la synthèse des multiples molécules issues du métabolisme bactérien varient en fonction du rythme nycthéméral, de l’alimentation, de la prise d’antibiotiques et de l’exposition aux agents infectieux comme aux polluants. Les modifications du microbiote induites par les changements récents de l’environnement humain semblent ainsi un acteur majeur non seulement dans l’épidémie actuelle de maladies métaboliques et inflammatoires chroniques de cancers, mais également dans la survenue de certains cancers et maladies auto-immunes. La compréhension par une approche ‘holistique’ des effets du microbiote comme des mécanismes qui contrôlent sa composition et son activité métabolique, se révèle donc aujourd’hui indispensable pour mieux appréhender la physiopathogénie de nombreuses maladies, améliorer leur prise en charge et leur prévention. Ce projet permettra de mieux comprendre les interactions entre le microbiote humain et les organes cibles des différents facteur de risque cardiovasculaires afin de pouvoir par la suite, élaborer une thérapie efficace et moins contraignante pour les patients.
Procédures
Les animaux seront tous soumis a 3 gavages de microbiote 3 jours de suite (1800 souris) et de FITC-dextran (max 360). Pour le gavage les animaux doivent être maintenu par contention douce et ferme sur animal vigile afin de ne pas les blesser et ajuster le geste de gavage à leur déglutition/respiration et à tout signe potentiel de douleur. Le gavage dure 4-5 secondes environ. Toutes les prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse (3 maximum par animal sur une période de 114 jours). Une prise de sang dure environ 10-15 secondes. La récolte des fèces sera réalisée sur des animaux vigile qui sont maintenus en cages individuelles environ 30 mn le temps de récolter des fèces fraiches au fond de la cage.
Impact sur les animaux
Les animaux pourrait souffrir d'inconfort (poils hérissés, dos vouté, hypothermie (froid au toucher) ou de comportements anormaux: immobilité, hyperactivité, diarrhée prolongée.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux à la fin des procédures
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l'impact du microbiote humain sur la physiologie de l'hôte ce qui est impossible in vitro, ni possible chez l'homme in vivo. Toutes les expérimentations sur l'animal seront conduites en respectant la règle des 3R.
Réduction
Pour les analyses statistiques, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance permetant une interprétation fiable des résultats. Une visite quotidienne des animaux sera effectuée pour vérifier leur état général et ne pas atteindre un des points limites. Un nombre maximale de 1800 animaux sera utilisé sur une periode de 5 ans. Chaque groupe d'animaux fera l'objet d'une analyse complete et détaillée : suivi de la prise de poids, ramassage des feces fraiche et en fin d'étude les souris seront euthanasiés. Une analyse phenotypique complête sera réalisée sur chaque animal (tissus et contenus intestinaux). Ces analyses exhaustives évitent de multiplier les groupes experimentaux.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Si les animaux devaient souffrir d'inconfort (poils hérissés, dos vouté, hypothermie (froide au toucher) ou comportements anormal immobilité, hyperactivité, diarrhée prolongée, ils seraient alors sortis du protocole et euthanasiés car tout traitement pharmacologique visant à prévenir l'inconfort pourrait affecter le microbiote et créer un biais dans les phénotypes recherchés. Les prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse après application d'un gel ophtalmique.
Choix des espèces
Le besoin d’avoir recours à des modèles expérimentaux permettant d'évaluer des changements de microbiote et leur impact sur la sante après transfert fécal spécifique de matériel fécal humain rend le modèle murin incontournable. De même l'accès aux contenus intestinaux et aux tissus murins ayant cohabité avec un microbiote humain représente un outil de comparaison avec l'homme avant de concevoir des études cliniques plus spécifiques. Ces modèles animaux sont de plus des modèles génétiques de prédisposition aux pathologies cardiométaboliques. Nos études requièrent que les animaux soient transplantés au moment du sevrage (3 semaines) lorsque la fenêtre de transférabilité du microbiote est la plus opportune en raison de l'adaptabilité du système immunitaire. Dans les deux procédures nous devons attendre environ 3 mois pour que les phénotypes cardiovasculaires (athérosclérose) se manifestent. Entre le gavage des fèces et le sacrifice, 13 semaines s'écouleront le temps qu’un équilibre se fasse chez la souris receveuse en termes de stabilité de l’écosystème bactérien en équilibre avec le système immunitaire de l’hôte.