Rongeurs
Impact du stress in utero sur l’infection bactérienne
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 016 dans des procédures de souffrance sévère. Des femelles gestantes sont enfermées dans un tube de contention sous lumière vive trois fois par jour pendant six jours, et leur descendance est infectée par gavage bactérien puis soumise à une distension colorectale par électrodes implantées sous chirurgie et à un test d'anxiété en labyrinthe surélevé. Le porteur indique que l'infection provoque une colite avec diarrhée et sang dans les selles, et que les petits développent des comportements anxieux et dépressifs durables. Il affirme que la douleur, le stress et l'infection sont des réactions de l'"organisme entier" impossibles à reproduire in vitro.
Objectifs
Les maladies inflammatoires et/ou douloureuses chroniques (comme les maladies auto-immunes et allergiques) représentent un problème majeur de santé publique et les approches thérapeutiques utilisées aujourd’hui ne donnent pas entière satisfaction. Il est donc important de comprendre la physiopathologie de ces maladies au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. De nombreux facteurs environnementaux ont été décrits comme participant à la genèse de ces pathologies ou comme facteurs facilitateurs de la mise en place de ces maladies chroniques. Parmi ces facteurs environnementaux, de nombreuses études épidémiologiques placent le stress et les infections bactériennes comme les facteurs majeurs impliqués dans la régulation de la douleur et de l'immunité. L'objectif de notre projet est de comprendre l'association qui pourrait exister entre le stress et l'infection dans la mise en place du système immunitaire intestinal et de la sensibilité viscérale.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche devrait nous permettre de mettre en évidence le rôle du stress et de l'infection au cours de la gestation sur le développement de maladie chronique chez la descendance. Il s'inscrit dans le concept beaucoup plus large des 1000 premiers jours de vie. En effet, beaucoup de grands systèmes (nerveux, immunitaires, intestinaux…) s’établissent au cours des 1000 premiers jours de vie de l’enfant en parallèle et de façon interdépendante de l’établissement du microbiote intestinal. Le stress et les infections bactériennes interagissent avec tous ces systèmes et peuvent donc avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu. Les retombées immédiates de ce projet seront une meilleure connaissance de l'implantation du microbiote intestinal en lien avec la maturation du système immunitaire, de l'infection chez l'enfant, de l'impact du stress lors de la grossesse et de l’impact de ces perturbations sur la mise en place de maladie chronique à l’âge adulte. Nos analyses biologiques devraient permettre de déterminer des biomarqueurs permettant une prise en charge ciblée de ces pathologies.
Procédures
Pour générer des souris F1 issues de mères stressées, 84 femelles seront placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour, pendant 6 jours, du 13ème jour au 18ème jour de gestation. Pour une étude, sur les 576 souris F1, la moitié sera soumise à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 3ième semaine de vie. Sur la moitié des souris infectées ou non infectées, soit 288 souris, la douleur viscérale sera déterminée par distension colorectale suite à l’implantation d’électrodes sous anesthésie chirurgicale (environ 1h) à la 8ième semaine de vie. La perméabilité paracellulaire sera évaluée soit à la 5ième semaine de vie, soit à la 8ième semaine de vie, avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse. Pour une deuxième étude, sur les 576 souris F1, la moitié des souris sera soumise à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 3ième semaine de vie. Sur l’ensemble des 576 animaux, le comportement anxieux sera évalué par le test du labyrinthe en croix surélevé sur animaux vigiles à la 5ième semaine de vie (288 souris) ou à la 8ième semaine de vie (288 souris). La perméabilité paracellulaire sera évaluée soit la 5ième semaine de vie (288 souris) ou à la 8ième semaine de vie (288 souris) avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse. Dans une dernière partie de l’étude, sur les 864 souris, 288 des souris F1 seront soumis à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 8ième semaine de vie alors que 288 souris seront soumises à une double infection par 2 gavages, un gavage à la 3ième semaine de vie et un gavage à la 8ième semaine de vie sur animaux vigiles. Sur la moitié des souris soit 432, la douleur viscérale sera déterminée par distension colorectale suite à l’implantation d’électrodes sous anesthésie chirurgicale (environ 1h) à la 10ième semaine de vie sur l’ensemble. Sur l’autre moitié des souris soit 432, le comportement anxieux sera évalué par le test du labyrinthe en croix surélevé sur animaux vigiles à la 10ième semaine de vie. La perméabilité paracellulaire sera évaluée à la 10ième semaine de vie avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
Ce modèle de stress prénatal n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Nous attendons le premier jour de la procédure de stress une stabilisation du poids ou une perte de moins de 3.5% du poids des mères gestantes en comparaison avec les mères gestantes non stréssées. Dès le deuxième jour de la procédure de stress les mères gestantes doivent reprendre du poids. Le stress réalisé sur les mères gestantes ne comporte pas d'effet visible comportemental. Le stress prénatal entraine chez la descendance des comportements anxieux et dépressifs observés tout au long de la vie et révélés à l’aide de test comme le labyrinthe en croix surélevé. Ces comportements n’ont cependant pas d’impact sur la prise alimentaire ou la croissance des animaux. L’infection par citrobacter rodentium entraine une réponse inflammatoire colique transitoire (entre le 5ème et le 15ème jours post gavage). Lors de la colite, les souris souffrent de diarrhée, de présence de sang dans les selles et d’une perte de poids. La bactérie n’est plus détectée dans les selles 21 jours après le gavage. Trente jours après le gavage, les souris ne présentent plus de signes macroscopiques d’inflammation. Au niveau microscopique, elles présentent un épaississement de la muqueuse et de la musculeuse du colon. De nombreuses études ont utilisé l’infection par citrobacter rodentium, les doses que nous allons utiliser dans notre étude ont été décrites comme n’ayant pas d’impact sur la survie. Après la chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle pendant 4 jours au maximum afin d'éviter qu'ils ne se mangent les électrodes. Nous ne pouvons pas replacer les animaux ensemble, car sans les électrodes nous ne pouvons pas enregistrer l'activité musculaire au cours de la distension colorectale.
Devenir
Les animaux ayant servi à générer la descendance F1 seront mis à mort après le sevrage des F1 et des prelèvements d'organes seront réalisés. Les souris F1 après simple infection seront euthanasiées à différents âges : soit à 5 semaines de vie soit à 8 semaines de vie. Les souris F1 après double infection seront euthanasiées à 10 semaines de vie. Des prélèvements tissulaires seront collectés pour différentes études au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut immunitaire et douloureux de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. De plus, la douleur, le stress, l'infection et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.
Réduction
Pour ce modèle, les animaux seront suivis régulièrement au cours du temps par des techniques non invasives comme le suivi du poids, la consistance des fèces et la présence de sang dans les fèces évaluée par le test HémoccultII® et de façon plus spécifique par l'analyse des scores cliniques pour l'infection. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude, permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. Le nombre de 12 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées. Nous utiliserons des analyses non paramétriques, le test Kruskal-wallis suivie d'un test post-hoc de Dunn pour les analyses multi-groupes et le test de Wilcoxon-Mann-Whitney pour les analyses concernant deux groupes.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, dans un premier temps, des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Selon la durée de l’étude, un deuxième enrichissement pourra être introduit dans l’environnement, tel que des aspen Brick, des tunnels en polycarbonate ou des igloos. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Une veille bibliographique sera effectuée pour déterminer si des méthodes de remplacement ont été mise en place. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure.
Choix des espèces
La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons également de souris déficientes pour l'expression de certains gènes cibles. Ces souris déficientes pourront, si ce projet aboutit, faire l'objet d'une nouvelle demande. Les mères seront stressées du 13 au 18 éme jours de gestation. C'est la période décrite dans la littérature pour ce modèle. Ensuite les souris F1 seront utilisées soit à 5 semaines de vie pour évaluer l'impact direct su stress et de l'infection avant le sevrage, soit à 8 semaines de vie pour évaluer l'impact du stress et de l'infection sur des animaux adultes et matures. D'autres souris F1, infectées ou non par citrobacter rodentium à la 3ième semaine de vie et ré-infectées à la 8ième semaine de vie pour évaluer l'éducation du système immunitaire vis-à-vis ce cette bactérie pathogène, seront utilisées à la 10ième semaine de vie.
Projet Fibrose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1150
12 350 animaux non-humains vont être utilisés, souris et rats, tous tués à l'issue, dont environ 4 600 dans des procédures de souffrance sévère. Quatre fibroses, rénale, pulmonaire, hépatique et dermique, leur sont provoquées, avec administrations répétées de composés pendant six à huit semaines, chirurgies et prélèvements sanguins, pour cribler des molécules antifibrotiques. Le porteur décrit des pertes de poids et des troubles respiratoires liés aux modèles. Il affirme que la mise à mort est "indispensable" pour prélever les organes et que les tests in vitro ne permettent pas de se passer de l'animal, avec pour horizon une mise sur le marché.
Objectifs
La fibrose se définit comme un processus pathologique de cicatrisation tissulaire. Elle est observée dans la majorité des organes (poumon, foie, rein, peau…). Le besoin médical est important car environ 45% des décès dans les pays développés sont reliés à une maladie fibrosante. Néanmoins à ce jour, aucun traitement curatif contre la fibrose n’est disponible et ce quel que soit l’organe touché. Deux traitements prescrits pour la fibrose pulmonaire permettent de ralentir la progression de la maladie sans nécessairement réduire les symptômes chez les patients. Dans ce contexte, le but de ce projet est de développer de nouvelles thérapies pour répondre à ce besoin médical important.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun médicament utilisé dans le traitement de la fibrose chez l’homme n'a permis de reverser et/ou stopper complètement une fibrose établie sur le plan histologique ou clinique. Toute fibrose confondue représente 45 % des décès dans les pays développés. Le but des expérimentations mises en place est de développer des molécules pouvant ralentir et/ou stopper le développement de la fibrose dans nos modèles expérimentaux. Les différentes procédures utilisées dans ce projet vont nous permettre d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des différentes fibroses. Elles vont également nous permettre, en support du travail réalisé in vitro, la recherche et la validation de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de la fibrose. De plus ces procédures nous permettront, une fois une cible identifiée, de développer de petites molécules permettant de reverser et/ou stopper le développement de la fibrose et aussi d’évaluer des combinaisons thérapeutiques afin d’augmenter l’efficacité ou de limiter les effets non désirables de certains composés prometteurs pour le traitement de la fibrose. L’ensemble de ces travaux a pour but d’avancer au maximum le développement préclinique de traitement anti-fibrotique en vue de leur développement clinique et leur mise sur le marché.
Procédures
Les gestes techniques réalisés sur animaux se pratiquent sur rats et souris, vigiles ou anesthésiés. - Sur animaux vigiles : o Identification individuelle (oreille, queue, patte). Tous les animaux de ce projet sont concernés par au moins un type d’identification. o Administration de composés par voies orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse. Ces gestes concernent la totalité des animaux de ce projet. Les administrations par voies orale, péritonéale et sous-cutanée peuvent être réalisées une à deux fois par jour, pendant 6 à 8 semaines. Les administrations par voie intraveineuse peuvent être réalisées une à deux fois par semaine, pendant 6 à 8 semaines. - Sur animaux anesthésiés par voie gazeuse ou par voie systémique : o Administration par voie oropharyngée. Acte unique qui concerne 1500 souris. o Administration par voie sous-cutanée. Acte réalisé au maximum 5 fois par semaine, pendant 4 semaines qui concerne 250 souris o Prélèvements sanguins intermédiaires au maximum 4 fois par animal ou terminaux. Ils sont réalisés en respectant les recommandations en termes de volumes et temps de récupération. Tous les animaux de ce projet sont concernés. o Mises à mort par une méthode règlementaire ou une méthode validée par un comité d’éthique. Tous les animaux de ce projet sont concernés. o Chirurgie (acte unique). Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. 600 souris et 250 rats sont concernés.
Impact sur les animaux
Quatre procédures décrivent des modèles de fibroses (rénale, pulmonaire, hépatique et dermique) qui par conséquent recréées de façon accélérée toutes les étapes impliquées dans la progression de cette pathologie. Ces modèles sont bien caractérisés dans nos laboratoires et n’engendrent pas d’effets indésirables autres que ceux liés aux modèles eux-mêmes. Le modèle de fibrose rénale nécessite de recourir à la chirurgie pour sa mise en place. Cette chirurgie provoque une perte de poids mineure. Sur la durée pendant laquelle le modèle est étudié, aucun signe clinique majeur n’est relevé. Les modèles de fibrose pulmonaire et dermique engendrent l’apparition de signes cliniques bien caractérisés tels que la perte de poids, liée essentiellement à une phase inflammatoire précoce et un trouble respiratoire par la suite. Le modèle de fibrose hépatique n’engendre pas de signes cliniques caractéristiques sur la durée pendant laquelle il est réalisé.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue des procédures est indispensable afin de pouvoir prélever le sang et les organes et réaliser les analyses permettant de répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Pour tester l’activité in vivo des composés issus du screening cellulaire in vitro, il est indispensable de recourir à l’utilisation de modèles animaux reproduisant le plus possible la pathologie humaine, qui intègrent toute la complexité des réactions physiologiques (interactions intercellulaires, inter-organes, inflammations…). Tous les modèles utilisés sont très bien décrits dans la littérature scientifique et ont été validés avec des composés de référence. Le processus de screening des composés est réalisé sur des tests cellulaires ou non-cellulaires in vitro. Ces tests permettent de réduire le nombre de composés à tester chez l’animal mais ne permettent malheureusement pas de se passer des modèles animaux.
Réduction
La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in-vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront testées sur les animaux. Ce système permet de réduire considérablement le nombre de molécules testées chez l’animal et donc le nombre d’animaux utilisés. Seuls les modèles animaux, bien décrits et validés par la communauté scientifique sont réalisés. En règle générale, 5 à 12 animaux sont utilisés par groupe. Des analyses statistiques permettent de mesurer si l’effet du composé est significatif. L’étude est répétée une deuxième fois pour évaluer la reproductibilité du test.
Raffinement
Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. Dès l’arrivage, les animaux sont habitués à la manipulation afin de limiter le stress lors du déroulement des procédures. Ils sont observés tous les jours et leur état clinique est évalué au minimum deux fois par semaine grâce à des grilles de signes cliniques permettant une gradation précise et adaptée de leur gravité. Ces grilles gradées engendrent la mise en place d’actions correctives comme la modulation des doses et fréquences des composés administrés ou l’ajout d’aliment gélifié dans les cages, voire l’arrêt de la procédure pour les animaux concernés (points limites et critères d’arrêt). Lors des procédures, notamment chirurgicales, les animaux bénéficient de soins peropératoires comprenant l’administration d’antalgiques et d’anesthésiques. Leur réveil est monitoré sur couverture chauffantes et accompagné de soins tels que l’ajout de complément d’enrichissement de leur milieu. Les conditions de chaque procédure expérimentale sont étudiées individuellement par la Structure Chargée du Bien-Être Animal (SBEA) qui émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux.
Choix des espèces
En pharmacocinétique, la souris puis le rat sont les espèces standards dans les premières phases de recherche et développement de nouveaux candidats médicaments. Le rat est choisi pour les molécules les plus intéressantes, afin de commencer la comparaison pharmacocinétique inter espèce, ainsi que de préparer les études de toxicologie futures. En pharmacologie, la souris est l’espèce recommandée et largement utilisée pour les premières étapes de la recherche. Elle permet de réduire les quantités de composés nécessaires à l’évaluation de leur efficacité. Les souris génétiquement modifiées permettent de valider de façon plus spécifique certains mécanismes d’action. Les modèles de fibrose ainsi que les études de pharmacocinétique sont réalisés avec des animaux juvéniles à adultes qui permettent une bonne évaluation de leur efficacité et la détermination de l’exposition des composés.
Évaluation de la coordination et de l’apprentissage moteur de souris génétiquement déficientes pour un récepteur de la sérotonine impliqué dans les troubles du spectre autistique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement privées d'un récepteur de la sérotonine, elles sont placées six jours sur un cylindre rotatif à vitesse croissante pour mesurer leur coordination, comme modèle des troubles du spectre autistique. Le porteur indique que le protocole n'entraîne pas d'effet grave, seulement un environnement stressant et un effort physique, avant l'euthanasie et le prélèvement de tissus. Sur le remplacement, il se borne à affirmer qu'il n'existe "pas d'alternative" aux tests de comportement sur souris.
Objectifs
Nous nous intéressons aux maladies psychiatriques, et en particulier aux troubles du spectre autistique (TSA). Dans cette maladie, les patients souffrent de problèmes de sociabilité, de difficultés à apprendre et de troubles de la motricité. A ce jour, aucun modèle ne permet d’étudier ces 3 types de symptômes simultanément. Un récepteur de la sérotonine, appelé 5HT6 joue un rôle majeur dans le développement de ces troubles autistiques. Nous avons montré que des souris génétiquement déficientes pour ce récepteur présentent les symptômes de sociabilité et d’apprentissage. Nous souhaitons donc déterminer si ces souris présentent également des difficultés motrices, ce qui en ferait un modèle idéal d’étude des TSA. Nous souhaitons donc évaluer l’habilité motrice de ces souris déficientes et leur capacité à apprendre, en les comparant à des souris de type sauvage dans le test du rotarod.
Bénéfices attendus
Il n’existe à ce jour aucun médicament permettant de traiter les patients présentant des TSA. Ce projet permettra de compléter l’évaluation du rôle du récepteur 5HT6 dans les symptômes moteurs des TSA et de confirmer qu’il est donc une cible thérapeutique prometteuse pour traiter à la fois les déficits cognitifs et moteurs des TSA.
Procédures
Les animaux seront soumis à un test comportemental non invasif, ayant pour but d’évaluer leurs capacités motrices. Le protocole consiste à les placer sur un cylindre rotatif tournant à vitesse croissante, et à mesurer la latence de chute. La durée maximale du test est de 1000s. Nous allons soumettre les animaux pendant 6 jours à un effet effort physique modéré, auquel ils pourront se soustraire à tout moment.
Impact sur les animaux
Ce protocole expérimental ne présente pas d’effets indésirables graves. Les nuisances éventuelles sont un environnement stressant et un effort physique.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés après la tâche comportementale et des tissus pourront être prélevés pour analyses biochimiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative aux expériences de comportement sur modèles murins pour évaluer leurs capacités
Réduction
Les effectifs ont été calculés en utilisant des outils statistiques afin de permettre une réduction des effectifs optimisée Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, nous testerons chaque animal dans différentes tâches et nous utiliserons les tests statistiques adéquats
Raffinement
Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes que subissent les animaux au cours des expériences. Concernant l’hébergement, les souris seront hébergées en groupe sociaux de 2 à 4 individus, ayant à disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, nous testerons chaque animal dans différentes tâches et nous utiliserons les tests statistiques adéquats. Pendant les expériences, nous suivront quotidiennement le bien-être de nos animaux en particulier leur poids et leur posture. Nous mettrons en place des points limites adaptés afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels on peut facilement détecter des altérations des comportement. Par ailleurs, les comportements de ces animaux sont suffisament riches pour pouvoir évaluer des réponses comportementales connues pour être affectées dans les pathologies et notamment les TSA. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est un outil de choix pour étudier in-vivo la fonction d’un gène. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8-12 semaines), âge auquel le répertoire comportemental est totalement développé et les déficits comportementaux fixés
Etude des connections synaptiques entre le télencéphale basal et le bulbe olfactif
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies cérébrales d'environ une heure sous anesthésie, puis sont mises à mort deux à trois semaines plus tard pour prélever leur cerveau, afin d'étudier les circuits entre le télencéphale basal et le bulbe olfactif. Le porteur décrit une perte de poids et une gêne liée aux sutures dans les jours suivant la chirurgie. Il reconnaît ne pouvoir prévoir le nombre d'expériences ni fixer une hypothèse statistique et relie ce travail exploratoire à un possible signe précoce de la maladie d'Alzheimer.
Objectifs
Des neurones localisés dans les noyaux cholinergiques du télencéphale basal projettent dans le bulbe olfactif, le premier relai de traitement de l’information sensorielle olfactive dans le cerveau. Ces neurones auraient pour fonction de moduler l’activité du bulbe olfactif, et donc les performances olfactives, en fonction du contexte comportemental (par exemple les conditions d’attention, de stress ou d’éveil) ou métabolique (par exemple l’état de satiété) de l’animal. Cependant, les projections en provenance du télencéphale basal sont massives et diverses et toutes leurs cibles et actions dans la bulbe olfactif n'ont pas été caractérisées. Il y a en outre dans le télencéphale basal plusieurs populations de neurones cholinergiques ou GABAergiques et chacune a probablement des cibles spécifiques dans le bulbe olfactif. Les objectifs de ce projet sont : 1) identifier les sous-populations de neurones du télencéphale basal qui projettent dans le bulbe olfactif, 2) déterminer leurs cibles dans le bulbe olfactif, 3) évaluer l’impact de cette innervation neuromodulatrice sur l’activité du bulbe olfactif.
Bénéfices attendus
Les voies de neuromodulation des circuits olfactifs et les conditions de leur mise en jeu in vivo ont été peu étudiées. Pourtant, la modulation de l’odorat en fonction du contexte comportemental et physiologique de l’animal a une importance considérable dans la vie des animaux qui dépendent de leur odorat pour survivre. Chez l’homme, la récente épidémie de Covid nous a rappelé combien les troubles de l'olfaction peuvent affecter la vie quotidienne des patients. Par ailleurs, les troubles de l’olfaction sont parmi les premiers symptômes de la maladie d’Alzheimer et d'autres neuropathologies dégénératives, apparaissant des années avant les symptômes cognitifs. Le lien entre odorat et Alzheimer n’est pourtant pas clairement établi. Il y a en revanche un consensus sur le fait que les voies neuromodulatrices cholinergiques dégénèrent précocement dans la maladie d’Alzheimer. Décrire chez l’animal l’organisation et l’influence des noyaux cholinergiques sur les circuits olfactifs devrait renforcer l’idée que les troubles olfactifs chez l’homme doivent être considérés comme un signe précoce annonciateur d’une possible maladie neurodégénérative.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale, d'une durée d'environ 1 h, ou deux interventions chirurgicales à deux semaines d'intervalle d'une durée d'environ 1 h chacune. Chaque chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie profonde.
Impact sur les animaux
Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et éventuellement des douleurs chez la souris, même si tout est mis en œuvre au moment de la chirurgie pour les réduire. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les fils de suture peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours.
Devenir
Tous les animaux entrant en procédure sont mis à mort 2 à 3 semaines après le début de la procédure afin de prélever leur cerveau. Des expériences d'électrophysiologie seront alors réalisées sur des tranches de bulbe olfactif ou des expériences d'immunohistochimie et/ou microscopie sur des tranches de télencéphale basal ou de bulbe olfactif.
Remplacement
Les expériences de ce projet ont pour but d'étudier les voies de modulation des circuits olfactifs chez la souris. Ces voies impliquent des aires cérébrales éloignées les une des autres qui sont semblables à celles trouvées dans le cerveau humain. Ces circuits sont impossibles à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doivent être intacts pour pouvoir être étudiéś. Ils sont impossibles à modéliser numériquement car leur organisation est encore méconnue. Nous utiliserons des souris car c'est dans cette espèce que les outils d'ingénierie génétiques sont les plus développés. De plus, de nombreux résultats démontrent que les découvertes chez la souris peuvent être utilisées comme outils précliniques chez l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base de nos études antérieures menées sur le même sujet, avec la même stratégie et les mêmes approches expérimentales. Il s’agit ici de décrire des propriétés de circuits de neurones qui n’ont jamais été étudiées auparavant. Une série de tests expérimentaux sera réalisée pour caractériser dans le détail les propriétés et fonctions de ces circuits neuronaux. La nature et le nombre de ces expériences ne peuvent pas être anticipée car ils dépendront de l'originalité de ce qui sera découvert. Par conséquent, une étude statistique prédictive pour estimer le nombre d’animaux qui sera nécessaire pour tester une hypothèse énoncée à l’avance n’est pas envisageable ici. Notre stratégie pour réduire le nombre d’animaux est: (i) de faire des expériences pilotes sur un petit nombre de souris pour sélectionner des lignées transgéniques d’intérêt (ii) d’analyser les résultats au fur et à mesure et d’arrêter les expériences dès qu’un résultat original a été établi ou observé dans un nombre suffisant de cellules (en général autour de 10), (iii) de baser notre approche expérimentale sur une manipulation sélective de neurones ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires pour identifier et caractériser des circuits synaptiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations régulières et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire, à température stable et contrôlée grâce à un tapis chauffant thermostaté. Les yeux sont protégés avec du gel pendant la chirurgie. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et des points limites ont été établis permettant de soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
La diversité neuronale est telle dans le cerveau que les souris transgéniques sont nécessaires pour identifier (grâce à des marqueurs fluorescents par exemple) et manipuler (grâce à l’optogénétique par exemple) des populations neuronales spécifiques. Les lignées de souris transgéniques qui seront utilisées dans ce projet permettent toutes ces expériences sur des populations de neurones déterminées. L’utilisation de ces modèles transgéniques simplifie l’interprétation des résultats et permet in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés. Animaux utilisé à partir de 3 semaines, c'est à dire assez âgés pour pouvoir être placés sur un appareil stéréotaxique.
Nouvelle approche thérapeutique des arythmies cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Injectées avec un virus dès l'âge de trois à cinq jours, ces souris transgéniques subissent des enregistrements cardiaques sous anesthésie puis une stimulation intracardiaque chirurgicale, suivie systématiquement de l'euthanasie et du prélèvement du cœur. Le porteur indique qu'il n'attend pas de phénotype sévère car les animaux ne sont pas maintenus jusqu'aux signes cliniques de la maladie. Il affirme que le cardiomyocyte adulte ne peut se cultiver et que l'efficacité de la thérapie ne peut s'évaluer que sur l'animal.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de mettre au point une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de troubles du rythme cardiaque héréditaires pouvant être mortels. Nous testerons l'effet de différents traitements (pharmacologiques et géniques) dans des lignées de souris transgéniques reproduisant la pathologie en étudiant leurs effets sur les arythmies déclenchées par stimulation électrique du cœur.
Bénéfices attendus
L'étude de ces modèles murins nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie des maladies liées à la conduction cardiaque et à ses troubles. Nous espérons définir de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de ces arythmies pouvant être mortelles chez l'Homme et pour lesquelles nous ne disposons pas de traitement efficace.
Procédures
La totalité des 220 animaux de ce projet subiront la procédure expérimentale "Étude des effets de nouveaux traitements sur la susceptibilité aux arythmies de 2 modèles murins de troubles du rythme cardiaque". Cette procédure expérimentale se déroule en 4 interventions qui se succèderont chez chaque animal: 1) Injection des virus à l'âge de 3 à 5 jours: quelques secondes par animal. 2) Enregistrement de l'échocardiographie sous anesthésie légère à l'âge de 9 semaines pour une lignée et de 23 semaines pour l'autre lignée: 10 minutes par animal. 3) Enregistrement de l'ECG de surface sous anesthésie légère à l'âge de 9 semaines pour une lignée et de 23 semaines pour l'autre lignée: 10 minutes par animal (40 minutes par animal pour le groupe recevant l'antiarythmique). 4) Stimulation endocavitaire sous anesthésie (unique procédure chirurgicale du projet): 40 minutes par animal (1 heure par animal pour les lots recevant l'antiarythmique) suivie systématiquement par l'euthanasie de l'animal.
Impact sur les animaux
Le phénotype des souris génétiquement modifiées utilisées ne sera pas considéré comme dommageable car aucune ne sera maintenue jusqu’au stade où apparaissent les signes cliniques des modèles concernés. Les potentiels effets néfastes de l'injection d'un AAV dans la circulation systémique d'une part, et de la surexpression de la GFP dans le cœur des souris d'autre part, seront évalués par comparaison des groupes recevant l'AAV-GFP avec les groupes recevant du sérum physiologique. On peut s’attendre à ce qu'il n'y ait pas de différence notable sur les paramètre ECG et échographiques entre les différents groupes au vu de résultats obtenus précédemment. L'introduction de la sonde de stimulation intra-cardiaque dans le ventricule droit de la souris via la jugulaire comporte un risque pour l'animal, risque lié à l'anesthésie et à la chirurgie.
Devenir
A l'issue de l'unique procédure de ce projet, toutes les souris seront euthanasiées par une injection létale dans le but de réaliser des analyses ultérieures. Les cœurs seront alors prélevés et congelés immédiatement dans l’azote liquide pour les expériences de biochimie, de biologie moléculaire et d'immunohistologie.
Remplacement
Le myocyte cardiaque adulte ayant atteint un état de différenciation terminale, il ne se divise pas, il ne peut être conservé en culture primaire plus de quelques jours et il ne peut être transfecté par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). De ce fait, l'utilisation d'animaux ne peut être remplacée par des modèles d'expression in vitro ou ex vivo. D'autre part, les lignées murines étudiées dans ce projet constituent d'excellents modèles pour tester de nouvelles thérapies car ces lignées sont plus susceptibles aux arythmies déclenchée électriquement que les souris sauvages. Nous utiliserons cette susceptibilité pour évaluer l'efficacité de notre approche thérapeutique, ce qui ne peut être réalisé que sur des animaux.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés et nous n'utiliserons que des préparations virales dont le titre aura été évalué afin d'utiliser la dose minimum efficace dans la transduction in vivo. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux: mâles et femelles, sauvages et mutés. Les fonds génétiques des souris sauvages et transgéniques sont identiques. Nous injecterons le même virus dans l'ensemble d'une portée. Nous exploiterons toutes les naissances et nous ne ferons pas faire naître d'animaux non nécessaires au projet. En tenant compte de tous ces critères, le nombre total d'animaux de ce projet s'élève à 220 animaux.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons ou tunnels en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe autant que possible, formation technique des utilisateurs. Afin de réduire au maximum la douleur chez les animaux utilisés, nous injecterons les virus (dilués dans une solution physiologique) par voie systémique, ce qui évite la chirurgie cardiaque lourde liée à une injection intracardiaque. Les caractéristiques physiologiques cardiaques de la maladie seront évaluées par des méthodes non invasives : enregistrements échocardiographiques et électrocardiographiques. Seul l'acte de déclenchement des arythmies nécessite quelques minutes de chirurgie qui sera effectuée sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris pour les raisons générales suivantes : 1) leur développement et leur physiologie sont bien connus. 2) le fonctionnement du système cardiovasculaire est proche de celui de l’Homme (échocardiographie, ECG). 3) de nombreux modèles physiopathologiques sont disponibles et caractérisés. 4) la reproduction rapide de ces rongeurs permet d’obtenir le nombre d’animaux requis pour les analyses statistiques des résultats. 5) la souris est le modèle animal le plus utilisé pour caractériser les vecteurs viraux AAV à tropisme cardiaque que nous allons utiliser. 6) les modèles pathologiques que nous souhaitons utiliser pour nos tests de thérapie génique sont murins. Les AAV seront injectés chez des animaux de quelques jours dans le but de limiter la réponse immunitaire des animaux et de limiter les volumes de virus à produire. De plus, les délais d'expression des AAV étant relativement longs, l'injection à un âge précoce, au lieu d'utiliser des animaux adultes, nous permettra de gagner beaucoup de temps et donc de place dans l'animalerie. L'étude de l'effet potentiellement thérapeutique des virus sera effectuée sur des animaux d'au minimum 9 semaines afin qu'ils aient atteint une taille adulte et que les transgènes soient exprimés.
Exploration fonctionnelle des déficits audio-vestibulaires dans un modèle murin de syndrome de Usher
- Enseignement supérieur
100 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour la recherche mais pour former des étudiants. Chaque étudiant explore l'équilibre et l'audition d'une souris d'un modèle du syndrome de Usher, avec des tests comportementaux puis des tests auditifs sous anesthésie profonde. Le porteur indique qu'aucun effet indésirable n'est attendu et que les souris retournent ensuite dans les cages de reproducteurs de la colonie. Il affirme que l'oreille interne ne peut s'étudier in vitro et que le modèle animal reste le "seul outil disponible".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de former les étudiants sélectionnés dans le cadre de notre cours sur l’Audition à la réalisation de tests d’équilibres et de tests auditifs sur des souris adultes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à former nos étudiants aux bonnes pratiques de laboratoire dans le domaine de l’exploration des fonctions audio-vestibulaires.
Procédures
Les souris seront utilisées pour des tests comportementaux non invasifs (50 minutes) et pour des tests audiologiques réalisés sous anesthésie profonde (40 minutes). Chaque étudiant étudiera l’équilibre et les capacités auditives d’une souris. Un maximum de 20 étudiants sera sélectionné chaque année. Vingt souris seront de fait utilisées chaque année, soit 100 souris sur 5 ans. D’un point de vue pratique, les étudiants seront divisés en 2 groupes. Pour le groupe 1 (10 souris), les tests auditifs auront lieu le 1er jour et les tests d’équilibre le 2ème jour. Pour le groupe 2 (10 souris), les tests d’équilibre auront lieu le 1er jour et les tests auditifs le 2ème jour.
Impact sur les animaux
Les souris seront utilisées pour des tests comportementaux non invasifs (50 minutes) et pour des tests audiologiques réalisés sous anesthésie profonde (40 minutes). Aucun effet indésirable n’est attendu.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris retourneront dans les cages de reproducteurs utilisés pour l’entretien de la colonie.
Remplacement
Nous ne disposons pas à ce jour de système in vitro capable d’intégrer les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules ciliées sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux neurones spiraux ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. Le modèle animal demeure donc le seul outil disponible pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la surdité et les troubles de l’équilibre.
Réduction
Chaque étudiant du cours se verra confier une souris sur laquelle il réalisera ses tests comportementaux et auditifs. A la fin des tests, toutes les souris retourneront dans les cages de reproducteurs utilisés pour l’entretien de la colonie. Les données générées pendant ce cours viendront compléter d’autres produites dans le cadre d’un projet de notre laboratoire, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Un igloo et des copeaux de carton seront ajoutés dans les cages d’hébergement. Nous renforcerons l’enrichissement des cages hébergeant des souris présentant un trouble de l’équilibre, par l’ajout de deux tubes creux en carton et de bâtonnets en bois. Une roue sera disposée dans les cages de souris mâles pour limiter les risques de bagarres. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies. Les animaux anesthésiés seront placés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet. L’état général des animaux sera surveillé de façon régulière.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins bien établis. Mâles et femelles seront utilisés, les déficiences auditives et vestibulaires étant similaires dans les deux sexes.
Evaluation de la contribution de la signalisation métabolique et redox dans la protection des photorécepteurs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris double knock-out sont suivies de 3 à 10 mois par des tests visuels dont un test optocinétique et un électrorétinogramme sous anesthésie, pour étudier une dégénérescence de la rétine. Le porteur indique qu'il retire délibérément tout enrichissement de la cage pendant les mois d'expérimentation, l'enrichissement modifiant la progression de la maladie. Il affirme que la fonction de la rétine ne peut s'étudier sur des cellules en culture et renvoie la thérapie envisagée à une preuve de concept.
Objectifs
L’objectif du projet est de suivre la progression du déficit de vision des souris avec des gènes doubles knock-out, y compris la fonction des photorécepteurs cône et bâtonnet, l’acuité visuelle, la structure de la rétine, etc. Les deux gènes sont paralogue et les deux knock-out existent pour chaque gène. Le phénotype de chacune de ces souris a été étudié précédemment. Elles présentent toutes deux un déficit de vision important avec une fréquence différente en terme de dégénérescence des cônes. Ceci suggère que les deux gènes ont une fonction distincte dans la protection des cônes. Nous nous attendons à un déficit de vision plus sévère chez les souris dont les deux gènes sont inactives, permettant ainsi d explorer la future stratégie de traitement de type combinatoire.
Bénéfices attendus
L’analyse des phénotypes chez les souris à double gène nous aidera à mieux comprendre l’interaction et leur effets compares à un seul gène. Nous possédons des arguments pour anticiper que l’administration des deux gènes d’intérêt aurait un effet thérapeutique synergétique. A plus long terme l’objectif est de faire la preuve de concept du bénéfice pour la vision d’une thérapie combinant les deux produits du gène comme alternative à la stratégie thérapeutique indépendante de la mutation causale de la rétinopathie pigmentaire.
Procédures
Les différents tests seront réalisés sur les mêmes animaux des quatre génotypes à 3, 6 et 10 mois. Test comportemental optocinétique (OKT, 5 min), fond d’œil grâce à une caméra de fond d'œil numérique (MICRON III, 5 min sous par gaz anesthésie), imagerie de la rétine par tomographie par cohérence optique (OCT, 5 min sous par gaz anesthésie), et électrorétinogramme (ERG, 30 min sous anesthésie par injection intrapéritonéale).
Impact sur les animaux
Nous anticipons des effets indésirables modérés dues aux paramètre suivants : absence d’enrichissement, chambre noir, test de comportement/stress, injection IP/contention/piqûre, anesthésie. Nous prévoyons un stress pour l’hébergement sans enrichissement, chambre noire ou encore comportement ; inflammation locale au site d’injection pour les IP ou encore risque anesthésique pour les actes sous anesthésie générale. Chambre noir est requis pour la mesure d’ERG scotopique. Pour l’absence d’enrichissement, tout est mis à contribution pour pouvoir reproduire le déficit visuel des souris contrôles précédemment étudiées en l’absence d’enrichissement La littérature montre que l'enrichissement affecte la progression de la dégénérescence de la rétine chez les souris rd10. Quinze jours précédant la première expérience, nous acclimatons les animaux en enlevant l'enrichissement. Nous supprimerons donc l'enrichissement uniquement durant la période d'expérimentation, commençant du 3eme mois au 10eme mois.
Devenir
Les souris seront testées à 3, 6 et 10 mois. La durée est fixée à 10 mois par des expériences publiées précédemment, mais la mesure des paramètres à 6 mois pourrait nous amener à repousser ce durée à 12 mois, ou même plus. Après la dernière mesure, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire. Les rétines des deux yeux de ces souris seront prélevées pour mesurer la densité des cônes.
Remplacement
L’étude de la fonctionnalité de la rétine d’un modèle murin au cours du vieillissement ne peut être réalisée sur des modèles de cellules en culture. Les photorécepteurs des organoïdes rétiniens obtenus par reprogrammation de cellules souches n’ont aucune fonction électrophysiologiques.
Réduction
Pour appréhender une aggravation statistiquement significative du phénotype visuel des souris analysées, il faut nécessairement répéter les mesures sur ces dernières car un design expérimental adéquat est requis. Il est aussi nécessaire de valider le déficit visuel pour ces dernières souris en le rapportant à la vision de la souris contrôle. Les quatre groupes sont donc requis scientifiquement. Le nombre de souris par groupe (n = 12), soit au total 48 souris, avec trois répétitions de cette expérience soit n=144. Ce nombre est estimé d’après des travaux antérieurs et par l’estimation du pouvoir statistique à atteindre pour obtenir une différence statistiquement et biologiquement significative. L’information extraite de chaque animal est poussée à son maximum en analysant les deux yeux de chaque souris. Chacun des quatre groupes de souris sera analysé à 3, 6 en 10 mois pour la fonction et la survie des bâtonnets et l’acuité visuelle des cônes leur fonction
Raffinement
De façon générale, les animaux seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou l’expérimentateur. Nous les considérons comme en bonne santé si leur pelage est brillant et que leur comportement est normal. S'il y a des signes de malaise, comme un comportement anormal, une perte de poids, une déshydratation, une prostration, un prolapsus rectal, etc. L'expérience sera arrêtée et le personnel qualifié de l'animalerie estimera le niveau de malaise, puis décidera d'observer, de traiter ou de les euthanasier. Toutes les expériences de chaque étape sont non invasives et l'analgésie et l'anesthésie seront utilisées pour réduire la douleur, le stress et l'inconfort des animaux. Si les risques d'anesthésie sont observés, tels que la dépression respiratoire, l’accident vasculaire cérébral, etc., l'animal sera alors, retiré du groupe et euthanasié. Les tests de comportement sont réalisés par une même personne permettant ainsi de réduire le stress des animaux et d’éviter des variations intra-individuelles.
Choix des espèces
Le phénotype visuel des souris avec inactivation d’un seul des deux gènes a été étudié précédemment. La souris est aussi une modèle pertinent d’étude des dégénérescences rétiniennes héréditaires. Les quatre cohortes seront suivies entre 3 et 10 mois, soit durant la période de perte de vision dans nos études publiées. Ces animaux seront placés dans une pièce dont l’intensité de la lumière et le cycle jour/nuit est contrôlé dès leur sevrage.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
2 428 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des douleurs chroniques leur sont provoquées par ligature du nerf sciatique, implantation de cellules cancéreuses dans le tibia, ménisectomie ou injections d'agents inflammatoires, puis évaluées par immersion d'une patte dans un bain à 42 °C, pour tester des molécules antalgiques proposées à des clients. Le porteur indique que ces modèles restent douloureux et stables dans le temps, ce qui rend selon lui les rats non réutilisables et non replaçables. Il conclut que l'étude chez l'animal vigile reste la "seule option" avant le passage chez l'humain.
Objectifs
Cet ensemble modèle/ test a été développé à la demande de la direction de l’entreprise afin de répondre à une demande des entreprises pharmaceutiques clientes. Au sein du laboratoire, nous avons pu caractériser 10 modèles de douleur (neuropathie traumatique par ligature du nerf sciatique (CCI,SNI,SNL), neuropathie diabétique, douleur cancéreuse, et inflammatoire (CFA, MOA, Carragénine, Capsaïcine et ménescetomie partielle) chez le rat, avec des tests d’hyperalgésie et d’allodynie mécanique. La composante thermique est donc manquante afin de permettre de caractériser au mieux les candidats médicaments et améliorer la qualité de vie des patients. Ce modèle est très bien décrit dans la littérature. Chez l’homme, la douleur neuropathique est très hétérogène : elle reflète des signes et des symptômes différents. Des douleurs peuvent survenir à la suite de lésion secondaire (diabète, cancéreuse) ou traumatiques (sections d’un nerf). Ces douleurs se traduisent majoritairement par une allodynie (douleur induite par un stimulus normalement non douloureux) ou une hyperalgésie (sensation de douleur ressentie plus intensément) induite par le toucher, la pression, le froid et le chaud. Sur le plan pharmacologique, la douleur neuropathique répond mal aux antalgiques classiques ou présentent d’importants effets secondaires (Gapabentine, duloxetine et Morphine) d’où le besoin de mise au point de nouvelles molécules. Le but de ce projet, est de fournir un modèle pré-clinique pour tester l’intérêt de molécules antalgiques destinées au traitement d’une allodynie thermique liée à une neuropathie traumatique. Pour cela, nous avons mis en place un test d’immersion de la patte dans un modèle de neuropathie traumatique induite par la ligature du nerf sciatique chez le rat. La mise au point sur ce modèle nous permet de faire la translation avec les 9 autres modèles cité au-dessus. Ce couple modèle/test va nous permettre de proposer à nos clients un modèle au plus proche des conditions cliniques afin de tester de nouvelles molécules ciblant ce type de douleur.
Bénéfices attendus
L’entreprise peut ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés avec un modèle proche de la clinique, qui nous permet de proposer de tester ces candidats médicaments dans des axes thérapeutiques thermique et/ou mécanique.
Procédures
Induction du modèle douloureux par chirurgie: ligature du nerf sciatique ou du nerf spinal réalisé sous anesthésie générale (rompun/imalgène). Elle dure entre 10 et 15minutes. Implatation de cellules cancéreuses localement dans le tibia, Ménisectomie partielle. Injection d’agents inflammatoires en sous-cutanée plantaire. Injection intrapéritonéale de Streptozotocine (ajouter si douleur chronique ou aigue) Administration de composés par voie : orale (po), intrapéritonéale (IP), sous-cutanée (sc), intrathécale (IT), intraveineuse (IV), intradermique (IM) de manière unique ou répétée. (dans le cadre de ce projet, le traitement répété peut être réalisé afin de mimer au mieux les conditions chez l’homme et éviter un surdosage et donc des effets secondaires). Prélèvements de sang : jugulaire, caudale ou rétro-orbitaire ou en intracardiaque si l’animal n’est pas réveillé. 10 à 20% du volume de sang total / 100g pour un prélèvement unique et 10 à 20% du volume de sang total / 100g répartis entre 1 à 14 jours pour un prélèvement répété. Le nombre de prélèvements est limité à 3/jour si réveil 4 si pas de réveil Test : immersion de la patte dans un bain à 42°C pendant une période de 15seconde maximum. Les points peuvent être rapprochés au maximum de 15min. 6 points de cinétiques maximums par jour. 3 séries peuvent être réalisé (7jours après chirurgie, 14jours après chirurgie et 21 jours après chirurgie)
Impact sur les animaux
Parmi les nuisances subies par les animaux,la chirurgie va impacter l’animal mais l’anesthésie par injection de rompun/imalgène permet de créer un effet antalgique le temps de la chirurgie. Des croquettes sont mises dans la cage afin que l’animal garde toujours un accès à la nourriture. L’induction peut aussi être faite par voie intrapéritonéeale (STZ) ou sous-cutannée plantaire (CFA, Carragénine, Capsaïcine). Dans le cadre de ce projet, les animaux subissent des tests de douleur aiguë évoquée (thermique par immersion de la patte dans une bain chaud). Le travail s’orientant vers de l’allodynie, une partie des animaux aura simplement une sensation de chaleur pour limiter cela la température choisie est de 42°C et un cut-off a été fixé à 15secondes d’immersion. Un maximum de 6 points de cinétique de test par semaine sur 3 semaines est fixé. Généralement seule une cinétique de 4 points de mesure est réalisée. Lors des tests, les animaux sont en contention. Pour limiter le stress, une habituation est réalisée un peu avant le test. Nous travaillons ici avec des modèles de douleurs, ils peuvent être chronique et stable dans le temps (modèles Cci, SNI, SNL, STZ, BCP, MNX, monoarthirte, procédure 1 à 7). Des points limites liées aux modèles (risque de mutilation, inflammation exagérée,palaysie de la patte arrière) peuvent survenir. Des points limites associées à la pharmacologie peuvent aussi apparaitre (tremblement, perte de poids, déshydratation…). Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, caudale, jugulaire, retro-orbital) ou vigil en contention (caudale) l’anesthésie est privilégiée afin de limiter le stress de l’animal. Le prélèvement sur rat vigil n’est pas exclu (bien que limité) quand l’isoflurane (anesthésiant) interfère avec le dosage souhaité. Le volume de sang et le nombre de répétition sont encadrés comme suit : 10 à 20% du volume de sang total / 100g pour un prélèvement unique et 10 à 20% du volume de sang total / 100g répartis entre 1 à 14 jours pour un prélèvement répété. Le nombre de prélèvements est limité à 3/jour si réveil 4 si pas de réveil de l’animal
Devenir
Une grande partie des modèles utilisées ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. Les autres modèles font mettre en place une réaction immunitaire qui peut interférer avec les autres modèles présents au sein du laboratoire. Les animaux ne peuvent donc pas être réutilisés. De plus la gamme de poids restent importante car la réalisation du test se fait en contention donc les animaux ne peuvent pas être trop gros. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésiques dans un modèle in vivo d’évaluation d’allodynie au chaud. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par le IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » (https://www.iasp-pain.org/terminology). L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat.
Raffinement
Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Nous limitons les doses et les injections au minimum afin de ne pas induire de douleurs supplémentaires. Le test comporte une valeur de cut-off à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h aux salles de tests). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise de l'entreprise (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude ou à défaut par un autre technicien (formé à l’expérimentation animale niveau I ou II ). De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique et briquettes en bois à ronger)
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » (https://www.iasp-pain.org/terminology). L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Inflammation colonique chez le cobaye
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
300 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une inflammation du côlon leur est provoquée par application de TNBS après mise à jeun, sans qu'aucun antalgique ni anti-inflammatoire puisse être donné pour ne pas fausser les candidats médicaments testés, l'euthanasie n'intervenant qu'en cas d'occlusion ou de souffrance intense. La douleur abdominale est évaluée par stimulation tactile. Le porteur décrit ce modèle comme "nécessaire" à la mise sur le marché de nouveaux médicaments intestinaux.
Objectifs
L'inflammation de la muqueuse du côlon, ou colite, se traduit par des douleurs pouvant être intenses, et différents troubles intestinaux incluant diarrhées, constipation ou ballonnements. La colite est donc un syndrome, c'est-à-dire un ensemble de symptômes caractérisant un état pathologique aux origines diversifiées, qui constitue un motif fréquent de consultation en gastro-entérologie. Le traitement de la colite dépend de sa cause, et peut inclure un repos digestif, la mise en place d'un régime pauvre en fibres ou en résidus, un traitement antispasmodique associé ou non à un traitement antalgique en cas de fortes douleurs, ou encore des traitements plus complexes associant plusieurs médicaments (corticothérapie, immunosuppresseur, biothérapies) voire un traitement chirurgical. Le projet vise à étudier les potentiels effets analgésiques et/ou anti-inflammatoires de substances pharmacologiques dans le cadre de pathologies inflammatoires du système intestinal chez le cobaye.
Bénéfices attendus
Ce modèle d'inflammation colonique est nécessaire à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter certaines pathologies intestinales. Les traitements ont pour objectif de réduire les symptômes et d’améliorer la qualité de vie des patients. Dans ce contexte, il est nécessaire de poursuive la recherche de nouveaux traitements efficaces sur le long terme et sans effets secondaires majeurs.
Procédures
La veille de l'induction de l'inflammation, les animaux sont mis à jeun. Le jour de l'induction, un réactif, le TNBS, est appliqué au niveau du colon des animaux préalablement anesthésiés (isoflurane). L'inflammation colonique se met progressivement en place. Au cours de l'étude (probablement de l'ordre de 2 à 3 fois au cours de l'étude), la douleur sera évaluée par des tests simples de stimulations tactiles (allodynie tactile, mesurée par l'application d'un stimulus non douloureux et mesure du seuil d'une réponse de retrait) au niveau de l'abdomen, et par l'observation du comportement des animaux (ainsi que d'aspects physiologiques tels que l'aspect des fécès). A la fin de l'étude, les animaux sont euthanasiés et leur colon est prélevé afin de réaliser des mesures histo-chimiques de l'inflammation. Des prélèvements de sang peuvent aussi être prévus pour mesure de marqueurs biologiques (e.g. veine saphène, environ 100 μL de sang chez l'animal éveillé ou sous sédation légère). La durée totale de l'étude est prévue de 7 à 14 jours après administration du TNBS (délai de mise en place de l'inflammation). Les candidats médicaments seront administrés de manière aigue ou chronique pendant le développement de l'inflammation.
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédures, il est attendu une réaction inflammatoire principalement localisée au niveau du colon. Quand on cherche à moduler la réponse inflammatoire à l'aide d'agents pharmacologiques, il est possible d'établir la balance « bénéfice/risque » pour permettre un bon emploi des médicaments de demain. Dans le cas de l'inflammation colonique, l'administration du réactif peut aboutir à une occlusion intestinale, causant des douleurs et une baisse de l'appétit des animaux. Il n'est pas possible d'administrer de traitement antalgique ou anti-inflammatoire, afin d'éviter toute intéraction avec les candidats médicaments, mais en cas d'occlusion ou de souffrance intense, les animaux seront euthanasiés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de leur colon.
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro ont pu être réalisés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement un groupe supplémentaire positif. Ce modèle est à développer, mais nos données historiques obtenues dans des modèles similaires indiquent qu'il est nécessaire de prévoir 10 animaux par groupe de traitement (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à tester) pour atteindre une sensibilité correcte. Néanmoins, ce modèle n'ayant jamais été réalisé dans les conditions décrites au sein du laboratoire, aucune analyse de puissance ne peut être réalisée. La première procédure est conçue pour garantir le nombre d'animaux strictement requis pour l'expérience. A la suite de quoi l'allotement pourra être modifié à la baisse si la puissance statistique peut être maintenue avec un effectif plus faible. Lorsque cela est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétique d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux. Différents organes peuvent être prélevés pour analyses ultérieures, contribuant à limiter le nombre d'animaux et la souffrance animale en général. D'autre part, le laboratoire dispose de tout moyen d'analyse pour limiter les volumes de prises d'essai, ce qui limite le stress et la répétition des expérimentations.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs, et sont suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique. Adultes (après le sevrage), conformément à la bibliographie scientifique
Recherche de nouvelles molécules à activité antiparasitaire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues de lignées génétiquement modifiées, dont certaines ont des cellules intestinales incapables de produire de l'acétylcholine, elles sont infectées par voie orale avec un parasite que le résumé ne nomme pas, reçoivent des injections intrapéritonéales et subissent un jeûne de quatre heures. Elles sont enfin opérées une heure sous anesthésie, sans réveil, pour recueillir le contenu de leur intestin et leurs tissus digestifs, l'objectif étant de montrer que ces cellules, dites tuft, produisent des composés antiparasitaires. Le porteur juge lui-même la balance bénéfice/risque "clairement favorable", et qualifie son étude de "potentiellement impactante" pour la santé publique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est simple, et consiste à démontrer que certaines cellules épithéliales du tractus digestif, nommées cellules tuft, sont capables de produire des composés antiparasitaires. Cette démonstration est d’une importance majeure en termes de santé, puisqu’ouvrant la voie à de nouvelles pistes en matière de lutte contre les parasites, qui touchent des millions de personnes dans le monde. Nos données obtenues montrent clairement que les souris dont les cellules tuft sont dans l’incapacité de produire de l’acétylcholine sont très sensible aux infections parasitaires. L’idée de ce projet consiste à montrer le lien direct entre cellules tuft, acétylcholine et ciblage des parasites, en démontrant spécifiquement la présence d’acétylcholine produite au sein de l'intestin. Notre stratégie expérimentale consistera à infecter des souris avec un parasite classiquement utilisé comme modèle expérimental, utilisé avec succès dans notre équipe par le passé. Nous doserons, en fin de procédure, le taux d’acétylcholine produite, via une procédure contrôlée sous anesthésie générale, pour récupérer le contenu intestinal. Ce travail devrait nous permettre de revisiter les modalités de la réponse de l’hôte contre des parasites entériques, dans une étude originale et potentiellement impactante en termes de santé publique.
Bénéfices attendus
La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Cette procédure nous permettra d’obtenir les données nécessaires pour démontrer le rôle des cellules tuft comme cellules productrices de composés antiparasitaires. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, les infections entériques avec des parasites touchant des millions de personnes dans le monde.
Procédures
Contention lors de l'étape d'infection parasitaire, administration de substances par voie intra-péritonéale, procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les lignées utilisées dans ce projet ne présentent, à l’état de base, pas de phénotype dommageable. Les étapes susceptibles d’être une source de stress pour les souris sont principalement celles de l’inoculation des parasites par voie orale, les injections de substances par voie intra-péritonéale, la mise à jeun de 4 heures, la réaction immunitaire liée à l'infection parasitaire, ainsi que la procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de récupérer les tissus digestifs et la ponction luminale.
Remplacement
Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être intégralement mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains parasites. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Nous avons, jusqu’à présent, pu valider notre hypothèse lors d’une précédente étude, légitimant cette demande d’expérimentation in vivo, et réduisant la probabilité d’échec de ce projet. De manière claire, toute possibilité d’utilisation des modèles ex vivo sera priorisée pour compléter les données acquises avec cette étude.
Réduction
A ce jour, nous avons le recul nécessaire d’un projet précédent, ce dernier nous ayant permis d’obtenir des données encourageantes. Les résultats seront obtenus via des analyses statistiques comparant la réponse antiparasitaire de nos groupes d'animaux. Lorsque possible, les analyses seront complétées en modèle ex-vivo (organoïdes intestinaux). La réduction du nombre d’animaux se fera aussi via l’utilisation de la majorité des animaux produits pour chaque lignée (études menées sur les mâles et femelles, la plupart des génotypes produits seront utilisés).
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité, selon des points limtes ayant été précdemment validés et déterminés. Afin de réduire le stress pendant les infections, les animaux seront anesthésiés. La phase expérimentale de prélevement durera 60 minutes, sous anesthésie générale contrôlée dans le cadre d’une procédure de chirurgie sans réveil. Cette procédure sera réalisée avec des substances anesthésiques, un analgésique local, ainsi qu'un tapis chauffant pour maintenir la température de l’animal.
Choix des espèces
Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l'homme et nos modèles génétiquement modifiés nous permettent de répondre à nos questions et finaliser notre étude. Ces dernières seront utilisées à l'âge de 8 semaines, lorsque le système digestif est mature.
Etude de la réponse thérapeutique aux chimiothérapies dans les cancers du sang chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 362 souris vont être utilisées, chacune recevant dans la queue, sans anesthésie, une injection de cellules leucémiques, puis jusqu'à deux ponctions de moelle osseuse dans le fémur sous anesthésie et jusqu'à cinq jours d'injections de chimiothérapie, éveillée. Les procédures impliquent un niveau de souffrance sévère, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour analyser leur moelle osseuse et leur rate. La leucémie peut leur faire perdre du poids et grossir la rate au point de gêner leur mobilité, la ponction du fémur peut être douloureuse et la chimiothérapie peut les amaigrir dès le troisième jour, l'objectif étant de mieux comprendre comment ces traitements tuent les cellules cancéreuses. Sur la douleur, le porteur écrit : "On peut aussi penser qu'elle cause des douleurs même si des signes visibles de douleur ne sont que rarement présents en cas de splénomégalie faible ou modérée", pour un projet qu'il classe en souffrance sévère.
Objectifs
Les agents de chimiothérapie utilisés pour soigner les patients atteints de leucémie (cancer du sang) ont des mécanismes d’action variés, mais leur action précise et majoritaire est encore incertaine. Le projet a pour objectif de mieux comprendre les effets de la chimiothérapie classiquement utilisée pour soigner les leucémies. Nous étudierons en particulier l’importance d’un gène qui participe à la mort des cellules cancéreuses lorsque les patients sont traités avec la chimiothérapie. L’objectif est de comprendre par quels mécanismes la protéine issue de ce gène peut entrainer la mort des cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Chez les patients atteints de leucémies, les rechutes sont très fréquentes après les traitements par chimiothérapie, en particulier chez les personnes âgées de plus de 60 ans. Les progrès à faire passeront par une meilleure compréhension des mécanismes d’action précis des chimiothérapies, qui pourront alors être améliorées. Ce projet permettra d’approfondir les connaissances sur la chimiothérapie et son mode d’action. Comprendre la manière dont la chimiothérapie conduit à la mort des cellules cancéreuses permet de travailler sur l’amélioration des traitements à plus long terme.
Procédures
Pour mettre en place le modèle de leucémie, les animaux seront soumis à une injection des cellules leucémiques par intraveineuse dans la queue. Cette procédure dure environ 20 secondes et se fait sans anesthésie. L’apparition de la maladie sera suivie par ponction de moelle osseuse (qui est le site d’expansion de ces cellules cancéreuses). Ce prélèvement sera fait au niveau du fémur, dans une patte arrière. Il se fait sous anesthésie et dure environ 2 à 3 minutes. Chaque souris sera soumise au prélèvement que deux fois maximum au cours de la procédure expérimentale avec un délai de deux semaines entre les deux prélèvements. Quand les souris commenceront à être malades (présence de cellules cancéreuses détectables en nombre dans l’organisme), elles seront traitées. Trois traitements seront testés : soit une molécule administrée par injection dans l’abdomen (environ 5 à 10 secondes), soit une molécule administrée en intra- veineuse dans la queue (environ 20 à 30 secondes), soit les deux molécules (donc injection dans l’abdomen + injection dans la queue). Les administrations se feront sur souris éveillées.
Impact sur les animaux
La manipulation des souris pour le traitement engendre un stress, la souris pouvant être traitées quotidiennement pendant maximum 5 jours. Quand la leucémie se développe, les souris peuvent perdre du poids et leur rate grossit (splénomégalie ). Cela peut gêner leur mobilité normale. On peut aussi penser qu’elle cause des douleurs même si des signes visibles de douleur ne sont que rarement présents en cas de splénomégalie faible ou modérée. D’autre part, le prélèvement intra-fémoral peut causer des douleurs. Quand les souris sont traitées avec la chimiothérapie, elles peuvent perdre du poids à partir du troisième jour du traitement. Elles ont alors le poil moins régulier et parfois le dos voûté.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des cellules de la moelle osseuse et de la rate et une avancée dans la compréhension du projet.
Remplacement
Nous avons au préalable testé la chimiothérapie sur des modèles de cellules cancéreuses en culture . Le passage dans l’animal est maintenant nécessaire pour reproduire les conditions physiologiques d’un organisme proche de l’homme, pour confirmer et approfondir les hypothèses.
Réduction
Nous utilisons un nombre suffisant et optimal d’animaux par groupe pour avoir des différences statistiquement significatives entre les groupes (nombre défini par une analyse statistique estimative). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, différents temps de traitement seront testés en même temps afin de comparer les différents groupes testés à un seul et unique groupe contrôle.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes pour respecter leur comportement naturel. Ils seront surveillés quotidiennement, et une grille d’évaluation, tenant compte de leur apparence de leur comportement et d’un suivi clinique, sera tenue chaque semaine de façon à définir des points limites de douleur/souffrance suffisamment précoces pour déclencher le recours à l’euthanasie si ces points limites étaient atteints. Ce suivi sera quotidien lors de la phase de traitement. En cas de perte de mobilité, l’accès à la nourriture sera facilité. Les cages seront enrichies pour améliorer le bien-être des animaux: nids composés de lanières de papier, coton, buchettes à ronger.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère suffisamment proche de l’Homme pour les expériences menées dans ce projet. Le gène étudié ainsi que la fonction de la protéine qui en découle sont très proches entre l’homme et la souris. Les molécules testées sont à administrer par différentes voies, toutes disponibles sur l’espèce animale choisie. De plus, le contrôle de leur bien-être au quotidien est facilité car les signes de souffrance/douleur ont été bien caractérisés chez cette espèce. Les leucémies touchent des cellules à un stade précoce de leur développement, ce qui nous conduit à utiliser des souris jeunes adultes de 6 à 8 semaines pour nos expérimentations.
Effet chronique de la kisspeptine et test d’expression et de sécrétion de la protéine dans le tissu musculaire de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des souris reçoivent un ADN censé faire produire en continu par leurs cellules musculaires la kisspeptine, un peptide qui stimule les hormones de la reproduction, afin de mettre au point un "outil permettant de maitriser la reproduction". 765 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent trois poses chirurgicales de mini-pompes à 28 jours d'intervalle ou une injection hydrodynamique dans la veine saphène, des prises de sang répétées, des frottis vaginaux, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, un open field, une chambre claire-obscure et un test de reconnaissance d'objet. Certaines subissent seize prises de sang en moins de onze heures après une injection de GnRH, et la mise à mort se fait sous anesthésie, par décapitation ou par perfusion de paraformaldéhyde dans le cœur. Le porteur présente ces études comme un "chainon essentiel" avant des expérimentations sur des "espèces de rente telles que les ovins".
Objectifs
La kisspeptine (Kp), produite dans le cerveau, est un puissant stimulateur de la sécrétion de gonadolibérine (GnRH) qui, à son tour, induit la libération de l’hormone lutéinisante (LH) dans la circulation sanguine chez les mammifères. A ce jour, de très nombreuses études ont évalué l’effet d’une injection aigüe de kisspeptine pour tenter de comprendre et de maitriser la reproduction de plusieurs mammifères (notamment la souris, l’Homme, mais aussi les animaux de rente pour lesquels le système reproducteur n’est pas actif tout au long de l’année). De ce fait, les mécanismes impliquant le contrôle de la sécrétion de LH et l'action de la Kp sont alors très bien connus et documentés. Cependant, une faiblesse majeure de la kisspeptine, utilisée en tant que telle pour maitriser la reproduction, est le délai d’action de la protéine qui est relativement vite dégradée. Des études ont alors tenté de mettre au point une forme modifiée de la kisspeptine afin de la rendre plus résistante aux processus de dégradation. A ce jour, aucune forme modifiée du peptide n’a cependant été assez performante pour être utilisée comme outils de maitrise de la reproduction. Le présent projet vise alors à adopter une approche totalement innovante à la lumière de ce qui est en cours de développement dans le domaine des biomédicaments : faire produire la kisspeptine directement par les cellules musculaires qui sont des cellules définitivement différenciées, qui ne se divisent pas, et sont capables de fortement exprimer une protéine puis de l'excréter dans le système circulatoire. Concrètement, l’idée est d’injecter dans le muscle un complexe ADN pour faire produire de la Kp qui sera excrété du muscle vers le système sanguin. Comme ils n’impliquent pas d’agents viraux, ces complexes sont plus faciles d’utilisation et n’ont pas d’effet inflammatoire. Nous souhaitons donc tester si l’injection de ces complexes dans le muscle peut être une technique efficace pour, à terme, faire produire de façon stable la Kp dans l’optique de stimuler ou inhiber la reproduction de l’organisme cible qui, dans ce projet, est la souris.
Bénéfices attendus
Le présent projet vise à mettre au point une méthode permettant de sécréter de la kisspeptine de façon continue par les cellules musculaires de l’organisme cible. Les bénéfices sont donc multiples 1) étudier l’effet d’une diffusion continue de kisspeptine sur la physiologie de l’organisme, 2) mettre au point une technique de production de peptides par les cellules musculaires et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction.
Procédures
Procédure n°1 : 1) Pose de mini pompes osmotiques sur 96 animaux : les mini pompes diffusent la solution qu'ils contiennent pendant 28 jours maximum, le protocole étant prévu pour 3 mois, les mini pompes seront remplacées 2 fois. Au final, ce sera donc 3 pose de mini pompes à ,28 jours d'intervalle sur 630 animaux. 2) Test de tolérance au glucose (GTT) et à l'insuline (ITT) sur 56 animaux avec des prélèvements de sang d'environ 1ul, réalisés 10 et 20 minutes avant une injection de glucose ou d'insuline et 15, 30, 60, 120 minutes après. L'ITT sera toujours réalisé 1 semaine avant le GTT et ceux ci seront réalisés 3 fois avec 28 jours d'intervalle. 3) Frottis vaginaux réalisés sur 28 femelles sur une période de 8 jours tout les 28 jours. 4) Tests de comportements sur 80 animaux : open field, chambre claire obscure, test de reconnaissance d'objet, réalisés sur une période de 5 jours tout les 28 jours. 5) Prises de 10ul de sang sur 96 animaux tout les 28 jours. L'intervention sera réalisée 4 fois. 6) Injection de GnRH et prélèvements de 4ul de sang de facçon sériée, une seule fois au 84ème jour du protocole. Seiez prélèvements seront réalisés 40 et 20 minutes avant l'injection de GnRH puis 20, 40, 60, 80, 100, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540 et 600 minutes après l'injection pour un total de 16 prélèvements de 4ul de sang. 7) Sacrifice après anesthésie, par décpaitation ou perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde. Procédure n°2 et 3 : 1) Injection hydrodynamique d'un vecteur plasmidique via la veine saphène réalisé sur 637 animaux au total sur les deux procédure (630 + 7). 2) Prises de 4 ul de sang tout les 10 jours pendant 3 mois, soit 9 fois. 3) Mise à mort après anesthésie par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde.
Impact sur les animaux
Le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les rongeurs. En termes de manipulation des animaux, les tests comportementaux, chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets secondaires peuvent être observés, notamment suite à la pose des mini pompes (procédure 1) ou l'injection hydrodynamique (procédure 2) : des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'antidouleurs au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence. L’objectif de ce projet est d’induire une production continue de kisspeptine par l’organisme, ce qui n’a encore jamais été testé jusqu’à présent.
Devenir
les animaux sont mis à mort pour prélèvements d’organes pour des études post mortem.
Remplacement
Une grande partie du travail de sélection des meilleurs vecteurs ADN a été réalisé en amont sur des modèles de cultures cellulaire, mais l'étude de l'effet de la Kp sur la fonction de reproduction et sur la physiologie globale de l’organisme nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu, aucune méthode de remplacement n'est donc envisageable dans ce contexte.
Réduction
Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement.
Raffinement
Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement (posture voutée, démarche anormale) et l'apparence (pelage négligé, réduction du toilettage, grattage excessif, eczéma) des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours (en prêtant attention au pourcentage de perte et qu'il ne dépasse pas le seuil critique de 20%) pendant 3 jours après les prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites (soulagement de la douleur en cas de dégradation d’un critère de comportement et d’apparence, euthanasie en cas d’atteinte du seuil critique des 20% de perte de poids et/ou dégradation de plus de deux critères de comportement et d’apparence). Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies (implantation de mini pompes et injections hydrodynamique, des traitements anesthésiques (kétamine, xylazine) et analgésiques (atipamézole, meloxicam) seront apportés aux animaux pour réduire leur douleurs au maximum.
Choix des espèces
Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction. De plus les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Cependant, l’effet de la kisspeptine sur le long terme sur la physiologie globale de l’organisme reste assez peu étudiée, or, ce peptide est de plus en plus présenté comme étant un outil prometteur pour la maitrise de la reproduction et le traitement de pathologies associées à la fertilité. La souris est alors un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Enfin, ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront de poursuivre avec des expérimentations sur les espèces de rente telles que les ovins et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse.