Rongeurs

651 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines puis des traitements administrés cinq jours par semaine pendant quatre semaines, avec prélèvements sanguins et imagerie, avant d'être tuées pour prélever rate et os. Le porteur indique que le développement de la leucémie et la toxicité des composés peuvent provoquer perte de poids et apathie. Il affirme que les modèles animaux sont "indispensables" pour évaluer les traitements au stade préclinique, le contexte tumoral ne se reproduisant pas selon lui in vitro.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une maladie complexe, avec de nombreux sous-types porteurs de combinaisons d’altérations particulières. Cette maladie est caractérisée par un blocage de développement et l’envahissement de la moelle osseuse par des cellules immatures. De nombreux progrès ont récemment été apportés dans la caractérisation des altérations des LAM. Ces études ont permis une meilleure classification des patients. Cependant, la prise en charge des patients à la récidive de la maladie reste problématique ce qui explique les taux de mortalité. Environ 25-30% des patients atteints de LAM ont une altération du récepteur FLT3 qui est associée à des fréquences de rechutes élevées et à un pronostic défavorable. FLT3 est une cible thérapeutique avérée pour laquelle des traitements efficaces et sélectifs sont disponibles. Cependant, des résistances apparaissent très rapidement après ce type de traitement. A la rechute, le traitement initial devient en général inefficace pour cibler les cellules leucémiques. Les résistances sont les causes majeures de l’échec thérapeutique. Il y a donc un besoin urgent de traitements alternatifs pour prendre en charge les patients. L'objectif de notre projet est donc d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette maladie. La majorité de nos expériences sont réalisées sur des modèles simplifiés de cellules en culture. Cependant, les modèles animaux sont indispensables pour évaluer les traitements prometteurs pour les études au stade préclinique.

Bénéfices attendus

Notre projet fait appel au repositionnement de médicaments existants pour le traitement des LAM et à des modèles précliniques de LAM. D’autre part, nous interagissons régulièrement avec des cliniciens. En cas de succès, le projet a un fort potentiel de valorisation et de transfert vers la clinique.

Procédures

Une transplantation de cellules cancéreuses (1 minute/souris) sera réalisée une fois au début de l’expérimentation. Les animaux seront soumis à des traitements qui seront administrés au niveau de différents sites d’injection 5 jours consécutifs maximum par semaine pendant 4 semaines. L’intervention durera maximum 1 minute par souris. Des prélèvements sanguins (5 minutes/souris) seront effectués 1 fois toutes les 2 semaines (4 fois maximum) pour suivre l’évolution de la maladie dans le sang. Lorsque les cellules cancéreuses sont bioluminescentes, nous pourrons suivre également l’évolution de la maladie sans geste invasif grâce à une caméra pouvant quantifier la lumière émise par les cellules, localiser le signal donc les cellules cancéreuses au niveau des organes et mesurer son intensité (1 lecture/semaine sous anesthésie volatile). Cette manipulation prendra 10 minutes par souris. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien avec une pesée 5 fois/semaine pour estimer au mieux leur état physiologique global. Ce suivi prendra maximum 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables dus à la toxicité des composés à la plus forte concentration sont potentiellement à prévoir avec une perte de poids des souris possible. Après greffe des cellules leucémiques, le développement de la pathologie peut entrainer des diminutions de la motricité, un défaut d’entretien du pelage et une perte de poids. Les traitements quotidiens, selon les composés testés, peuvent provoquer une apathie des animaux avec une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasiés. Lors de greffe de cellules cancéreuses, après la mise à mort des souris, la rate et les fémurs/tibias seront prélevés, puis dissociés pour énumérer les cellules cancéreuses afin d'évaluer l'effet des traitements. Un stockage de cellules leucémiques issues de ces organes sera aussi effectué afin de réaliser des expérimentations pour évaluer la fréquence de cellules initiatrices de la leucémie et pour analyser in vitro différents marqueurs exprimés par les cellules en réponse aux traitements.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de développement chez l’homme en l’absence de données précliniques. La régulation de l’hématopoïèse normale et pathologique implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux (extrinsèques) et propres aux cellules hématopoïétiques (intrinsèques): ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma et du contexte cytokinien, sont cruciaux dans la réponse thérapeutique et ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Nous ferons en sorte que le groupe contrôle, qui recevra le véhicule de solubilisation du/des composé(s), soit commun à plusieurs combinaisons ce qui nous permettra de réduire le nombre de souris. Afin de réduire le nombre d'animaux génétiquement modifiés issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés. Le sexe sera choisi en fonction du nombre d'animaux nécessaires et disponibles par cohorte.

Raffinement

Hébergement en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton pour nidification), et maintien des animaux en groupes de 3-5 afin d’éviter le stress de l’isolement. De même, les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. Les greffes de cellules seront réalisées sous anesthésie gazeuse. De plus, dans un souci de raffinement et de réduction, le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques de la charge leucémique circulante après prélèvement sanguin et par imagerie optique par bioluminescence (quand cela est possible) sous anesthésie gazeuse. Durant toute la durée d’un protocole, l’ensemble des animaux est observé quotidiennement et le bien-être est évalué à l'aide d'une grille de scores. La durée des protocoles sera fonction de l’atteinte des points limites ou de l’obtention de résultats validés statistiquement.

Choix des espèces

La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d’un individu d’une espèce donnée chez un individu hôte d’une espèce différente. Ainsi, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise de greffe de cellules leucémiques humaines et éviter la réaction de l’hôte vis-à-vis du greffon. Dans ce contexte, la lignée de souris NOD.Cg-Prkdc scid/J (NSG) est un des modèles les plus couramment utilisé et très bien documenté dans la littérature dans le cadre d’études précliniques réalisées à partir de xénogreffes de cellules leucémiques humaines. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules leucémiques, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

70 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent une injection intracérébrale de cellules tumorales par craniotomie, et trente d'entre eux subissent une seconde chirurgie pour implanter un dispositif d'administration et une pompe osmotique. Le porteur teste une voie d'administration locale de médicament contre le glioblastome, et non une molécule, ce qu'il présente comme réalisable seulement in vivo. Il fixe comme point limite une taille de tumeur qu'il décrit comme n'induisant pas encore de souffrance perceptible.

Objectifs

Bien que l'incidence du glioblastome soit faible (~6/100000) la médiane de survie post-diagnostic est de l'ordre de 15 mois malgrè un traitement agréssif associant une chirurgie et une chimio/radiothérapie. Parmi les améliorations thérapeutiques possibles, l'utilisation d'une infusion focale à flux fixe (CED) est une option. Toutefois, ce type d'infusion est limité dans le temps et possible qu'au moment de l'exèrese. L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer l'apport d'un nouveau dispositif médical permettant de délivrer localement un médicament par une infusion multifocale à flux fixe et ceci sans contrainte de temps.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à cours terme est de proposer une approche thérapeutique innovante et modulable pour le glioblastome dont la médiane de survie reste très courte.

Procédures

Parmi les 70 animaux inclus dans cette étude, 70 recevront une injection intracerébrale de cellules tumorales. Ils subiront donc une chirurgie sous anesthèsie générale de 15-20 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 0.5mm de diamètre. Parmi les 70, 30 subiront une seconde chirurgie 8 jours après la première. Les gestes seront identiques à ceux réalisés précédement. 30 subiront une seconde chirurgie, 8 jours après la première, sous anesthèsie générale de 60 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 4mm de diamètre au niveau de la plaque pariètale, suivi par la pose du dispositif et un décollement cutané au niveau interscapulaire afin de poser une pompe osmotique. Les 10 derniers ne subiront pas de chirurgie complementaires. Tous les animaux seront suivi par IRM afin d'évaluer l'impact des thérapies mises en oeuvre sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont relatives aux chirurgies incluses dans le protocole. En effet, une première chirurgie consistera à injecter les cellules tumorales au travers d'un orifice de diamètre inférieur à 1mm dans le crâne du rat après incision cutanée. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post opératoire de buprénorphine (0,1mg/kg 0,1mg/mL Buprécare) et injection locale de lidocaine (16,2mg/mL, 100uL). La seconde chirurgie sera réalisée une semaine après la première, également sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post-opératoire de buprénorphine et injection locale de lidocaine. Cette chirurgie s’accompagnant d’une craniotomie de 4mm de diamètre et d’une tunnelisation pour la pose de la pompe osmotique, des doses supplémentaires de buprénorphine seront dispensées 6h et 18h post chirurgie. Enfin, après chaque chirurgie, les animaux seront isolés pour 24h afin d’éviter qu’ils ne se rongent mutuellement les sutures.

Devenir

En fin de procédure 1 (inoculation de cellules tumorales) tous les animaux seront conservés car impliqués dans la procédure 2. En fin de procédure 2 (evaluation du nouveau dispositif) tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Il existe de nombreux tests de toxicité de molécules sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous on permis de selectionner 2 molécules avec un potentiel thérapeutiques certains sur la lignée de glioblastome testée. Dans notre cas, nous ne cherchons pas à tester une nouvelle molécule mais une voie d'administration innovante et ceci ne peux être réalisé qu'in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante. en effet, une simulation en utilisant G-power montre que pour nos groupes (non traités, traités PBS avec le nouveau dispositif, traités par la molécule 1 avec le nouveau dispositif, traité en CED par la molécule 1 et traité par du PBS par CED) contenant un nombre d'individus équivalent et égal à 10, un gain de survie moyen de 2 jours pour la thérapie CED et au minimum 3 fois supérieur pour le nouveau dipositif peux être mis en evidence avec un risque alpha de 0.05 et beta 0.95.

Raffinement

Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux seront maintenus en normothermie pendant toutes les procédures chirurgicales. Ces procédures seront réalisées sous anesthèsie isoflurane et une injection locale au niveau de la zone d'inscision de lidocaine. Une analgésie pre et post operatoire par de la buprenorphine et également associée. De plus, le suivi réguliers par IRM de la croissance tumorale, là aussi en normothermie assurée par une couverture chauffante asservie à la temperature réctale, et le suivi lors de ces examens du rythme respiratoire, la production de données sériées permet de limiter le nombre d'individus nécessaire pour tester notre hypothèse de travail. De plus, le suivi de la masse tumorale permet d'arreter le protocole expérimental avant tous signes cliniques de souffrance de l'animal. En effet, notre expérience de ce type de modèle nous permet de fixer comme point limite une taille de tumeur de 100µL, taille qui n'induit pas de modifications comportementales traduisant une souffrance.

Choix des espèces

Les tumeurs 9L sont des tumeurs initialement produites chez le rat fisher et ne se developpent que chez cette souche immunocompétente. Les animaux utilisés seront des animaux adultes de 7-8 semaines au moment de la première chirurgie. A cet age, il est possible de poser le dispositif sur le crane de l'animal en ne touchant qu'une seule plaque pariètale. De plus, le dispositif faisant environ 3mm de hauteur, il est possible de suturer sans crèer de tension importante. Enfin, avec cette taille de rat, la pompe osmotique (environ 1cm de long et 0.4cm diametre) alimentant le dispositif une tubulure souple en polyurethane peut être placée entre les omoplates sans entraver la mobilité de la tête.

150 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection cérébrale de vecteurs viraux sous anesthésie, reçoivent du tétrahydrocannabinol, passent des tests de comportement moteur et sont isolées une semaine, avant d'être tuées pour vérification histologique. Le porteur étudie le rôle du récepteur CB1, cible des molécules du cannabis, dans le contrôle moteur et les maladies neurodégénératives. Il affirme que les simulations numériques ne sont pas fiables et que le recours à l'animal "demeure nécessaire".

Objectifs

Le « système moteur » est principalement composé par le groupe de noyaux appelé « les ganglions de la base ». Ce système fortement conservé chez les mammifères, y compris l’homme, est un système complexe des connexions entre différents noyaux fortement régulé par plusieurs mécanismes agissant en différentes étapes, et toujours ces mécanismes sont à clarifier complètement. Le système des ganglions de la base est aussi la principale cible des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. Pour nous, un possible candidat qui pourrait être important dans le control des ganglions de la base est le système endocannabinoide. Dans le cerveau, l’action du principal composé psychoactif du cannabis passe par un ensemble de molécules, appelées collectivement « système endocannabinoïde ». Ce système contrôle de très nombreuses fonctions du corps humain. Il est notamment impliqué dans le contrôle moteur et la coordination. Avec ce projet (que est un complement de un projet deja en cours) nous voulons comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes agissent sur les fonctions motrices, et leurs implications possibles dans les maladies neurodégénératives affectant ces fonctions.

Bénéfices attendus

Le récepteur CB1 est la cible endogène des molécules psycho-actives du cannabis. Au niveau endogène, ce récepteur est activé par des molécules lipidiques (endocannabinoïdes) qui jouent un rôle crucial dans les mécanismes de protection et régénération neuronales. De plus, l’administration de drogues dérivées du cannabis a été suggérée comme un outil thérapeutique pour plusieurs maladies du système nerveux centrale et des ganglions de la base. Ce projet nous aidera à mieux comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes régulent l'activité de ce circuit neuronal en visant donc au development d’outils thérapeutiques pour les troubles moteurs associé aux maladies neurodegeneratives.

Procédures

Nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées. Sur certaines souris, nous allons injecté des vecteur viraux pour reduire la signalisation du recepteur CB1 dans des regions specifiques du cerveau. Cette procédure chirurgicale se fera sous anesthésie générale, avec un traitement analgesique pour prévenir la douleur (durée total de 30 minutes). L'intervention aura une durée de 30 minutes. Dans la période postopératoire (intevention de 3 jours), une injection sous-cutanée de Buprénorphine sera administrée 6 heures apres la premiere injection et répétée une fois par jour pedant 3 jours. Trois semaines apres chirurgie, les souris seront en isolement une semaine avant injection et seront injecteé avec differentes drogues: Tetrahydrocannabinol et leur vehicule (Durée total de 45 minutes). Apres traitments, les souris seront soumis a des tests de comportement moteur (Durée de 5minutes ). Apres le comportement, les souris seront mis a mort selone les modalité decrites.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de risque majeur lié à l’acte chirurgical et la douleur associée est traitée par une anesthésie approprié et des analgésiques. Il n’y a pas de signe perceptible des douleur après l'opération, durant la récuperation et lieés au procedures de injection et comportement. Néanmoins, il y a des points limites bien décrit dans les procédures. Le taux d’apparition des signes d’infection de la plaie suite à la chirurgie est très faible.

Devenir

Les souris issue de la procedure de chirurgie seront en suite traité avec des drogues suivi par des tests comportamentales. En suite les animaux seront mis a mort pour fin experimentation et verification hystologique des injectiones virales.

Remplacement

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux n'excèderont pas 15 animaux, c'est à dire le nombre minimal d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine et aussi décrit dans la literature scientifique sur le sujet. Au regard du faible nombre d'individu par groupes expérimentaux, les analyses statistiques basées sur des tests non paramétriques seront privilégiées par rapport aux tests paramétriques. De cette facon, les nombres prévus permettent de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience nous montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Un protocole de surveillance et un suivi quotidien et rigoureux seront mis en place par l’experimentateur et le personnel zootechnicien. En cas de blessure légère, un protocole de soins et désinfection sera mis en place (antiseptique topique et antiinflammatoire systémique) jusqu’à la guérison. En cas d’atteinte du point limite terminal, l’animal sera mis à mort. Pour les traitments pharmacologiques, les injections IP sont bien maitrisées dans le laboratoire et ils n’induisent pas de mal-être chez l’animal. En plus les produits utilisés (et leur doses) sont bien tolérés chez les animaux. Les souris seront néanmoins bien observées suite aux injections, par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. Pour certaines experiences de comportement moteur, les souris seront isolées pedant 7 jours avant injection. Toutes les mesures pour reduire l'impact de ce type d'hébergement seront mise en place (congénères à proximité et enrichissement approprié). Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant et après manipulation, sauf pour certaines experience de comportement moteur que prevoi une semaine d'isolement. Les souris seront hébergés avec un milieu enrichi (matériel de nidification en coton et 2 tunnels par cage), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs, formés selon la règlementation en vigueur et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général et comportemental des animaux comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, pré- et post-opératoire, prévoit aussi l’utilisation d’analgésique pour la prise en charge de la douleur. Elles seront effectuées par des experimentateurs formés à la chirurgie chez les rongeurs, selon la règlementation en vigueur.

Choix des espèces

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur CB1), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont équipées pour être destinées à l’étude des rongeurs. L'age des animaux sera de 8-12 semaines car les protocoles que nous avons établis seront développés à l'âge adulte des souris en évitant les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le terrain.

160 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime carencé en vitamine A censé induire une neurodégénérescence, avec déclin cognitif et altérations motrices, avant d'être tués pour analyse post-mortem du cerveau, la moitié alimentant une biobanque. Le porteur signale que ces déficits ne sont visibles qu'au moyen de tests comportementaux "poussés" qu'il ne détaille pas. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative adaptée pour ce projet de physiologie intégrée.

Objectifs

Cette étude s'inscrit dans le cadre d'un Grand Projet de Recherche (GPR) financé par l'Etat français. L'objectif scientifique du projet est d'étudier en parallèle et de manière harmonisée 3 maladies neurodégénératives pour identifier des biomarqueurs communs et ainsi développer de nouvelles stratégies thérapeutiques de prévention et de traitement pour ces pathologies. Ces trois maladies sont la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amiotrophique. Le modèle de carence en vitamine A chez le rat présente des aspects de déclin cérébral global : déclin cognitif et altérations motrices principalement. J'étudie ce modèle depuis plusieurs années en rapport avec la neurodégénéresence spécifique à la maladie de Parkinson. Je m'associe au projet GPR afin d'étudier tous les aspects de la neurodégénérescence dans ce modèle, en rapport avec les 3 maladies neurodégénératives citées plus haut. Ainsi, les animaux utilisés vont permettre d'étudier l'impact de la carence en vitamine A sur la neurodégénérescence d'un point de vue biochimique et sub-cellulaire dans les différents types de neurones spécifiquement altérés dans ces pathologies. Par ailleurs, la moitié des animaux utilisés servira à constituer une biobanque qui a vocation à recueillir les échantillons biologiques des différents modèles des pathologies citées, pour des investigations harmonisées sur ces 3 pathologies.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ces animaux permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques communs qui sous-tendent la neurodégénérescence dans les maladies d'Alzheimer, de Parkinson et la sclérose en plaque amiotrophique.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime sub-carencé en vitamine A. C'est la seule intervention qui sera réalisée dans cette étude.

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux suite au régime sub-carencé en vitamine A sont d'une classe de sévérité modérée. Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont attendus chez les animaux. Hormis la neurodégénérescence qui est attendue, ce qui peut induire un déclin cognitif et des altérations motrices modérées, nous n'avons pas observé d'effet sévère sur les animaux à cause du régime. Pour la vie quotidienne des animaux, les conséquences de la sub-carence ne sont pas observables, il faut réaliser des tests comportementaux poussés pour voir des déficits au niveau des capacités de mémorisation et d’apprentissage moteur.

Devenir

Les animaux doivent être euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale car une grande partie du projet repose sur l'analyse post-mortem de plusieurs structures cérébrales pour étudier les mécanismes de la neurodégénérescence à l'échelle sub-cellulaire.

Remplacement

Ce projet est fondamentalement un projet de physiologie intégrée étudiant l'impact de la nutrition sur la physiologie du cerveau dans son ensemble, il n'existe donc pas de méthode alternative ou substitutive adaptée aujourd'hui. Les cellules en culture ne forment pas de réseaux de neurones représentatifs de la réalité biologique et nous n'avons pas encore suffisamment de données pour utiliser des modèles informatiques. De plus, les approches expérimentales réalisées dans ce projet ne sont pas envisageables chez l'Homme.

Réduction

Un nombre de 10 animaux par groupe a été déterminé comme étant le minimum requis pour atteindre une puissance statistique suffisante. Nous aurons 2 études en parallèle dans ce projet, avec 2 régimes différents et 2 temps de prélèvements post-mortem, et ces études seront réalisés chez des rats mâles et femelles. Ceci représente un total de 160 rats.

Raffinement

Les rats seront hébergés par paire avec un congénère et ils bénéficieront d'un enrichissement comportemental dans leur cage. Leur état de santé sera vérifié quotidiennement et ils seront pesés 1 fois par semaine. Malgré toutes les précautions prises, si un animal présente des points limites à un moment de l'étude, comme une diminution du poids de plus de 20% en 1 semaine, il sera euthanasié pour éviter toute souffrance. Cette étude de recherche fondamentale apportera des connaissances importantes sur les mécanismes de la neurodégénérescence et pourra ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les maladies étudiées et/ou en ralentir la progression.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle rat représente le meilleur compromis pour tester nos hypothèses afin de comprendre la neurodégénérescence induite par la carence en vitamine A. D'une part, le modèle de carence en vitamine A est très maitrisé depuis de nombreuses années chez le rat. Ainsi, cette étude pourra s'appuyer sur toutes les données déjà publiées et ne nécessitera pas de validation supplémentaire. D'autre part, la carence chez le rat est bien mieux maitrisée que chez la souris, car la carence chez la souris est beaucoup plus longue, ou bien doit être commencée pendant la phase développementale, ce qui n'est pas réalisable vis à vis de nos hypothèses de travail. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage (21 jours) et les régimes dureront 1 ou 4 mois.

Jusqu'à 3 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des injections de tamoxifène déclenchent chez des souris génétiquement modifiées des lésions précancéreuses de la prostate, qui peuvent évoluer vers des tumeurs volumineuses provoquant douleur abdominale et perte de poids, la mise à mort étant prévue à 2 000 mm3 de tumeur ou à 20 % de perte de poids. Les animaux sont tués à différents temps pour prélever la prostate et d'autres organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique des lésions et conclut à la "nécessité" d'expériences in vivo.

Objectifs

Le cancer de la prostate ( CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine de l’agressivité des tumeurs est donc requise afin de d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate, développés au laboratoire, répliquent les mutations du gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines. Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme. L'objectif de ce protocole est le suivi et caractérisation des lésions précancéreuses de la prostate. Suite à l'invalidation du ou des gènes, des lésions, nommées néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), se développent. L'évolution des PIN sera suivie pendant un délai suffisant à l'apparition des formes agressives. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes d'apparition des formes agressives du cancer de la prostate afin d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et des outils diagnostiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des gènes étudiés dans cette évolution. Les prélèvements de fluides (urines et sang) nous aideront à mettre en évidence des biomarqueurs du cancer de la prostate permettant un diagnostic précoce de la maladie.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène réalisés au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, 100 µL du sang sera prélevé sur 20 animaux à chaque point de la cinétique ( 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12 et 15 mois après injections du tamoxifène), un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Une injection en intra péritonéale prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris.

Impact sur les animaux

Suite à l'injection du tamoxifène, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. La taille de tumeur sera donc un point limite clé(2000 mm3). Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

L’effectif demandé a été calculé afin d’obtenir les groupes des souris mutantes à différents points cinétiques de taille suffisante pour réaliser les tests statistiques de sorte à pouvoir tirer des conclusions pertinentes de nos expériences. Pour un type de souris donné et un point cinétique donné, 20 souris seront utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction de nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. En revanche, sur les points clés, des expériences supplémentaires pourront être réalisées, toujours dans la limite de 3200 souris maximum.

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Après injection, les souris seront observées pour détecter les éventuels signes de douleur ou de souffrance, à savoir la posture inhabituelle, le dos vouté, le poil hérissé, les grimaces, les vocalisations. Si ces signes persistent dans la journée suivant l'injection, les souris seront sorties de l'étude. De plus, lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, elles seront observées par l'expérimentateurs et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler la taille de la prostate par palpation et l’apparence générale de la souris. Les points limites de l’expérience seront le volume de la prostate et le poids de la souris. Si le volume de la prostate est supérieur à 2000 mm3, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est supérieure à 20% et/ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Après chaque prélèvement sanguin, un volume équivalent au prélèvement de sérum physiologique sera injecté en sous-cutanée. De plus, le lieu de l'injection sera surveillé dans les journées suivantes afin de détecter des signes d'une éventuelle inflammation (rougeur, gonflement).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans des gènes Pten et Trp53 le plus fréquemment mutés dans les cancers de la prostate humain pour générer nos modèles. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte. Les animaux utilisés seront adultes, les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

110 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une restriction alimentaire, un implant cérébral chirurgical et un hébergement en cage individuelle pour enregistrer leur activité cérébrale pendant des tâches de mémoire en labyrinthe et pendant le sommeil. Le porteur présente la restriction alimentaire et l'exercice en labyrinthe comme "bénéfiques" pour la santé des animaux, et indique qu'une démarche de replacement auprès d'une association reste seulement "en cours". Il affirme que l'étude des mécanismes de la mémoire ne peut se faire que sur des animaux au cours de l'apprentissage.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester la théorie standard des mécanismes de la formation et de la consolidation de la mémoire, qui attribue un rôle critique à l'hippocampe et à ses partenaires corticaux et sous-corticaux, notamment pendant le sommeil. Nous entraînerons donc des rats à effectuer des tâches de mémoire impliquant ces systèmes, nous enregistrerons l’activité cérébrale pendant l’accomplissement de ces tâches et pendant le sommeil, et nous tenterons également d'altérer les performances mnésiques en modifiant la dynamique cérébrale au moyen de stimulations ciblées. Des rats seront utilisés pour toutes les étapes de ce projet. Le rat est un modèle standard pour l’étude de la mémoire aussi bien en psychologie animale qu’en neurophysiologie chez l’animal libre de ses mouvements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux de la formation et de la consolidation de la mémoire. Nous nous intéresserons en particulier à l’hippocampe, une structure qui chez l’homme joue un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée dans les troubles mnésiques liés aux maladies neurologiques, notamment l’épilepsie et la maladie d’Alzheimer. À ce titre, des travaux précédents décrivant une méthode d’amélioration de la consolidation de la mémoire chez le rat ont été récemment répliqués chez l’homme et laissent entrevoir la possibilité de pallier certains déficits mnésiques liés à l’âge ou à la pathologie.

Procédures

Ce projet utilisera 110 rats. Pour étudier les bases neurales de la mémoire, les animaux sont entraînés à effectuer des tâches de mémoire spatiale dans des labyrinthes (max 110 rats, typiquement 1–2 h/jour, 2–4 semaines). L’accomplissement de ces tâches repose sur la motivation des animaux à obtenir des récompenses alimentaires. Une légère restriction alimentaire est donc nécessaire à leur motivation, ainsi que pour éviter leur surpoids (max 110 rats, depuis l’entraînement jusqu’à la fin des enregistrements, typiquement 1–3 mois). Pour permettre une restriction précise, les animaux sont maintenus dans des cages individuelles, à proximité directe de leurs congénères, dans des cages transparentes pour assurer une contiguïté visuelle, auditive et olfactive (max 110 rats, pendant la durée de la restriction). La littérature scientifique montre que la légère restriction alimentaire (>85% du poids normal à l’âge de l’animal) et l’exercice physique dans les labyrinthes sont bénéfiques pour un grand nombre de marqueurs de santé et de vieillissement. Les animaux reçoivent un implant chirurgical (max 110 rats, 1 fois, typiquement 4–12 h) pour pouvoir enregistrer leur activité cérébrale (max 110 rats, typiquement pendant 2 à 3 semaines) pendant l’accomplissement de la tâche (typiquement 1–2h/jour d’enregistrement) ainsi que pendant le sommeil lorsque la mémoire se stabilise à long terme (typiquement 1–6h/jour d’enregistrement). Pour 40 animaux (max), une expression intracérébrale de protéines d'intérêt sera également pratiquée (1 fois, typiquement 1–2h). Une analyse histologique permettra de vérifier les sites d’enregistrement ou d’expression (max 110 rats, 1 fois, typiquement

Impact sur les animaux

Le projet nécessite de maintenir les animaux dans des cages individuelles pendant une durée limitée pour pouvoir assurer une restriction alimentaire (ou hydrique) précise. Pour limiter le stress, les animaux sont maintenus à proximité directe de leurs congénères, dans des cages transparentes (contiguïté visuelle, auditive et olfactive). La légère restriction alimentaire (>85 % du poids normal à l’âge de l’animal) est bénéfique pour un grand nombre de marqueurs de santé et de vieillissement (vieillissement cellulaire, déclin immunitaire, inflammation chronique, communication cellulaire). De plus, les animaux sont entraînés à explorer des labyrinthes (typiquement, 1 à 2h/jour), ce qui contribue également à éviter les inconvénients d’une obésité liée à une consommation alimentaire à volonté combinée à un manque d’exercice physique résultant du maintien en cage. L’exploration de labyrinthes constitue par ailleurs une stimulation bénéfique (exercice physique, curiosité, récompenses alimentaires, etc.) L’implantation des dispositifs d’enregistrement cérébral nécessite une récupération, facilitée par l’utilisation d’anesthésiques gazeux (récupération plus rapide) et de traitements antibiotiques, analgésiques et anti-inflammatoires appropriés.

Devenir

À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique. Une démarche alternative est en cours auprès d’une association pour replacer les animaux qui seraient jugés aptes par un vétérinaire.

Remplacement

Certains mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant la mémoire (par exemple, le recrutement de nouveaux récepteurs au niveau synaptique) peuvent être défrichés in vitro. Certaines propriétés computationnelles de petits réseaux de neurones peuvent être testées in silico. Mais in fine, l’étude des mécanismes de réseau de formation et de consolidation de la mémoire nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire, et ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer >100 neurones simultanément, ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal.

Raffinement

Les soins post-opératoires incluront des traitements antibiotique (ex : marbocyl), analgésique (ex : buprénorphine), ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Nos expériences s'effectueront sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements (et non tête fixée) pour se rapprocher au mieux de la physiologie et limiter le stress. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Pour limiter le stress dû à l’isolement, nous utiliserons des cages transparentes placées à proximité les unes des autres, de façon que les animaux puissent rester en contact visuel, auditif et olfactif. De la musique sera diffusée dans la pièce pour réduire le stress causé par les éventuels bruits environnants (ex : passage de personnes dans le couloir), qui bien que réduits pourraient devenir plus saillants dans le silence.

Choix des espèces

Le rongeur est l’espèce standard pour toutes les études des bases neurophysiologiques de la mémoire spatiale depuis des travaux fondateurs menés dans les années 70. Ce sont les modèles pour lesquels les outils expérimentaux sont les plus développés (électrophysiologie à grande échelle, vecteurs viraux, optogénétique). En outre, les rats peuvent apprendre des tâches comportementales élaborées et être équipés de dispositifs d’enregistrement visant plusieurs structures cérébrales. Nous utiliserons de jeunes adultes (typiquement 2 à 6 mois), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.