Rongeurs

2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite est induite par injection de collagène, qui provoque un gonflement des pattes et des articulations, sans qu'aucun anti-inflammatoire puisse être administré puisqu'il interférerait avec l'expérimentation. Le projet teste des cellules souches mésenchymateuses et leurs sécrétions pour réduire les signes d'arthrite. Le porteur annonce un impact "majeur" et des "retombées énormes" en santé publique, tout en renvoyant l'application humaine à un modèle préclinique.

Objectifs

Notre groupe travaille sur la mise au point d’approches de thérapies cellulaires pour inhiber l’inflammation ou régénérer le cartilage détruit suite à des pathologies ostéo-articulaires notamment dans le cas de la polyarthrite rhumatoïde. L’inhibition de l’inflammation associée à cette pathologie consiste à injecter de manière locale ou systémique des cellules « médicaments », les mitochondries ou les vésicules extracellulaires qu’elles sécrètent capables d’inhiber la réponse immunitaire. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les capacités thérapeutiques de cellules appelées cellules stromales mésenchymateuses (CSM) non-modifiées ou modifiées (ou ce qu’elles sécrètent) pour diminuer les signes d’arthrite. Les CSM sont des cellules qui possèdent des propriétés anti-inflammatoires qui les rendent particulièrement intéressantes pour mettre en place une approche thérapeutique de l’arthrite. Le modèle utilisé couramment est le modèle d’arthrite induite au collagène (CIA).

Bénéfices attendus

En l’absence de traitement de l’arthrite chez environ 30% des patients atteints de formes sévères et résistants aux biothérapies, il est nécessaire de développer de nouvelles approches thérapeutiques. L’utilisation des cellules souches a déjà montré son intérêt dans plusieurs modèles de pathologies autoimmunes dont l’arthrite rhumatoide. Notre projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de ces cellules dans un modèle pré-clinique d’arthrite chez la souris et à comprendre les mécanismes mis en œuvre par ces cellules afin de déterminer les meilleures options thérapeutiques chez l'homme. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement de l’arthrite. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux subiront deux injections dans le tissu cutané, deux intraveineuses ainsi que des prélèvements sanguins. Tous ces gestes seront effectués sous anesthésie générale gazeuse.

Impact sur les animaux

L’immunisation des animaux et leur suivi constituent un protocole induisant des douleurs modérées et pour lequel il n’est pas possible d’administrer de traitements anti-inflammatoires qui interféreraient avec l’expérimentation. L’immunisation des animaux pour induire l’arthite se fait par des injections dans le tissu cutané après anesthésie gazeuse. Elle provoque un gonflement des pattes et des articulations. Un stress lié à l’anesthésie et une douleur au site d’injection peuvent être provoqués. Cependant, la douleur reste faible et sans impact sur le comportement des animaux.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour prélevés les organes d’intérêt

Remplacement

- Remplacement : Afin de proposer une thérapie cellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses humaines et murines dans un modèle pré-clinique pertinent chez l’animal. Des modèles in vitro ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces cellules ou des molécules ou des vésicules qui en dérivent.

Réduction

- Réduction : le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer (données préliminaires obtenues dans d’autres expériences réalisées au laboratoire)

Raffinement

- Raffinement : toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement. Le bien-être des animaux sera suivi à l’aide d’une grille de score de bien-être. Si les souris ont du mal pour se redresser ou à se nourrir, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition des souris directement dans la cage des animaux.

Choix des espèces

Les souris mâles de la souche utilisée sont susceptibles à l'arthrite au collagène qui est le modèle expérimental de référence pour la pathologie humaine. Les souris doivent être âgées d'au moins 9 semaines et posséder un système immunitaire mature. Les animaux sont utilisés à semaine 9, âge recommandé pour ces modèles d’arthrite induite

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau ou l'implantation d'une canule cérébrale reliée à une minipompe, complétées par un régime gras, des tests métaboliques, un jeûne de 24 heures et des prélèvements sanguins. Le porteur décrit une inflammation post-chirurgicale possible et l'isolement des souris en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire. Il situe l'intérêt du projet dans la recherche de cibles contre l'obésité, notant que ces médicaments sont "particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique", et affirme que cette régulation ne peut s'étudier que chez la souris.

Objectifs

L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. L'organisme doit en permanence recueillir et interpréter des signaux hormonaux, métaboliques et nerveux émis par les tissus périphériques impliqués dans l'utilisation et le stockage de l'énergie (foie, muscle, tissu adipeux). En retour, l'intégration de ces signaux par le cerveau se traduit par la mise en place d'une réponse adaptée au niveau comportemental (manger ou jeûner) et métabolique (production de sucre par le foie et libération de lipides par le tissu adipeux en période de carence, ou bien stockage d'énergie par ces mêmes tissus en période d'abondance). Au niveau du système nerveux central, une région particulière de l'hypothalamus, le noyau arqué (ARC), joue un rôle fondamental dans la signalisation et l'intégration des messages circulants de satiété et de faim. L'ARC contient deux populations neuronales clés dans la régulation du comportement alimentaire : les neurones à Agouti-Related Protein (AgRP) stimulant la prise alimentaire et les neurones à pro-opiomélanocortine (POMC) inhibant la prise alimentaire. Nous avons observé que la prise alimentaire est réduite chez des souris dans lesquelles notre gène d'interêt est invalidé dans les neurones AgRP. Nous voulons maintenant: 1. déterminer les voies de signalisation moléculaires qui sont mises en jeu dans cette population neuronale. 2. Vérifier la réversibilité du phénotype observé chez les souris dont le gène d'intérêt est invalidé. 3. Verifier si la protéine codée par le gène d'intérêt peut être une cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de Type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établie et de façon encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'un gène d'intérêt dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Des mutations du gène étudié ont été trouvées dans de nombreuses cohortes de diabétiques DT2. Nos données laissent entrevoir un rôle spécifique de ce gène dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'a pas été mise en avant jusqu'à présent. Les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage les mécanismes moléculaires reliant notre gène d'intérêt à la prise alimentaire, ce qui sera nécessaire pour déterminer si la protéine codée par ce gène est ou non une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité. Par ailleurs, l'utilisation d'inhibiteurs ciblant la famille de notre protéine d'intérêt nous permettra de fournir une première preuve de concept qui déterminera si l'inhibition pharmacologique est effectivement une voie à privilégier. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction cellulaire. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints d'obésité.

Procédures

230 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Avant et après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 4 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 90 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Ces animaux subiront, sous anesthésie générale, l’implantation par chirurgie stereotaxique d’une canule dans une zone particulière du cerveau. La canule est reliée à une minipompe implantée sous la peau du dos au cours de la même chirurgie. 1 semaine avant et 1 mois après la chirurgie, un prélèvement sanguin à la veine temporo mandibulaire (durée : 30-45 sec.) est réalisé sur les animaux vigiles. Par ailleurs, au cours du mois suivant la chirurgie, ces animaux seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le premier nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements d’une goutte de sang (2µl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le 2ième nécessitera 4 injections IP (1 inj/jour - durée 10 sec.)

Impact sur les animaux

La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post-chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim) qui, pour habituer les animaux, nécessite une injection IP de NaCl0.9% quotidienne pendant jours sans aucun effet prévu. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Un troisième test est décrit, il s'agit d'un test de tolérance au glucose. Un bolus de glucose est administré par voie IP, ce qui aura pour effet l'élévation de la glycémie (taux de glucose sanguin). La glycémie est mesurée à différents temps pour évaluer la capacité à Les animaux recevront une injection stéréotaxique qui pourra provoquer une inflammation post-chirugie. La procédure pour tester la sensibilité à la ghréline nécessite l'injection quotidienne intrapéritonéale de NaCL 0.9% afin d'habituer les souris avant le jour du test. Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche gras pour créer une environement obésogène sera mis en place chez les souris traitées avec l'inhibiteur pharmacologique, ce qui peut creer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisees dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 340 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs tests métaboliques (avec un temps de récupération adapté pour les animaux) seront réalisées sur les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Les animaux sont surveillés par le personnel qualifié tous les jours. Le stress lié aux procédures nécéssitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Chaque semaine, la prise de poids, la quantité de nourriture sont mesurées permettant ainsi un suivi hebdomadaire des souris. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour réduire tout inconfort ou douleur qui se développerait et des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Tout signe de douleur sera pris en charge en prenant les mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé, après avis vétérinaire. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formé spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Dans le domaine du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles le gène codant pour la protéine CaMK1D est invalidé. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgées de 8 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale (PE3)

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intradermique puis, cinq jours plus tard, une injection dans la voûte plantaire des deux pattes arrière pour déclencher une réaction inflammatoire, sans analgésique afin de ne pas interférer avec l'inflammation. Le porteur teste des cellules stromales mésenchymateuses censées réduire cette inflammation, en vue de traitements de l'arthrose et de la polyarthrite. Il affirme que les modèles in vitro ne suffisent pas à évaluer l'efficacité dans un contexte inflammatoire complexe.

Objectifs

Dans le cadre du traitement des pathologies ostéo-articulaires telles que l’arthrose ou la polyarthrite rhumatoïde, ldifféretnes approches de thérapies cellulaires sont en cours d’évaluation. Notre projet de recherche consiste à étudier les capacités thérapeutiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) pour diminuer l’inflammation associée à ces maladies. L’évaluation des propriétés anti-inflammatoires des CSM (ou de molécules thérapeutiques libérées par ces cellules) peut être effectuée dans un modèle inflammatoire simple, avant d’avoir recours à des modèles plus complexes et plus lourds à mettre en œuvre. Le modèle que nous utiliserons est le modèle d’hypersensibilité retardée (DTH) chez la souris. Le projet repose sur l’utilisation des cellules stromales mésenchymateuses murines ou humaines. La voie d’injection des cellules est locale. En parallèle, nous évaluerons les mécanismes moléculaires mis en place par ces cellules en utilisant des cellules souches mésenchymateuses déficientes pour l’expression de certains gènes et nous déterminerons l’impact de ces molécules sur l’effet thérapeutique des cellules.

Bénéfices attendus

Le modèle d’hypersensibilité retardée est un modèle rapide, simple et reproductible d’inflammation permettant d’évaluer l’efficacité d’un traitement immunomodulateur médié par les cellules stromales mésenchymateuses et des molécules ou des vésicules extracellulaires qu’elles libèrent. Grâce à ce modèle, nous pourrons valider in vivo une molécule identifiée in vitro ou un nouveau médicament cellulaire plus efficace sur l’inflammation que les approches thérapeutiques déjà en cours d’évualuation clinique chez les patients souffrant de pathologies ostéo-articulaires avec notamment des atteintes inflammatoires importantes. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement efficace des pathologies ostéo-articulaires. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire en identifiant des traitements plus efficaces aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge de l’inflammation des patients touchés par ces pathologies

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intra-dermique puis 5 jours plus tard, à une injection au niveau de la voûte plantaire des deux pattes arrière. Toutes les injections se feront sous anesthésie générale gazeuse (maximum 5 min/animal) au moment de l’intervention.

Impact sur les animaux

Nuisance et effets indésirables : la douleur induite par les injections de BSA méthylée en intradermique puis dans la voûte plantaire des souris sera de degré modéré et ne nécessitera pas l’administration d’analgésique qui pourrait interférer avec les mécanismes d’inflammation. Un stress lié à l’anesthésie peut être présent mais sans impact sur le comportement des animaux. Concernant les molécules qui seront testées : elles auront été sélectionnées et validées in vitro auparavant pour leur effet anti-inflammatoire. Il n’est donc pas attendu qu’elles puissent générer un effet indésirable

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de la procédure.

Remplacement

Avant de proposer une thérapie cellulaire ou acellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des traitements proposés dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte complexe d’inflammation rencontré in vivo.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et une analyse statistique afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour chaque expérience. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe expérimental afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux.

Raffinement

Enrichissement du milieu : Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle quotidien. L’injection des traitements est réalisée sous anesthésie gazeuse générale. Surveillance liée aux procédures : Les souris seront observées quotidiennement et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés et consignés dans une grille de score. Les points d’injection seront désinfectés à la vétédine avant et après injection et surveillés quotidiennement. Jusqu’à présent, nous n’avons jamais mis en évidence de signes d’irritation aux sites d’injection. La durée très courte de l’expérience garantit également une limitation de la douleur dans le temps.

Choix des espèces

Le modèle murin d’hypersensibilité retardée a été choisi parce qu’il présente l’avantage d’être simple, rapide et qu’il permet d’évaluer rapidement l’effet anti-inflammatoire d’un traitement avant d’avoir recours à des modèles in vivo plus complexes. Les animaux sont utilisés à semaine 7, âge recommandé pour ce modèle murin.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux âgés de 2 à 30 jours subissent une chirurgie d'injection intra-cochléaire de vecteurs, sont séparés de leur mère le temps de l'intervention, puis tués par dislocation cervicale quinze jours plus tard pour étudier leur cochlée. Le porteur indique qu'aucun modèle in vitro d'oreille interne ne permet de tester la diffusion des vecteurs dans le temps. Une éventuelle application aux surdités humaines est renvoyée à une dizaine d'années, après des tests sur des porcs.

Objectifs

Notre projet a pour objectif de corriger certaines surdités d’origine génétique, grâce au développement de nouveaux transporteurs (vecteurs) non viraux permettant d’acheminer l’information génétique corrigée aux cellules de l’organe de l’audition, la cochlée, afin de restaurer les capacités auditives. Ces tests seront réalisés sur des souris C57/Bl6, dont l'oreille interne est bien caractérisée et proche de celle de l’homme. Objectif : Optimiser les conditions d’utilisation (efficacité, localisation) de vecteurs non viraux au sein de la cochlée.

Bénéfices attendus

Le développement de vecteurs non viraux efficaces au niveau de l’oreille interne pourrait permettre leur utilisation pour corriger les surdités congénitales humaines. Celles-ci sont actuellement traités par appareillage auditif ou implantation cochléaire en fonction de l’intensité de la perte auditive. Bien que ces traitements soient dans la majorité des cas efficaces, les résultats sont imparfaits dans certaines conditions, notamment pour la compréhension de la parole en milieu bruyant. Le développement d’alternatives permettrait d’optimiser la correction apportée, et améliorer la qualité de vie des individus ayant une surdité congénitale. Le temps estimé du projet est de 2 ans. En fonction des résultats, notamment de l’efficacité et de la localisation, nous pourrons cibler au mieux certaines anomalies génétiques provoquant une surdité. Nous testerons l’efficacité de la thérapie génique sur des modèles murins, pour une durée estimée de 4 ans, car nécessitant un suivi plus prolongé. Si l’efficacité est confirmée, des tests sur modèles porcins seront nécessaires avant une potentielle utilisation chez l’homme, dans une dizaine d’années.

Procédures

180 souris auront une injection intra cochléaire (chirurgie d'une durée de 5 à 8 minutes sous anesthésie générale) à 2 ou 15 ou 21 ou 30 jours après la naissance et seront mises à mort 15 jours après l'injection.

Impact sur les animaux

Les procédures d’injection intra cochléaire peuvent être source d’inconfort pour les animaux (douleur, risque d’infection), pendant environ une semaine. Les pesées réalisées quotidiennement après injection seront source de stress, les 3 premiers jours, puis tous les 3 à 4 jours, soit 5 à 6 pesées par animal. Les souris à un âge précoce seront séparés de leur mère pendant une dizaine de minutes le temps de l'injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par dislocation des vertèbres cervicales, pour étude des cochlées.

Remplacement

La conformation 3D des explants utilisés in vitro est incomplète, et ne permet pas de refléter la diffusion in vivo. De plus, ces explants ont une durée de vie limitée de 3 à 5 jours. Il n’existe pas actuellement de modèle d’oreille interne utilisable in vitro permettant de tester la transfection au cours du temps, et dans les mêmes conditions 3D qu’in vivo, et il n’existe pas non plus de lignées de cellules ciliées de cochlées , ou de culture primaire de cellules ciliées à partir de prélèvement, qui permettraient de cibler spécifiquement les cellules d’intérêt. Le remplacement est donc impossible.

Réduction

Des explants d’oreille interne ont été utilisés in vitro permettant de sélectionner les 2 vecteurs les plus efficaces, à partir de prélèvements réalisés sur animaux mis à mort hors champ réglementaire et autorisés par la structure bien-être de l'établissement. Après utilisation de 36 animaux, si l'analyse statistique intermédiaire (Test de Mann-Whitney) montre des résultats significatifs, le projet sera poursuivi sur 144 animaux.

Raffinement

En complément de l'anesthésie générale, des anesthésiques locaux seront utilisés pour gérer la douleur post-opératoire générée par l’injection de vecteurs et l’incision réalisée au niveau de l’oreille interne. Concernant le suivi journalier des animaux, des grilles de soin adaptées à notre procédure ont été établies afin d’identifier pour chaque animal les points limites et points limites terminaux permettant de prendre en charge immédiatement les signes de stress, d’angoisse ou de douleur.

Choix des espèces

L'utilisation de souris pour étudier de nouveaux transporteurs (vecteurs) au sein de l’oreille interne est pertinente car : -L’oreille interne de souris est morphologiquement proche de celle de l’homme -Nous maîtrisons la technique chirurgicale nécessaire à la mise en place de ce modèle, qui ne provoque pas de baisse d'audition. Les injections seront réalisées 2 ou 3 jours après la naissance, équivalent du stade embryonnaire chez l’homme, en termes de développement de l’oreille interne. Les souris étant sourdes à cet âge, à 15 jours de vie, au début du développement de l’oreille interne, à 21 jours de vie en cours de développement de l’oreille interne et à 30 jours de vie à la fin du développement de l’oreille interne. Différentes études ont montré des différences en termes de répartition des transporteurs (vecteurs) en fonction de l’âge des souris.