Rongeurs

960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de sept jours, chaque raton subit une chirurgie du cerveau pour léser l'hippocampe, 320 recevant plus tard un implant d'électrodes, puis les animaux sont exposés à l'alcool et isolés durant l'adolescence avant d'être tués pour vérification histologique. Le porteur justifie le rat par l'auto-administration d'alcool, plus difficile à observer chez la souris, et par la reprise d'un modèle déjà utilisé au laboratoire. Il indique utiliser mâles et femelles pour ne pas avoir à éliminer d'animaux surnuméraires.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact à l'adolescence d'expositions précoces aux drogues sur les troubles du comportement et sur la transmission dopaminergique au sein du noyau accumbens dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'alcool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agents cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission dopaminergique. En effet la dérégulation de ce système de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la consommation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie. A ce jour, aucune étude ne s'est intéressée aux effets à court terme des expositions précoces aux drogues dans les modèles de schizophrénie.

Bénéfices attendus

Il a déjà été montré que l'exposition précoce à l'alcool durant l'adolescence est nécessaire pour l'observation à l'âge adulte d'une consommation exagérée d'alcool. Néanmoins, nous n'avons pour le moment aucune information concernant la co-exposition avec des agents cannabinoides, drogues très fréquemment consommées par les adolescents et les jeunes adultes atteints de schizophrénie ou non. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques précoces qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact à l'adolescence d'une exposition précoce à des drogues couramment utilisées sur les systèmes dopaminergiques.

Procédures

Tous les animaux du projet (soit 960 ratons mâles et femelles) subiront une chirurgie à l'âge de 7 jours. Cette opération ne dure jamais plus de 20 minutes et se fera sous anesthésie générale et sous anesthésie locale. Par la suite à l'adolescence 320 rats subiront une seconde chirurgie qui ne durera pas plus de 30 minutes. De plus, les animaux auront la possibilité d'avoir accés à de l'alcool (10% à l'adolescence pendant 15 jours et 20% pendant 4 semaines à l'âge adulte). Cette exposition à l'alcool se fera de manière volontaire par les animaux puisqu'ils seront soumis à un protocole de libre choix à 2 bouteilles, une bouteille contenant la solution d'alcool et une bouteille d'eau.

Impact sur les animaux

Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à J7 suite à la lésion de l'hippocampe ventral par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à environ J50 - J60 suite à l'implantation d'électrodes d'enregistrement par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. Isolement des animaux pendant la période d'exposition à l'alcool à l'adolescence pendant 14 jours.

Devenir

Les procédures initiales ne sont que des étapes qui nous permettent de générer nos animaux modèles de comorbidité. Tous les animaux issus de ces procédures seront répartis en différents groupes expérimentaux avant d'être euthanasiés en fin de protocole pour vérification histologiques des sites de lésions et d'implantations.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant le même modèle NVHL en prenant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet. De plus nous réaliserons les expériences aussi bien sur les mâles que sur les femelles pour ne pas avoir à éliminer les animaux surnuméraires mais également, dans le but d'une réduction, ne pas à avoir à refaire tout ce projet ultérieurement uniquement sur les femelles (et donc euthanasier les ratons mâles surnuméraires à ce moment).

Raffinement

Pour chacune des procédures nous avons mis en place un série de points limites ainsi qu'une grille de scoring du bien-être animal. Une action thérapeutique adaptée sera déclenchée dès q'un point limite sera atteint. « En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe tout au long du projet sauf pendant les périodes d'évaluation de la consommation d'alcool. Ces périodes seront limitées au strict minimum nécessaire et l'isolement sera contrebalancé par une manipulation accrue par les expérimentateurs (enrichissement inter-espèce).

Choix des espèces

Le modèle NVHL est un modèle décrit chez le rat. Pour poursuivre nos études nous devons utiliser le même modèle que précédemment. Le rat est un modèle idéal pour l'étude de la comorbidité troubles de la consommation d'alcool/schizophrénie en particulier en ce qui concerne certaines études comportementales comme l'auto-administration d'alcool qu'il est plus difficile d'observer chez les souris. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. Le modèle de schizophrénie que nous allons utiliser nécessite une lésion de l'hippocampe ventral au 7ème jour de vie. Tous les petits seront ensuite soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle préexposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.

795 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes, elles sont irradiées puis greffées avec des cellules leucémiques humaines, subissent des prélèvements de sang à la joue et des ponctions de moelle osseuse au fémur, avant d'être tuées pour analyse. Le porteur indique que la maladie peut provoquer perte de poids, baisse de mobilité et, rarement, paralysie des membres. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet de cultiver ces cellules leucémiques, trop fragiles hors d'un organisme vivant.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une forme de cancer qui touche les cellules de la moelle osseuse, qui produisent normalement les globules rouges, les plaquettes et les globules blancs. La leucémie est caractérisée par la prolifération excessive et le blocage de la maturation de ces cellules immatures. Les leucémies affectent enfants et adultes, et bien que, ces dernières décennies, de nombreux progrès ont été fait du point de vue thérapeutique, des rechutes fatales sont observées dans 20 % des cas pédiatriques ; chez l’adulte, la survie globale à 5 ans est seulement de 30-40% chez les patients de moins de 60 ans, et de 20% pour les plus de 60 ans. Un sous type particulier de cancers du sang affectant les cellules myéloïdes (les leucémies aiguës à mégacaryoblastes) sont généralement observées chez l’enfant et sont de très mauvais pronostic. Elles résultent d’une prolifération accrue des cellules à l’origine des plaquettes, bloquant ainsi leur maturation en plaquette. Il est donc essentiel de poursuivre la compréhension des mécanismes conduisant à ces pathologies pour concevoir des thérapies ciblées afin d’améliorer la survie des patients leucémiques. L’objectif de notre projet est d’identifier des régions du génome humain qui régulent l’expression de gènes favorisant les cancers. Afin de réaliser cet objectif nous utiliserons un modèle de cancers du sang affectant les cellules myéloide humaine se développant dans des souris dépourvues de système immunitaire et ne pouvant rejeter la greffe, seule façon de modéliser cette maladie.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes conduisant au cancer doit nous conduire à concevoir des thérapies ciblées. Au terme de notre projet, les résultats obtenus devraient contribuer à l’amélioration des traitements proposés aux patients.

Procédures

Nous utiliserons des souris dépourvues de système immunitaire permettant ainsi l'amplification (absence de rejet de la greffe) des cellules tumorales de patients atteints de LAM. Les souris seront irradiées avec une dose suffisamment faible pour ne pas induire leur mort mais permettant la greffe de cellules humaines (durée de l'irradiation: moins de 2 min). Ces cellules seront injectées quelques heures après l’irradiation dans la veine de la queue, aucune anesthésie ou analgésie ne sera nécessaire (durée de l'injection: 30 s). Les souris recevront un traitement antibiotique dilué dans l’eau de boisson durant les 2 semaines suivantes afin d’éviter tout risque d’infection liée à la perte de leur système immunitaire. Des échantillons de sang seront prélevés sur souris éveillée de manière bi-mensuelle dans la veine de la joue, la durée d’un prélèvement est inférieure à une minute. Ces prélèvements seront effectués pendant 3 mois et demi suivant l’injection de cellules. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins deux semaines. Des prélèvements de moelle osseuse réalisés au niveau du fémur pourront être réalisés deux fois maximum à 2 semaines d’intervalle. Pour cela, une anesthésie gazeuse sera effectuée, la durée d’un prélèvement est inférieure à 5 minutes. Une analgésie est prévue afin d’éviter la douleur.

Impact sur les animaux

Une perte de poids, une réduction de la mobilité et une négligence du toilettage pourraient être observés chez les animaux lors de la progression de la leucémie. Une paralysie des membres inférieurs peut être observé dans de très rares cas. L’irradiation sublétale des animaux, conduisant à l’ablation des cellules immunitaires, peut rendre les animaux plus susceptibles aux infections. Les prélèvements sanguins itératifs et les biopsies de moelle osseuse peuvent représenter un risque hémorragique.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à différents temps et les organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode alternative permettant de cultiver les cellules leucémiques primaires de patients in vitro. En effet, ces cellules sont extrêmement fragiles et ne peuvent pas être maintenues en vie en dehors d'un organisme vivant. En outre, la culture cellulaire ne permet pas de modéliser les différentes interactions entre les cellules tumorales et l’environnement dans lequel elles prolifèrent. Ces interactions ne sont possibles que dans un organisme entier vivant afin de conserver les interactions des cellules leucémiques avec les cellules des organes environnants.

Réduction

Grâce à des analyses statistiques, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements, ...etc.). De plus, un suivi clinique des souris sera également entrepris 2 fois par semaine pour détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. L'administration d'un antalgique sera réalisée en cas de douleur légère avant l'euthanasie de l'animal si son état se dégrade soudainement. Enfin, les cages où sont maintenus les animaux feront l’objet d’un change hebdomadaire, et nous nous assurerons d’y apporter le maximum d’enrichissements (Social : les souris seront en groupe de 5 pour favoriser les interactions sociales entre elles. Matériel : bûchettes en bois, papier kraft, tunnels, ...etc.).

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Les souris seront des souris adultes afin de maximiser la prise de greffe comme cela a été décrit auparavant dans la littérature scientifique.

5 750 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 1 835 réutilisées pour entraîner le personnel aux gestes techniques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une fragilité osseuse décrite comme un phénotype dommageable, elles subissent tatouage, injections sous-cutanées répétées et prélèvements de sang, avant un prélèvement terminal sous anesthésie. Le porteur écarte l'adoption au motif qu'il s'agit de souris transgéniques. Il affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire et qu'aucune méthode in vitro validée n'offre d'alternative.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, l’efficacité et la tolérance de molécules à visée thérapeutique dans le cadre de traitement des problèmes de fragilité et densité osseuse sur un modèle de souris. Dans ce projet, nous allons tester des molécules en développement qui ont montrées un potentiel thérapeutique élevé in vitro et une bonne tolérance in vivo sur des animaux ne developpant aucune pathologie (objet d’une précédente Demande d'Autorisation de Projet).

Bénéfices attendus

Les maladies touchant la densité osseuse sont des pathologies lourdes, pouvant être létales. Elles se caractérisent chez les patients par des troubles du tissu conjonctif entrainant une faible masse osseuse, une fragilité osseuse et des fractures. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif, c’est pourquoi il est nécessaire de développer de telles thérapies. Ce projet permettra de sélectionner des molécules d’intérêts pour des études pré-cliniques et cliniques.

Procédures

- Identification individuelle à l'oreille, tatouage (

Impact sur les animaux

Ce projet sera réalisé sur des souris présentant des fragilités osseuses, il s'agit d'un phénotype dommageable. Les premiers animaux générés (autre établissement utilisateur) expriment le phénotype attendu dès 2 mois : faible masse osseuse, une augmentation de la fragilité osseuse et des risques de fractures. Ces animaux sont également de petite taille. Etant donné le phénotype, seuls les mâles porteurs de la pathologie seront utilisés pour la reproduction. Les portées sont de tailles normales. Les femelles porteurses de la pathologie seront utilisées lors des expérimentations. S'agissant d'une lignée nouvellement créée, nous seront particulièrement vigilant quant à tout nouveau phénotype observé.

Devenir

Procédure 1: Les animaux trop vieux pour la reproduction seront euthanasiés. Les animaux ne développant aucune pathologies et surnuméraires pourront être utilisés dans un projet de formation aux gestes techniques (nous estimons à 1 835 le nombre de mâles générés et ne développant aucune pathologie). Etant donné qu’il s’agit de souris transgéniques, l’adoption ne peut être envisagé ici. Procédure 2 :Tous les animaux utilisés dans l’étude sont mis à mort afin de réaliser des analyses ex vivo.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’une molécule à visée thérapeutique en développement pour une utilisation chez l’Homme. Pour cela un organisme entier est nécessaire. Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet.

Réduction

Les molécules évaluées dans ce projet auront été auparavant testées in vitro afin de n’administrer que les molécules présentant un potentiel thérapeutiques élevé sur les animaux et ainsi réduire leur nombre. Les molécules testées ici sur des animaux transgéniques ont également fait l’objet d’une précédente demande avec des animaux ne développant aucune pathologie et seules celles ayant démontré une bonne tolérance seront utilisées. Des groupes de maximum 10 animaux sont réalisés, puisqu’il a été observé lors d’études préliminaires (réalisées dans un autre établissement) que ce nombre permettait d’avoir des résultats statistiques significatifs.

Raffinement

Dans un but de raffinement des expériences, nous réalisons une évaluation précise de l’état de santé des animaux au cours de l’hébergement et des procédures expérimentales grâce à des grilles de suivis et l’établissement de points limites précoces. Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux (ex: recours à l'anesthésie avant certains prélèvements). Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation des signes cliniques, la pesée des animaux après la période d’acclimatation et lors des injections. Les points limites spécifiques mis en place seront appliqués. Etant donné le phénotype des animaux, ils seront manipulés le moins possible et avec précaution. Bien que les traitements testés dans ce projet aient déjà démontrées une bonne tolérance in vitro ainsi que sur des animaux ne developpant pas de pathologie, nous porterons une attention accrue sur les animaux en cours de traitement tout au long de l’étude : comportement, sites d’injection, sites de prélèvement, poids, signes cliniques…

Choix des espèces

Compte tenu des connaissances et des technologies actuelles, la souris est un modèle de choix pour les modifications génétiques. Nous utilisons ici un modèle de souris dans lequel a été modifié un gène codant pour une protéine de la matrice osseuse. Cette modification génétique est retrouvée chez 80% des patients et ce modèle permet de récapituler au mieux la pathologie étudiée. C’est pourquoi nous utilisons la souris dans ce projet. Pour l’élevage, les animaux seront mis en croisement à partir de l’âge de 8 semaines (âge de maturité sexuelle) jusqu’à maximum 10 mois d’âge (âge au cours duquel la fertilité des animaux diminue). Pour les expérimentations, les animaux seront utilisés à partir de 8 à 10 semaines d’âge minimum et jusqu’à 18 à 20 semaines. En effet le pic de densité osseuse chez les souris C57Bl6/J (maturité du squelette) est atteint à l’âge de 4 mois. Nous choisissons d’évaluer l’efficacité des molécules sur la densité osseuse sur des animaux entre 8/10 et 18/20 semaines (durée du traitement) afin d’inclure la période de puberté. Lors d’une étude pilote (réalisée dans une autre CRO), il n’y a pas eu d’effet observé de cette classe de molécule sur des souris jeunes (2 semaines) contrairement à l’utilisation de souris de 8 semaines.

1 140 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ la moitié tuée à l'issue, l'autre moitié réutilisée ou rendue à l'élevage. Ils subissent une sensibilisation par contention stressante de deux heures ou par instillation rectale d'acide acétique, puis l'insertion d'un ballonnet dans le rectum pour un test de distension colorectale, avec un risque de saignement anal. Le porteur indique qu'aucun gel lubrifiant n'est utilisé pour ne pas fausser le test, et que le groupe témoin non sensibilisé n'est pas proposé aux clients afin de réduire le nombre d'animaux. Il conclut que la preuve de concept doit être obtenue sur "animal entier".

Objectifs

Le syndrome de l’intestin irritable (SII) est un trouble fonctionnel intestinal dans lequel des douleurs abdominales sont associées à des troubles du transit (diarrhée ou constipation prédominante voire une alternance des 2) et une hypersensibilité viscérale. Les origines du SII, probablement multifactorielles, ne sont pas clairement connues. C'est un trouble fréquent qui touche environ 5 % de la population française. Même si les symptômes sont sans gravité majeure, leur chronicité est responsable de l’altération de la qualité de vie des personnes qui en souffrent. Si de nombreux traitements sont déjà disponibles pour essayer de mieux contrôler les différents symptômes du SII, leur efficacité est souvent limitée, très variable d’un patient à l’autre et leur utilisation s’accompagne fréquemment d’effets indésirables. L’objectif de ce projet consiste donc à évaluer, chez le rongeur, l’efficacité de nouveaux candidats médicaments, ou de nouvelles stratégies thérapeutiques, sur un modèle de distension colorectale. Le test de distension colorectal (CRD) est précédé d’une phase de sensibilisation ayant pour objectif d’abaisser le seuil de sensibilité viscérale comme c’est le cas pour les patients atteints de SII et souffrant d’hypersensibilité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouvelles molécules ou thérapies sur le modèle rongeur du SII. Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant de douleur viscérale.

Procédures

Dans le cadre de ces études, les rats peuvent être administrés avec le candidat médicament du sponsor soit par voie intrapéritonéale (IP), par gavage (PO), par voie sous-cutanée (SC), intra-rectale (IR) ou intraveineuse (IV). Les traitements sont faits le jour du test et/ou en chronique au maximum 3 semaines avant le test. Une sensibilisation sera réalisée par un stress de contention de 2h ou par l’administration IR d’acide acétique. Dans les deux cas, l’animal sera isolé pendant 2h. L’animal sera ensuite placé dans un tunnel de contention et un ballonnet sera inséré dans son rectum afin de procéder au test de distension colorectale. Ce test est précédé de 30 min d’habituation et dure 20 minutes. Des prélèvements de fèces peuvent être réalisés à intervalle de quelques jours pendant la phase de traitement et/ou pendant la phase de sensibilisation (2h). Des prélèvements de sang peuvent être réalisés à la fin du test de distension colorectale. Un prélèvement sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (induction 4%, entretien 2,5% mix air et oxygène) par ponction directe à la veine jugulaire est préconisé. Si le volume de sang souhaité par le sponsor est important (maximum 15% de la volémie), un prélèvement en intracardiaque est alors réalisé sous anesthésie gazeuse et est immédiatement suivi de la mise à mort de l'animal par surdose de produit euthanasiant.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. La sensibilisation est induite soit par un stress déclenché par une contention partielle et un isolement de 2h, soit par une administration rectale d'acide acétique. Le stress de l’isolement et de la contention est considéré comme aigu et fait partie intégrante de l’induction du SII chez le rat. La mise en place du ballonnet est également une nuisance pour l’animal. Si l’animal est agité, un saignement au niveau de l’anus peut être observé. Malheureusement, un gel lubrifiant ne peut être utilisé car le risque d’expulsion du ballonnet pendant le test de distension colorectale (CRD) serait augmenté.

Devenir

Les animaux maintenus en vie seront utilisés dans le cadre de formations internes ou d’améliorations de nos procédures (raffinement) ou bien seront réhabilités. Nous estimons que la moitié des projets ne nécessitera pas la mise à mort des animaux et donc que 570 animaux seront gardés en vie. Les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'organes ou suite à un prélèvement de sang en intracardiaque dans les cas où ces échantillons seront nécessaires pour des analyses complémentaires réalisées par le sponsor.

Remplacement

Le SII est un trouble fonctionnel très complexe, même si ses origines exactes ne sont pas clairement définies à ce jour. Différentes observations mettent cependant en évidence l’implication de facteurs à la fois périphériques (modifications de la flore intestinale, perturbation de la motricité digestive, historiques d’épisodes infectieux, etc…) et centraux (hypersensibilité du tube digestif, influence du stress et de certains états psychologiques) dans l’apparition du SII. Compte tenu de l’interaction étroite entre ces différents systèmes, il est clair que, dans le processus de développement de candidats médicaments, des preuves de concept doivent être obtenues sur animal entier.

Réduction

La réponse au stress est très variable d’un individu à un autre. Il est donc recommandé d’inclure 12 animaux afin d’optimiser les chances d’obtenir une différence significative. Ce nombre a été déterminé par un calcul du nombre de sujets nécessaires (calcul de N), sur la base de données internes obtenues préalablement et prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Du fait du risque d’expulsion ou de fuite du ballonnet au moment du test de distension colorectale, 1 animal supplémentaire est inclus dans les groupes traités au véhicule et avec les candidats médicaments. Les rats du groupe composé de référence étant beaucoup plus calmes, il n’est pas nécessaire d’ajouter un animal. Par ailleurs, le groupe non sensibilisé, permettant de valider l’induction du modèle, n’est pas recommandé à nos sponsors afin de réduire le nombre d’animaux par projet.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance toute particulière sera portée au suivi des animaux afin de prévenir et de remédier au plus vite à toute apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites seront également fixés avant le début des expérimentations. Les administrations seront réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. Le matériel utilisé sera adapté à l’espèce (aiguille, canule de gavage, etc.). Pour les injections intrapéritonéales, afin de ne pas provoquer d’inflammation locale, le site d’injection sera alterné entre la gauche et la droite de l’animal. Une habituation des animaux aux tunnels en plexiglass est réalisée pendant 30 minutes quotidiennement au moins 3 jours avant le test. La sensibilisation et l'insertion du ballonnet dans le rectum de l'animal est réalisée sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (induction 4% pendant 3 min dans un mélange air/O2).

Choix des espèces

Les modèles de SII développés chez le rat sont très pertinents et permettent d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments. Le CRD qui est également pratiqué chez l’Homme peut être facilement reproduit chez le rat. En effet, d’un point de vue pratique, la taille du rat permet l’utilisation de petits ballonnets de distension. Enfin, une bonne corrélation a été observée entre les résultats obtenus chez le rat et les données cliniques. Des rats de 5 à 8 semaines pourront être utilisés. Le ballonnet utilisé est calibré pour des rats idéalement de 6 ou 7 semaines (pesant environ 250 grammes). Cependant, pour certains projets, l’impact du test de distension colorectale sur des rats plus jeunes sera recherché. Inversement, pour des protocoles nécessitant un traitement chronique avec une longue durée de traitement, le test de distension colorectal sera réalisé sur des animaux plus âgés. Le facteur limitant est la taille des tunnels de contention utilisés. En dessous de 180 grammes, l’animal pourra se retourner à l’intérieur et risquera de se blesser. Au-delà de 350 grammes, l’animal sera trop serré dans le tunnel et il y a un risque d’étouffement.

22 750 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 525 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules ou de fragments tumoraux en sous-cutané, intradermique ou intra-mammaire, des administrations de candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour et des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour prélever la tumeur. Le porteur fixe un point limite de volume tumoral de 1 500 à 2 000 mm3 et indique que les souris surnuméraires servent à entraîner le personnel aux gestes techniques. Il affirme que l'étape animale reste "indispensable" pour évaluer une molécule anticancéreuse dans un organisme complet.

Objectifs

Les études de pharmacodynamie ont pour but d’évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt par un candidat médicament, au sein d’un organisme vivant et complexe. Une série de tests in vitro (biochimiques et cellulaires) est réalisée en amont afin d’identifier le meilleur candidat. Parallèlement, des tests de pharmacocinétique (PK) in vivo sont réalisés en complément. Ces études faites sur animaux non greffés, (a minima des souris), et à des doses faibles permettent de compléter la première sélection sur la base des caractéristique ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme et Elimination). L’objectif est de sélectionner ainsi des candidats susceptibles d’atteindre leur cible d’intérêt avec une puissance cellulaire et une exposition plasmatique suffisantes dans l’organisme. En effet, une molécule très active sur la cible mais insuffisamment concentrée dans le plasma ne présentera par exemple aucune activité fonctionnelle sur la croissance tumorale. Dans ce projet, les tumeurs à étudier sont greffées sur souris et les doses testées sont plus fortes. Cela permettra d’établir une relation entre l’exposition du produit, la quantité de produit dans la tumeur et son niveau d’atteinte de la cible (PK/PD), chose que l’on ne peut pas faire sur souris non greffées. En fonction de la cible étudiée ou du candidat à caractériser, il est possible que ces études soient effectuées soit dans des conditions de système immunitaire fonctionnel sur des souris immunocompétentes (concernant dans ce cas des greffes de lignées tumorales murines), soit sur des souris immunodéprimées, classiquement utilisées en oncologie et présentant un système immunitaire altéré et permettant ainsi de recevoir des greffes de tumeurs d’origine humaine.

Bénéfices attendus

Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales qui ont acquis, au cours du temps, un certain nombre de mutations faisant qu’elles ne répondent plus aux différents mécanismes de régulation et prolifèrent indéfiniment engendrant la formation d’une tumeur maligne et/ou de métastases. Un enjeu majeur pour la recherche consiste à trouver de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. Ce projet permettra d’identifier les candidats médicaments qui agissent sur la cible d’intérêt (au niveau de la tumeur) et ainsi la sélection des produits qui feront alors l’objet d’études d’efficacité (effet sur la croissance tumorale) encadré par un autre projet.

Procédures

chez l'animal vigile : •Greffe sous-cutanée, 1 injection (durée environ 15 sec) •Pesée et Mesure de tumeur (environ 30 sec par mesure), 2 à 3 fois/ semaine le temps de l’étude (1 mois max + Mesure pour la randomisation) •Prélèvements de sang si nécessaire dans la limite de 10% du volume total de sang par prélèvement et limité à 15% de volume total de sang sur une période de 28 jours + Tonte de la patte arrière en vue du prélèvement sur animal vigile (en principe une seule fois sauf si un prélèvement a lieu longtemps après la randomisation et que les poils ont repoussé : 10 sec) •Administration de composés candidats médicaments : jusqu’à 2 fois /j suivant la nécessité de l’étude, entre 15 sec et 1 min selon les composés et la voie d’administration. Chez l'animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : •Greffe intra mammaire, intradermique ou intratumorale : 1 fois (durée Anesthésie + geste, environ 1min30)

Impact sur les animaux

Le but du projet est d’évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt par nos candidats médicament dans des modèles pathologiques. Pour ce faire, les souris reçoivent une greffe de cellules cancéreuses ou de fragments tumoraux en sous-cutanée, en intradermique ou en intra-mammaire pour développer une tumeur dont la taille cible est de 300mm3 environ (si la tumeur pousse de façon hétérogène, les critères d’inclusion peuvent être élargis entre 100-550 mm3) Concernant les traitements pharmacologiques, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet). Cependant, selon la cible du candidat médicament, même à des doses tolérées dans l’absolu, il peut y avoir une toxicité allant de faible à modérée. En effet, même si les efforts pour identifier des thérapies ciblées sont nombreux, les cellules tumorales sont à l’origine des cellules normales du soi : il est donc très difficile de trouver des traitements qui affectent uniquement les cellules cancéreuses en épargnant complétement les tissus sains. Par ailleurs, ce projet peut nécessiter l’utilisation de souches de souris transgéniques ou mutantes leur conférant un statut immunodéprimé. Ce statut peut être considéré comme un phénotype dommageable mais qui ne s’exprimera pas dans les conditions d’hébergement protégées strictes appliquées au laboratoire

Devenir

Les animaux inclus dans l’étude après traitement et randomisation sur la taille de la tumeur greffée seront euthanasiés en vue de prélever la tumeur/sang pour effectuer des mesures in vitro : Réalisation des tests biochimiques et/ou moléculaires, visant à évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt, à partir des lysats tumoraux (Western-blot, ELISA, MSD, immunohistochimie, qPCR, …). Dosage du principe actif dans les échantillons plasmatiques et/ou des lysats tumoraux, permettant la relation PK/PD. En cas d’animaux greffés surnuméraires, une ré-inclusion dans un autre projet pourra être prévue notamment pour des entrainements du personnel aux gestes techniques. A défaut, ils seront euthanasiés.

Remplacement

Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique

Réduction

Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires avant le début de l’expérimentation. De plus, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. C’est seulement sur la base de ces données préalables que les études de pharmacodynamie sont réalisées : seuls les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, des prélèvements de sang (entre 40 et 80 µl de sang) à la veine saphène latérale sont mis en œuvre chaque fois que possible pour avoir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées) et pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale en faisant, notamment, de la relation PK/PD. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excède pas les 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement peu invasive et rapide, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques. Si des volumes sanguins plus importants s’avèrent indispensables, les prélèvements seront réalisés en terminal, à la veine cave ou en intracardiaque, sous anesthésie gazeuse, juste avant le prélèvement de la tumeur. En cas d’animaux greffés surnuméraires après randomisation, une ré-inclusion dans un autre projet sera prévue.

Raffinement

Dans le cas d’un protocole avec traitement chronique, les animaux sont quotidiennement observés et les tumeurs sont mesurées au moins 2 par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour limiter la souffrance et appliquer les points limites si nécessaire. De plus, au-delà de 1500 mm3 (pour les tumeurs SC et ID) et de 1000mm3 (pour les tumeurs IMam), une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Si ce volume est atteint la veille du week-end, des dispositions seront prises en fonction de la croissance du modèle tumoral (déterminée lors des études de TK). Si la tumeur pousse rapidement et a un risque de dépasser les 2000mm3 avant le lundi, l’animal sera euthanasié. Dans le cas contraire, le volume tumoral sera réévalué dès le lundi. La progression du volume tumoral est mesurée via le pied à coulisse et permet un suivi dans le temps sur les mêmes animaux. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulation strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de prévenir tout risque d’infection et/ou contamination. Les souris immunocompétentes, quant à elles sont logées et manipulées dans un secteur conventionnel. Toutefois, pour des questions logistiques, elles peuvent être hébergées et manipulées dans le secteur à confinement spécifique dédié à l’expérimentation des souris immunodéprimées. Dans ce cas, elles sont de statut SOPF et sont logées et manipulées dans des salles dédiées et identifiées. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Pour répondre aux impératifs liés à l’expérimentation (nombre d’animaux par groupe/dose/temps…) ce nombre pourra varier, tout en restant dans les standards imposés de respect du nombre d’animaux maximum/superficie disponible Des éléments de nidification (ex : cocoon, sizzle…) sont apportés ainsi que des éléments d’enrichissement lavables (ex : tunnels...) permettent une complexification de l’environnement et l’expression des comportements naturels des souris

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans les publications en recherche préclinique. En effet, ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Le choix de la souche est dicté par les études de détermination de la prise tumorale réalisées en amont de toute évaluation de candidat médicament. Cela permet de déterminer tous les paramètres in vivo (taux de prise, temps de doublement, caractère éventuellement cachectique de la tumeur sur la souche, etc…). La souche sélectionnée sera conservée pour toutes les études ultérieures quelle qu’elles soient. En effet, il peut exister des différences significatives en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit fonction de la souche murine considérée, pouvant impacter les résultats. Femelle, sexe utilisé dans toutes nos études de pharmacologie et pour lequel nous avons un grand historique. Exceptionnellement, les mâles peuvent être utilisés dans le cas de produits dont la finalité est le traitement de tumeurs se développent spécifiquement chez la personne masculine.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, jusqu'à sept par animal, et du LPS qui provoque un état de type septique avec fièvre, diarrhée et tremblements, ces derniers servant de point limite, ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le porteur affirme que l'étude de la protéine visée ne s'envisage que dans un "organisme complet" et non sur un modèle cellulaire. Les débouchés annoncés pour l'aplasie fébrile de l'enfant restent formulés comme des perspectives.

Objectifs

Le traitement des cancers de l’enfant utilise la chimiothérapie, qui peut transitoirement entrainer un déficit d’immunité appelé aplasie. Durant cette période, les enfants présentent souvent des épisodes de fièvre, pouvant être sévères et entraîner la mort. Devant ce risque, des mesures importantes sont mises en place avec hospitalisation en urgence et utilisation d’antibiotiques. Les infections en cours d’aplasie fébrile restent une réelle complication avec risque de décès chez ces enfants malades. Onze à 24 % vont présenter une bactériémie (présence d’une bactérie dans la circulation sanguine), facteur de risque de décès en contexte d’aplasie fébrile. En effet, la mortalité au cours des aplasies fébriles chez l’enfant est estimée entre 0,2 et 3 %, pouvant s’élever jusqu’à 10% chez les patients avec une bactériémie. Les infections à Pseudomonas aeruginosa gardent une place majeure tant par leur fréquence que par leur sévérité. A ce jour, il n’existe pas de marqueur biologique pouvant prévenir la gravité d’une aplasie fébrile. Il existe des molécules de danger, libérées dans le corps en période d’infection, et qui sont néfastes pour l’organisme (inflammation majorée, formation de caillots sanguins). Des études publiées montrent que neutraliser ces molécules de danger peut avoir un effet protecteur, améliorant le pronostic au cours d’une infection sévère. Des travaux préliminaires réalisés chez l’adulte présentant une infection sévère et généralisée, suggèrent que la protéine X, naturellement produite par l’organisme, est capable d’inhiber les effets délétères de certaines molécules de danger. Notre projet repose sur l’hypothèse que, chez l’enfant présentant une aplasie fébrile, le taux sanguin de X peut prédire la sévérité de l’infection. Notre étude s’articule en 2 axes : (1) une étude clinique portant sur l’intérêt du dosage de X dans une population pédiatrique suivie en oncologie et (2) une étude chez la souris mesurant la synthèse et l’élimination de X au cours de l’infection et évaluant son potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les débouchés cliniques sont multiples : (i) évaluation de nouveaux marqueurs permettant de prédire la gravité d’un épisode d’aplasie fébrile, (ii) orientation vers le type de pathogène (bactérien, fongique, viral), (iii) proposition d’escalade ou de désescalade de la prise en charge anti-infectieuse, notamment dans le contexte des tumeurs solides pédiatriques et enfin (iiii) un potentiel impact thérapeutique.

Procédures

Dans les quatre procédures de l’étude, les animaux seront traités par des injections intrapéritonéales. Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Dans les quatre procédures de l’étude, des prises de sang seront réalisées. Sous anesthésie gazeuse (moins de 5 minutes), la prise de sang rétro orbitaire permet la récolte de 50 à 100µL de sang en moins de 2 minutes, sans traumatisme et sans douleur. Lorsqu’un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement (avec réveil). Procédure 1 : pour chaque animal • 1 injection intra péritonéale • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 2 : pour chaque animal • 2 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie • • Procédure 3 : • 3 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 4 : • 7 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’administration de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux des procédures 1, 3 et 4. Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre de sous-cutanées qu’un un animal pourra recevoir. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Impact sur les animaux

Ce projet étudie le sepsis, c’est-à-dire une inflammation systémique déclenchée par le LPS (lipopolysaccharide = endotoxine), mimant ainsi une infection bactérienne, chez le sujet soumis à une chimiothérapie aplasiante. Une inflammation systémique donne classiquement de la fièvre. Les souris pourront présenter, suivant la dose reçue (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une fatigue et une douleur potentielle. Une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une diarrhée transitoire, une modification de comportement par l’absence de mobilité pourront être observées. A une dose plus importante de LPS, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés. Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. 1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle concerne tous les animaux du projet. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle permet, sous anesthésie gazeuse, une récolte de sang rapide, sans traumatisme et sans douleur. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’injection de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Devenir

Nous souhaitons doser la molécule X ainsi que diverses molécules pro-inflammatoires dans le sang des animaux mais aussi dans des organes comme la rate, le foie, les poumons et les reins qui sont très touchés par l’orage cytokinique déclenché par le sepsis. Les animaux seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Le métabolisme de la protéine X est mal connu à ce jour. Sa synthèse est probablement mixte, avec une production (i) par les cellules sanguines), mais également (ii) par d’autres tissus, dont les endothéliums vasculaires (=vaisseaux sanguins). L’étude de cette protéine ne peut donc s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. Un modèle murin parait être le plus adapté à l’étude de cette protéine.

Réduction

Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre de contrôles internes obligatoires en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre minimal d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 40% d’écart type intra lot est de 10 (Berndston et al. J ANIM SCI 1991). La cinétique des réponses immunitaires pouvant varier d'une expérience à l'autre, celles-ci seront répétées au minimum deux fois pour renforcer l'approche statistique (Cf. chronogramme associé au dossier).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, selon l’annexe III de la directive 2010/63/CE, les souris seront hébergées en cages collectives (5 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général selon les critères de Lloyd et al. (Lab animal management and welfare, 1994). Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la facilité d'introduire une modification génétique chez ces espèces, à la grande taille des portées, au temps de génération court et à la relative facilité d'hébergement et de soins. De plus, la littérature scientifique décrit de nombreux modèles murins de sepsis. Nous disposons au laboratoire, d’une lignée de souris de fond génétique C57BL/6 chez laquelle le gène de la protéine X, étudiée dans ce projet, est rendu non fonctionnel. Cette technique couramment utilisée en recherche pré-clinique permet de démontrer l’importance d’une protéine dans un modèle donné. Notre étude porte sur l’aplasie fébrile pédiatrique. Nous utiliserons donc des animaux de 4 à 5 semaines, sevrés mais n’ayant pas atteint la maturité sexuelle.

576 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un composé par gavage oral répété pendant 13 à 19 jours, 180 d'entre eux subissant en plus une perfusion intracardiaque sous anesthésie sans réveil, et tous sont tués pour analyser leur cerveau et leurs tissus. Le porteur mesure les capacités d'apprentissage par le test de la piscine de Morris et justifie le rat par l'absence de modèle spontané de trisomie 21 et sa proximité génétique avec l'espèce humaine. Le bénéfice annoncé, déplacer de quelques points le quotient intellectuel des patients, reste un objectif lointain avant tout passage en clinique.

Objectifs

Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement crânio-facial et le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent des anomalies crânio-faciales ainsi qu’une une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observée dans la T21. Des collaborateurs proposent des composés ayant la propriété d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons tester l’un de ces composés sur nos modèles rats de la trisomie 21. Ce composé est synthétisé et testé pour l’ADME pharmacologique (administration, distribution, métabolisation et excrétion) par nos collaborateurs. Divers dérivés de ce composé ont été préalablement testés au sein de notre laboratoire sur des modèles souris de la T21, permettant ainsi une amélioration des fonctions cognitives de ce modèle sans aucun effet toxique observé. Sachant que le métabolisme des souris et des rats sont différents, ici nous souhaitons optimiser le traitement sur le modèle rat. Dans ce projet, le composé testé sera administré par notre équipe à des rats modèles de la T21 et à des rats contrôles dans le but de s’assurer qu’ils n’ont pas d’effet toxique. Les rats feront l’objet d’une étude comportementale afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives. Le composé sera testé à différents temps et différentes doses afin d’identifier la durée et la dose minimales nécessaires pour obtenir un rétablissement des fonctions cognitives des rats trisomiques.

Bénéfices attendus

Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la Trisomie 21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la trisomie 21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. De plus, dans le cadre de cette étude, réussir à reproduire sur le modèle rat, les résultats obtenus sur les modèles souris de la Trisomie 21, nous permettra une généralisation des résultats avant le passage en phase clinique du candidat-médicament.

Procédures

Dans le cadre de cette étude, un gavage oral répété sera réalisé sur un total de 576 rats. Ce gavage sera effectué sur un même rat soit 19 fois (étude sur 19 jours), soit 13 fois (étude sur 13 jours). La réalisation du gavage prend 1 à 2min pour un rat par jour. De plus, au cours de ce projet nous réaliserons une perfusion par voie intracardiaque sur 180 rats des 576. La procédure qui est sans réveil sera réalisée une seule fois par rat et elle dure 30min par rat. Pour cela il nous faudra anesthésier l’animal via une administration d’anesthésiant par voie intrapéritonéale. Ce geste nécessaire pour réaliser l’exsanguination de l’animal sous anesthésie générale profonde est réalisé en 1 à 2min par rat.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, un gavage oral répété sera réalisé sur un total de 576 rats. Ce gavage sera effectué sur un même rat soit 19 fois (étude sur 19 jours), soit 13 fois (étude sur 13 jours). La réalisation du gavage prend 1 à 2min pour un rat par jour. Ce geste technique peut entraîner un stress non négligeable, une irritation de l’œsophage et un risque de fausse route existe. De plus, au cours de ce projet nous réaliserons une perfusion par voie intracardiaque sur 180 rats des 576. La procédure qui est sans réveil sera réalisée une seule fois par rat et elle dure 30min par rat. Pour cela il nous faudra anesthésier l’animal via une administration d'anesthésiant par voie intrapéritonéale qui réalisé en 1 à 2min par rat. L’anesthésie de l’animal via l’introduction d’une aiguille par voie intrapéritonéale peut entraîner un stress à l’animal.

Devenir

A l’issu de la procédure expérimentale : Gavage oral d’inhibiteurs de Dyrk1A dans des rats modèles de la trisomie 21, l’ensemble des 576 rats seront mis à mort. 180 rats sont mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques sur le cerveau des animaux, et les 396 autres rats seront euthanasiés selon les bonnes pratiques de laboratoires, les tissus prélevés sur ces derniers seront utilisés pour des analyses moléculaires.

Remplacement

Le rat est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique de cette espèce sont bien connues. Son génome aisément manipulable permet de multiples applications telles que la création de modèles de pathologies humaines. De plus, la nécessité d’utiliser des animaux transgéniques est liée à l’absence de tout modèle spontané de trisomie 21 dans une espèce mammifère autre que l’Homme. De plus, l’intérêt d’utiliser le rat est de pouvoir comparer les résultats obtenus à ceux de la souris. En effet, comme on le sait, il peut exister des différences inter-espèces et il est donc important de comparer les résultats entre deux organismes-modèles. Si des résultats similaires sont obtenus entre les deux espèces, cela permettra une généralisation de ces résultats.

Réduction

Pour ces tests, des rats mâles et femelles seront utilisés à partir de 10-12 semaines, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons le composé sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. De plus, le traitement sera aussi effectué sur des animaux contrôles dans le but de vérifier qu’il n’y ait pas d’effet toxique. La variabilité inter-individu observée dans les études comportementales nécessite de tester 12 à 16 animaux par groupe pour avoir un résultat significatif avec une puissance statistique suffisante. C’est pourquoi nos expériences sont construites sur des groupes de 16 mâles et 16 femelles au maximum par condition. Il nous faudra donc un total de 576 rats dans ce projet (16 rats x 6 groupes x 2 sexes x 3 conditions = 576 rats).

Raffinement

Préalablement aux études des analyses de pré-tox ont été réalisé par nos collaborateurs, pour s’assurer que les molécules n’ont pas d’impact majeur sur les animaux après administration. L’administration des composés sera réalisée par gavage oral durant 19 et 13 jours continus comme expliqué précédemment. Au cours du traitement nous procéderons aux études du comportement : le test de la piscine de Morris. Durant toute l’étude, les animaux feront l’objet d’un contrôle journalier pour vérifier leur bien-être. Les animaux présentant des signes de douleurs seront évalués suivant l’échelle de l’expression faciale et seront exclus des tests puis soignés ou euthanasiés selon la situation et l’avis du vétérinaire. Concernant la procédure de perfusion intracardiaque, elle est effectuée sous anesthésie générale pour éviter tout stress et limiter la douleur de l'animal.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. N’existant pas de modèle spontané de la trisomie 21, le rat avec la souris, sont les seules espèces physiologiquement et génétiquement proches de l’Homme dans lesquelles nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que ces modèles permettent d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes lors de l’optimisation de composé pharmacologique. En outre, le génome du rat étant aisément manipulable, permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du syndrome de Down. De plus, l’intérêt d’utiliser le rat est de pouvoir comparer les résultats obtenus à ceux de la souris. En effet, sachant qu’il existe des différences inter-espèces il est intéressant de comparer les résultats entre les modèles souris et rats afin de généraliser les résultats si ces derniers sont similaires. Enfin, le rat ayant des capacités d’apprentissage plus performantes que la souris, il est un meilleur modèle pour l’étude des déficiences cognitives associées à la trisomie 21. Les rats seront étudiés à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 10-12 semaines, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes d’apprentissage et de mémorisation sont présents.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules de mélanome pour développer une tumeur et des métastases, puis sont tuées par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever tumeur et organes. Le porteur indique que la tumeur peut atteindre 1 500 mm3, seuil déclenchant l'arrêt de l'expérience. Il affirme que la formation de métastases ne peut être modélisée qu'in vivo et conclut que l'étude sur animal est inévitable.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche CPER FEDER destiné à étudier le rôle des cellules stromales mésenchymateuses et à identifier l’expression des micro-ARN (miARN) lors du développement de tumeurs métastatiques. Les métastases sont une cause majeure de décès chez les patients atteints de tumeurs malignes. Les miARN sont des petits ARN régulateurs de l'expression génique. Une modification de l’expression de ces miARN peut contribuer au développement tumoral et à la dissémination métastatique par dérégulation de l’expression de gènes impliqués dans des processus clés du cancer. Le système du complément a démontré des rôles dans la régulation de la croissance tumorale, bien que ceux-ci puissent différer selon les types de tumeurs. C3a a une fonction prépondérante de médiateur dans les phénomènes inflammatoires au sein des tissus. Le ciblage spécifique du système du complément peut être d'une grande importance et valeur dans le futur traitement des tumeurs. Nous utiliserons le modèle de tumeurs induites par l’administration sous cutané de cellules B16-F10 chez les souris C57BL/6. Ce modèle permet le développement de tumeurs primaires et de métastases dites « spontanées », ce qui correspond étroitement à celles développées par les humains. Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée et seront réalisées dans les conditions les moins stressantes possibles pour les animaux. Dans un souci permanent du bien-être animal et afin de minimiser l’emploi des animaux de laboratoire, l’évaluation de l’expression des miARN dans un contexte cancéreux sera réalisée en priorité dans des modèles in vitro. Ce projet engagera des souris dans un nombre estimé à 45 individus pour la durée que couvrira ce projet. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque lot de chaque procédure est réduit, il correspond au seuil minimal qui puisse nous permettre d’apprécier, avec nos moyens techniques et en fonction de la variabilité inter-individus, les effets désirés. Par ailleurs, l’hébergement des animaux pendant la phase d’acclimatation et pendant l’expérimentation sera faite avec enrichissement du milieu afin d’améliorer leur bien-être. A terme, nos travaux permettront d’identifier les miARN impliqués dans l’angiogenèse et annonciateurs de formation tumorale et de dissémination métastatique. Ainsi les cancers pourraient être pris en charge à un stade précoce.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront l’identification des miARN annonciateurs de développement tumorale et ainsi permettre une prise en charge plus précoce des patients atteint de cancer, ainsi que de comprendre le mécanisme et l'implication du système du complément dans la tumorigenèse.

Procédures

Induction de tumeurs métastatiques par injection de cellules B16-F10 ou B16-F10/C3a par voie sous cutanée une seule fois à J1. - Prélèvement sanguin (1mL) par ponction cardiaque après anesthésie volatile des souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont des douleurs légères suite aux injections IP des cellules tumorales et le développement de tumeurs métastatiques.

Devenir

Après l'injection sous cutanée, les souris seront maintenues en vie jusqu'à la fin de l'étude. Les indivisus seront mis à mort à la fin de l'étude par ponction cardiaque précédée d’une anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d'une dislocation cervicale. Les organes prélevés seront scindés en 5 : 1/5 protéine (analyse par western blot), 1/5 ARN, 1/5 miARN (quantification, qRTPCR), 1/5 isopentane, 1/5 paraffine (analyse immunohistologique). La tumeur sera récupérée.

Remplacement

Remplacement: Nos études in vitro avec les cellules stromales mésenchymateuses pulmonaire et un modèle de cellules cancéreuses apportent quelques résultats sur les miARN impliqués dans cette pathologie. Néanmoins, ce modèle cellulaire ne suffit pas a modéliser le processus de développement tumoral dans son ensemble. La formation de métastases est un processus complexe et ne peut être modélisé que in vivo. L’étude in-vivo est inévitable pour comprendre le rôle des cellules stromales mésenchymateuses dans le développement de tumeurs métastatiques, identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans cette pathogenèse et étudier la capacité du c3a à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression du développement tumoral.

Réduction

Réduction du nombre : Pour chaque condition testée, nous utiliserons un nombre minimal de souris pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Nous utiliserons pour l’étude statistique le test one way ANOVA suivi d’un un test de Bonferroni pour comparer les trois groupes d’animaux entre eux, ainsi qu'un t-test suivi d'un test de Student.

Raffinement

Raffinement : La ponction cardiaque sera réalisée sous anesthésie volatile (isoflurane). Le prélèvement des organes se fera après la mise à mort des animaux. L’évaluation de la qualité de l’anesthésie se fera en vérifiant les 4 étapes suivantes : -l’absence de douleur et/ou de réponse réflexe en exerçant une pression au niveau des doigts de l’animal -L’immobilisation de l’animal -La relaxation musculaire -L’état d’inconscience en vérifiant les mouvements respiratoires. Les souris seront observées 3 fois par jour pendant les 10 premiers jours, puis 1 fois par jour pour le reste de l’expérimentation, dans le but de déceler le plus rapidement possible des signes cliniques critiques dus à l’expérimentation (prostration, température trop élevée, perte de poids, …). Ceci sera basé sur une grille de scoring définie. Chaque situation d’animal montrant des signes d’inconfort ou de souffrance liés ou non à l’expérience sera rapporté au vétérinaire responsable de l’animalerie pour que l’animal soit pris en charge de manière individuelle afin d’améliorer son bien-être. Si l'état ne s'améliore pas au-delà de 24h, il sera euthanasié par ponction cardiaque sous anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d’une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés.. De plus, si la taille de la tumeur arrive à 1500mm3 avant J30, l’expérimentation s’arrêtera dès lors, afin d’éviter des expérimentations en durée « non-nécessaires » sur les animaux. La durée de l’étude principale sera de ce fait réduite d’autant. La mesure des tumeurs se fera mécaniquement à l’aide d’un pied à coulisse Caliper. Pour respecter le principe des 3R, un nombre réduit d’animaux a été choisi.

Choix des espèces

Les C57BL/6 sont des souris robustes, et sont déjà utilisées pour la formation de tumeurs métastatiques induites par les cellules B16-F10. Souris adultes de 6 à 8 semaines