Rongeurs

560 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de monocrotaline pour induire une hypertension pulmonaire, puis des traitements par injections, avec deux anesthésies pour échographie cardiaque et cathétérisme, avant d'être tué pour prélever poumons et cœur. Le porteur qualifie de bénins les effets attendus car la maladie est étudiée à un stade précoce, et applique une crème anesthésiante aux points d'injection. Sur le remplacement, il indique disposer de résultats sur cellules humaines mais vouloir les valider dans trois modèles animaux d'hypertension pulmonaire.

Objectifs

L'hyperTension Artérielle Pulmonaire (HTAP) est une maladie qui affecte les petits vaisseaux du poumon qui vont s'épaissir par un processus appelé remodelage vasculaire pulmonaire. Cette altération va imposer un effort au cœur qui à terme va aboutir à une insuffisance cardiaque. Bien que les mécanismes restent encore méconnues, il est maintenant établi que les protéines osseuses morphogénétiques joue un rôle important dans ce remodelage vasculaire pulmonaire. Cependant, les connaissances autour du mode de fonctionnement de ces protéines dans les petits vaisseaux du poumon sont très limitées. C'est pourquoi nous souhaitons étudier leurs rôles dans l'HTAP et tester l’efficacité de molécules ciblant ces protéines pour lesquelles nous avons trouvé une efficacité sur des cellules de vaisseaux pulmonaires en culture.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet seront multiples et devraient permettre non seulement de mieux comprendre le rôle des protéines présentes dans les petits vaisseaux du poumon, mais aussi leur contribution au développement de l'HTAP. De plus, ce projet permettra de tester l'efficacité de certaines molécules ciblant ces protéines pour lesquelles de premiers résultats in vitro sont encourageants.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour effectuer une échocardiographie afin de valider le modèle avant les traitements (temps : 5 min/ rat). En fin de traitement les animaux seront à nouveaux anesthésiés afin de mesurer tous les paramètres nécessaires à l'étude (échographie et cathétérisme).

Impact sur les animaux

La procédure appliquée à ce projet nécessite d'effectuer 2 types d'injection chez le rat : 1 injection sous-cutanée et des injections intra-péritonéales pour les traitements ou du placébo. Pour limiter ces nuisances, une crème lidocaïne sera appliquée sur la zone où s'effectueront les injections. Également, deux anesthésies gazeuses (isoflurane) seront pratiquées sur l'animal : la première pour valider le modèle expérimental avant traitement par échographie transthoracique, et la deuxième pour évaluer l'efficacité du traitement par échographie transthoracique et cathétérisme. Nous veillerons donc au bon réveil de l'animal et évaluerons son bien-être et prendrons, si nécessaire, les mesures développées dans la description de la procédure. La première injection de la procédure est réalisée avec la monocrotaline, une molécule naturelle extraite de la plante Crotalaria. Cette molécule est connue pour induire une hypertension pulmonaire modérée chez le rat. Les effets seront bénins dans notre projet car nous étudierons la mise en place de la maladie en phase précoce. Nous avons également des données qui valident la non toxicité cellulaires de nos molécules pour les différents traitements du projet. D’ailleurs, une étude publiée récemment a démontré l’innocuité et l’efficacité de ce type de molécules pour lutter contre le métabolisme du glucose et des lipides dans le cadre de modèles animaux axés sur l’étude de l’obésité.

Devenir

Des prélèvements d'organes (poumons et cœur) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.

Remplacement

Nous avons obtenu des résultats sur des échantillons pulmonaires humains et des cultures de cellules qui indiquent une altération de voies de signalisation dans les cellules endothéliales HTAP et que celle-ci peuvent être restaurées sous l'effet d'une molécule spécifique. Dans l'objectif de valider l'importance de ce défaut sur la fonction cardiaque et sur le remodelage des petites artères pulmonaires, nous souhaitons restaurer ces voies dans 3 modèles complémentaires d'HTAP reconnus internationalement et conclure sur son potentiel thérapeutique.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons choisi de cibler nos traitements sur les protéines de la voie ayant la plus forte dérégulation que nous comparons aux contrôles positifs et négatifs d'hypertension pulmonaire. De plus, les effectifs ont été calculés à l’avance et se basent sur nos études passées et celles récemment publiées autour de ce type de molécules. Le critère déterminant pour évaluer l'efficacité du projet est la mesure de la pression artérielle pulmonaire moyenne. Les données de ce projet seront traitées statistiquement à l'aide d'un logiciel spécifique. Par ailleurs, les échantillons provenant d'animaux témoins non malades et témoins d'HTAP pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche pour des analyses histologiques et moléculaires.

Raffinement

Les rats bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Pour la réalisation de la procédure, nous avons établi des points limites au moyen d'un score afin d'évaluer le bien-être animal. Les animaux seront donc suivis quotidiennement afin de veiller à ce bien-être et de prendre les mesures nécessaires développées dans la description de la procédure.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards d’études de maladies cardiovasculaires. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des rats âgés de 4 semaines et pesant 100 grammes chacun seront utilisés.

530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales de mélanome sous la peau, avec prélèvements de sang et de selles, pour tester l'effet de métabolites du microbiote sur la réponse à l'immunothérapie, avant d'être tuée pour prélever ses organes. Le porteur indique que l'immunothérapie ne bénéficie qu'à une minorité de patients et présente ce traitement comme "incontournable". Sur le remplacement, il répète qu'un système immunitaire ne peut être reconstitué in vitro et juge le recours à l'animal "indispensable".

Objectifs

L’immunothérapie est désormais incontournable dans la prise en charge des cancers du mélanome, du poumon et du rein. Ce traitement est basé sur la stimulation des défenses immunitaires de l’organisme favorisant la reconnaissance et la destruction des cellules cancéreuses. Bien qu’elle soit attractive, l’immunothérapie présente une efficacité restreinte, ne bénéficiant qu’à une minorité de patients répondeurs (35 %). Il est donc urgent de trouver de nouveaux biomarqueurs impliqués dans cette non-réponse à l'immunothérapie et d'en comprendre les mécanismes de résistance associés. Ce projet permettrait d'améliorer l'efficacité de l'immunothérapie des individus non-répondeurs à et in fine à en limiter la progression du cancer. Des études récentes suggèrent que le microbiote de l'hôte, c'est à dire l'ensemble des microorganismes de notre organisme, conditionne cette réponse immunitaire lors d'une l'immunothérapie et est indispensable à l'obtention d'un prognostique favorable du patient. Certains de ces effets bénéfiques du microbiote intestinal ont été attribués aux espèces bactériennes de l'hôte. Cependant, une simple corrélation de ces bactéries a été associée à une réponse efficace, sans démontrer leur causalité et les mécanismes associés. À l'heure actuelle, la métabolomique, est science récente qui permet d'étudier les métabolites issus de l'organisme et est utilisée pour identifier les métabolites, biomarqueurs d'impact sur le métabolisme complexe du patient et sur l'immunothérapie. Dans ce projet, nous sommes intéressés au métabolome de 3 cohortes de patients atteints de mélanome, recevant une immunothérapie. L’analyse du métabolome du sérum de patients hyper-répondeurs à l’immunothérapie et avec prognostique favorable, a permis d’identifier 17 métabolites d'origine de l'hôte et du microbiote. Basés sur ces résultats, l’objectif de notre projet est i) d’évaluer et valider in vivo l’effet de ces métabolites sur la croissance tumorale dans des modèles préclinique du mélanome, et d’en identifier les mécanismes métaboliques hôtes-microbiens associés, et ii) déterminer l’effet des meilleurs métabolites immunostimulants sur l'efficacité des agents immunothérapeutique dans le mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet sur les métabolites immunostimulateurs associé au mélanome et leur rôle potentiel dans l'efficacité de réponse à l'immunothérapie permettra: 1) de valider et de caractériser fonctionnellement les empreintes du microbiome intestinal associées au cancer et à l'immunothérapie 2) d'évaluer une pertinence clinique pour le pronostic des patients 3) développer des outils de diagnostic qui pourraient enrichir l'arsenal oncologique pour la prévention, la prédiction et la personnalisation de la thérapie du cancer.

Procédures

Au cours de l’expérimentation, nous prévoyons 2 prélèvements fécaux/souris récoltés de manière naturelle (lors de la prise de la souris engendrant une défécation naturelle) (2 à 3 fèces/ souris), au Jour 7, et lors de la fin de la procédure destiné à l'analyse de la composition du microbiote, métabolome, durée 10 secondes. Nous prévoyons également 2 prélèvements de sang/souris : sur souris vigiles après anesthésie locale (lidocaïne) à Jour 7, durée 5 minutes, , lors de la fin de la procédure pour l'étude du métabolome de l'hôte. Injections de cellules tumorales sous anesthésie générale: durée 2 minutes (une par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées aux injections et prises de sang, ainsi qu'à la présence de tumeurs greffées par voie sous-cutanée.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélèver différents organes pour analyse du métabolome et du microbiote intestinal.

Remplacement

Il est maintenant indispensable de valider leur effet anti-cancéreux et sur l’immunothérapie à l’échelle de l’organisme entier, de façon à prendre en compte les interactions complexe de la réponse immunitaire antitumorale, celle de l’hôte et du microbiote intestinal, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal. Ce projet pourra ainsi permettre d’améliorer l’efficacité des immunothérapies des non-répondeurs par l’intermédiaire de nouveaux biomarqueurs métaboliques. L’analyse de l’impact des métabolites sur le métabolisme de l’hôte et sur son système immunitaire nécessitant l’utilisation d’un organisme complexe, le recours à l’animal est indispensable. En effet, utiliser uniquement une approche in vitro exclurait la prise en compte des possibles interactions intervenant chez l’hôte. Nous avons besoin d’un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Comme il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité, il est absolument nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été défini à l’aide d’études précédentes publiées dans la littérature scientifique, mais aussi grâce à un test de puissance afin de solliciter un nombre minimum d’animaux, tout en gardant la possibilité d’obtenir des résultats statistiques exploitables. Le nombre de groupes proposé inclut les groupes contrôles nécessaires. L’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Par ailleurs, une veille bibliographique constante sera faite pour éviter toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature. Les expérimentations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Durant l’expérimentation, l’état de santé des animaux sera surveillé quptodiennement permettant l’intervention rapide en cas de problème. La mise en place d’une grille de suivi clinique et des points limites qui seraont strictement appliqués permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: i) La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue, ii) La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Enfin dans la littérature, la souris C57Bl6/J s’avère être la souche la plus utilisée pour l’analyse du métabolisme et l’étude de l'interaction du microbiote intestinal sur son métabolisme. Les animaux seront utilisés au stade adulte (6-9 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire et le métabolisme est mature (développement thymique achevé). Ceci permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie chez l’Homme adulte, âge où sont suivi est important. De plus, les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une irradiation puis une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie et deux injections intrapéritonéales, pour étudier une protéine régulant les lymphocytes T dans l'auto-immunité intestinale. Le porteur indique qu'environ 30 % des souris modifiées développent une inflammation ano-rectale, et que les animaux sont tués par dislocation cervicale pour prélever rate, ganglions et côlon. Sur le remplacement, il affirme que les interactions entre cellules immunitaires ne peuvent être reproduites in vitro de façon fiable.

Objectifs

Les maladies auto-immunes résultent d'un dysfonctionnement du système immunitaire conduisant ce dernier à s'attaquer aux constituants normaux de l'organisme. C'est par exemple le cas dans le diabète de type 1, la sclérose en plaques ou encore la maladie de Crohn. Ces maladies sont généralement la conséquence d’une activation incontrôlée des lymphocytes T (LT). La caractérisation des protéines régulant l’activité des LT a donc un fort intérêt thérapeutique. Nous avons développé un modèle de souris dans lesquelles la protéine X est spécifiquement invalidée dans les LT ; certaines de ces souris développent spontanément une auto-immunité spécifiquement dans le colon, caractérisée par une forte activation des LT. Nous souhaitons confirmer ces données sur une cohorte plus large d’animaux, puis étudier les rôles spécifiques de X dans les différents sous-types de LT afin d’identifier le mécanisme responsable de la survenue de l’auto-immunité.

Bénéfices attendus

Ces travaux ont tout d’abord une portée fondamentale, puisqu’ils pourraient permettre l’identification d’un mécanisme moléculaire responsable du développement des maladies auto-immunes touchant l’intestin. D’autre part, nous espérons mettre en évidence les niveaux d’expression de la protéine X comme facteur de risque ainsi que comme cible thérapeutique dans ces maladies.

Procédures

Les souris seront soumises à une irradiation (30 minutes), puis recevront une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale (1 minute). Huit semaines plus tard les animaux vigiles recevront deux injections intra-péritonéales à 24h d’intervalle (2x 30 secondes).

Impact sur les animaux

Environ 30% des souris déficientes pour la protéine X développent une inflammation ano-rectale à partir de 9 mois après la naissance ; il s’agit d’un phénotype dommageable de gravité moyenne. Les autres souches de souris utilisées ne présentent pas de phénotype dommageable. L'irradiation suivie de reconstitution de moelle, l'injection de cellules par voie intraveineuse et l'injection intrapéritonéale ne provoquent pas d’effets secondaires dommageables détectables chez la souris. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité modérée, susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée. Le comportement, le poids, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale ; les rates, ganglions lymphatiques et colon seront prélevées pour analyse du phénotype immunitaire par cytométrie en flux et analyses histologiques. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines X dans la fonction des lymphocytes au cours de l’auto-immunité intestinale.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Certains animaux transgéniques utilisés développent un phénotype dommageable (prolapsus rectal) ; d’autre part certaines procédures peuvent induire une douleur légère à modérée (irradiation, injections intraveineuses et intra-péritonéales). Les protocoles d’injection que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le comportement, le poids, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles transgéniques nous permettant de mesurer spécifiquement le rôle de la protéine X dans les lymphocytes T et la survenue de l’auto-immunité. Ces animaux seront suivi jusqu’à un an après la naissance.

56 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de méthimazole pour détruire sa muqueuse olfactive et le rendre anosmique, puis passe un test de discrimination de deux odeurs sous restriction alimentaire, avant d'être tué pour analyse des tissus. Le porteur indique que la perte d'odorat peut perturber la prise alimentaire et le poids, suivis quotidiennement. L'objectif affiché est de valider ce modèle d'anosmie pour tester ensuite des implants olfactifs.

Objectifs

L'anosmie, ou perte complète de l’odorat, est une maladie qui affecte gravement la qualité de vie, étant donné l’importance de ce sens pour la prise alimentaire et les interactions sociales. L'anosmie est également liée à un risque accru de dépression et de décès, et peut handicaper les individus face aux dangers (nourriture avariée, fuite de gaz…). On estime que 5% de la population générale est anosmique. Par rapport à d'autres pertes sensorielles telles que la cécité ou la surdité, l'anosmie a attiré peu d'attention en partie parce qu'il s'agit d'une condition socialement « invisible ». La pandémie de COVID-19 a considérablement augmenté le nombre de personnes touchées par la perte d'odorat et a sensibilisé le grand public à ce sujet. Toutefois, il n'existe actuellement aucun traitement pour l'anosmie de longue durée, en dehors de l'entraînement olfactif, dont le bénéfice est significatif (surtout pour les anosmies causées par une infection virale) mais limité. L'implant olfactif représente une approche prometteuse pour traiter l'anosmie, toutefois il est nécessaire d'évaluer un tel dispositif sur des modèles animaux in vivo. Notre objectif est dans un premier temps d’induire une anosmie à long terme chez des rats afin de pouvoir par la suite tester des implants olfactifs qui seraient adaptables chez l'homme. L'anosmie sera induite pharmacologiquement par injection de méthimazole, composé connu pour produire une altération de la muqueuse olfactive. Nous avons choisi le rat, qui a un système olfactif dont l’organisation est proche de celle de l’Humain et qui permettra de tester l'efficacité d'un implant olfactif.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider un modèle d'anosmie induite chez le rat. Notre objectif est dans un premier temps d’induire une anosmie à long terme chez des rats afin de pouvoir par la suite tester des dispositifs de récupération olfactive.

Procédures

Les rats recevront une injection intra-peritoneale en début de protocole (1 injection/animal) qui doit altérer la muqueuse olfactive et diminuer significativement leur odorat. Afin de tester l'efficacité de cette méthode, les rats seront soumis à un test olfactif dans lequel ils doivent discriminer 2 odeurs. Pour cela, ils sont soumis à un test olfactif dans une cage dédiée à laquelle ils seront habitués au préalable. Deux odeurs sont présentées l'une récompensée par une boulette de sucre, l'autre non récompensée. Quand le rat sait quelle odeur prédit une récompense (son comportement l'indique) alors on considère qu'il discrimine bien les deux odeurs. Pour que le rat soit motivé à aller chercher sa récompense, on réduit sa nourriture. Cette réduction peut conduire à une perte de poids que l'on contrôle. La restriction dure environ 10 jours , le test olfactif 5 à 10 jours environ.

Impact sur les animaux

Le composé injecté peut présenter une toxicité qui devra être évaluée pré et post-mortem. L’anosmie chez le rat peut perturber la prise alimentaire, celle-ci ainsi que le poids des animaux devront être contrôlée quotidiennement suite au traitement.

Devenir

Analyse des tissus après euthanasie après 3 jours de traitement afin de voir si l'injection a bien conduit à une altération de la muqueuse olfactive: 12 rats traités / 12 rats véhicule maximum Analyse comportementale puis analyse histologique après euthanasie après 30 jours de traitement pour évaluer la durabilité du traitement: 16 rats traités / 16 rats véhicule maximum

Remplacement

Cette étude ne peut être remplacée par d’autre moyen, comme la culture cellulaire, car nous regardons le comportement de l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au minimum en optimisant au maximum les groupes expérimentaux. Pour une première approche histologique (3 jours), l'analyse est qualitative et un nombre d'animaux réduit sera utilisé. Cette procédure nous permettra de tester avec un nombre réduit d'animaux les éventuels effets indésirables et l'efficacité de notre traitement avant de décider si nous pouvons réaliser notre projet. Pour les test olfactifs, des tests statistiques montrent qu'une différence en fonction du traitement peut être observée avec un nombre d'animaux de 6 traités versus 6 controles. Nous prévoyons 2 groupes.

Raffinement

Tout sera mis en oeuvre afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Le bien-être animal est pour nous primordial vis-à-vis de l’animal mais aussi de nos expérimentations. Le stress modifie les capacités olfactives des animaux, ainsi les résultats de comportement ne peuvent être valable que si l’animal est bien portant. L’anosmie chez le rat peut perturber la prise alimentaire, celle-ci ainsi que le poids des animaux devront être contrôlée quotidiennement suite au traitement. Les tests olfactifs seront réalisés en condition de restriction alimentaire en s'assurant au préalable que l'état des animaux le permet. L’eau est disponible à volonté. Des points limites spécifique d’évaluation de la douleur à chaque procédure sera mise en place. Nous proposerons un autre type de nourriture si nous notons une dénutrition (gel nutritif ou nourriture enrichie en graisse et en sucre). Si l'animal présente une forte baisse du poids >15% malgré un régime adapté il est sera euthanasié s'il n'y a pas d'amélioration de son état. Une quantité de nourriture, mesurée par rapport au poids de l'animal, est donnée chaque jour aux animaux à heure fixe. Si l'animal présente une forte baisse du poids >15% il est remis sur un régime à volonté et le test est arrêté jusqu'à récupération. S’il y a l’apparition d’un mal être sévère (poil hérissé, catatonie, trouble du comportement...) et/ou une perte de poids de l’animal supérieure à 15% sans reprise malgré des soins particuliers (surveillance, nourriture en gel, réchauffement le cas échéant) au bout de 3-4 jours, l’animal sera euthanasié. Si une douleur est visible, elle sera soulagée par un analgésique, si la douleur persiste plus de 2 jours, l'animal sera euthanasié. Les cages sont agrémentées d’un nid végétal et d'objets pour le confort de l'animal.

Choix des espèces

Les rats ont de très bonnes capacités olfactives, ils peuvent apprendre facilement les odeurs. Le système olfactif est très conservé avec l'évolution, et les rats ont un système olfactif très similaire à celui de l'homme et sont de bons modèles pour tester l'implant olfactif sur lequel nous allons travailler. Les animaux sont utilisés à l'age adulte pour ne pas intérférer avec le développement.

2 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, d'une lignée fortement immunodéprimée, reçoit un conditionnement au busulfan puis des injections de cellules souches sanguines humaines, avant d'être tuée pour prélever moelle osseuse, rate et thymus. Le porteur indique que le busulfan entraîne une perte de poids et que de rares animaux développent une réaction du greffon contre l'hôte conduisant à leur euthanasie. Sur le remplacement, il affirme que le nichage des cellules souches dans l'organisme ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

Notre laboratoire a pour mission le développement et la conservation des greffons contenant des cellules souches sanguines humaines. Ces greffons sont utilisés pour le traitement par thérapie cellulaire de patients atteints de pathologies hématologiques telles que certaines leucémies, mais aussi dans certains cas, pour le traitement de cancers solides tels que le cancer du sein. Les procédures de greffe mises en oeuvre nécessitent une recherche permanente visant à améliorer et faciliter les procédures de greffe et à accroître l'efficacité de la greffe. L’objectif de ce projet vise l’optimisation de la qualité des greffons ainsi que le développement d'une nouvelle génération de greffon de cellules souches. Il s’agit principalement de préserver, voire augmenter, la capacité fonctionnelle (capacité de greffe) des greffons au cours des différentes étapes de préparation de ces greffons du donneur au receveur et notamment lors des protocoles de conservation, protocoles d’expansion, ou de manipulation géniques de ces greffons. Pour atteindre ces objectifs, il est indispensable de pouvoir analyser les cellules qui composent les greffons et notamment les cellules souches, et de pouvoir les étudier d'un point de vue fondamental.

Bénéfices attendus

Nos recherches sur les greffons hématopoïétiques et sur les cellules souches hématopoïétiques en particulier permettront une meilleure connaissance des mécanismes de régulation des CSH (survie, autorenouvellement, différenciation) d'un point de vue fondamental. Ces connaissances seront appliquées afin de (i) optimiser les conditions de conservation des greffons hématopoïétiques avant leur infusion aux patients, (ii) optimiser les protocoles d'expansion des greffons hématopoïétiques, et (iii) développer une nouvelle génération de greffons (à partir d'une source de cellules encore inexploitée (cellules du sang périphérique en homéostasie)).

Procédures

Les souris utilisées dans se projet seront soumises à des injections réalisées à l'aide d'une seringue et d'une aiguille. Il s'agit de piqûres réalisées en quelques secondes (minimum 5 secondes - maximum 90 secondes). Chaque souris subira un maximum de 3 piqûres réalisées à au moins 24h d'intervalle.

Impact sur les animaux

L'administration de bulsulfan pour le conditionnement des souris induit une légère perte de poids (

Devenir

A l'issue de la procédure, il est nécessaire de récupérer les moelles osseuses, la rate et le thymus des souris afin d'évaluer la prise greffe par les cellules injectées initialement. L'ensemble des souris est donc euthanasié afin de procéder à ces analyses et à l'obtention des résultats expérimentaux.

Remplacement

L’absence d’alternative à l’expérimentation animale pour l’ensemble de ces études est justifiée par le fait que la greffe des cellules souches du sang (« nichage » et développement chez l’hôte) fait intervenir des micro-environnements cellulaires et moléculaires extrêmement complexes et impossibles à reproduire en culture in vitro. Néanmoins, dans le cadre de ce projet, toutes les expérimentations in vitro (notamment analyses phénotypiques ciblant des populations cellulaires enrichies en CSH) seront réalisées chaque fois que possible.

Réduction

Pour chaque greffon utilisé et pour chacune des conditions expérimentales testées, le nombre d’animaux injectés est fixé à 7 afin d’obtenir les valeurs minimales nécessaires à la réalisation de tests statistiques lors de l’analyse des animaux. Afin d'éviter toute utilisation inutile d'animaux, les greffons sont testés pour leur contenu en cellules immatures (contenant potentiellement les cellules souches) sur des critères phénotypiques et/ou métaboliques afin d’estimer la qualité du greffon et d’éviter des injections inutiles en cas de greffons dont la qualité est jugée insuffisante.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort. Les souris recevront notamment de la nourriture enrichie dès le départ de l'expérimentation qui est marquée par la 1ère injection de busulfan (conditionnement des animaux avant greffe). Cette nourriture a pour but de limiter la perte de poids liée à la perte d'appétit elle-même liée à l'administration du busulfan. Ainsi pour une perte de poids attendue de 20% sans nourriture enrichie, cette perte est limitée à 10% grâce à l'utilisation d'une nourriture enrichie. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques. Elles seront hébergées en cages de type 2L en présence de leur congénères (à raison de 5 souris par cage) afin de maintenir leurs relations sociales. Les conditions d’hébergement sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll ». S'agissant des animaux qui reçoivent une injection de cellules par voie intrafémorale sous anesthésie générale, une analgésie préventive est également administrée quelques minutes avant l’anesthésie générale afin de limiter toute éventuelle douleur au réveil. Tous les animaux concernés par l’injection intra-fémorale sont suivis avec une attention particulière jusqu’à leur réveil et jusqu’à la reprise d’une activité normale (locomotion, prise de boisson, relation avec les congénères…) qui intervient généralement dans les 5 à 10 minutes suivant le réveil.

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris NSG. Cette souche de souris est très largement utilisée dans la recherche sur les cellules souches hématopoïétiques en raison de sa capacité à permettre la génération d'une hématopoïèse humaine à partir des cellules souches injectées. Cette capacité est obtenue grâce à la forte immunodépression de cette souche de souris. Elle représente donc un modèle pertinent et efficace pour l'étude et la mise en évidence de cellules souches humaines ; ce modèle permet d'extrapoler la greffe chez l'humain. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, modèle de la maladie d'Alzheimer, subit sous anesthésie une injection de molécules directement dans le cerveau après incision du crâne et pose d'agrafes, puis des prélèvements sanguins, avant d'être tuée pour découper le cerveau en tranches. Le porteur indique que ces lignées développent plaques, déficits de mémoire, troubles moteurs et mort prématurée dès l'âge de six mois. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne conviennent pas et que l'étude des réseaux neuronaux exige un "organisme entier".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie qui, en entrainant la mort des neurones du cerveau, altère la mémoire. L'objectif de ce projet est de permettre une meilleure compréhension des modifications de l’activité des neurones associés à la MA et d’évaluer l’efficacité / toxicité de molécules en développement sur ces modifications. Pour cela, nous utiliserons différents modèles de souris qui miment la maladie. Ce projet de 5 ans comporte 1 procédure qui consiste à administrer directement au niveau du cerveau, sur animal préalablement anesthésié et analgésié, des molécules en développement afin d’évaluer leur action contre les symptômes de la MA.

Bénéfices attendus

Ce projet scientifique associé à notre plateforme d’enregistrement de l’activité des neurones sur des coupes de cerveau permettra de mettre en évidence les modifications de l’activité des neurones associés à des modèles de la MA et de tester les effets protecteurs de molécules en développement sur les modifications du réseau de neurones impliqués dans la MA. Ce projet permettra ainsi d'approfondir les connaissances actuels sur les déficits neuronaux liés à la MA et ainsi de permettre le développement de nouvelles molécules chez l'Homme afin de traiter ces déficits.

Procédures

Procédure chirurgicale: -Administration d’anti inflammatoire (par exemple, Type Carprofene, 10 mg/Kg SC) ou de morphinique (Type Buprénorphine, Buprecare, 0,03 mg/kg; SC) 30 minutes avant l’anesthésie. (maximum 5 minutes) -Anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane sous 1 litre d'air et maintien 0.5-1.5% d’isoflurane sous 1 litre d'air) (maximum 5 minutes) -Application d’un gel ophtalmique (type Ocrygel) dès que l’animal est endormi afin d’éviter le dessèchement de la cornée. (maximum 2 minutes) -Injection d’un analgésique local en sous-cutané au niveau de la zone à inciser (maximum 2 minutes) -Placement de la souris profondément endormie dans le cadre stéréotaxique dont les barres d’oreilles ont été enduites d’un analgésique local (maximum 5 minutes). -Vérification du niveau d’anesthésie de l’animal en permanence en observant son rythme respiratoire et en testant le réflexe du retrait (maximum 2 minutes) -Incision de la peau (envion1.5 cm) au-dessus du crâne et nettoyage/désinfection de l’épicrâne (Type Vétédine) (maximum10 minutes). -Fermeture de la plaie à l’aide d’agrafes (maximum 5 minutes) Lors de l’expérimentation, des prélèvements sanguins pourront être effectués 1 fois par semaine maximum sur animal vigile ou anesthésié selon les méthodes réglementaires (au maximum 5 minutes).

Impact sur les animaux

Le premier modèle de souris utilisé pour ce projet présente une accumulation spontanée et progressive d’un peptide dans le cerveau, formant des plaques. Jusqu'à l'âge de 8-9 mois, les plaques ne sont pas observées au niveau du cerveau. Au cours de cette période "pré-plaque" de la maladie, un déficit de mémoire a été mis en évidence dans ce modèle. A l'âge de 11-12 mois les plaques commencent à apparaitre dans le cerveau. Les 2 autres modèles de souris utilisés pour ce projet sont caractérisés par une modification progressive de la composition d’une protéine présente dans le cerveau dès l'âge de 3 mois, entraînant des déficits de mémoire. Ces souris développent progressivement des problèmes de locomotion, une perte de poids, et un décès prématuré dès l'âge de 6 mois. Suite à l’administration des molécules en développement dans le cerveau, les animaux peuvent présenter des signes de douleur malgré les précautions prises pendant la phase de chirurgie (analgésiques, anesthésiques) et en post-opératoire (anti-douleurs et antibiotiques si besoin). Dans ce cas, les points limites préalablement définis permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux et de mettre en place des interventions précoces.

Devenir

Les animaux inclus dans une procédure expérimentale seront tous mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrales sur ces coupes.

Remplacement

L'organisation des réseaux neuronaux peut être étudiée sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces expériences ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in vitro. Une meilleure compréhension des pathologies du système nerveux central nécessite donc l’étude des réseaux neuronaux sur un organisme entier. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des test statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (nids végétaux, copeaux de bois à grignoter, contact visuel et olfactif entre les animaux, commutation progressive de la lumière et interactions fréquentes avec les humains…). Avant la chirurgie, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Pendant la chirurgie, des mesures seront mises en place afin de réduire au maximum la douleur : anesthésiques (en pré-opératoire) et analgésiques (en pré- et post-opératoire), gel ophtalmique, maintien d'une température constante (tapis chauffant)...Si besoin, les animaux recevront une antibiothérapie adaptée. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé après la phase d’opération pendant 3 jours. Une période de récupération post-chirurgicale d’au moins 10 jours sera respectée. Dès réception des animaux, une observation journalière sera mise en place. Des points limites préalablement définis et adaptés permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux (souffrance, angoisse…) et de préserver leur bien-être. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérite de la douleur observée. L'atteinte d'un point limite entraînera la mise en place d'interventions précoces et adaptées et des procédures de modifications de soins pourront être mises en oeuvre en cas de besoin comme détaillé dans la fiche de suivi et dans la procédure expérimentale. Les animaux exprimant des signes permanents de douleur seront exclus de l’étude et mis à mort immédiatement, sur décision du directeur de l'étude et/ou du vétérinaire désigné

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, petit rongeur dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour une large communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits de la maladie d'Alzheimer, la souris représente un modèle de choix pertinent car il existe des modèles transgéniques, bien décrits dans la littérature et couramment utilisés pour tester l'effet de composés en développement sur le fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 4 semaines à 40 semaines afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte et tous les stades de la pathologie.

15 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont élevées pour porter des maladies osseuses humaines comme le syndrome de Marfan ou l'ostéogénèse imparfaite, qui provoquent selon le porteur fractures spontanées, déformations de la colonne, dilatation de l'aorte et mort prématurée. Les seuls gestes décrits sont une biopsie d'oreille pour le génotypage et un tatouage, la souffrance venant surtout de la pathologie que ces lignées expriment. Le porteur indique que les animaux sont tués faute de pouvoir se reproduire ou être adoptés, et qu'aucune analgésie particulière n'est prévue.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des souris atteintes de pathologies osseuses dans le but d'étudier ces pathologies : Dysplasie congénitale spondylo épiphysaire (SEDc), Syndrome de Marfan, Aggrécanopathies, Ostéogénèse Imparfaite, Dysplasie Diastrophique et Syndrome d'osteolyse carpotarsien multicentrique (MCTO).

Bénéfices attendus

Ce sont des maladies rares sévères pour lesquelles il n’existe pour l’heure actuelle peu ou pas de traitement. Si ces approches fonctionnaient cela permettrait de développer des traitements efficaces pour les patients et apporter un bénéfice éventuel à long terme pour les patients.

Procédures

1 Biopsie d’oreille sur animal vigile pour le génotypage (10s) ; 1 Tatouage sur les coussinets plantaires sur animal vigile (30s)

Impact sur les animaux

Les modèles de souris utilisés sont malades. En effet, les animaux atteints de collagénopathies présentent des complications qui surviennent de façon chronologique et si les souris survivent les premières semaines, elles restent modérément atteintes. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les souris Marfan, ce modèle présentent des troubles cardiovasculaires, en particulier une dilatation progressive de l’aorte (entraînant une baisse significative de l’espérance de vie), une hyperlaxité des articulations et une déformation de la colonne vertébrale et du thorax. Ces symptômes sont également associés à des troubles de la vision. En ce qui concerne les souris Aggrécanopathies, d’après leur description scientifique, les souris présentent avec le temps des difficultés pour s’alimenter à cause d’un mauvais alignement des vertèbres cervicales. En ce qui concerne les animaux Ostéogénèse imparfaite, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une diminution de la densité osseuse provoquant des fractures spontanées. En ce qui concerne les souris MCTO, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une perte osseuse progressive, concernant généralement les os des pattes, entraînant une déformation et un handicap, ainsi qu'une insuffisance rénale chronique dans de nombreux cas. En ce qui concerne les souris Diastrophique dysplasia, d’après leur description scientifique, ce modèle présente une ostéoporose des os longs, une déformation de la colonne vertébrale sévère entraînant une posture caractéristique avec tête fléchie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure car ils ne seront plus en âge de reproduire et le fait que les lignées soient génétiquement modifiées et mutantes empêche tous replacement/adoption.

Remplacement

Globalement, la construction des traitements nécessaires à l’expérimentation (qui fera l’objet d’un autre PEA) et leur optimisation se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Cependant, l’utilisation du modèle murin de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé de manière à produire les animaux nécessaires pour la partie expérimentation. Plusieurs de ces modèles étant nouveaux, il est possible que le nombre d’animaux nécessaire pour les expérimentations soit amené à changer et donc en conséquence le nombre d’animaux nécessaire en élevage.

Raffinement

Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance inattendue, les animaux seront mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Les modèles de souris choisis ici sont tous détaillés dans la littérature scientifique pour mimer la maladie humaine. Les croisements seront effectués à partir de 8 semaines d’âge (âge de maturité sexuel). Les femelles seront gardés jusqu’à 10 mois et les mâles 12 mois.