Rongeurs

48 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des ions perchlorates dans l'eau de boisson pendant huit semaines, puis une colite est provoquée par instillation intrarectale d'un mélange d'acide et d'éthanol, l'animal étant maintenu allongé quinze minutes, avant une mise à mort trois jours plus tard. Le porteur teste l'hypothèse d'un lien entre pollution aux perchlorates et maladie de Crohn, et qualifie de "très modérée" la colite obtenue. Sur le remplacement, il affirme l'absence de méthode alternative et juge "indispensables" douze rats mâles par groupe.

Objectifs

Ce projet vise la réalisation d’une étude exploratoire de l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive du rat.

Bénéfices attendus

Nous n'avons pour le moment aucune information concernant un potentiel effet pro-inflammatoire au niveau intestinal des ions perchlorates chez l'Homme ou dans un modèle expérimental. L’hypothèse testée trouve son origine dans la corrélation spatiale très significative entre pollution des sols et des nappes phréatiques par les perchlorates et prévalence de la maladie de Crohn, qui est maximale en région Hauts de France. D’autre part, le registre EPIMAD sur les maladies inflammatoires du tube digestif apporte un certain nombre d’arguments épidémiologiques compatibles avec cette hypothèse.

Procédures

Les animaux seront soumis pendant 8 semaines à des ions perchlorates administrés par le biais de l'eau de boisson ou non dans le cas des contrôles. Au bout de 8 semaines, une inflammation expérimentale du colon (colite) sera induite par administration d'un mélange d'acide et d'éthanol 50% par voie intrarectale (n=24 animaux au total). L'administration intrarectale du mélange d'acide et d'éthanol se fait très progressivement pendant environ 1 min. Les animaux doivent ensuite être maintenus allongés sur le dos, le tête orientée vers le bas, pendant 15 min supplémentaires afin de prévenir une éjection rapide du produit. Les animaux témoins "colite" (groupes Contrôles et Perchlorates) recevront 100µl en intrarectal d'un mélange sérum physiologique/éthanol. Tous les animaux seront mis à mort 3 jours après l'induction de la colite ou leurs témoins respectifs (solvant).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucune nuisance particulière sur les animaux. Les ions perchlorates à la dose utilisée ne doivent induire aucun effet particulier sur l'état général des animaux sur une durée de 8 semaines. Le modèle de colite expérimentale à la dose utilisée est un modèle de colite très modérée. Les modèles de colite expérimentale sont parfaitement maîtrisés par le responsable de projet et ce modèle a déjà été pratiqué dans un précédent projet et hormis une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids modérée les 2 premiers jours de la colite, aucune autre altération du comportement des animaux n'a été observée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la période d'administration des ions perchlorates et l'induction de la colite expérimentale.

Remplacement

Le recours au modèle animal rat est justifié par l’absence de méthodes alternatives pour les études physiologiques et comportementales telle que des modèles in vitro. De plus, nous étudions des paramètres liés à la survenue de l'inflammation intestinale ainsi que son intensité. impossible à modéliser autrement que par une étude chez l'animal de laboratoire. De plus, les interactions entre différentes fonctions physiologiques et organes (système digestif, microbiote, foie...) est impossible à reproduire par un modèle in vitro. Nous savons également que l’inflammation colique peut produire une élévation de la température corporelle qu’un organisme vivant peut compenser par la mise en place de mécanismes d'adaptation par le biais de certaines fonctions telle que le sommeil ou la prise alimentaire, contrairement à des cellules en culture. De plus le modèle d’induction de la colite expérimentale chez le rat est bien décrit dans la littérature et maîtrisé par l’expérimentateur du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet (n=48; n=12/groupe expérimental, 4 groupes) a été estimé sur la base de nos précédentes expériences sur le même modèle ou des modèles différents utilisés les années précédentes. S’agissant d’une étude exploratoire « preuve de concept », aucun résultat expérimental n’est disponible à ce jour. Nous avons décidé de ne pas travailler sur des femelles gestantes comme ce fut le cas dans nos précédents projets et explorer ensuite les effets sur la descendance mâle et femelle. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons commander spécifiquement des animaux mâles juste sevrés de façon à limiter le nombre total d'animaux impliqués. En fonction des résultats que nous obtiendrons dans cette étude préliminaire, nous déposerons un projet plus complet et de plus grande envergure dans lequel les populations mâles et femelles seront étudiées. En conséquence, 12 animaux mâles par groupe expérimental seront indispensables pour s'affranchir de la variabilité des réponses et pour obtenir des données exploitables tant sur l'aspect variabilité physiologique qu'analyse statistique.

Raffinement

Dans la mesure où nous travaillons sur un modèle expérimental de colite, nous ne pouvons utiliser d'antalgique et d'anti-inflammatoire qui auraient pour conséquence de modifier les réponses physiologiques rendant nos résultats inexploitables mais ces traitements pourront être administrés avant induction de la colite si nécessaire. Nous fournissons en annexe une grille d'évaluation de la douleur qui sera scrupuleusement respectée. De par l'expérience que vous avons de ce modèle inflammatoire, nous savons que la dose utilisée est une dose faible permettant d'induire une colite très modérée n'entrainant aucun décès prématuré d'animaux et que très peu d'effets visibles chez le rat sont observés, excepté une perte de poids et quelques selles molles sur les 2 premiers jours expérimentaux après induction de la colite. Dans le cas d'un dépassement d'un score de 9, l'animal sera isolé de ses congénères et mis à mort par une injection d'euthanasiant chimique. En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe (nombre en fonction du poids conformément à la règlementation en vigueur) tout au long du projet. Un enrichissement sera apporté par des tunnels en carton et des frisettes de papier. Des points limites ont été mis en place, ainsi qu'une méthode d'évaluation pour la prise en charge des animaux.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à différents types de polluants environnementaux, - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation intestinale comme référencé dans la littérature - l’hébergement au sein de l'animalerie est adapté depuis plusieurs années à cette espèce. Les animaux mâles commandés seront des animaux juste sevrés de façon à pouvoir débuter l'administration orale des ions perchlorates vers l'âge de 5 semaines de vie maximum et pour une durée de 8 semaines consécutives.

108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit un amincissement du crâne d'une heure puis deux injections dans le cerveau avec perçage bilatéral du crâne, avant des séances d'imagerie cérébrale par ultrasons ou par TEP, pour étudier le rôle des astrocytes dans une neuroinflammation provoquée. Le porteur signale comme nuisances possibles une hémorragie lors de la chirurgie et une mise à jeun de quatre heures, et indique qu'une perfusion intracardiaque tue tous les animaux en fin de procédure pour les analyses. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle in vitro ou mathématique n'est "pas pertinent" pour construire cet outil d'imagerie préclinique.

Objectifs

Les besoins thérapeutiques liées aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels. Il est nécessaire de revisiter certains concepts pharmacologiques afin d’ouvrir le champ à de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment en ciblant des cellules autres que les neurones. Ainsi, les cellules gliales, composant 50% des cellules cérébrales de l’Homme, sont dorénavant considérées comme des acteurs à part entière dans la transmission des signaux chimiques et la régulation des neurones. Parmi les cellules gliales, les astrocytes contribuent à cette ‘gliotransmission’, représentant ainsi une nouvelle cible pharmacologique d’intérêt pour l’élaboration de nouveaux médicaments. Le projet aura pour but d’exposer le potentiel des modalités de neuroimagerie (tomographie par émission de positons (TEP), et imagerie par ultrasons à haute résolution (fUS) dans l’exploration des contributions des réseaux neurogliaux dans un modèle de neuroinflammation in vivo. D’un point de vue métabolique et moléculaire, la TEP représente une technique d’imagerie de pointe pour l’étude pharmacologique relatif au fonctionnement cérébral. Elle repose sur l’utilisation de radiotraceurs intégrés à des molécules cibles tels que le glucose et permet l’étude de la distribution ainsi que de la cinétique des molécules étudiées. L’imagerie fUS récemment développée, est basées sur l’utilisation d’ondes ultrasonores et nous permet d’évaluer et de cartographier l’activité cérébrale par la mesure des variations du volume sanguin cérébral local. L’expertise dans ces différentes méthodes d’imagerie, et leurs associations dans le cadre d’études pharmacologiques, permettent d’envisager des perspectives de recherches innovantes. Plusieurs molécules seront utilisées à la fois pour créer une inflammation cérébrale locale mais également pour moduler l’activité des astrocytes. En bref, l’objectif principal sera d’identifier et de caractériser la modulation astrocytaire dans les données d’imagerie multimodale fUS et TEP obtenues chez le rat présentant une neuroinflammation locale.

Bénéfices attendus

La gliopharmacologie (par analogie à la neuropharmacologie) est un nouvel enjeu pour les médicaments de demain, il est primordial d’avoir à disposition des approches in vivo permettant l’étude de l’activité de ces cellules. Ainsi ce projet permettra de caractériser les contributions des astrocytes dans les données de neuroimagerie dans un contexte d’inflammation cérébrale et d’élaborer des nouveaux outils permettant le développement de nouveaux médicaments, plus spécifiques présentant moins d’effets secondaires.

Procédures

Procédure 1 (Deux interventions + deux acquisions d’imagerie fUS) : 1) Amincissement du crâne (durée : 60 minutes) -Réalisé sous anesthésie générale (isoflurane) -Sur les animaux impliqués dans la procédure 1 uniquement : soit 60 rats -Chaque animal subit cette chirurgie qu’une seule fois 2) Injections stéréotaxiques (durée : 45 minutes) : -Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) -Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 60 rats -Chaque animal subira deux injections stéréotaxiques comprennant 15 min de préparation de l’animal (placement dans le cadre, anesthésie, et perçage bilatéral du crane)+ 15 min par côté nécessaire à l’injection). 3) Sessions d’imagerie fUS (durée : 80 minutes) – Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane+médétomidine) – Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 60 rats. Chaque animal subit cette session d’imagerie deux fois. Procédure 2 (Deux interventions + une acquisition d’imagerie TEP) : 1) Injections stéréotaxiques (durée : 45 minutes) : -Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) -Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure: soit 48 rats -Chaque animal subira deux injections stéréotaxiques comprennant 15 min de préparation de l’animal (placement dans le cadre, anesthésie, et perçage bilatéral du crane) + 15 min par côté nécessaire à l’injection. 2) Mise à jeun 4h avant l’imagerie TEP pour la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 48 rats. 3) Session d’imagerie TEP (durée : 75minutes) – Réalisée dans un état éveillé pour l’injection et la captation du radiotraceur et sous anesthésie générale (isoflurane) pour l’acquistion TEP – Sur la totalité des animaux décrits dans cette procédure : soit 48 rats. Chaque animal subit cette session d’imagerie une seule fois.

Impact sur les animaux

Les procédures d’imagerie fUS nécessiteront chez le rat de réaliser une fenêtre d’amincissement afin de visualiser les structures d’intérêt. De plus, les animaux subiront des injections de molécules modulatrices dans un état d’anesthésie générale. Une nuisance possible serait l’apparition d’hémorragie lors de la chirurgie. Le protocole est alors optimisé pour que les risques de ces complications soient minimes (zone opérée réduite au maximum). Pour les procédures d’imagerie TEP, une mise à jeun (4h avant l’acquisition) est nécessaire et constitue également une nuisance potentielle pour l’animal.

Devenir

A la fin de chaque procédure, l’ensemble des animaux subiront une perfusion intracardiaque nécessaire pour l’analyse immunohistochimique et biochimique post-mortem.

Remplacement

L’ensemble du projet et des procédures ont été choisis après une lecture minutieuse de la littérature actuelle, avec une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. S’agissant d’un projet dont l’objectif final est de construire un outil préclinique in vivo, l’utilisation d’un modèle in vitro ou d’un modèle mathématique n’est pas pertinente, ni cohérente avec l’état actuel des connaissances.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de calcul de puissance statistique compte tenu de la taille des effets observés et de la variabilité connue. Dans le cadre de l’imagerie fUS, les animaux réaliseront deux passages, ce qui permettra d’obtenir des informations importantes avec un aspect longitudinal sur un même individu, en limitant ainsi le nombre d’animaux, sans compromettre les résultats. De plus, pour l’imagerie TEP, contrairement à l’imagerie fUS, l’accumulation des interventions et des anesthésies est moins importante ; ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux par groupe dans la procédure correspondante à cette modalité.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement grâce à une grille de score et des points limites adaptés. La douleur sera réduite au maximum par l’administration d’analgésiques dès l’apparition de signes. En cas de signe de détresse, la procédure serait interrompue et si nécessaire, la mise à mort serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boîtes ou cylindres.

Choix des espèces

Souvent préconisé pour l’utilisation des dispositifs d’imagerie, le rat constitue un modèle animal pour lesquelles ils existent déjà des données précliniques impliquant l’utilisation des molécules utilisées et des différentes modalités d’imagerie utilisés au sein de ce projet. De plus, la taille du cerveau du rat est plus favorable en imagerie (TEP et fUS) que d’autres modèles animaux. Rats adultes afin d’étudier les contributions astrocytaires et neuronales au sein de réseaux neurogliaux pleinement développés.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc puis une injection de cellules Natural Killer dans le sinus rétro-orbitaire, avec une mesure quotidienne de la tumeur, pour étudier l'activité antitumorale de ces cellules immunitaires. Le porteur indique que les souris sont tuées quand la tumeur atteint 15 millimètres ou dès qu'un point limite est atteint, comme une gêne au déplacement ou une prostration. Sur le remplacement, il affirme que le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires en jeu rend la modélisation in vitro impossible et que les cellules NK n'existent que chez les mammifères.

Objectifs

Les cellules immunitaires Natural Killer (NK) appartiennent à la première ligne de défense du corps contre les agents pathogènes. En effet, ces cellules sont capables de reconnaître et d’éliminer les cellules infectées par des virus mais également les cellules cancéreuses. Ces cellules sont également douées d'une certaine mémoire, ce qui signifie que leur réponse sera amplifiée lors d'un second contact avec une cellule infectée ou tumorale. Ainsi, chez des souris porteuses de tumeurs, il a été montré une diminution de la taille des tumeurs et une meilleure survie des souris quand celles ci sont traitées avec des cellules NK pré-activées. Cette pré-activation consiste en une incubation de 16h de cellules NK purifiées avec un cocktail de cytokines. Les cellules NK ainsi pré-activées sont dites cellules NK mémoires car elles montrent une meilleure survie et de meilleures fonctions effectrices in vitro et in vivo lors d'un second contact avec des cellules tumorales. Le but de ce projet et de mieux comprendre l'interaction et l'importance de chaque cytokine prise séparément et en cocktail sur la préactivation des cellules NK. Il permettra notamment d'évaluer l'importance de différentes voies moléculaires en aval de ces cytokines pour la génération de NK mémoires. Afin d'évaluer leur rôle anti-tumoral in vivo, les cellules NK seront traitées avec différentes combinaisons de cytokines en présence d'inhibiteurs de ces voies. Ces cellules NK seront ensuite injectée à des souris porteuses de 4 types de tumeurs afin d'établir l'importance de ces voies moléculaires sur l'activité anti-tumorale des NK mémoires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact des cellules NK préactivées sur la pousse tumorale et de caractériser les voies essentielles à leur fonction in vivo. Il pourra permettre d'affiner les méthodes de pré-activation des NK, méthodes potentiellement transposable en immunothérapie contre le cancer.

Procédures

Injection de cellules tumorales en sous cutanée sur le flanc droit, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, une fois . Injection de cellules NK purifiées préactivée en intra veineuse au niveau du sinus retro-orbital, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, une fois. Mesure de la tumeur, anesthésie sous isoflurane, quelques minutes, journalier.

Impact sur les animaux

Le transfert de cellules NK par injection intra veineuse au niveau du sinus retro-orbatal ne devrait créer aucun stress particulier. Les cellules tumorales seront injectées en sous cutané au niveau du flanc droit ce qui conduit à une gêne associée à la pousse de la tumeur, c'est pourquoi la mesure de la tumeur sera journalière.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude ou avant si un point limite est atteint.

Remplacement

Ce type de projet nécessite l'utilisation de modèles animaux, le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires mis en jeu étant trop nombreux et leurs interactions trop complexespour pouvoir être modélisés in vitro. D'autre part, les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères ce qui exclut le recourt à d'autres modèles animaux non mammifères.

Réduction

Une étude bibliographique appuyée par nos expériences relevant d'autres projets nous ont déjà permit de définir les doses de cellules tumorales et NK à injecter ainsi que la cinétique de croissance des tumeurs ce qui limite les études préliminaires. Le nombre d'animaux nécessaires a été calculé de façon à apporter des réponses statistiquement fiables tout en évitant des mises à mort inutiles (test de LogRank pour les statistiques reliées à la survie, nombre d'animaux par groupe calculé par epiR package version 0.9-030). Afin d'optimiser le nombre d'animaux utilisés de nombreux paramètres sur la pousse de la tumeur, la fonction des cellules NK et leur phénotype à la fin de l'expérimentation seront analysés sur un même animal.

Raffinement

Lors de cette procédure, un suivit des animaux et des mesures journalières de la tumeur seront réalisées. Ainsi l'animal sera mis à mort lorsque le plus grand diamètre de la tumeur atteint 15 mm (Workman et al, BJC, 2010). D’autre part, les animaux seront mis à mort dans l’un des cas suivants : blessure au niveau de la tumeur, gène dans le déplacement, prostration, absence d’interaction avec le groupe. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l'injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique jusqu'à disparition des symptômes.

Choix des espèces

Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées (KO, KI, possibilité d'utiliser la technique CRISPR/cas9) et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8-12 semaines seront utilisées pour les expérimentations. Cet âge correspond, selon la courbe de croissance des souris C57BL/6, à un poids de 19-21 grammes à jeun. A cet âge, les souris ont un système immunitaire mature.

Greffées sous la peau du flanc de cellules tumorales, 372 souris reçoivent ensuite des injections d'un virus candidat médicament dans leur tumeur et deux prises de sang d'environ 20 minutes chacune. Toutes sont tuées au 60e jour ou à l'atteinte d'un point limite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le virus est testé sur des tumeurs plus ou moins rapides selon le nombre de cellules greffées, et le porteur écrit que la greffe "déclenchera une altération de la capacité de mouvement", alors qu'il ne prévoit un antalgique qu'au conditionnel, "Si une douleur est présente". Le résumé ne précise ni le nombre d'injections de virus, ni les conditions testées qui aboutissent à 372 souris par groupes de 12.

Objectifs

Dans le domaine de la recherche en oncologie, l'utilisation de virus thérapeutiques est devenue l'une des principaux axes de recherche. En effet, cette stratégie permet une approche ciblée sur des marqueurs spécifiques des tumeurs et ainsi une attaque focalisée des cellules malades. Dans ce cadre, de nombreux candidats viraux sont testés afin de déterminer l'approche la plus efficace. Ce projet vise ainsi à mettre en évidence l'effet d'un candidat virus sur une lignée de tumeur greffées en sous-cutanée dans un modèle de Souris. Les effets seront suivis sur la croissance tumorale mais aussi sur les facteurs circulant au niveau sanguin. Les données générées nous permettront d'améliorer notre compréhension des mécanismes d'action dans un organisme complexe et de poursuivre le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d'action et son efficacité en fonction de la vitesse de croissance tumorale. Cette dernière sera liée à la quantité de cellules tumorales que nous allons greffer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets de candidats virus sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre leurs capacités d'action et l'impact de leur injection sur des lignée tumorales déjà installées. Cette connaissance nous permettra de mettre en place des virus thérapeutiques permettant de soigner certaines tumeurs chez l'Homme.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par injection sous-cutanée. Celle-ci déclenchera une altération de la capacité de mouvement et une potentielle dégradation de l'état général des animaux. Par la suite, des injections tumorales de virus seront pratiquées. Ces différentes injections sont effectuées en quelques minutes. Deux prélèvements sanguins seront aussi effectués, chacun durant environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous anticipons l'apparition de tumeurs sous-cutanées, qui pourra déclencher une éventuelle perte de poids, une mobilité réduite, un mauvais toilettage. Ce protocole aura une durée maximale de 60 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J60 ou à l'atteinte d'un point limite. Ils ne sont pas réutilisables du fait de la présence de cellules tumorales et de virus thérapeutiques dans leur organisme.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l'oncologie ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèle non animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexe à l'oeuvre dans la mise en place de tumeurs ou la réponse immunologique associée.

Réduction

Ce projet a été mise en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Ainsi, nos connaissances des modèles tumoraux sous-cutanés chez la Souris nous permettent de dimensionner une première étude avec des groupes de 12 animaux par condition. Cet effectif nous permettra de disposer de conclusions statistiquement relevantes. Nous mesurerons les tailles de tumeurs et le poids de manière répétées. Grâce à ces données, nous réaliserons ensuite les études successives impliquant les virus thérapeutiques avec un nombre d'animaux optimal. Le maximum sera de 12 animaux mais si l'étude statistique nous permet de réduire ce nombre, nous essaierons autant que possible d'y procéder.

Raffinement

Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement. Nous injecterons les cellules tumorales sur le flanc. Ensuite l'apparition de tumeurs et leurs croissances seront mesurées trois fois par semaine afin de suivre la progression ainsi que l'effet possible du virus candidat sur celle-ci. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique à température. Nous suivrons à chaque pesée l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, les sites d'injection et l'aspect des tumeurs. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance.En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommendations vétérinaires.

Choix des espèces

Le modèle Souris constitue un bon modèle pour l'étude de modèle tumoraux. En effet, il s'agit de mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme pour disposer d'une approche translationnelle valide. Nous analyserons des animaux âgés de 8 semaines au moment de l'injection. A cet âge, le système immunitaire est suffisamment développé.

138 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une microchirurgie avec clampage de l'artère et de la veine rénale pendant 22 minutes puis trois prélèvements sanguins, pour mettre au point un modèle de vieillissement rénal destiné à tester des candidats médicaments. Le porteur indique que l'anesthésie profonde peut provoquer la mort chez ces animaux de 70 à 72 semaines, et que toutes seront tuées 28 jours après la chirurgie pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme que les cultures de cellules rénales humaines ne peuvent pas reproduire la complexité physiologique ni les réponses systémiques, et conclut au recours à la souris.

Objectifs

10% de la population mondial est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique est caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale résultant à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Ces problèmes rénaux sont particulièrement exacerbés chez les personnes âgées. Il a été démontré que le vieillissement rénal accélère le développement de maladies rénales chroniques à la suite de lésions aigües de l’organe. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie chez les sujets âgés sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments à visés rénale. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité et de toxicité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques. De plus, le principe de cette procédure repose sur une microchirurgie relativement moins invasive comparée aux procédures existantes qui sont beaucoup plus lourdes pour l’animal (ex : néphrectomie unilatérale et incision des 2/3 du rein controlatéral, obstruction unilatérale de l’uretère…). Enfin, comme le vieillissement accélère l’établissement de maladies rénales chroniques, ce nouveau modèle in vivo permettra de réduire considérablement les délais d’expérimentations et les contraintes associés subit par les animaux.

Procédures

Chaque animal subira : - 1 procédure de microchirurgie : Laparotomie puis clampage de l'artère et de la veine rénale pendant 22 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - 3 prélèvements sanguin à d0 (avant chirurgie), à d2 et d6-7 post-chirurgie. Prélèvement d'environ 20 microlitre de sang par légère incision au niveau de la queue

Impact sur les animaux

Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe

Devenir

28 jours apès la procédure de microchirurgie, toutes les souris seront euthanasiées et leurs organes collectés pour analyses.

Remplacement

En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), notre société travaille sur le développement de modèle in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques ne peuvent pas être reproduit in vitro.

Réduction

Dans la première phase de mise au point du modèle, un nombre restreint de souris sera utilisé (environ 8) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Plusieurs facteurs clés pourront être alors déterminé tels que le temps idéal de chirurgie, d'ischémie et de suture. Sur la deuxième phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène de l'ischémie. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse à l’ischémie. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. La stratégie d'ischémie reperfusion unilatérale permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, dans les observations comparatives, le "groupe" contrôle sera constitué du rein controlatéral n'ayant pas subi d'ischémie-reperfusion.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur très expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, la procédure de microchirurgie sera réalisée sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (100mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. La souris sera aussi maintenue sous oxygène lors de la procédure chirurgicale. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture. Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effet secondaire lié au traitement et minime.

Choix des espèces

La souris est largement utilisé par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’ischémie-reperfusion au niveau rénal et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. Les souris utilisées lors de cette procédure seront très âgées (70-72 semaines). Comme décrit dans la partie introductive, les souris âgées présentent un phénotype rénal qui se rapproche des conditions retrouvées lors des maladies rénales chroniques. Afin d’accélérer le processus et d’exacerber ce phénotype, celles-ci subiront une procédure d’ischémie-reperfusion. Cette microchirurgie sur ce type d’animal permettra d’obtenir un modèle expérimental qui présentent beaucoup de similitudes avec les conditions physio-pathologiques retrouvés chez l’Homme.

822 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans la moelle épinière ou le cerveau sous anesthésie et subissent des tests de force musculaire, avant une perfusion intracardiaque mortelle permettant de prélever la moelle épinière, pour évaluer une protéine censée protéger les motoneurones dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur indique que les souris mutées présentent dès huit semaines une baisse de force musculaire et un léger comportement dépressif. Il affirme que la production de ces données précliniques sur l'animal est nécessaire pour soutenir une demande d'essai clinique.

Objectifs

Les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlent les mouvements volontaires ainsi que la respiration. Dans la sclérose amyotrophique latérale (SLA), ces cellules dégénèrent ce qui entraîne des troubles moteurs. Notre laboratoire a montré que la protéine EN1 exprimée et sécrétée par les interneurones de la moelle épinière est importante pour la survie des MN. Une injection intrathécale unique de la protéine recombinante hEN1 permet de bloquer pendant 3 mois la neurodégénérescence, et des injections répétées de hEN1 permettent de maintenir l’effet neuroprotecteur sur une durée plus longue. Ce projet a pour objectif de produire des données précliniques sur l’activité neuroprotectrice de hEN1 permettant de soutenir une demande d’essai clinique évaluant le recours à hEN1 dans le traitement de la SLA, ainsi que d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous chercherons à : 1) tester l’activité de nos lots de protéine hEN1 afin d’évaluer leur conformité et permettre ainsi leur utilisation; 2) décortiquer les mécanismes d’action de hEN1; 3) déterminer si l’effet neuroprotecteur de hEN1 implique une action sur les synapses inhibitrices des MN ; et 4) évaluer l’impact de l’hyperactivité des MN corticaux sur la mort des MN spinaux. Nous prévoyons donc d’injecter la protéine hEN1 par voie intrathécale, ainsi que des virus encodant la protéine dans le cerveau de souris par injection stéréotaxique. Ces injections seront suivies d’études comportementales, physiologiques et histologiques.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégénératives est en constante augmentation à l’échelle planétaire. En France, la SLA affecte actuellement 5000 à 7000 patients, avec une incidence annuelle proche de 2,5 pour 100 000 habitants. Chez les patients atteints de SLA, les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlant les mouvements volontaires ainsi que la respiration dégénèrent, ce qui entraîne des troubles moteurs. L’espérance de vie des patients est en général inférieure à 5 ans après établissement du diagnostic. Cette maladie est progressive et fatale. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour cette pathologie. En plus de la lourde souffrance pour les patients et leurs proches, le coût de prise en charge pour la santé publique est important. La protéine recombinante humaine Engrailed 1 (hEN1) promeut la survie des MN. Ce projet aidera à comprendre les mécanismes qui sous-tendent la mort des MN chez les souris et de caractériser le mécanisme d’action de hEN1 sur la survie des MN. Ce projet servira aussi à évaluer la conformité de nos lots de hEN1 en amont de leur libération pour injection chez le patient. L’ensemble de ces expériences est d’une importance critique pour permettre la soumission une demande d’essai clinique de Phase I/II visant à évaluer la sûreté mais également l’activité d’une thérapie innovante pour le traitement de la SLA reposant sur l’injection intrathécale de hEN1.

Procédures

Les injections intrathécale se déroulent en conditions d’asepsie et d’anesthésie générale. La procédure dure en moyenne environ 15 minutes. Un maximum de 640 souris sur 5 ans seront soumis à cette procédure. Les injections stéréotaxique intracérébrale se déroulent en conditions d’asepsie et d’anesthésie générale. La procédure dure en moyenne environ 1 heure. Les animaux utilisés seront âgés de 30 jours. Un maximum de 16 souris seront soumis à cette procédure. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront âgés de 4,5 mois. La procédure prend en moyenne environ 2 heures. Un maximum de 24 souris seront soumis à cette procédure. Les évaluations de la force musculaire par tests moteurs seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront âgés de 6 semaines à 4,5 mois. Environs 15 minutes sont nécessaires pour la réalisation des 3 tests pour un animal donné. Un maximum de 552 souris seront soumis à cette procédure. Les perfusions intracardiaque seront réalisées sous anesthésie générale et prennent environ 15 minutes. L’ensemble des animaux utilisés (i.e. un maximum de 822 souris) seront soumis à cette procédure.

Impact sur les animaux

Nos expériences nécessitent des procédures de classe modérée. Pour toutes nos expériences, les souris sont anesthésiées selon les bonnes pratiques vétérinaires. Cependant, et même si notre laboratoire a acquis une solide expérience en la matière, suite à une injection intrathécale ou intracérébrale ou à une enregistrement électrophysiologique, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite, une posture voutée, des problèmes digestifs, une hyperactivité, et des difficultés respiratoires. Les souris En1+/- ont été caractérisées au laboratoire et sont actuellement utilisées dans le cadre d’autres projets. Elles présentent à partir de l’âge de 24 semaines de légères modifications de leur activité locomotrice et un léger comportement dépressif. Elles présentent à partir de l’âge de 8 semaines une baisse de force musculaire, mais ne manifestent cependant aucun point limite, au moins jusqu’à l’âge de 15 mois. Les souris Gephyrin-RFP ne présentent pas de phénotype dommageable. Nous attendons donc que les souris En1+/- ::Gephyrin-RFP que nous obtiendrons dans le cadre du croisement des 2 lignées présentent un phénotype dommageable au même niveau que la lignée En1+/-. Néanmoins, une fois ce croisement obtenu, une vérification de phénotype sera réalisée.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur moelle épinière collectée afin de permettre des analyses histochimiques visant à évaluer l’effet neuroprotecteur de hEN1 sur les MNs spinaux ou caractériser l’expression de L1, de Piwil1 ou du rapporteur fluorescent Gephyrin-RFP.

Remplacement

Nos expériences devant permettre de soutenir une demande d’essai clinique, il est nécessaire qu’elles soient réalisées sur l’animal. De plus, l’expérimentation in vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de l’activité neuroprotectrice de hEN1. Enfin, nos travaux ont pour objectif d’évaluer les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de la mort des MNs dans la SLA, ce qui implique d’avoir recours à un modèle animal offrant ainsi un contexte physiologique pertinent pour l’étude de l’origine des déficits observés chez les patients. Dans ce cadre précis, la souris s’avère être un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques.

Réduction

Nos travaux précédents réalisés sur des animaux soumis à une injection intrathécale ainsi qu’à une évaluation comportementale nous ont permis de démontrer qu’un nombre de 8 souris par condition expérimentale permet d’obtenir une puissance statistique satisfaisante malgré d’éventuels « drops out » ou de mauvaise réalisation de l’injection. Cependant, lorsque des animaux sont utilisés dans le seul but de permettre des analyses histologiques, nos résultats antérieurs indiquent que 6 souris par groupe constituent un nombre minimum d’animaux pour une puissance statistique suffisante (www.stasticalsolutions.net/pssTtest_calc.php). Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. Après une chirurgie, les animaux seront transférés dans une cage elle-même chauffée grâce à un matelas chauffant jusqu’à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leurs groupes d’origine afin d’éviter le stress lié à l’isolement et observés et pesés chaque jour pendant cinq jours. Ensuite, en plus d’une inspection visuelle quotidienne, des relevés de poids seront réalisés au moins 2 fois par semaine et d’éventuels signes de douleur seront recherchés. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.

Choix des espèces

La souris est une des espèces majoritairement utilisées dans le domaine scientifique pour l'étude des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet ainsi une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de SLA ont été générés et caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de EN1 dans un modèle murin de la SLA ainsi qu’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la mort des MNs spinaux chez la souris En1+/-. Les premiers signes de neurodégénérescence étant observés à l’âge de 3 mois, nous prévoyons d’injecter la protéine hEN1 à cet âge afin de pouvoir évaluer sa capacité à bloquer le phénomène dégénératif. Certaines de nos expériences seront également réalisées à des stades plus précoces (à partir de l’âge de 1 mois), afin de caractériser les déficits moléculaires intervenant en amont de la mort des MNs.

4776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à trois chirurgies stéréotaxiques du cerveau puis une imagerie terminale d'environ deux heures sous anesthésie, avant d'être tuées, pour développer des techniques de microscopie et cartographier l'espace extracellulaire du cerveau sain et malade. Le porteur décrit surtout les nuisances liées à la chirurgie et au transport vers le centre d'imagerie. Il affirme qu'obtenir ces données sur l'animal sain et pathologique passe par des modèles reproduisant la complexité des maladies humaines.

Objectifs

Comprendre le fonctionnement cérébral est un enjeu sociétal majeur tant pour la connaissance générale de cet organe encore bien mystérieux que pour notre capacité à combattre et traiter les maladies neurologiques et psychiatriques. La compréhension de la vie intracellulaire des cellules cérébrales, comme les neurones, a connu une expansion incroyable au cours des dernières décennies, ouvrant par exemple la voie à des manipulations de l’activité des réseaux neuronaux. Cependant, le coeur de l’activité d’un réseau neuronal qu’est le passage d’information d’une cellule à l’autre à travers le milieu extracellulaire, reste malheureusement un processus très peu compris. La compréhension de cet environnement, où toutes les molécules de l’information cérébrale passent, reste très limitée à cause d’un manque de technologie permettant son étude en condition vivante. Le projet repose sur une capacité à développer de nouvelles approches de microscopie à haute résolution au service de l’étude de la communication cérébrale. Il a pour objectif de comprendre le fonctionnement cérébral en décryptant comment l’environnement extracellulaire du cerveau contrôle la communication entre cellules dans un contexte physiologique et dans des maladies neurodégénératives et psychiatriques. En effet, combattre les maladies neurologiques et psychiatriques nécessite une compréhension fine des désordres moléculaires en place, jusqu’à la diffusion des molécules à visée thérapeutique. L’utilisation du modèle rongeur permet d’acquérir des connaissances et de favoriser leur transfert à la clinique humaine.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’utiliser deux nouvelles approches de microscopie super résolutive développées dans nos laboratoires pour fournir une description détaillée de l’espace extracellulaire et du réseau structurel de la matrice extracellulaire dans le tissu sain et pathologique : technique d’imagerie de nano-objets uniques (suivi des nanotubes/nanoparticules de carbone). Ces approches permettront de composer, à une échelle nanométrique, une carte de l’espace extracellulaire et de sa matrice dans les régions d’intérêt. C’est pourquoi, nous proposons à travers cette étude qui regroupe quatre laboratoires de caractériser l’espace extracellulaire via des technologies nouvelles et inédites de microscopie de super-résolution

Procédures

Chirurgie stéréotaxique (1h maximum), au maximum 3 chirurgies stéréotaxiques pour les modèles pathologiques sur 4 mois. Anesthésie pendant la chirurgie (1h) et en terminal pour l'imagerie (en moyenne 2h), une fois par animal.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie stéréotaxique, mais bien cadrés par l’utilisation d’analgésiques adaptés et d’un suivi régulier des animaux. Ils sont aussi liés au transport des animaux entre leur hébergement et le centre d'imagerie, mais réduits au minimum dans le temps, avec un respect du maintien de la température.

Devenir

A l'issu des procédures tous les animaux seront euthanasiés soit à des fins d'imagerie (tranches) soit après l'imagerie in vivo.

Remplacement

L'étude de l'espace extracellulaire a connu des avancées récentes, grâce au développement de techniques comme la microscopie en super résolution appliquée aux modèles ex vivo. Pour compléter les connaissances sur le sujet il est nécessaire d'obtenir des données sur l'animal sain et pathologique, à travers des modèles animaux réalisés chez le rongeur. Nous souhaitons caractériser l’espace extracellulaire sain et pathologique, nécessitant l’utilisation de modèles animaux pouvant mimer la complexité des maladies chez l’humain. Pour la partie expérimentale sur tranche des tests de Student seront pratiqués, en revanche pour les études sur les modèles in vivo la comparaison des groupes sera effectuée grâce à une ANOVA.

Réduction

Cette étude concerne un consortium composé de 4 laboratoires français qui à la fin de l’étude récupèreront des échantillons afin d’effectuer des études histologiques ou biochimiques, complétant ainsi les études in vivo et ainsi la base de données scientifiques, limitant l’expérimentation animale à cette seule étude.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Ils sont acclimatés pendant deux semaines avant l'expérimentation. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité.

Choix des espèces

L'utilisation de souris dans le développement d'outil de microscopie en super résolution est pertinente dans cette phase de notre projet. En effet, la taille réduite de l'animal, son cycle de vie court et la disponibilté des modèles pathologiques permettent d'optimiser le développement d'outils pour l'imagerie in vivo de l'environnement extracellulaire. Les animaux seront utilisés à l'âge de 2 mois et jusqu'a 6 mois, pour permettre de travailler avec des animaux sains et pathologiques adultes.

696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur du poumon ou de mélanome sous anesthésie puis un suivi de la croissance tumorale sur quatre à huit semaines, avant d'être tuées pour prélever la tumeur, afin de tester si l'invalidation d'un gène nommé TREX1 renforce l'effet des chimiothérapies. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements ou s'ulcérer et que les métastases pulmonaires provoquent des difficultés respiratoires. Il affirme que cette preuve de concept ne peut s'établir que sur des modèles immunocompétents, l'animal ne pouvant plus être remplacé à ce stade.

Objectifs

L'immunothérapie est l'une des stratégies les plus prometteuses pour le traitement du cancer mais de trop nombreux patients ne répondent pas de manière satisfaisante à ses nouvelles thérapies, en particulier les patients atteints de mélanome métastatique et de cancer du poumon. Un défi majeur dans le traitement du cancer consiste donc à faire bénéficier l’immunothérapie à un plus grand nombre de patients. Des études précliniques ont montré que les traitements cytotoxiques comme la chimiothérapie ou la radiothérapie stimulent les réponses immunitaires antitumorales. Une meilleure compréhension de la façon dont ce processus est régulé pourrait être exploitée pour activer le système immunitaire du patient afin que celui-ci détruise les cellules cancéreuses. Nous avons montré récemment qu'une protéine, particulièrement présente dans les cellules cancéreuses, a pour but de rendre ces cellules cancéreuses invisibles au système immunitaire, empêchant donc celles-ci d'être détruite. Nos résultats montrent que lorsque l'on supprime cette protéine, les cellules tumorales deviennent à nouveau sensibles au système immunitaire, qu'elles sont plus sensibles également aux chimiothérapies et donc qu'elles sont détruites plus facilement. Le projet qui fait l’objet de cette saisine consistera donc désormais à démontrer, dans deux modèles précliniques murins de mélanome et de cancer du poumon dont les cellules tumorales n'expriment plus la protéine, une meilleure efficacité des chimiothérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif principal de faire la preuve de concept, sur deux modèles de tumeur solide de mélanome et de cancer du poumon, que l’invalidation du gène TREX1 peut à la fois augmenter la sensibilité de la cellule tumorale aux chimiothérapies conventionnelles mais également contribuer à générer une réponse immunitaire anti-tumorale, souvent liée chez l’homme à des réponses très favorables aux traitements et soutenues dans le temps avec l’absence de récidives (rémissions complètes). Cette étude ouvrira un champ particulièrement intéressant de développement d’inhibiteur de la protéine TREX1, comme nouvelles molécules thérapeutiques permettant de potentialiser les effets des chimiothérapies et donc d’en diminuer les doses, et par conséquents réduire les effets secondaires souvent sévères associés à ces doses.

Procédures

Tout au long des expériences décrites dans ce projet aucun type de prélèvement ne sera fait sur les animaux vigiles. Les seules manipulations au cours de l'expérience seront la pesée hebdomadaire et la mesure de la tumeur trois fois par semaine. Les mesures tumorales s'étaleront sur une durée de 4 à 8 semaines. Seuls des prélèvements terminaux seront faits en fin d'expérience. La greffe sous-cutanée ainsi que l'administration sous-cutanée du traitement se fera de manière unique et sous anesthésie et le réveil des animaux sera particulièrement suivi et surveillé..

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs. Dans le modèle sous-cutané, les effets indésirables peuvent être une gêne de la locomotion ou une ulcération de la tumeur. Dans le modèle métastatique (métastases pulmonaires) les effets indésirables peuvent être des difficultés respiratoires. Le suivi quotidien des animaux nous permettra de procéder à l’euthanasie de tout animal atteignant un des points limites décrit ci-après.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments.

Remplacement

La preuve de concept du rôle de cette protéine dans la résistance aux chimiothérapies conventionnelles revêt une importance capitale dans le cadre du développement de nouvelles molécules inhibitrices de cette protéine pour le développement en clinique chez des patients atteints de mélanome ou de cancer du poumon mais également pouvant être étendus à d’autres type de cancer. Cette preuve de concept ne peut s’établir que sur de véritables modèles précliniques immunocompétents dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Seuls les modèles proposés nous permettront non seulement de mesurer l’efficacité de nos traitements en fonction de la présence ou de l’absence de l’expression de TREX1 sur la croissance tumorale et la survie globale, et d’étudier les mécanismes de la mise en place d’une réponse immunitaire anti-tumorale. A ce stade du projet il n’est donc plus possible de substituer l’animal à un modèle in vitro qui ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester le rôle de TREX1 sur l’efficacité des traitements.

Réduction

Le nombre d’animaux sera au maximum de 640 souris sur 3 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) des chimiothérapies lors de l'inactivation de cette nouvelle cible thérapeutique. Le nombre d’animaux a été évalué de manière à effectuer les tests statistiques adéquats pour définir la significativité de nos résultats D’autre part le projet est dessiné dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux dans le cheminement expérimental proposé, dans la mesure où la validation d’une étape donnera le feu vert à l’étape suivante uniquement si les résultats attendus sont significatifs. De la même manière la répétition d’une expérience ne se fera que si un effet est observé avec une tendance sans que le significativité statique soit atteinte. Cette répétition sera effectuée afin de montrer la reproductibilité de cette tendance. L’expertise et le recul que nous avons au laboratoire sur les deux modèles de mélanome et de cancer du poumon nous permettra de limiter le nombre d’animaux à son strict minimum afin d’avoir une validation statistique de nos résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés (5 par cage d'une superficie de 500cm2) à 20-24°C, 30-50% d'hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu est enrichi par une litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et une ouate coton pour le confort des animaux. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress. La prostration, les difficultés respiratoires, l’agressivité et l’isolement sont tous des critères d’arrêt conduisant au sacrifice des animaux avant la fin du protocole. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. L’utilisation de souris femelles dans nos protocoles expérimentaux réduit le risque d’agressivité et d’isolement. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience et seront reportés sur une fiche de suivi clinique. Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être utilisée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation induite par les greffes de cellules de mélanome ou de cancer du poumon. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé. Les signes listés ci-dessous feront l’objet d’une attention particulière lors de nos visites journalières: - le volume tumoral et l’ulcération de la tumeur (observation de la tumeur et mesure) - l’absence d'hydratation ou de prise de nourriture (observation de l’état général) - la gêne de la locomotion (observation du déplacement dans la cage) - le saignement ou une perte de liquide par un orifice (observation de l’animal) - l’isolement par rapport aux autres animaux, le dos vouté, les yeux enfoncés, la respiration saccadée, l’amaigrissement (observation du comportement de l’animal).

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé dans notre étude est le modèle le plus relevant pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence des effets thérapeutiques sur le long-terme et éviter les récidives ou les résistances aux traitements actuels. Dans la mesure où nos effets passent par le système immunitaire, c'est le modèle le plus pertinent par rapport à ce qui se déroule chez l'homme. Ce modèle est considéré comme une étape obligatoire avant de potentielles applications cliniques. Les souris seront âgées de 7 semaines, âge adulte chez la souris, période à partir de laquelle le système immunitaire est complètement mature et fonctionnel, et où l'on observe une forte incidence et une forte homogénéité de prise de greffe.