Rongeurs

540 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une à trois chirurgies cérébrales pour implanter cathéter, électrodes ou fibres optiques, et 520 d'entre eux s'auto-administrent de la cocaïne chaque jour pendant deux à trois mois, pour étudier les effets d'une stimulation cérébrale profonde sur l'addiction. Le porteur indique que les rats peuvent perdre du poids, se gêner du bloc de ciment dentaire fixé sur le crâne et se battre entre partenaires de cage. Il affirme que l'étude des comportements de consommation exige un animal vigile et libre de ses mouvements, faisant du rat un modèle qu'il juge irremplaçable.

Objectifs

L'addiction, notamment à la cocaïne, est une maladie psychiatrique pour laquelle il n'existe pas de médication efficace. Ainsi, les approches chirurgicales, telles que la stimulation cérébrale profonde (SCP) sont désormais envisagées pour réduire les comportements addictifs liés à la consommation de drogues. La SCP consiste en l’implantation d’électrodes de stimulation dans des zones profondes du cerveau afin de normaliser l’activité neuronale, responsable de comportements pathologiques en injectant des impulsions électriques à haute fréquence. Bien qu’utilisée avec succès chez l’homme, notamment pour la maladie de Parkinson et la dépression, les mécanismes cellulaires responsables des effets bénéfiques de la SCP restent largement méconnus. Nos données récentes obtenues chez le rat indiquent que la SCP du noyau subthalamique permet de réduire certains comportements pathologiques liés à l’auto-administration de cocaïne. Le but de ce projet est de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets bénéfiques de la SCP sur les comportements de type addiction chez le rat.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de découvrir quels sont les substrats cellulaires et moléculaires du STN ciblés par le SCP pour produire ses effets bénéfiques sur les comportements addictifs. Pour cela, nous utiliserons un nouveau protocole comportemental, qui recrée fidèlement les conditions observées chez l'humain, en permettant l'observation concomitante de l'émergence de l'escalade de la cocaïne et de sa recherche compulsive. Les enregistrements électrophysiologiques sur tranches permettront de caractériser les neuroadaptations induites par la cocaïne dans le NST et de déterminer comment celles-ci sont affectées par la SCP. Ce projet permettra également de caractériser le rôle de la connexion préfrontale-NST dans les comportements addictifs. Ce projet générera des résultats à fort impact translationnel, apportant de nouvelles perspectives sur la physiopathologie de l’addiction, et confirmera le potentiel de la SCP du NST pour le traitement de cette pathologie.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet seront soumis au moins une fois à un acte chirurgical, réalisé sous anesthésie générale et analgésie adaptée. 180 animaux seront soumis à un seul acte (160 implantés avec un cathéter, 45 min ; 20 injectés avec un virus, 60min). 180 animaux seront soumis à deux actes (implantation de cathéter, 45min, + électrodes de stimulation, 90min). 180 animaux seront soumis à trois actes chirurgicaux chirurgies (injection de virus, 60min, + implantation de fibres optiques, 90min, + cathéter, 45min). 520 animaux s'auto-administreront la cocaïne quotidiennement durant 2-3 mois, entre 2h et 8h par jour.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les conséquences ‘classiques’ à court terme des interventions chirurgicales. Dans les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation d’électrodes ou de fibres optiques, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Les animaux sont suivis quotidiennement les jours suivant l’opération afin d’anticiper et de soulager une nuisance potentielle. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période. Un autre type de nuisance, pouvant engendrer du stress, est l’appariement fait entre les animaux de façon aléatoire à la réception des individus. Lorsque l’alimentation devient contrôlée (les animaux ne sont pas restreints, mais pas ad libitum), un sujet très dominant peut empêcher son partenaire de cage de s’alimenter correctement. Enfin, les matériaux utilisés pour fabriquer et maintenir les cathéters, électrodes, ou fibres optiques, peuvent parfois provoquer des ‘bagarres’ entre partenaires de cage. En effet, les éléments en plastique, plus ou moins mous, les constituant, peuvent être ‘rongés’ par l’un des rats, provoquant ainsi une gêne et/ou un stress chez l’autre individu. Suivant les sessions d’auto-administration durant le protocole PIE, les animaux présentent une hyperactivité marquée, qui s’estompe en moins d’une heure (la dose i.v. de cocaïne est faible). Les symptômes de manque (perte de poids, agressivité…) sont rares, car les animaux ont accès tous les jours à la cocaïne.

Devenir

Afin d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques ex vivo, sur tranches, tous les animaux du projet seront mis à mort pendant ou à la fin de des procédures.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements et choix. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude.

Réduction

Notre approche, visant à réaliser des enregistrements électrophysiologiques chez des animaux préalablement soumis à un protocole comportemental, permet à elle seule de réduire le nombre d’animaux. Toutefois, dans l’optique de ne pas utiliser d’animaux plus que nécessaire, nous analyserons régulièrement les données expérimentales. Nous effectuerons a posteriori des tests de puissance statistique afin de calculer la robustesse statistique de nos résultats. Après obtention d’un effet robuste pour une condition donnée, nous cesserons de tester cette condition expérimentale. Par expérience, 10 animaux sont nécessaires par condition testée pour permettre de mettre en évidence un effet comportemental dans les protocoles d'auto-administration de drogues ; ce nombre prenant en compte l’exclusion de certains individus suite à d’éventuels problèmes inhérents à ce type d’étude (infection, cathéter bouché etc…). Pour les études combinant auto-administration et SCP et/ou de l'optogénétique, 15 animaux par condition testée sont nécessaires pour anticiper de possibles mauvais placements d'électrodes/fibres.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 2 dans leur cage à l'animalerie, avec accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques. L'état de santé général de tous les animaux de l'étude est suivi quotidiennement, ce qui nous permet de réagir immédiatement et de manière appropriée en cas de besoin. En cas de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé...) et/ou de perte importante de poids, l’animal sera isolé et aura accès ad libitum à une nourriture enrichie. Un traitement antidouleur pourra être administré si besoin (méloxicam 0,5mg/kg, 0,25ml, sc). Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie appropriée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. Les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigile et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'homme. Afin d'améliorer la qualité des enregistrements électrophysiologiques, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez de jeunes adultes 7-8 semaines (environ 200g), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer de l'ovaire, un suivi par imagerie deux fois par semaine, puis jusqu'à vingt et une injections d'un produit bloquant ou la pose chirurgicale d'une mini-pompe, pour étudier le rôle de protéines appelées prokinéticines. Le porteur indique que la maladie peut provoquer une accumulation de liquide, un amaigrissement et des ulcérations de la tumeur. Il affirme qu'après l'échec de ses essais sur des souris immunodéprimées, la confirmation dans un "organisme entier" doté d'un système immunitaire complet est "indispensable".

Objectifs

Le cancer de l’ovaire est le cancer le plus fréquent et le plus mortel parmi les cancers gynécologiques. ll est responsable de plus de 140 000 décès chaque année dans le monde. Sa forme la plus commune est le cancer épithélial de l'ovaire (CEO), généralement diagnostiqué à un stade avancé et qui représente plus de 95% des tumeurs malignes de l'ovaire. La chirurgie suivie d'une chimiothérapie à base de platine constitue le traitement standard actuel. Cependant, cette approche n’est pas toujours efficace pour améliorer la survie des patientes. Depuis une quinzaine d’années, notre groupe de recherche s’intéresse à l’étude d’une famille de protéines, les prokinéticines. Ces protéines sont spécifiquement exprimées dans les tissus endocrines (ovaire, testicule, cortex surrénal et placenta) où elles agissent sur les cellules endothéliales. Très peu de données existent quant à leur rôle dans le développement et la progression du cancer de l’ovaire, L’objectif de notre projet est de déterminer l'implication de deux protéines PROK1 et PROK2 dans le développement et ou la progression du cancer épithélial de l'ovaire (CEO) par le biais d'approches clinique, in vitro et in vivo. Nos expériences ont démontré que les taux circulants et ovariens de PROK1 et de ses récepteurs étaient augmentés chez les patientes CEO. Les prokinéticines sont également fortement exprimées par l’environnement tumoral et notamment par les cellules immunitaires. L’ensemble de ces résultats suggère que les prokinéticines contribuent au développement du CEO et que le blocage de leurs effets pourrait constituer une thérapie pour le traitement du CEO. Nos expériences précédentes sur des souris présentant une immunité fortement altérée et dans lesquelles des cellules humaines de CEO étaient injectées n’ont pas donné satisfaction, nous proposons donc dans ce projet de confirmer ces résultats dans un organisme entier vivant et possédant une système immunitaire complet, indispensable pour l’observation du développement de la tumeur ovarienne et pour le suivi de sa progression. Le nouveau modèle consistera à injecter des cellules murines du cancer de l’ovaire. Ce modèle de cancer de l’ovaire murin a déjà été utilisé et publié par plusieurs laboratoires. Il nous permettra de suivre le développement tumoral puisque les cellules seront dotées d’un marqueur bioluminescent.

Bénéfices attendus

Le cancer de l’ovaire reste une cause majeure de décès dans le monde. La recherche de nouvelles cibles dans son traitement est indispensable pour améliorer la survie des patientes. Les bénéfices attendus de ce projet seront une meilleure compréhension de rôle des prokinéticines dans le développement et la progression de ce cancer. Plus spécifiquement, les résultats de ces tests permettraient de démontrer la possible valeur thérapeutique du blocage des récepteurs au sein d’un organisme entier.

Procédures

Les animaux seront injectés avec des cellules de souris de cancer de l’ovaire, sous anesthésie gazeuse. Pour suivre le développement tumoral, elles seront imagées 10 min après une injection de luciférine pendant 15 sec. Ce suivi sera effectué 2 fois par semaine pendant 5 semaines maximum. Une partie de ces souris sera traitée par un produit qui bloque l’action des récepteurs pendant une durée maximale de 3 semaines, à raison d’un nombre d’injection maximum de 21 par souris. Pour l’autre groupe des souris, une mini pompe nécessitant une intervention chirurgicale de 10 min maximum sera posée pendant 2 semaines afin de délivrer en continu les protéines d’intérêt.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale ou en sous-cutané est susceptible de provoquer une modification du poids de l’animal, que ce soit une augmentation (avec le développement de liquide d’ascites) ou une diminution/ cachexie due à la progression de la maladie (affaiblissement). Des signes de stress (poils hérissés, absence de toilettage), de douleur due à une éventuelle ulcération de la tumeur ou une inflammation de la zone suturée peuvent apparaître. Des changements de comportement tels que des difficultés à se déplacer ou manger peuvent être attendus.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à la fin de la procédure en raison de l’injection de cellules cancéreuses. Leur réutilisation n’est donc pas envisageable.

Remplacement

L’équipe a récemment montré l’importance des prokinéticines dans l’environnement tumoral (cellules immunitaires, cellules des vaisseaux, adipocytes) sur des biopsies de patientes avec un cancer de l’ovaire. Nos modèles in vitro, sur lesquels nous nous sommes appuyés jusqu’à présent, limitent fortement l’avancée de nos recherches puisque la reproduction d’un environnement et notamment d’un système immunitaire y est impossible. En effet, ils ne nous permettent pas de mimer de façon précise le cancer de l’ovaire dans des conditions se rapprochant de ce qui est observé en clinique. Le recours au modèle animal est donc indispensable. Ces études sont donc à réaliser sur des animaux qui peuvent intégrer les mécanismes physiologiques complexes aboutissant à la pathologie.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Nous utiliserons dans cette étude 165 souris femelles sur 5 ans. En utilisant des doses déjà testées dans d'autres études, nous éviterons de réaliser une étude dose-réponse ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les expériences seront réalisées dans un laboratoire contrôlé pour l’absence de pathogènes. Les souris sont hébergées en groupe sociaux dans un environnement contrôlé avec nourriture et eau ad-libitum. Le milieu est enrichi grâce à des maisonnettes et des carrés de coton (pour la nidification et le jeu) conformément aux règles mises en place dans l’installation. Les animaux sont observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins, y compris les week-ends, afin de s’assurer de leur bon état général. Une grille de « scoring » a été établie pour chaque procédure afin de définir des points limites précis. La prise en charge des souris en cas de stress, de douleur ou d’inconfort est également détaillée et connu par tous les responsables du projet. L’utilisation d’analgésiques est systématique lorsque les animaux présentent des signes de souffrance. La taille de la tumeur ainsi que le poids des souris seront mesurés 2 fois par semaine.

Choix des espèces

Le projet a pour but de caractériser le rôle des prokinéticines dans le microenvironnement tumoral du cancer de l’ovaire et plus précisément sur les cellules immunitaires infiltrant la tumeur. Les souris utilisées dans nos expériences sont des souris immunocompétentes de la souche C57BL/6J pour réaliser un modèle syngénique. En effet, ce modèle nous permettra d’étudier les relations complexes entre les différents composants du système immunitaire et le développement du cancer de l’ovaire. De plus, ces souris ne présenteraient pas de risque de rejet car les cellules injectées sont d’origine murines. Plusieurs études ont démontré qu’il existe une grande similitude entre le développement tumoral chez la souris et chez la femme et dans l’expression et la régulation des gènes tumoraux et que plusieurs facteurs de l’angiogenèse et de l’inflammation comme les prokinéticines sont exprimés dans des types cellulaires similaires et régulés de la même façon. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles.

148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent des tumeurs mammaires spontanées ou reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses, afin d'étudier le rôle de protéines appelées intégrines dans les cancers du sein liés au gène BRCA1. Le porteur indique que les tumeurs restent localisées et que des ulcérations sont rares. Il décrit les souris transgéniques comme des "modèles incontournables" et affirme qu'il est "indispensable" de travailler in vivo malgré les cultures cellulaires utilisées en complément.

Objectifs

Le cancer du sein représente la première cause de décès par cancer chez la femme, principalement dû à une connaissance encore incomplète des mécanismes moléculaires et cellulaires qui induisent le développement tumoral. La glande mammaire est une structure épithéliale constituée d’un système de canaux ramifiés et d’alvéoles. L’épithélium mammaire adulte est composé de cellules luminales sécrétrices du lait et de cellules basales myoépithéliales qui, en se contractant, aident à l’expulsion du lait vers les canaux. Ces deux types de cellules dérivent de la prolifération et de la différenciation de cellules souches mammaires. Or, des études récentes ont montré que l’amplification aberrante des cellules souches est à l’origine de cancers du sein agressifs associés à des mutations du gène BRCA1 (Breast Cancer 1), un gène connu pour être un suppresseur tumoral. Ces cancers appartiennent à un groupe des tumeurs pour lesquelles les thérapies ciblées utilisées dans le traitement d’autres types de cancers du sein (par exemple, les thérapies hormonales) se sont avérées inefficaces. Les intégrines sont des protéines présentes dans la surface des cellules qui permettent leur adhésion et régulent de nombreuses fonctions. Certaines intégrines sont indispensables à la multiplication et la différenciation des cellules souches nécessaires à une gestation et lactation normales. Nous souhaitons étudier le rôle de ces intégrines dans un modèle murin connu pour développer des tumeurs mammaires dont l’origine et les caractéristiques sont très similaires aux cancers du sein avec mutation en BRCA1 chez la femme. Nos premiers résultats indiquant que la perte des intégrines dans ce modèle diminue l’apparition des tumeurs mammaires, nous projetons d’analyser les mécanismes qui expliquent cette inhibition. On déterminera en particulier l’impact de la perte des intégrines dans la glande avant l’apparition des tumeurs (statut pre-néoplasique) et sur son contenu en cellules souches tumorales, connues pour leur implication dans les récidives et la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

L’interaction des intégrines avec la matrice extracellulaire qui entoure les cellules joue un rôle important au cours des différentes étapes de la progression tumorale mammaire, du carcinome in situ (tumeur en stage initiale, souvent bénin) à l’invasion tissulaire (tumeur invasif mais encore localisé à la glande mammaire) et la métastase (invasion d’autres tissues). De façon notable, certaines intégrines sont surexprimées dans les tumeurs du sein et leur expression est associée à un mauvais pronostic et à des taux de survie réduits. Notre étude permettra de déterminer la contribution des intégrines dans le développement tumoral de la glande mammaire et la régulation des cellules souches tumorales, responsables des récidives et de la dissémination métastatique. Notre approche permettra d’évaluer la contribution de ces intégrines dans les anomalies de croissance cellulaire, différenciation et invasion observées dans les carcinomes mammaires humains. A long terme, ces informations permettront de mieux appréhender les mécanismes impliqués dans la communication entre cellules épithéliales et matrice extracellulaire et notamment d’évaluer si des signaux anormalement émis par les intégrines dans le contexte tumoral peuvent constituer des cibles thérapeutiques efficaces pour le traitement de certains cancers du sein.

Procédures

Un suivi des animaux développant spontanément des tumeurs mammaires (observation et palpation) sera réalisé pendant toute la durée de l’expérience (au maximum 4 semaines après la détection des tumeurs). Des expériences de transplantation (greffe) de cellules tumorales dans le tissu adipeux mammaire de souris receveuses seront réalisées. Cette intervention chirurgicale est peu invasive, le péritoine (membrane entourant la cavité abdominale), restant intact. Elle est de courte durée (15-20 min par animal) et s’effectue sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nos souris transgéniques sont viables et ne présentent aucun problème sévère de santé à l’âge adulte. Le modèle de tumorigenèse que nous étudions n’entraînent pas de souffrance notable. Les nuisances liées au développement tumoral sont faibles et les souris portant des tumeurs seront analysées en moyenne 2 semaines après leur détection, avec un maximum de 4 semaines pour les tumeurs à croissance lente. Les tumeurs restent localisées à la glande mammaire et ne sont pas métastatiques dans notre fenêtre expérimentale. L’apparition de tumeurs sur d’autres organes reste extrêmement rare dans ce modèle. De possibles mais rares ulcérations peuvent se produire dans les tumeurs mammaires chez certains animaux. Les animaux opérés pourront éventuellement développer des tumeurs mammaires qui, d’après la littérature, reproduiront le phénotype de la tumeur originale avec, notamment, une absence de développement métastatique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

Notre projet repose sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées (souris transgéniques) pour définir les mécanismes qui régulent les cellules souches et leur contribution dans les cancers du sein. La glande mammaire est un tissu spécifique aux mammifères dont le fonctionnement normal est contrôlé par un ensemble complexe de régulateurs hormonaux et locaux. La souris reste à ce jour le modèle le plus pertinent pour étudier la biologie des cancers du sein. Les souris transgéniques sont reconnues comme des modèles incontournables pour explorer les mécanismes de tumorigénèse et développer des thérapies. Bien que nous utilisions des méthodes alternatives réduisant l’utilisation des animaux, en particulier des cultures pour modéliser le comportement des cellules tumorales in vitro, il est indispensable d’effectuer des expériences in vivo pour comprendre la formation et la progression des tumeurs dans leur environnement physiologique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible pour maintenir une signification statistique. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements de glande mammaire, on utilise chaque glande mammaire d’une même souris donneuse, celle-ci étant pourvue de 5 paires de glandes. Des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées.

Raffinement

Les animaux seront manipulés le moins possible. Les souris seront surveillées soigneusement pour détecter tout signe de détérioration des conditions cliniques. L’apparition de tumeurs sera surveillée à partir de l’âge de 4 mois (l’âge moyen d’apparition de tumeurs dans ces souris est de 7,5 mois). Des palpations seront effectuées trois fois par semaine. Un examen complet au moins hebdomadaire (fréquence adaptée à l’évolution) des souris développant des tumeurs permettra de détecter des signes précoces de détresse et de maladie. Les points limites sont soigneusement définis avec une surveillance attentive des signes cliniques. Des fiches d'évaluation clinique sont mises en place pour ce projet spécifique. Les expériences de transplantation se font sous anesthésie générale. Pour minimiser les risques d’infection, les instruments de chirurgie sont stérilisés et les surfaces et la loupe utilisées, soigneusement lavées et rincées à l’éthanol. Pendant l’opération un gel de protection oculaire est appliqué aux animaux pour éviter le desséchement. Des analgésiques, sont administrés 20 min avant l’anesthésie (buprenorphine, carprofen), puis relais 24h après l’opération (ibuprofène). Après l’intervention, nous utilisons du fil de suture stérile résorbable pour refermer la plaie. En post-opératoire, les souris encore anesthésiées sont réhydratées et placées sur une platine chauffante pour éviter l’hypothermie. Les souris greffées sont surveillées tous les jours afin de déceler tout signe de mal-être et pour détecter l’apparition de tumeurs (palpation trois fois par semaine). Si elles présentent des signes de mal-être (amaigrissement, prostration), elles sont mises à mort avant la fin programmée de l’expérience.

Choix des espèces

Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Par ailleurs, la connaissance du génome murin, sa forte homologie avec le génome humain et l’existence de divers modèles génétiques murins rendent ce modèle puissant. Enfin, c'est un animal facile à anesthésier, ce qui permet de réduire au maximum le stress qui pourrait être provoqué chez l'animal. Ainsi, ce modèle animal est le meilleur compromis entre l’étude d'un modèle animal mammifère et l’obtention de réponses pertinentes aux questions posées. Pour l’analyse des tumeurs, les souris avec un phénotype potentiellement dommageable sont euthanasiées à l’âge adulte (à partir de 5-6 mois d’âge lors de l’apparition des tumeurs ou avant, pour analyse de la glande pre-néoplasique). Les tumeurs sont analysées avant qu’elles ne génèrent de signes de souffrance chez les souris. Les souris receveuses utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles pré-pubertaires âgées de 3 semaines. A ce stade, l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du tissue adipeux resté intact.

45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur cérébrale leur est implantée par chirurgie sous anesthésie, puis ils reçoivent des injections intraveineuses de nanoparticules et des séances d'IRM et de scanner, pour optimiser la dose permettant de visualiser la tumeur et de renforcer l'effet de la radiothérapie. Le porteur qualifie de légère la douleur liée à l'incision du crâne et prévoit une mise à mort si un point limite est atteint, le cerveau étant prélevé pour analyse. Il affirme que la complexité des tumeurs cérébrales et la distribution des nanoparticules ne peuvent être appréhendées qu'in vivo.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.

Devenir

Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.

4980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome puis un ou deux traitements, avant d'être tuées pour prélever la tumeur et les organes du système immunitaire, afin de tester un composé naturel censé activer l'immunité contre la tumeur, seul ou associé à des immunothérapies. Le porteur indique que les injections et la croissance tumorale peuvent provoquer des douleurs. Parmi les bénéfices attendus, il cite l'amélioration de la prise en charge des patients mais aussi la publication de ses travaux.

Objectifs

Nous avons montré qu’un composé naturel (CN) inhibe la progression des tumeurs de la peau (mélanomes) et qu’il stimule l’infiltration des cellules immunes dans les tumeurs. Les expériences réalisées sur des cellules de tumeur en culture montrent que le CN induit la libération de petites vésicules extracellulaires (pVE) et la mort des cellules cancéreuses qui vont libérer des signaux (lysats cellulaires). Nous avons montré que les pVE et les lysats cellulaires induits par le CN stimulent l’activation de certaines cellules immunes mises en culture. Les objectifs du projet sont d’étudier sur différents cancers de la peau (mélanome) implantés chez la souris, si le CN active le système immunitaire contre la tumeur et de caractériser si les pVE ou les lysats cellulaires participent aux effets du CN. Il sera également étudié si l’activation du système immunitaire et l’inhibition de la progression de la tumeur par le CN peut augmenter l’efficacité d'autres immunothérapies déjà utilisées en clinique en testant leur association.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra de compléter les études réalisées in vitro sur des cellules en culture et montrera l'impact du CN et des mécanismes qu'il active sur la réponse immune contre la tumeur et déterminera si l’association du CN avec d’autres immunothérapies utilisées en clinique peut augmenter leur efficacité. Ce projet aura pour bénéfice de pouvoir étudier dans un système intégré l'action de nouvelles thérapies qui stimulent le système immunitaire contre la tumeur dans le but d’améliorer la prise en charge des patients ayant un mélanome et qui ne répondent pas aux immunothérapies proposées en clinique et et permettra de publier nos travaux.

Procédures

L'animal sera soumis à un ou deux traitements avec une durée inférieure à 1 minute par traitement. Il n'y aura pas de prélèvements sur animaux vigiles et aucune procédure chirurgicale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur l'animal seront dues aux injections des cellules tumorales et des traitements qui entrainent des douleurs sur le site de l'injection ainsi que la croissance des tumeurs qui peut entrainer des douleurs. Le CN a déjà été testé in vivo sur plusieurs modèles de tumeurs et aucun effet indésirable, ni perte de poids n'ont été observés. Les immunothérapies ont déjà été utilisés chez la souris (rapporté dans la littérature) sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées. Par contre, les combinaisons du CN avec les immunothérapies n'ont pas été testées. Dans tous les cas, pour chaque traitement ou combinaison de traitements, nous serons vigilants et nous surveillerons de façon quotidienne les animaux afin de s’assurer que les traitements ou combinaisons n’auront pas d’effets indésirables et ne provoquerons pas de souffrance, et de même nous surveillerons si la croissance des tumeurs induit des douleurs. Si une souffrance est observée, un traitement mis dans l’eau de boisson pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire de la zootechnie.

Devenir

Procédure 1: Les souris seront gardées en vie après la formation des tumeurs car elles seront soumises à des traitements pendant une durée déterminée. Procédure 2: A la fin du temps des traitements, les souris seront mises à mort car la tumeur et les organes du système immunitaire seront récupérés afin d'isoler et de caractériser les différentes populations de cellules immunes qui sont activées ou inhibées par les traitements.

Remplacement

Le CN a été montré comme activant l'infiltration des cellules immunes dans les tumeurs mammaires et de mélanomes implantées chez la souris immunocompétente par des études d'immunohistochimie. Des expériences in vitro sur des cellules immunes ont été préalablement réalisées et ont montré les effets du CN et des mécanismes activés (sécrétion des pVE ou mort des cellules tumorales) sur la réponse immune. Nous nous sommes ainsi assurés de la pertinence d'étudier la réponse immune anti-tumorale chez la souris.

Réduction

Le nombre de souris utilisé sera le nombre minimal d’animaux qui permettra d’avoir des résultats significativement exploitables compte tenu de la grande variabilité des réponses immunitaires anti-tumorales des souris et pour répondre aux objectifs du projet qui sont d’évaluer la réponse immune anti-tumorale de plusieurs traitements et d’isoler et de caractériser les différentes populations de cellules immunes qui ont infiltrées les tumeurs et qui sont minoritaires comparé aux cellules tumorales. Les lignées choisies sont des lignées utilisées dans la littérature et en immunothérapie..

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général, pesée) afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur. Si une souffrance est observée, un traitement mis dans l’eau de boisson pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire de la zootechnie.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et permet de comparer les effets obtenus à d’autres molécules développées dans d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour étudier cette espèce. Le système immunitaire est un système complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires et plusieurs organes immuns qui communiquent entre eux. Ainsi, l'utilisation des souris immunocompétentes ou immunodéficientes pour montrer l'implication du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale du CN, des pVE et des lysats cellulaires est essentielle pour cette étude qui nécessite un système intégré.

2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, l'injection d'un candidat-médicament marqué à un isotope radioactif puis jusqu'à dix prélèvements sanguins, certaines étant isolées jusqu'à 96 heures en cage à métabolisme, pour suivre la distribution du produit dans les organes. Le porteur précise que ces études sont commandées par des entreprises clientes, selon un schéma répétitif de sélection de candidats-médicaments. Il indique que la tumeur peut atteindre 1500 mm3 ou se nécroser et que la toxicité peut entraîner une perte de poids supérieure à 20 pour cent, et affirme qu'aucun modèle ex vivo ou sur organoïdes ne reproduit la complexité physiologique de l'animal.

Objectifs

Les études de pharmacocinétique sanguine, de distribution tissulaire et d’élimination de candidats médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Dans le cadre d'études en cancérologie, il est également crucial de vérifier le ciblage spécifique des candidats médicaments pour les cellules cancéreuses que ce soit à but diagnostic ou thérapeutique. Ces études in vivo s’inscrivent dans un contexte d’études répétitives car elles seront réalisées selon un même schéma directeur expérimental ayant pour unique objectif l’étude pharmacologique de sélection de candidats médicaments biologiques. Les variations peuvent porter sur la souche de souris sélectionnée pour l’évaluation du candidat, le mode d’administration du candidat, le nombre d’animaux par groupe et le nombre de groupes (différentes doses et/ou différents temps d’euthanasie à analyser). Ces études in vivo sont menées à partir de l’administration de candidats médicaments préalablement marqués par un isotope radioactif de faible énergie afin de tracer et de quantifier ces candidats dans les différents tissus dont le tissu tumoral et fluides biologiques d’intérêt. La radioactivité est administrée à des doses ne présentant aucun effet nocif pour la santé de l’animal.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont que la molécule testée soit spécifique du tissu tumoral ciblé afin dans un second temps de développer des candidats-médicaments spécifiques de ces tumeurs à but diagnostique et/ou thérapeutique.

Procédures

Toutes les souris sont injectées en sous-cutanée avec des cellules cancéreuses ; fréquence : 1 fois/animal durée : 30 sec. Les souris recevront toutes une injection d'un candidat-médicament ; voies possibles : IV, SC, IM, IP, voie orale et intravésicale fréquence : 1 fois/animal durée : 30 sec à 3 min. A l'exception des souris en cage à métabolisme, toutes les souris seront prélevées en sang : - Cas du microsampling : fréquence max 3 fois sur 24 heures puis 1 fois par 24 heures pendant 7 jours = 10 prélèments durée/prélèvement : 1 min - Cas des autres techniques de prélèvements: fréquence max 2 fois avec un intervale minimum de 1 heure et maximum de 5 jours durée/prélèvement : 1 min Les souris en cage à métabolisme sont isolées pendant 96 heures au maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables inattendus sont: - tumeur aggressive dépassant les 1500 mm3 et/ou nécrosante entrainant l'arrêt de l'étude pour les animaux concernés. - toxicité de la molécue testée se traduisant par une perte de poids >20% et/ou un état général dégradé ( poils piqués, réduction de la motricité , perte d'appétit...) entrainant l'arrêt de l'étude pour les animaux concernés.

Devenir

Tous les organes d'intéret doivent être prélevés d'où l'impossibilité de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Ces étude ne peuvent pas être remplaceées étant donné que le système d'intéraction tumeur et molécule à tester est complexe et qu'à l'heure actuelle ex-vivo, sur organoides ou modélisation ne permet de reproduire la complexité physiologique de l'animal.

Réduction

Un groupe composé de 6 individus au maximum est nécessaire et suffisant à la détermination d'un coefficient de variation prenant en compte la variabilité interindividuelle. La mesure radioactive est très précise et répétable ne nécessitant pas l'intégration d'animaux supplémentaires. Aucun test statistique n'est envisagé. Il sera uniquement prévu de calculer la moyenne et l'écart-type obtenus sur chaque groupe de 6 animaux.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place: Une une période d'acclimatation de 5 jours minimum avant l'entrée dans le protocole ; Des conditions d'hébergement adéquates incluant un enrichissement avec du papier accordéon et des tunnels teintées un suivi quotidien des animaux ; la mise en place de méthodes d'anesthésie et d'euthanasie reconnues et validées ; l'instauration de points limites pertinents et précoces le respect des volumes d'injection , de la fréquence et des volumes de prélèvements sanguinss

Choix des espèces

Les souris sont des animaux préférentiellement utilisés dans les phases précoces de recherche de biodistribution tissulaire. Le choix de la souche et du sexe dépendra ensuite des résultats antérieurs de la Société cliente. Les animaux sont utilisés à l'âge de jeune adulte (environ 6-8 semaines). Le système immunitaire à cet âge est mature.