Rongeurs
Phénotypage cardiaque d’un modèle de souris pour une myopathie centronucléaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. La moitié porte une mutation reproduisant une myopathie myotubulaire humaine, une maladie musculaire que le porteur décrit comme provoquant faiblesse et difficultés de locomotion dès cinq semaines, et toutes subissent échographie et électrocardiogramme sous anesthésie puis des mesures de pression artérielle par contention pendant sept jours. Le porteur indique que les souris mutantes ont un poids inférieur et peuvent présenter une bradycardie sous anesthésie, une perte de poids de 20 % en une semaine déclenchant l'arrêt du protocole. Il affirme que la fonction cardiaque ne peut être évaluée in vitro et présente la souris comme l'une des seules espèces permettant les modifications génétiques voulues.
Objectifs
MTM1 est un gène muté dans une maladie musculaire sévère appelée myopathie myotubulaire. Les patients masculins atteints de myopathie myotubulaire présentent une forte hypotonie dès la naissance associée à une faiblesse musculaire généralisée et des déficiences respiratoires. Les patients nécessitent alors une assistance respiratoire et plus de 60% d'entre eux ne survivent pas plus de 2 ans. Ce projet a pour objectif principal de quantifier d'éventuels impacts sur la fonction cardiaque associés à cette pathologie. Une précédente étude dans le coeur des souris ayant mis en évidence plusieurs gènes et fonctions moléculaires affectées par la maladie, nous souhaitons obtenir des données quantitatives précises pour étudier l'impact de ces dérégulations sur la fonction cardiaque.
Bénéfices attendus
Pour cette étude, nous évaluerons les conséquences fonctionnelles d'une mutation de Mtm1 sur le coeur, ce qui n'a jamais été réalisé auparavant. Ce modèle chez la souris reproduit fidèlement les symptômes de patients atteints de myopathie myotubulaire, et présente une altération de l'expression des gènes dans le coeur. En caractérisant quantitativement la fonction cardiaque de ces souris, nous espérons ainsi mieux comprendre les mécanismes causant cette pathologie.
Procédures
Les animaux (16 souris) seront soumis à une anesthésie sans intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes pour réaliser l'échographie et l'électrocardiogramme, et à une mesure non invasive sur animaux vigiles (mesure de pression artérielle grâce à un manchon gonflable positionné autour de la queue) d'une durée de 20 minutes répétée une fois par jour pendant sept jours.
Impact sur les animaux
Pour cette étude , nous utiliserons un modèle atteint de myopathie myotubulaire. Cette souris développe une faiblesse musculaire et peut montrer des difficultés de locomotion qui apparaissent vers 5 semaines d' âge en moyenne. Ces animaux mutants ont également un poids corporel inférieur aux animaux contrôles. Pendant la procédure expérimentale, les souris peuvent avoir une bradycardie liée à l'anesthésie. La température sera contrôlée par une sonde rectale sur la platforme de l'échographie tout au long de l'expérience. Pour l'échographie, le thorax des souris sera rasé, et des électrodes seront insérées en sous cutané pendant l'électrocardiogramme. Les souris subiront une contention lors de la mesure de pression artérielle.
Devenir
Afin de pouvoir réaliser une analyse histologique, les animaux d'expérience (16 souris) seront mis à mort pour prélever leur coeur, ce qui nous permettra de réaliser des analyses histologiques complémentaires.
Remplacement
Nous souhaitons caractériser la myopathie myotubulaire, une maladie génétique affectant les muscles. La souris est physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, et il existe un modèle de souris présentant un mutation sur le gène Mtm1 qui conduit à l'absence de la protéine correspondante. Ce modèle reproduit fidèlement les symptômes des patients atteints de myopathie myotubulaire. Il nous permet donc d’étudier et de mieux comprendre cette pathologie. D’autre part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car l’évaluation de la fonction cardiaque serait impossible.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en permettant une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur ces modèles animaux mutants et les études réalisées auparavant montrent que 8 souris mâles par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. C’est le nombre d'animaux par groupe nécessaire pour atteindre la significativité statistique. Nous prévoyons donc 16 animaux d'expérience pour cette étude. Les géniteurs ne présentent pas de phénotype dommageable, on compte donc au total 16 animaux pour cette étude.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de mouvement apparaissent, de la nourriture en gelée sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude de la souris en question sera prématurément stoppée. L'échographie et l'électrocardiogramme seront réalisés sous anesthésie, et toutes les précautions adéquates seront prises pour assurer le bien-être des animaux lors de la procédure expérimentale (plaque chauffante à 37°C jusqu'au réveil, gel ophtalmique pendant l'anesthésie pour éviter le désechement de la cornée).
Choix des espèces
La souris est une des seules espèces assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir un modèle de myopathie myotubulaire, une pathologie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherches dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe, ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec d'autres études et de mieux comprendre le pathomécanisme de la maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier la fonction d'un organe, le coeur. Pour caractériser le phénotype cardiaque de ces souris, les animaux seront étudiés à 5 semaines, ce qui est un âge auquel on peut observer des effets sur les muscles squelettiques. Nous faisons donc l'hypothèse qu'un éventuel impact sur la fonction cardiaque serait également visible à cet âge. Les symptômes très sévères observés chez les souris à partir de 6 semaines ne nous permettent pas de réaliser cette étude à un âge plus avancé.
Identification de la fonction de la protéine SELENON dans la régulation glycémique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 192 opérées du pancréas sous anesthésie et tuées avant tout réveil et 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement invalidées pour le gène SELENON, une partie reçoit une alimentation enrichie pendant six semaines pour induire un syndrome métabolique, avec mesures répétées de la glycémie et prises de sang, pour étudier le rôle de cette protéine dans la régulation du sucre. Le porteur indique que les souris peuvent développer un diabète avec perte de poids supérieure à 20 %, polyurie et hypo ou hyperglycémies, une insulinothérapie devant limiter ces atteintes. Il affirme qu'aucun autre modèle n'existe et qu'il est "impératif" d'étudier la protéine dans un organisme complet où tous les acteurs de la glycémie sont présents.
Objectifs
Le projet de recherche porte sur l’identification de la fonction de la protéine à sélénium SELENON, dans les mécanismes de la régulation glycémique en conditions physiologique et physiopathologique. La mutation de SELENON est responsable de dystrophies musculaires chez l’homme. Néanmoins, la fonction de SELENON et les mécanismes impliqués dans ces dystrophies musculaires restent inconnus et aucun traitement n’est actuellement proposé. Curieusement, l'expression de SELENON n'est pas limitée au tissu musculaire. En effet, plusieurs données de la littérature décrivent la présence du gène SELENON dans le pancréas. Le pancréas est un acteur central de la régulation de la glycémie. Par ailleurs, il a été démontré l’importance du dialogue muscle-pancréas dans le contrôle de ce système de régulation de la glycémie. De plus, dans certaines études réalisées sur une cohorte de patients atteints de myopathie liée à SELENON, il a été démontré que des index de masse corporel faibles sont associés à des niveaux d'insuline à jeun et post-prandial élevés, suggérant un risque élevé de résistance à l'insuline. L'objectif du projet est d'étudier le rôle de SELENON dans le pancréas dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène SELENON. D’une part, nous étudierons in vitro son rôle dans les mécanismes de régulation glycémique dans les îlots pancréatiques. D’autre part, nous étudierons, dans le cadre d’une étude métabolique menée in vivo, sa fonction dans un contexte de syndrôme métabolique induit par une alimentation enrichie.
Bénéfices attendus
Les différentes analyses qui seront réalisée lors des études in vitro et in vivo de ce projet, nous permettront d’identifier les facteurs contrôlant l'expression de SELENON et fourniront des informations précieuses sur le contexte de son activité. Elles nous aideront également à évaluer la contribution d’un dysfonctionnement pancréatique au développement de la maladie musculaire. Enfin, les découvertes qui seront obtenus lors de ce projet nous permettrons d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques du diabète mais également des maladies musculaires.
Procédures
Procédure1 : Pour le prélèvement du pancréas, une incision de l’abdomen et la mise en place d’un tube très fin en plastique dans le pancréas seront réalisés sous anesthésie générale. Après quoi l’animal est euthanasié puis le pancréas prélevé (procédure sans réveil). Procédure2 : Les souris seront soumises soit à de l’alimentation standard appelée normal diet soit à une alimentation enrichie, appelé High Fat Diet pendant 6 semaine afin d’induire un syndrôme métabolique (durée classiquement décrite dans la littérature). Quotidiennement la prise de poids et la glycémie capillaire (lecteur de glycémie) seront mesurées. Hebdomadairement, une prise de sang sera effectuée pour la réalisation de divers dosages. Une fois par mois la fonction réelle du pancréas sera évaluée. Le test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capillaire à l’aide d’un lecteur de glycémie (0,6 µL de sang par mesure) toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 6h (accès à l'eau ad libitum). Une prise de sang de 200 μL (incision de l'extrémité de la queue) et une mesure de la glycémie seront effectuées à jeun juste avant l'injection intrapéritonéale du glucose et 200 µL en postprandial. L’injection de glucose est réalisée sur animal vigile soumis à une contention manuelle. En fin d’étude, les animaux seront mis à mort et les organes prélevé (pancréas, muscles…) pour réalisation d’études histologique, protéomique et génomique.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, il pourrait être envisagé le dévelopement d'un phénotype diabétique chez les souris KO. Ainsi, une dégradation de l’état sanitaire des animaux diabétiques pourrait survenir. Cela pourrait se manifester par une diminution marquée de l’activité ou à l’inverse une hyperactivité, une diminution du toilettage, une perte de poids rapide supérieure à 20%, une polyurie, des hyper et hypoglycémies. etc... Néanmoins, l’insulino-thérapie qui sera mise en place pour traiter l'hyperglycémie devrait empêcher ces nuisances.
Devenir
L'objectif du projet est d'aborder l'expression de SELENON dans les tissus pancréatiques dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène SELENON. D’une part, nous étudierons in vitro son rôle dans les mécanismes de régulation glycémique dans les îlots pancréatiques. D’autre part, nous étudierons, dans le cadre d’une étude métabolique menée in vivo, son activité dans un contexte de syndrôme métabolique induit par une alimentation enrichie. Ainsi, les devenir des animaux après chaque procédure se justifie par : - Procédure 1 : Cette procédure permet d’obtenir des îlots pancréatiques, source de cellules indispensable pour les études menées sur le diabète (mécanismes moléculaires de l'insulino-sécrétion physiologique et physiopathologique...). - Procédure 2 : L’euthanasie des animaux nous permettra de réaliser des études histologiques, de protéomique et de génomique sur les différents organes impliqués dans la régulation de la glycémie et sur les organes impactés par le diabète. Ceci nous apportera de cruciales informations sur le rôle de SELENON dans le développement du diabète afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutique de cette maladie. Enfin, les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvement.
Remplacement
En dehors de notre lignée de souris transgénique, il n’existe pas d’autre modèle permettant d’étudier le rôle du gène SELENON dans la fonction musculaire et la régulation glycémique. Des études menées in vitro sur des cultures cellulaires de muscle nous permettent d’étudier les mécanismes moléculaires et voies cellulaires auxquels participe SELENON. Toutefois, ces études ne permettent pas de comprendre l’importance physiologique de ces processus dans la formation et la maintenance du tissu musculaire. Par ailleurs, un îlot pancréatique est un ensemble complexe composé de différents types cellulaires interconnectés les uns avec les autres pour réguler de façon adapté la fonction régulatrice de la glycémie par la sécrétion de différentes hormones telles que l’insuline, le glucagon etc… Les lignées cellulaires n’ont pas réussi à l’heure actuelle de reproduire efficacement ce fonctionnement. Ainsi, la culture primaire d’îlots pancréatiques est indispensable pour une telle étude in vitro. Enfin, la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’évaluer le rôle de SELENON dans un environnement physiologique et physiopathologique, il est également impératif de l’étudier dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présents.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés.
Raffinement
Les cages ventillées des souris seront enrichies à l’aide de cylindres en PVC rouges et de carrés de nidification. Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes d’anesthésie et de prise en charge des animaux tout au long de leur séjour dans notre animalerie. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. En accord avec cette grille d’évaluation, des points limites prédictifs ont été déterminés afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Pour ce projet les souris seront uniquement utilisés à un stade adulte (Age: 8-12 semaines à leur arrivée à l’animalerie), stade de maturité sexuelle. De plus, concernant l’isolement d’îlots pancréatiques, la cathétérisation du canal cholédoque à ce stade de développement est bien maîtrisée au laboratoire et permet une bonne reproductibilité des rendements en îlots pancréatiques. Enfin, pour ce projet, les mâles et les femelles seront utilisés car nous souhaitons caractériser le rôle de SELENON dans la régulation glycémique quel que soit le sexe.
Rôle de l’immunosénescence dans le pronostic rénal après une agression rénale aiguë.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une insuffisance rénale aiguë leur est provoquée par ischémie-reperfusion ou par injection d'agents néphrotoxiques, et certaines souris jeunes sont irradiées puis reconstituées avec les cellules de souris âgées, pour étudier le rôle du vieillissement immunitaire dans l'atteinte rénale. Le porteur indique un risque de mortalité de 20 à 30 % lié à l'induction de la maladie et décrit un stress transitoire lié aux chirurgies et injections. Il affirme que la maladie est trop complexe pour des modèles in vitro et présente la souris comme l'espèce "la moins susceptible de ressentir" douleur et souffrance.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier l'impact du vieillissement sur l'infiltrat immunitaire durant l'Insuffisance Rénale Aigue (IRA) et de tenter de trouver de nouvelles interventions ciblant les cellules immunitaires pour prévenir 'lInsuffisance Rénale Aigue (IRA) et sa transition vers l'Insuffisance Rénale Chronique (IRC) chez les sujets âgés.
Bénéfices attendus
Meilleure compréhension des mécanismes immunitaireset physiopathologiques mis en jeu lors d'une agression rénale aigue chez des souris agées et recheche de traitements pharmacologiques potentiels
Procédures
1/ groupe IRA : L'IRA sera induite par ischémie-reperfusion ou injection d'agents néphrotoxiques (glycérol ou PHZ) sur des souris males et femelles de 2 et 18 mois anesthésiées. 2/ groupe inhibiteur pharmacologique : Après IRA, des souris seront exposées ou non à des traitements pharmacologiques ou moléculaires susceptibles de bloquer la fibrose rénale. 3/ groupe chimère hématopoiétique : Des souris jeunes seront irradiées puis le compartiment hématopoiétique sera reconstitué par des cellules provenant de souris agées. Par la suite une IRA sera induite >>Avant sacrifice, tous les groupes d'animaux seront soumis à des investigations in vivo pour évaluer la fonction rénale : diurèse en cage metabolique (1 fois), débit de filtration glomérulaire (2 fois : J0 et avant sacrifice), prise de sang (3 fois : J0, H6, J2) au niveau de l'artère caudale (volume inférieur à 50μl) pour mesurer l'urée plasmatique.
Impact sur les animaux
Protocole #1: stress transitoire lié à la chirurgie, apparition progressive d'une insuffisance rénale Protocole #2: stress transitoire lié à l'injection du glycerol, apparition progressive d'une insuffisance rénale Protocole #3: apparition progressive d'une insuffisance rénale Protocole #4: léger stress transitoire lié à l'irradiation Protocole #5: léger stress transitoire lié à l'installation des capateurs Protocole #6: léger stress transitoire lié aux cages métaboliques
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes pour des analyses post sacrifice.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est justifié par le fait qu’une insuffisance rénale aiguë est une pathologie complexe, impliquant différents compartiments cellulaires (épithélium, vaisseaux, cellules immunitaires…), impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés. (ex : cultures cellulaires).
Réduction
Les effectifs des cohortes sont réduits au maximum dans la limite de l’outil statistique. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons sont extraits de l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de matériel biologique. Compte tenu du risque de mortalité (environ 20-30%) lié à l'induction d'IRA (ischémie reperfusion ou l'injection d'agents nephrotoxiques (glycerol ou PHZ)), 5-6 animaux par groupe avec 3 à 4 protocoles seront suffisants. Les comparaisons entre groupes traités et non traités seront réalisées en utilisant un test de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère dans un environnement enrichi (ajout de papier essuie tout pour la nidification). Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance.
Choix des espèces
L’espèce utilisée permet d'utiliser le moins d'animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Pour ce projet portant sur l’immunosénescence, nous avons besoin de comparer des animaux jeunes à des animaux vieux. Pour cela, nous utiliserons des souris de 2 mois (jeunes) et de 18 mois (vieux).
Etudes de fertilité ou de screening en toxicologie de la reproduction chez le rongeur et le lapin
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 13048
Lapins : 2576
18 404 animaux non-humains, dont 13 048 rats, 2 780 souris et 2 576 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un produit par gavage quotidien pendant jusqu'à seize semaines, les femelles subissent des lavages vaginaux répétés et une partie des animaux a été ovariectomisée ou castrée, pour évaluer la toxicité de produits sur la reproduction selon des lignes directrices réglementaires. Le porteur indique que le produit testé peut altérer l'accouplement, la gestation, la mise bas et le développement des descendants, et que la nature des nuisances dépend de chaque substance. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace ces essais et les présente comme "indispensables" à la mise sur le marché.
Objectifs
Ce projet doit permettre l’évaluation de la toxicité d’un produit chez le rongeur et le lagomorphe sur les fonctions de reproduction notamment, et/ou sur la santé, conformément aux lignes directrices : - ICH M3 (R2), S5 (R2). - OCDE 421 et/ ou 422. - OCDE 440 et/ou 441. Les procédures peuvent être indispensables pour une mise sur le marché ou un enregistrement de produit, et permettre la sélection de doses pour des études postérieures. Les études de cette procédure permettent aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition en fournissant des informations sur les effets toxiques majeurs (détermination d’une dose sans effet adverse, d’une marge de sécurité pour l’utilisation/exposition humaine).
Bénéfices attendus
Ces études permettent d’intégrer globalement l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce). En effet, à ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais des études in vivo restent indispensables pour une évaluation complète de l’exposition maternelle à certains produits. Les études réalisées selon les lignes directrices OCDE 440/441 correspondent au Niveau 3 de test de screening in vivo dans le contexte du « Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens » (GD 150 (OCDE, 2018)) et ne sont effectuées uniquement si elles sont identifiées comme nécessaires dans le contexte de la démarche et dans la suite des tests précédents, comme test de screening essai in vivo fournissant des données sur un seul mécanisme endocrinien.
Procédures
Les animaux sont traités le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière (jusqu’à 16 semaines, mais dépend du type d’étude), avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux (jusqu’à 5 semaines). Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle (jusqu’à positivité du test), observations ophtalmologiques (en général 1 occasion par étude), mesures de pattes (1 à 2 fois par semaine jusque l’âge adulte), évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels, en général 1 occasion par étude). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur. Chaque technique (administration par voie orale, réalisation d’un frottis vaginal, examen ophtalmologique, mesure de la longueur de la pattes, évaluation du comportement) dure moins d’une minute par paramètre par animal. Les animaux utilisés dans le cadre des OCDE 440/441 pourront avoir fait l’objet d’une chirurgie (femelles ovariectomisées ou mâles castrés), tel que demandé par les lignes directrices. Cette chirurgie aura été réalisée chez le fournisseur d’animaux, selon autorisation du fournisseur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, des difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, des altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. La toxicité du produit administré peut cibler chaque phase. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.
Devenir
La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ces types de procédure en raison de la complexité que représente un organisme vivant et celle des processus de développement des concepti et des échanges dynamiques entre mère et descendance. Ces études in vivo, ne sont effectuées uniquement si elles sont identifiées comme nécessaires au cours de cette démarche et dans la suite des évaluations et tests précédents. Les études réalisées selon les lignes directrices OCDE 440/441, font partie d’une batterie d’essais in vitro et in vivo permettant d'identifier les substances susceptibles d’interagir avec le système endocrinien, et, à terme, d’évaluer les risques et les dangers pour la santé humaine ou l’environnement.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est en moyenne de 20 par sexe afin d'obtenir au moins 16 portées par groupe permettant d'avoir des résultats cohérents. Au-dessus de 20-24, il n'y a pas d'amélioration de la cohérence et de la précision des résultats. Ce nombre de portées par groupe (entre 16 et 20-24) est recommandé par la ligne directrice ICH. Le nombre d’animaux par groupe est lui aussi celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude.
Raffinement
L'état de santé des animaux est contrôlé tous les jours et évalué par rapport à des points limites définis de façon à éviter tout inconfort ou souffrance prolongé(e). Si nécessaire, un vétérinaire peut intervenir, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable (i.e., en conformité avec la réglementation en vigueur). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. En cas de plaie et/ou douleur, possibilités de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les lagomorphes ou rongeurs, notamment le rat, sont les espèces de choix car : - recommandées par les lignes directrices et pertinentes pour atteindre les objectifs des études, - présentent notamment une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de descendants par portée, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rat, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - font l’objet de données historiques robustes, - l'utérus des rattes est considéré (notamment par les lignes de l'OCDE 440) comme un organe cible approprié pour le dépistage in vivo des agonistes et des antagonistes des œstrogènes, puisque les tissus utérins répondent par une croissance rapide et vigoureuse à la stimulation par les œstrogènes, - l’emploi de rats castrés et des cinq tissus sexuels cibles est jugé pertinent par les lignes directrices de l'OCDE 441 pour le dépistage in vivo d’agonistes et d’antagonistes des androgènes et d’inhibiteurs de 5α-réductase. Le produit sera administré à des animaux juvéniles ou adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement), car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements et doivent correspondre aux âges requis par les lignes directrices. Dans les OCDE 440/441 : conformément aux exigences des lignes directrices associées, le produit pourra être administré à des animaux ayant subis une chirurgie (femelles ovariectomisées ou males castrés), car l’activité endocrine endogène des animaux doit être réduite au minimum afin de pouvoir évaluer l’effet du produit seul. Les petits qui naissent dans le cadre de certaines études (OCDE 421/422), seront gardés pendant une partie de la lactation (selon les lignes directrices ; observation du développement des petits pendant les premières périodes de vie).
Amélioration du traitement de l’accident vasculaire cérébrale via du tPA encapsulé dans des nanomembranes plaquetaires
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
75 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine après pose d'un cathéter dans la veine de la queue, puis les lésions sont évaluées par IRM avant prélèvement du cerveau, pour tester un nanomédicament censé améliorer le traitement de l'AVC humain. Le porteur indique que certaines souris peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures et un affaiblissement de la patte avant gauche correspondant à la zone lésée. Il affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information et présente la souris comme le meilleur compromis entre "pertinence scientifique" et "sensibilité de l'espèce".
Objectifs
L'AVC est une maladie qui survient de manière inattendue et a une issue désastreuse. Environ 15 millions de personnes connaîtront un épisode d'AVC chaque année dans le monde, dont 33 % avec une incapacité permanente, tandis que 40 % des cas entraîneront la mort. La thrombolyse avec l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant intraveineux (rtPA) est le seul traitement médicamenteux approuvé pour les patients ayant subi un AVC ischémique aigu, mais son utilisation est limitée par une fenêtre thérapeutique étroite, une efficacité sélective et des complications hémorragiques. L'ambition principale du projet est de mettre au point un nouveau modèle de nanomédicaments « intelligents » afin d'améliorer l'efficacité thrombolytique du rtPA, réduire le risque de saignement systémique, d'hémorragie, et d'évaluer le taux de recanalisation par des techniques d'imagerie. Cette stratégie innovante devrait améliorer les résultats des patients victimes d'AVC traités par rtPA, augmenter la fenêtre de temps thérapeutique et donc le nombre de patients victimes d'AVC qui peuvent bénéficier de ce traitement.
Bénéfices attendus
Cette stratégie innovante devrait améliorer les résultats des patients victimes d'un AVC traités par rtPA, augmenter la fenêtre de temps thérapeutique et donc le nombre de patients victimes d'un AVC qui peuvent bénéficier de ce traitement.
Procédures
Les animaux seront soumis à un modèle d'accident vasculaire cérébral ischémique. Puis un cathéter intraveineux sera mis en place pour permettre l'injection des différents traitements. Les lésions cérébrales seront ensuite évalués par imagerie par résonnance magnétique (IRM). Enfin les cerveaux seront prélevés pour permettre de futures analyses.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la pate avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (un carré de coton (Nestlets), dôme en carton, paillettes), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).
Devenir
A partir de la procédure 1 (Pose d'un cathéter dans la veine caudale de la queue pour l'injection des différents traitements pharmacologiques), tous les animaux seront utilisés pour la procédure 2 (Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine) puis la procédure 3 (Evaluation des lesions cérébrales par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM)) qui sera suivie de leur mise à mort.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. De plus, l'utilisation de technique d'imagerie non invasives permettant un suivie longitudinal du même individu permet de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le traitement de l'accident vasculaire cérébrale. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Evaluation de l’effet de molécules à visée thérapeutique sur la néphropathie lupique dans un modèle de lupus érythémateux disséminé chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un lupus, elles subissent pendant vingt semaines des administrations répétées de molécules, un gavage quotidien possible, des passages en cage à métabolisme et des mesures de filtration rénale sous anesthésie, pour tester les candidats médicaments d'un client. Le porteur indique ne connaître ni la nature ni les effets des molécules testées, et signale des effets possibles comme des infections, des lésions de l'œsophage ou des hématomes aux points d'injection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la maladie et conclut que le recours à l'animal est "incontournable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur l’atteinte rénale dans un modèle de lupus érythémateux disséminé.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de lupus érythémateux disséminé.
Procédures
Dans ce projet, les animaux ne subiront aucune procédure chirurgicale. Les animaux pourront subir toutes les procédures expérimentales pendant 20 semaines. Ils pourront avoir des administrations de candidats médicaments ou réactifs de traitement de façon quotidienne pour les voies per os et sous-cutanées, 1 fois par semaine pour les voies intra-péritonéales, intraveineuse et 2 fois par semaine pour la voie intramusculaire. Les animaux pourront être placés en cage à métabolisme par groupe de souris ou de façon individuelle pendant 24H 1 fois par semaine. Les animaux pourront avoir une mesure de filtration glomérulaire qui consiste à une anesthésie légère pour scotcher le capteur d’enregistrement et une administration intra-veineuse. Selon la demande du client, un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours ou à la fin de la procédure expérimentale. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin plus important terminal pourra être réalisé sous anesthésie avant l’euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés sont génétiquement modifiés pour qu’ils développent spontanément une néphropathie lupique. Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. La procédure expérimentale est longue (20 semaines) et les animaux peuvent avoir des traitements répétitifs pouvant engendrer des effets indésirables comme des infections, des lésions de l’œsophage par exemple, des hématomes aux points d’injection… Une attention particulière sera apportée lors des administrations.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie lupique dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
L’évaluation de l’effet de candidats médicaments sur le lupus érythémateux disséminé et sur la néphropathie lupique se fera au cours du temps (jusqu’à 20 semaines) par des techniques non-invasives : évolution dans le temps du phénotype (scores des lésions cutanées de 0 à 6), mesure de la protéinurie par bandelette urinaire et récolte urinaire par cage à métabolisme, ce qui réduit fortement le stress de l'animal. De plus, une évaluation en basal (avant traitement) ainsi que des évaluations à différents temps pendant le traitement permettront pour chaque animal d'être son propre contrôle et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
L’état général des animaux sera observé tous les jours par du personnel qualifié. . Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, différents types d’enrichissement pourront être ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois) ou igloo en polycarbonate). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal.
Choix des espèces
Le modèle choisi pour cette étude est un modèle murin génétiquement modifié (souris MRL/MpJ-Faslpr/J, communément appelées souris MRL-lpr). Ces souris développent une maladie auto-immune ressemblant au lupus érythémateux disséminé en raison d'une mutation (Faslpr) qui favorise la survie des lymphocytes auto-réactifs, et d'un fond de souche (MRL/MpJ) prédisposé à l'auto-immunité. Elles vont développer de manière spontanée une néphropathie cliniquement similaire à ce qui est observé dans la pathologie humaine. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Evaluation d’un traitement anti cancéreux chez la souris, par transfert de globules blancs modifiés pour sécréter des molécules thérapeutiques après détection in vivo de marqueurs tumoraux.
- Recherche appliquée
- Cancers
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sur chaque flanc, une injection de lymphocytes B et T modifiés, puis un suivi par bioluminescence sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour tester une immunothérapie censée diriger des globules blancs vers la tumeur. Le porteur indique que la greffe peut provoquer une ulcération des tissus cutanés et que les contentions induisent un stress modéré. Il affirme qu'on ne peut pas s'affranchir du modèle murin et conclut que le recours in vivo est "indispensable".
Objectifs
Les cancers représentent un problème de santé publique majeur causant environ 10 millions de décès par an. Les traitements disponibles présentent de nombreux effets secondaires et nécessitent souvent de multiples interventions, d’où la nécessité de nouvelles alternatives thérapeutiques plus efficaces, plus spécifiques, voir ciblées, et ce, sur le long terme. L'un des principaux problèmes expliquant la progression du cancer est l'incapacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales. Récemment, des stratégies d'immunothérapie modulant le système immunitaire du patient pour augmenter son efficacité ont suscitées un fort intérêt. L’objectif du projet est d’améliorer le système immunitaire du patient, en modifiant un sous type de globules blancs, afin qu’il discrimine et détruise spécifiquement les cellules cancéreuses. Les propriétés de reconnaissance du globule blanc seront améliorées afin qu’il détecte les cellules tumorales et génère en réponse une forte réponse immunitaire anti-tumorale qui conduira à la destruction de la tumeur. L’un des principaux avantages de cette thérapie est qu’elle permet de prévenir des rechutes du cancer car les globules blancs modifiés persistent dans l’organisme sur le long terme et pourront être réactivés en cas de nouvelles poussées de la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’évaluer dans un premier temps la capacité de nos cellules B à se diriger vers le site de la tumeur et l’activation du circuit des cellules B reprogrammées puis dans un second temps l’efficacité anti tumorale de ces cellules. Ces procédures vont nous permettre de vérifier la localisation des cellules modifiées et réinjectées ainsi que la libération localisée de la molécule thérapeutique par ces cellules in vivo.
Procédures
- Greffe sous anesthésie : Injection de cellules tumorales humaines sur chaque flanc (15 min/animaux). - Co injection de lymphocytes B et T sous anesthésie (2 min maximum en prenant en compte l'anesthésie et l'injection, le réveil est quasi immédiat) - Suivi de la bioluminescence sous anesthésie (entre 5 secondes et 8 minutes maximum en fonction de l’intensité lumineuse émise et les limites de saturation de la caméra photosensible). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Injection du substrat pour la bioluminescence (moins d'1 minute en prenant en compte la contention et l'injection). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Prélèvement sanguin, 1 fois sous anesthésie générale (moins d'1 minute). - Les animaux seront pesés une fois par semaine (environ 1 minute) pendant 28 jours. - Les tumeurs seront mesurées au pied à coulisse 2 fois par semaine (environ 2 minutes) pendant 28 jours.
Impact sur les animaux
Suite à la greffe de cellules tumorales en sous cutanée, une tumeur va se développer et peut induire des distensions et ulcérations des tissus cutanées. Dans notre cas les durées d’expérimentation ne sont pas suffisamment longues pour permettre l’installation de distension des tissus, le point limite le plus critique est l’apparition d’ulcération des tissus cutanés qui peuvent apparaître chez certains animaux avant la fin de l’expérimentation. Le phénotype des animaux est non dommageable car ils sont élevés dans les conditions appropriées (conditions d’hébergement et d’expériences). Un stress modéré sera induit par les contentions préalables aux anesthésie gazeuse et locale, aux pesées et aux mesures des tumeurs.
Devenir
A l'issue de ces procédures, les animaux seront mis à mort afin de quantifier la luminescence ainsi que la présence de lymphocytes B modifiés dans la tumeur et dans la rate.
Remplacement
Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro. Cependant, on ne peut pas s’affranchir du modèle murin. La nouveauté de ce traitement est la sécrétion locale des molécules thérapeutiques au niveau de la tumeur exprimant le marqueur ciblé. Or pour étudier la localisation des cellules modifiées dans l’organisme après injection ainsi que la zone anatomique de sécrétion de la molécule médicament par ces cellules, le modèle in vivo est indispensable. De plus, l’activation des lymphocytes B (globules blancs modifiés) est un processus relativement complexe et fait intervenir plusieurs organes où s’effectueront les étapes de maturation ainsi que de nombreux types cellulaires. Pour l’heure ces processus d’activation ne peuvent être reproduits in vitro, c’est pourquoi le recours à un modèle in vivo est indispensable.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été défini après discussion avec des statisticiens, ainsi que sur la littérature scientifique pour estimer les effets attendus et a été réduit au minimum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Le suivi de la bioluminescence des cellules B modifiées in vivo a permis de réduire le nombre d’animaux dans les procédures 1 et 2 en permettant de suivre la localisation et l’activation du circuit sans mettre systématiquement à mort les animaux à différents temps. Le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été déterminé en prenant en compte le pourcentage de prise de greffe (80%).
Raffinement
Les manipulations des souris immunodéficientes seront effectuées dans un environnement complétement stérile garantissant ainsi un phénotype non dommageable. Tout au long des expériences, nous veillerons au bien-être des animaux, à réduire au maximum la souffrance et l'angoisse des souris grâce à la mise en place d’une grille de score clinique. Une période d’une semaine d’acclimatation sera mise en place avant le début du protocole et les animaux seront maintenus en groupes sociaux. La greffe des cellules tumorales ainsi que le suivi de la bioluminescence seront réalisées sous anesthésie afin d’éviter toute méthode de contention prolongée. La Co-injection des lymphocytes B et T sera faite sous anesthésie avec au préalable une anesthésie locale. Un prélèvement de sang total sera réalisé à la fin de l’expérimentation, sous anesthésie profonde au sinus retro-orbital ou intra cardiaque.
Choix des espèces
La souche de souris utilisée a été choisie pour son immunodéficience sévère permettant la xénogreffe de cellules humaines (cellules tumorales et immunitaires humaines). D’après notre expérience, pour cette souche de souris, un âge d’environ 6 semaines permet une bonne prise de greffe des cellules tumorales.
Optimisation de l’efficacité anti-tumorale des lymphocytes T humains dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
8 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles reçoivent des cellules T humaines et des cellules tumorales, avec une à deux injections ou prélèvements par semaine, pour optimiser l'efficacité de ces cellules contre le lymphome. Le porteur indique une perte de poids possible et l'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Il affirme que cette analyse de cellules humaines ne peut se faire qu'in vivo, sur un modèle murin très immunodéprimé.
Objectifs
Le traitement des cancers des cellules du sang représente un enjeu majeur et dans ce contexte, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer ont récemment été développées en utilisant notre système de défense pour cibler et éliminer les tumeurs. Notamment, des immunothérapies basées sur l’injection de cellules immunitaires spécifiques de protéines tumorales, comme par exemple les approches utilisant des cellules T modifiées pour reconnaitre spécifiquement une tumeur, ont démontré leur potentiel thérapeutique, et sont maintenant approuvées en clinique pour certaines applications. Cependant des cas de résistances/rechutes pour ces patients restent trop nombreux et de nombreuses questions demeurent pour en comprendre les raisons et en conséquence, pouvoir optimiser la persistance et la réactivité des cellules T greffées chez ces patients. Dans ce projet, nous proposons de déterminer dans un modèle murin adapté : 1) l'efficacité anti-tumorales de cellules T humaines générées à partir d’échantillons de patients atteints de lymphome 2) de quelle manière le processus de préparation des cellules T et la nature de la tumeur, affectent le devenir et l’efficacité des cellules T greffées. Les résultats obtenus pourraient permettre une amélioration de l’efficacité de ces nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de notre projet sont tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans une réponse anti-tumorale efficace d’une population de cellules de notre système immunitaire, les cellules T. D’autre part, nous espérons que nos résultats auront pour conséquence l’amélioration dans un premier temps du traitement des lymphomes mais également, à plus long terme, d’autres types de cancers. Cette problématique reste en effet une problématique majeure puisque le traitement des cancers des cellules sanguines en général, et du lymphome en particulier, représente toujours un enjeu de santé majeur (plus de 5000 nouveaux cas/an dont 1/3 de cas réfractaires aux traitements de premières lignes). Dans ce contexte, comme indiqué ci-dessus, le développement de nouvelles stratégies anti-tumorales, basées sur les propriétés du système immunitaire pour cibler et éliminer les tumeurs, a permis d’améliorer les traitements contre le cancer et notamment les hémopathies. Ainsi, les traitements basés sur l’injection de cellules T anti-tumorales sont maintenant approuvés en clinique pour le traitement de différents cancers hématologiques tels que les leucémies ou les lymphomes. Toutefois, malgré des résultats spectaculaires, des formes réfractaires à cette approche persistent. Différentes explications peuvent être invoquées comme une faible/absence d’expansion des cellules T anti-tumorales après infusion, un défaut de persistance ou encore une altération de leur fonctionnalité. Ainsi, il est crucial de déterminer les causes de ces échecs afin d’optimiser l’efficacité de ces nouvelles thérapies pour cet enjeu majeur de santé publique. Ce projet permettra ainsi comme indiqué précédemment d’accroître nos connaissances sur les paramètres pouvant impacter l’efficacité des cellules T anti-tumorales et ainsi, identifier de nouvelles pistes pour optimiser cette approche thérapeutique prometteuse.
Procédures
Les animaux subiront différents types d'injections ou prélèvements pour lesquelles la douleur est faible à modérée et ne requièrent pas plus que quelques minutes par animal. Par souci du bien être animal et en fonction du type d'injection, l'intervention sera réalisée sous anesthésie ou contention appropriée de l'animal. En moyenne, un animal subira 1 à 2 injections ou prélèvements par semaine au cours d’une expérience.
Impact sur les animaux
Le protocole expérimental mis en place afin de répondre à nos objectifs peut induire une perte de poids transitoire chez l’animal. Les animaux seront observés et suivis régulièrement afin de détecter l’apparition de tout signe de douleur détaillée dans une fiche de suivi clinique (perte de poids, altération du comportement, de la qualité du poil, de la mobilité, …). En cas de souffrance de l'animal, l'expérimentation sera arrêtée.
Devenir
La totalité des animaux impliqués dans cette demande sera mise à mort en fin d'expérimentation afin de prélever les organes lymphoïdes et réaliser des analyses par cytométrie en flux et microscopie.
Remplacement
La caractérisation des effets anti-tumoraux des cellules T de patients modifiées ex vivo en parallèle du suivi du développement tumoral ne peut être abordé à ce stade qu’in vivo. Il n’existe pas d’approches in vitro ou in silico qui permettent de s’en affranchir. Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence de tumeurs. Toutefois, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront, dans une première phase, testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser, le nombre de conditions testées in vivo.
Réduction
Cette étude est basée sur les données de la littérature et l’expertise de nos collaborateurs dans la réalisation d’expériences comparables. Par ailleurs, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront dans une première phase testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser le nombre de conditions qui seront ensuite testées in vivo. Les modèles tumoraux utilisés dans cette étude permettent un suivi facilité du développement tumoral par bioluminescence et une limitation du nombre d’animaux utilisés. De plus, nous avons évalué en fonction des données connues, du degré d’hétérogénéité de la pathologie et de la prise des greffes, que le nombre d’animaux par groupe expérimental (n=8) permettait d’atteindre une puissance statistique suffisante. Les expériences proposées sont décrites en deux phases ce qui permettra de sélectionner et limiter les conditions à tester dans la deuxième phase et ajuster, si nécessaire, le nombre d’animaux requis. Par ailleurs, mâles et femelles pourront être utilisés dans ce projet afin d’optimiser au maximum l’utilisation des animaux. Enfin, les données obtenues seront systématiquement évaluées au moyen de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Durant les expériences, les animaux seront suivis quotidiennement par les zootechniciens et/ou chercheurs. Pour leur bien être et réduire le plus possible souffrance et angoisse, les animaux seront maintenus systématiquement à plusieurs par cage avec un enrichissement suffisant pour leur permettre de construire des nids et ainsi améliorer leur bien être. Afin d'évaluer la souffrance des animaux en expérimentation, la qualité du poil, la mobilité, la posture et le poids des souris seront monitorés (en utilisant une grille d'évaluation clinique). Une attention toute particulière sera portée à la perte de poids : ainsi, le poids des animaux sera mesuré régulièrement et un peu de nourriture humidifiée (et/ou substitut gélifié) sera déposé si besoin directement dans la cage afin d’éviter aux souris d’aller chercher en hauteur la nourriture et l’eau. L’expérimentation sera arrêtée immédiatement si un état de souffrance est détecté chez les animaux.
Choix des espèces
Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence ou en absence de tumeurs. Ces questions ne peuvent pas être abordées à l’heure actuelle au moyen de méthodes alternatives in vitro ou in silico, et demandent ainsi de faire appel à des modèles animaux, murins dans le cas présent, en raison des grandes similitudes du système immunitaire murin et humain. Par ailleurs, pour cette étude faisant appel au transfert adoptif de cellules T humaines, seul un modèle murin fortement immunodéprimé peut être utilisé. Dans cette optique, des animaux adultes males et femelles (agés de 8-15 semaines) seront utilisés pour les expérimentations proposées.
Evaluation de la fonction cardiaque après transfert de gène par vecteur AAV dans des modèles de rats
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une injection de vecteur de thérapie génique dans une veine, puis des prises de sang chaque semaine pendant six mois et des examens cardiaques mensuels, pour vérifier si ce traitement d'une maladie du foie provoque des effets sur le cœur. Le porteur indique ne pas attendre d'effet indésirable mais surveiller infarctus et troubles du rythme éventuels. Il affirme que tester la fonction cardiaque impose un animal vivant.
Objectifs
Notre projet a pour but de développer des solutions thérapeutiques pour patients atteints de glycogénose de type 1A (GSD1A), due à des mutations de la sous-unité catalytique de la glucose-6-phosphate (G6pc). La G6pc permet de fournir de l’énergie à tout l’organisme (sous forme de glucose) et de maintenir la glycémie lors d’un jeûne. La technologie de transfert de gène consiste à introduire un gène médicament dans les cellules malades cibles via un vecteur. Il existe plusieurs types de vecteurs, dont les vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV) qui sont aujourd’hui les plus utilisés et les plus prometteurs pour cibler le foie. Plusieurs équipes dont la nôtre ont déjà démontré l’efficacité de ce type de stratégie dans un modèle murin de la GSD1A (en cours de publication). Dans ce projet, nous voulons explorer l’expression de la G6pc dans le cœur et les conséquences sur la fonction cardiaque. En effet, l’AAV apporte la protéine G6pc dans le cœur, alors qu’il n’y est pas exprimé naturellement. L’expression cardiaque de la G6pc pourrait induire une surcharge en glucose. Or, il est connu que la surcharge en glucose conduit à une toxicité responsable de cardiomyopathies diabétiques. Afin de poursuivre le développement de notre produit, le projet présenté ici a pour but d’évaluer l’expression d’un ensemble de biomarqueurs tissulaires et fonctionnels permettant de détecter tous les signes de complications cardiaques. Nous utiliserons des rats, mâles et femelles, de 4 à 6 semaines.
Bénéfices attendus
La GSD1A touche 1 naissance sur 100 000 chaque année. Il n’y a à ce jour aucun traitement curatif sur le marché. Notre but est de développer une thérapie génique efficace pour traiter ces patients. Dans nos études chez le modèle murin de la GSD1A, nous avons mis en évidence une correction de la glycémie (les hypoglycémies sont les principales causes de décès chez les patients) et une diminution de la fréquence d’apparition des tumeurs grâce à notre vecteur AAV. Afin de poursuivre le développement de notre produit vers la clinique, nous devons déterminer s’il peut entraîner des effets indésirables dans le cœur. En effet, l’AAV est capable d’apporter la G6pc dans le cœur, or, cette protéine n’y est pas exprimée naturellement. Ces études nous permettront donc de déterminer si nos vecteurs AAV conduisent à l’apparition d’effets cardiaques indésirables.
Procédures
Tous les animaux seront injectés sous anesthésie gazeuse avec des vecteurs AAV au niveau de la veine caudale. Tous les animaux seront prélevés en sang, sous anesthésie gazeuse ou sur animal vigile selon le site de prélèvement, toutes les semaines pendant 6 mois. Les sites de prélèvements seront alternés (veine caudale, veine sous-mandibulaire droite ou gauche et veine rétro-orbitale droite ou gauche sous anesthésie). L’activité cardiaque sera mesurée mensuellement par électrocardiogramme sur animal vigile, et par échocardiogramme sur animal endormi par anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Lors nos études précédentes chez la souris, nous n’avons pas observé d’effet indésirable, cardiaque ou autre, ni de surmortalité chez les groupes traités par AAV. Nous ne nous attendons pas à une mortalité supérieure chez les rats traités par AAV. Néanmoins, ces complications cardiaques, si elles survenaient, pourraient être de trois types : infarctus (fibrose cardiaque), cardiomyopathie (hypertrophique ou dilatée) ou troubles primaires du rythme.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux n’est pas remplaçable pour réaliser cette étude car (1) il faut tester la fonction cardiaque sur animal vivant ; (2) il est nécessaire de tester nos produits sur un corps entier pour observer les effets simultanés sur le foie et sur le cœur ; et (3) il faut obtenir des fluides (sang, urine) pour mesurer les biomarqueurs.
Réduction
Afin d’utiliser un minimum d’animaux, nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat significatif nous permettant de répondre aux problématiques posée. Ce nombre minimum est respectée pour chaque procédure.
Raffinement
La taille des cages devrait permettre aux rats de démontrer des comportements importants pour leur qualité de vie : ils seront hébergés par 2 ou 3 individus (selon leur poids) de même âge, favorisant les comportements normaux de l’espèce, comme le jeu et les relations sociales (Pellis et coll., 2010). L’enrichissement des cages avec des éléments tels que des aménagements pour favoriser l’activité physique (structures pour grimper) ou se cacher / éviter le contact (tubes, séparateur), des matières pour permettre de creuser, des objets à mâcher (blocs en bois) etc… devraient limiter le stress des animaux, les rendre moins craintifs et moins agressifs et favoriser leur bien-être général (Botelho et coll., 2007; Patterson-Kane et coll., 1999). Dès leur arrivée en zone d'expérimentation (2 semaines avant le début des traitements), les rats seront manipulés et contentionnés au moins 3 fois avant le début de la procédure, afin d’être familiarisés aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Le rat étant très sensible au stress, cette habituation est importante. Ceci devrait réduire stress et angoisse. Avant chaque intervention, l’identification de l’animal doit être vérifiée et son état général observé avec attention. Les informations pertinentes pourront alors être notifiées sur une fiche d'évaluation. En effet, l'évaluation du comportement de l'animal et de ses signes cliniques doit être réalisée de manière minutieuse afin de détecter tout changement ou signes d'inconfort de stress ou de douleur. Après intervention, une surveillance minutieuse sera mise en place pour garantir que l’animal récupère pleinement de l’acte réalisé.
Choix des espèces
Les rats de type sauvage ont été choisis comme animaux modèles car ce modèle est plus sensible aux éventuels effets secondaires cardiaques que les modèles de souris (meilleure entrée du vecteur dans le cœur de rats que dans le cœur de souris). De plus, nous regardons l’expression supraphysiologique d’une protéine et ses conséquences au niveau cardiaque, nous n’avons donc pas besoin de rats modèles de la pathologie. Nous allons utiliser de jeunes rats et des rats adultes pour cette étude (4 et 6 semaines) Ce choix est basé sur trois considérations : 1) Nous souhaitons traiter de jeûnes adultes et des adultes lors des essais cliniques, nous voulons utiliser une population de rats « mimant » cet âge. 2) L’utilisation de rats de 4 ou 6 semaines nous permettra par comparaison d’évaluer l’effet de notre produit sur un cœur en développement. 3) Le foie est un tissu en forte croissance lors des premières semaines de vie chez le rongeur, entraînant ainsi une dilution du génome de l’AAV dans les hépatocytes ce qui a pour conséquence de réduire son efficacité au cours du temps, nous souhaitons donc minimiser cet effet en utilisant des rats dont le foie est suffisamment développé pour que la prolifération soit modérée. Selon les études précédentes réalisées au sein du laboratoire, des animaux de plus de 4 semaines peuvent être inclus.
Etude de l activité motrice de souris deficiente pour l’activité mitochondriale
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles courent sur un tapis roulant motorisé dix minutes par jour pendant quatre jours, et une partie reçoit une injection de fixateur sous anesthésie, pour mesurer l'effet d'une protéine sur l'activité motrice et le fonctionnement des mitochondries. Le porteur indique que le tapis peut provoquer un léger stress et de la fatigue. Il conduit une partie du projet sur des cellules in vitro et réserve l'animal aux tests d'effort et aux analyses de tissus.
Objectifs
Dans le cadre de notre projet nous nous intéressons à une famille de protéine, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, nous avons montré que des homologues de cette protéine possèdent la même fonction dans la régulation du métabolisme énergétique et nous avons donc mis en évidence un mécanisme original pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique, nous voulons étudier le rôle d’un des membres de cette famille de protéines selon 3 axes : 1-Tester l’impact de la protéine sur l’activité motrice de la souris puisque les attentes énergétiques engendrent des déficits musculaires et une intolérance à l’effort. Pour cela, nous souhaitons mesurer la vitesse roulant motorisé et l’endurance des souris à l’aide d’un tapis de course. La vitesse du tapis sera progressivement augmentée et l’activité locomotrice de l’animal sera monitorée grâce à une caméra hautes fréquences. 2-Nous voulons mesurer l’atteinte énergétiques au niveau des tissus par des tests biochimiques. 3- nous voulons voir les défauts d’organisation et de morphologie des usines énergétiques des tissus, les mitochondries) par des analyses histologiques.
Bénéfices attendus
La mitochondrie sont les usines de production d’énergie dans les tissues et elles sont donc nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Des déficits mitochondriaux induisent des pathologies sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, il est nécessaire de comprendre quelles sont les causes cellulaires de ces pathologies. Notre projet se place dans ce cadre. Nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une famille de protéines dans la production énergétique. La protéine que nous étudions dans ce projet fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille et cela permettra de développer des traitements pour ces pathologies à plus long terme.
Procédures
Concernant, les tests d'effort, les animaux seront placés sur un tapis roulant motorisé pour une durée maximale de 10 minutes pendant 4 jours consecutifs. De plus, 40 animaux seront soumis a une injection unique de fixateur de tissus. Ces injections se feront sur des animaux anesthésiés. Au total, cette intervention dure 15 minutes au total.
Impact sur les animaux
Le versant comportemental de notre étude est basé sur une analyse de la marche sur tapis roulant. Ce test peut engendré un stress leger chez l'animal du à la découverte de l appareillage. Ces tests de efforts pouvent engendrés de la fatigue physique. Pour ce qui est de la perfusion intracardiaque, la procédure réalisée sur animal anesthésié suit les normes et pratiques en vigueur.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses biochimiques et histologiques sur les tissus en postmortem.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests d'effort locomoteur (sur tapis roulant) et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et des voies de signalisation sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.
Réduction
D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro au niveau de l’organisme. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, les tests biochimiques (20 animaux) et histologiques (40 animaux) seront effectués à partir des tissus collectés sur les animaux évalués sur tapis roulant (60 animaux). Cette approche combinée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation du projet.
Raffinement
Nos souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle, au sein de laquelle le bien-être et la santé des animaux sont suivis quotidiennement, permettant de détecter toute anomalie physique ou comportementale potentiellement révélatrice de signes cliniques. Les animaux sont hébergés en cages collectives dans les conditions les mieux adaptées au modèle murin. Nos animaux sont hébergés en présence de raffinement spécifique permettant la création de nids (important pour les femelles gestantes et allaitantes) des tunnels en carton, qui leur servent à se cacher et à jouer. Dans le ,cadre spécifique de la procédure du projet, nous avons inclus une étape préalable d’habituation aux appareillages afin de limiter le stress et l'anxiété des animaux. Nous avons également établi des points limites objectifs et précoces permettant de mettre fin à toute procédure le cas échéant, et appliquons systématiquement un traitement analgésique et des mesures de soins lorsque nécessaire. L’ensemble des procédures est encadré et mis en oeuvre par du personnel dument formé et habilité aux méthodologies utilisées et au bien-être animal.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des animaux adultes âgés de 10 à 14 semaines. A cette période, les souris sont adultes et présentent la capacité d’activité élevée. Ainsi, il est plus facile d’observer des différences entre les phénotypes, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Imagerie de l’athérosclérose et de l’inflammation par des lipoprotéines marquées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
428 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour développer des plaques sous régime gras, elles reçoivent une injection de lipoprotéines marquées et, pour une partie, un agent inflammatoire, afin de tester une imagerie de l'athérosclérose. Le porteur indique mettre à mort 328 animaux pour prélever leurs tissus et transférer les 100 autres vers un autre établissement pour une imagerie sur corps entier. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet de suivre ces composés injectés dans l'organisme.
Objectifs
L’athérosclérose se caractérise par l’accumulation progressive de lipides dans la paroi des artères, conduisant à la formation de plaques d’athérome pouvant obstruer partiellement la lumière artérielle. Cette maladie peut rester longtemps silencieuse avant de provoquer un accident vasculaire provoqué par la rupture soudaine de la plaque, devenue instable car fragilisée par des phénomènes inflammatoires. La cause initiale de la formation des plaques d’athérome est le captage anormal de lipoprotéines, complexes transportant le cholestérol dans la circulation. On distingue ainsi des lipoprotéines de type LDL (« mauvais cholestérol ») ou HDL (« bon cholestérol »). LDL est HDL peuvent toutes deux être captées par les cellules présentes dans la paroi artérielle. Dans un projet précédent, nous avons développé un système de marquage bimodal permettant de suivre une molécule d’intérêt au niveau du corps entier (imagerie PET) et dans des biopsies de tissus (microscopie en fluorescence). L’objectif de ce projet est d’appliquer ce système de marquage aux lipoprotéines afin d’utiliser ces dernières comme nouveaux agents d’imagerie de l’athérosclérose sur corps entier et sur biopsies de plaques. Nous testerons nos lipoprotéines marquées sur deux modèles de souris génétiquement modifiées connus pour développer, sous régime riche en cholestérol, des plaques d’athérome d’étendue modérée (souris LDLRKO) ou importante (souris ApoEKO). Nous testerons également la capacité de nos lipoprotéines marquées à discriminer des plaques d’athérome stables (souris ApoEKO sans inflammation) ou instables (souris ApoEKO avec inflammation induite par injection de LPS).
Bénéfices attendus
L’athérosclérose est une des premières causes de mortalité dans les pays développés. Les techniques d’imagerie actuelle permettent de détecter des rétrécissements artériels ou des lésions artérielles avancées, mais sont limitées à des explorations dans des régions corporelles très restreintes et ne permettent pas de discriminer des plaques stables de plaques instables. Si nos lipoprotéines marquées s’avèrent efficaces elles permettraient, après transposition à l’humain, de détecter les plaques d’athérome de manière exhaustive et de prédire leur propension à se rompre. Cette nouvelle stratégie d’imagerie permettrait ainsi d’orienter de manière plus précise la prise en charge des patients tant au niveau des interventions chirurgicales que des traitements médicamenteux. A long terme, ces nouveaux traceurs permettraient notamment de diminuer le résiduel et les récidives d’accidents vasculaires qui persistent chez les patients à risque.
Procédures
Injection intraveineuse de traceur d’imagerie sur souris vigiles. Une seule fois, sur tous les animaux. Régime riche en graisse sous forme de croquettes fournies ad libitum durant 12 semaines pour 232 souris au total. Anesthésie gazeuse pour prélèvement sanguin terminal avant mise à mort sur 328 souris au total. Injection intrapéritonéale de sérum physiologique (« placebo ») ou d’un agent inflammatoire sur souris vigiles : 1 par jour pendant 5 jours. 40 souris placebo et 40 souris avec inflammation. Transport vers l’autre EU : stress lié au transport (5minutes). 100 souris au total.
Impact sur les animaux
Injection intraveineuse de lipoprotéines. Les composés injectés sont naturellement présents dans la circulation chez les vertébrés, donc leur injection ne devrait pas provoquer d’effet néfaste. Seule la contention liée à la procédure d’injection est susceptible de provoquer un inconfort chez les animaux. Régime riche en graisses. D’après nos expériences passées, le régime riche en graisse (croquettes ad libitum) donné aux souris durant les 12 semaines n’a pas d’effet indésirable sur les animaux, qui ont néanmoins un pelage d’aspect « gras ». L’athérosclérose induite après 12 semaines de régime est complètement asymptomatique et ne provoque aucune nuisance à l’animal. Injection d’un composé pro-inflammatoire. L’injection en elle-même est associée à un inconfort léger le temps de la contention. L’inflammation induite par ce composé est susceptible de générer une douleur modérée mais réversible au bout de 5 jours.
Devenir
Pour chacune des trois procédures, les prélèvements sanguins et de tissus (foie, intestin, rate, plaques d’athérome) impliquent la mise à mort des animaux sous anesthésie : 96 pour la procédure 1 ; 192 pour la procédure 2 ; et 40 pour la procédure 3. Les autres animaux sont transférés vers un autre EU à des fins d’imagerie sur corps entier : 20 pour la procédure 1 ; 40 pour la procédure 2 ; et 40 pour la procédure 3.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux pour ce projet visant à étudier le trajet dans l’organisme de composés administrés par voie veineuse et destinés à des applications d’imagerie sur corps entier et sur biopsies de tissus.
Réduction
Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature en termes de pharmacocinétique. Nos précédents projets de cinétiques utilisant des molécules portant des marqueurs bimodaux nous ont permis de connaitre les doses optimales à utiliser.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe (minimum 3 ou 4 par cage), dans des conditions standard avec enrichissement du milieu. Ils seront contrôlés quotidiennement. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel familiarisé aux souris, formé aux gestes techniques et au bien-être animal, en utilisant un appareillage de contention spécialement dédié. Elles seront effectuées hors des pièces d’hébergement pour ne pas générer un stress supplémentaire. Pour la plupart des animaux utilisés dans ce projet, l’intervention se limitera à une injection intraveineuse suivie d’une mise à mort sous anesthésie générale. Un petit nombre d’animaux recevra 5 injections intrapéritonéales visant à induire une inflammation modérée et feront l’objet d’un suivi particulier avec traitement de la douleur en cas d’apparition de signes de détresse. Tous les animaux seront surveillés après injection et ceux présentant des signes de détresse persistant au-delà de 24 heures (posture prostrée, contractions abdominales, masque de douleur, grognements) ou d’atteinte neurologique ou respiratoire (paralysie, suffocation) seront mis à mort sous anesthésie générale. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale avant mise à mort.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de choix en pharmacologie car ses grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’homme (fonction rénale, hépatique). Le rat ne développe pas de plaque d’athérome, même sous régime riche en graisses. Les lignées de souris génétiquement modifiées LDLRKO et ApoEKO sont les deux modèles de référence pour l’étude de cette pathologie avec deux degrés différents de sévérité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les composés d’intérêt étudiés ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de la plaque d’athérome. Du fait de la pathologie intervenant chez l’adulte, il est justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.
Mise au point d’un modèle murin d’hépatite alcoolique par la cytolysine
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Vingt-quatre reçoivent un régime alcoolisé pendant onze jours et des gavages répétés d'une bactérie productrice de toxine, pour mettre au point un modèle d'hépatite alcoolique jugé plus proche de la maladie humaine. Le porteur indique une perte de poids servant de point limite et une agressivité possible provoquant morsures et dépilations. Il affirme qu'aucune approche in vitro n'existe pour cette maladie et que l'animal est "indispensable".
Objectifs
L'hépatite aiguë alcoolique apparaît chez des patients consommant de l'alcool de manière chronique et excessive. La mortalité atteint 30 à 40% à 28 jours d'évolution. La cortisone, un anti-inflammatoire est le seul traitement validé mais son utilisation est limitée par l'absence de réponse au traitement dans 40% des cas, des potentiels effets secondaires et l'absence de bénéfice sur la mortalité au-delà de 28 jours. Ainsi, un nombre significatif de patients se retrouve sans alternatives thérapeutiques. A ce jour, les modèles murins disponibles sont imparfaits en raison d'une faible inflammation et d'une fibrose légère. Ces données sont ainsi très loin de la physiopathologie observée chez les patients atteints d'hépatite aiguë alcoolique. La bactérie Entéroccocus faecalis est présente dans le tractus gastro-intestinal des humains et chez certains animaux. Chez des patients atteints d'hépatite alcoolique aiguë, elle est notamment responsable de la production d'une toxine appelé cytolysine. Récemment, il a été démontré que cette toxine est responsable de la mort des cellules du foie, les hépatocytes et ainsi aggraverait le pronostic vital du patient. Le lien étroit entre cette maladie et le microbiote intestinal est due à l'induction d'une perméabilité intestinale accrue causée par une consommation aiguë et chronique d’éthanol. L'objectif du projet est d'utiliser un modèle murin d'alcoolisation chronique connu en ajoutant des gavages intragastriques à des temps précis de la souche bactérienne productrice de la toxine, la cytolysine. Cela permettra d'obtenir un modèle murin représentatif de la réalité médicale et permettra par la suite de valider des médicaments soignant la pathologie.
Bénéfices attendus
Aucun modèle actuel ne synthétise parfaitement les caractéristiques de l'hépatite aiguë alcoolique limitant la compréhension des mécanismes permettant le développement d'étude chez l'Homme. Le modèle que nous proposons de mettre au point se veut rapide (16 jours), reproductible (souches bien identifiées et purifiées de la bactérie) et transposable à l'homme. Par ailleurs ce modèle nous permettra de tester nos molécules d'intérêts que nous avions à ce jour testé sur les modèles connus mais imparfaits. Avec ce modèle plus pertinent, les résultats de cette étude pourront conduire au développement rapide d'études chez l'Homme.
Procédures
Toutes les souris (n=48) du protocoles vont bénéficier d'un régime alimentaire semi liquide pendant 16 jours. Ce régime sera alcoolisé ou non (11 jours sur 16) ce qui est une variation par rapport à leur standard d'alimentation lorsqu'il y a de l'alcool. Cette intervention à base d'alcool concernera 24 souris. L'appétence pour la texture semi liquide est très importante pour les souris qui l'apprécient. 24 animaux seront soumis à des gavages intragastriques à J6, J9, J12 et J15 de la souche E. faecalis pour les groupes 2 et 4. Les gavages intragastriques en termes de temps sont très court pour l'animal et ne représentent pas de douleurs. Les 24 autres souris ne subiront pas cette intervention.
Impact sur les animaux
Nous possédons une expertise du protocole murin d'alcoolisation. Les effets indésirables observables pour ce protocole sont la perte de poids qui représente le point limite. Une procédure de raffinement spécifique est mise en place pour permettre d'endiguer la perte de poids trop importante. Le gavage intragastrique par une souche bactérienne est une inconnue cependant nous nous sommes entourés d'un laboratoire de bactériologie. De plus, la concentration administrée à chaque gavage correspond à 10g de selles humaines soit des concentrations réalistes et acceptables. Le gavage de bactéries prévu est en quantité modeste et doit être répété car en quantité insuffisante pour coloniser la flore digestive des souris et induire une intoxication aiguë. Néanmoins, pour prévenir toute incertitude liée à la tolérance des ingestions répétées de bactéries par gavage, nous avons développé un score clinique de surveillance détaillé dans la partie raffinement et constituant un point limite. Les gavages intragastriques itératifs peuvent stresser l'animal, une procédure de raffinement est prévue. L'alcoolisation chronique peut entrainer une agressivité chez certaines souris dominatrices. Cette aggressivité n'est pas constante et ni spécifique de ce protocole. L'aggréssivité se manifeste en premier lieu par des lésons de dépilation ou de morsures qui restent modestes. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les souris agressives ou à l'inverse blessées seront isolées et soignées par soins locaux de bétadine. Cela ne constitue pas un point limite et la souris aggressive peut rester dans le protocole d'étude bien qu'elle soit isolée. Les maladies du foie comportent un large spectre allant de la stéatose jusqu'au cancer du foie. Des complications graves comme la jaunisse ou de l'accumulation de liquide dans l'abdomen (ascite) sont observées chez les patients malades. Ces stades ne sont pas retrouvés chez les modèles murins et ainsi ne représentent pas une nuisance potentielle.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour des analyses post mortem de différents organes (foie, rate, intestin).
Remplacement
A ce jour, il n'existe aucune approche in vitro pour étudier l'évolution d'une pathologie inflammatoire multifactorielle comme l'hépatite alcoolique et notamment le lien avec le microbiote intestinal en corrélant la présence de la cytolysine, la toxine produite par la bactérie Entéroccocus faecalis avec la mort des cellules du foie, les hépatocytes. Une étude chez un organisme vivant telle que la souris est indispensable pour pouvoir valider par la suite des études de phase 2 chez l'Homme.
Réduction
L'étude sera menée avec un nombre total de 48 jeunes souris adultes mâles pesant 18 à 20g, basé sur le calcul a priori du nombre de souris nécessaires tenant compte de la variabilité interindividuelle sur l'évolution de la pathologie hépatique. Ce nombre correspond au nombre de souris mâle permettant de former chaque groupe (n=12) au sein de l’étude statistiquement significatif.
Raffinement
Dès la réception, les animaux auront une période d'acclimatation d'une semaine pour s'adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l'air, ...) à leur bien-être. Une procédure d'estimation (avec des paramètres définis) et suppression de la souffrance sera mise en place. Les points limites de ce protocole concerne 1) la perte de poids de l'animal. Ainsi, une surveillance pondérale régulière (J0, J6, J8, J10, J15) et un protocole de raffinement spécifique est prévu (augmentation de la stimulation les conduisant à mieux s’alimenter, renutrition par des croquettes riches en protides). Dans les cas éventuellement graves, les animaux seront mis à mort selon le protocole en vigueur à l'animalerie. 2) Nous prévoyons d'utiliser un score de surveillance prenant en compte l'apparence, la mobilité, la réponse aux stimuli, l'ouverture des yeux, la froideur au toucher et la fréquence respiratoire. Un score élevé constitue un point limite. 3) En cas d'aggréssivité persistantes des animaux attesté par des morsures et lésions de dépilation, la souris dominante sera isolée pour prévenir toute éventualité d'aggravation des lésions. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des prélèvements d'organes seront effectués pour permettre de réaliser les analyses biochimiques et immuno-pathologiques.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est la souris C57BL/6. Ce choix a été motivé par l'expertise de l'équipe pour cet animal et cette souche pour la mise en place de modèle murin dans le cadre des maladies du foie. Ce choix nous permettra des comparaisons entre nos modèles et au niveau international avec les modèles en vigueur. De plus nous prévoyons l’utilisation future d’inhibiteurs de TREM-1 sur ce modèle s’il est probant. Le choix de l’espèce est ainsi étayé par l’existence d’un modèle transgénique KO-TREM-1. L’étude sera réalisée sur des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines au début du projet. Ce choix est motivé par l’analyse de travaux publiés dans des journaux scientifiques internationaux portant sur l’étude de l'hépatite aiguë alcoolique.