Rongeurs
Essai d’efficacité d’un vaccin contre le SARS-CoV2 sur un modèle hamster : évaluation comparée d’un procédé de haute purification antigénique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
50 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont vaccinés puis anesthésiés pour des prises de sang, avant d'être infectés par voie nasale avec un variant du SARS-CoV-2, pour comparer l'efficacité d'un vaccin candidat. Le porteur indique une perte de poids progressive attendue pendant les six jours suivant l'infection, sans autre symptôme ni décès non désiré selon lui. Tous les hamsters sont tués pour autopsie et collecte d'organes.
Objectifs
Les vaccins récemment développés contre le SARS-CoV-2 sont majoritairement destinés à générer une réponse anticorps vis-à-vis des protéines situées à la surface du virus. Avec un risque de mutation de ces protéines au cours du temps, l'efficacité des vaccins actuels pourrait s'en trouver diminuée. Par ailleurs la réponse anticorps contre cette protéine de surface, s'estompe dans le temps et pourrait ne plus être suffisante pour une protection à long terme nécessitant des rappels vaccinaux réguliers. Le présent projet se propose de poursuivre l'évaluation de l'efficacité d'un vaccin candidat produit à partir d’une protéine conservée au sein de la famille des coronavirus (protéine N), qui oriente la réponse immunitaire vers une réponse cellulaire (en plus de la production d'anticorps) en stimulant certaines catégories de cellules (les lymphocytes T) responsables de la destruction des cellules infectées. Ce projet constitue la quatrième phase d'une étude d'efficacité d'un vaccin candidat (3 études menées en 2021). Ici, l'antigène vaccinal a été obtenu par un nouveau procédé de haute purification afin d'être compatible avec des essais cliniques sur l'Homme prévus ultérieurement. Les objectifs de l'étude sont: 1/ Comparer les 2 formes d'antigène résultant de deux procédés de purification différents: DSP1 (ancien procédé ayant abouti au vaccin candidat évalué lors des 3 précédentes études) et DSP3 (nouveau procédé adapté aux Bonnes Pratiques de Fabrication). 2/ Evaluer l'efficacité du nouveau vaccin candidat combiné à un autre vaccin favorisant la réponse anticorps contre la protéine Spike du virus.
Bénéfices attendus
Une confirmation de l'efficacité du vaccin candidat obtenu grâce au nouveau procédé de haute purification de l'antigène permettra d'entrevoir la phase d'essais cliniques chez l'Homme.
Procédures
Tous les animaux seront : 1/ anesthésiés à J0 pour prise de sang par voie rétro-orbitale et vaccinés par voie intramusculaire avec l'une des formulations vaccinales choisies (durée totale= quelques minutes). 2/ vaccinés à J28 par voie intramusculaire avec l'une des formulations vaccinales choisies (quelques secondes). 3/ anesthésiés à J42 pour prise de sang par voie rétro-orbitale (durée = quelques minutes). 4/ anesthésiés à J56 pour infection par voie intranasale avec un variant du SARS-CoV2 (quelques minutes) 4/ anesthésiés à J60 (50% de l'effectif) ou J63 (50% de l'effectif) pour subir une prise de sang totale par voie intra-cardiaque, et une autopsie pour collecte d'organes (durée totale = environ 10/15 minutes)
Impact sur les animaux
Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période de 6 jours post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. A partir du 7ème jour post-infection, les animaux commencent à reprendre du poids.
Devenir
Les animaux de chaque procédure seront tous mis à mort pour autopsie puis collecte d'organes/sang.
Remplacement
Les évaluations de la réponse immunitaire post-vaccination et de l'efficacité vaccinale ne peuvent être conduites que sur modèle animal.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été défini de sorte à avoir 5 animaux à chaque temps de mise à mort qui est le minimum généralement requis pour obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs.
Raffinement
Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.
Choix des espèces
Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.
Evaluation de cibles et effet anti-leucémique et différentiateur de nouveaux composés dans la Leucémie Aigue Myéloïde sur lignées leucémiques murines et humaines et sur blastes issus de patients
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 772 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité tuée à l'issue et douze réutilisées. Des cellules de leucémie aiguë myéloïde, de lignées ou issues de patients, leur sont injectées, parfois directement dans le tibia sous anesthésie, pour évaluer de nouveaux traitements. Le porteur cite des effets attendus tels que douleur au point d'injection, douleurs chroniques, perte de poids et développement tumoral, et affirme qu'il n'existe "aucune autre méthode probante" pour remplacer l'animal en préclinique. Les souris sont tuées en fin de procédure pour analyse de l'implantation de la leucémie.
Objectifs
La Leucémie Aigüe Myéloïde (LAM) est une hémopathie maligne traitée principalement par chimiothérapie conventionnelle associé à une forte toxicité et un taux de rechute important. Le projet porte sur l’évaluation de nouveaux traitements et de nouvelles cibles dans les LAM préalablement identifiés et validés in vitro sur modèles cellulaires. Il n’existe actuellement aucune autre méthode probante se substituant à l’expérimentation animale pour les évaluations précliniques. Ce projet est développé par un laboratoire académique et financé dans les tutelles et des associations de lutte contre le cancer et les leucémies. L’étude in-vivo validera les cibles et les candidats médicaments dans des modèles murins C57BL/6 ou NOD-SCIG -gamma (NSG).
Bénéfices attendus
Les retombées du projet sont de valider les effets anti-leucémiques / différenciateurs de nouveaux composés à visée anti-tumorale et de valider de ouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans la leucémie aigue myéloïde.
Procédures
Certains animaux auront une injection en intra-tibial des cellules leucémiques sous anesthésique (isoflurane) et analgésique (buprenorphine). La durée de l'intervention est de 3 à 5 minutes et est effectuée en transcutané sans ouverture. Le nombre de souris minimum (mise au point et xénogreffes de cellules de patients PDX) sera au maximum de 572 animaux. Si les résultats des étapes de mise au point des modes d'injection (intra-péritonéal, intra-veineux ou intra-tibial) pour les lignées leucémiques humaines montrent la nécessité d'effectuer les procédures expérimentales en injection intra-tibiale, ce nombre passera au maximum à 1436 animaux.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont une possible une douleur transitoire au point d’injection, des douleurs chroniques, une perte de poids >15%, le développement excessif d'une tumeur ou grosseur au point d’injection sans que la charge tumorale n’excéde 10 % du poids normal de l'animal sujet aux expériences thérapeutiques, ou qui gêne les mouvements normaux de l’animal ou qui est ulcérée, la perte d’alimentation brutale ou encore une tension abdominale signe de splénomégalie ou d’ascite induisant une forte prise de poids et liée au développement de certains modèles de leucémies aigues myéoïdes, des tremblements, secousses, convulsions, boiteries ou décubitus permanent.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures pour analyse de l'implantation de la leucémie des modèles leucémiques ou des effets des traitements. Les souris controles seront trop agées à l'issues des procédures pour éventuellement être réutilisées dans les procédures d'implanation des cellules leucémiques.
Remplacement
L'objectif est d'évaluer les effets anti-cancéreux et/ou différentiateurs de nouveaux composés anti-cancéreux. La souris est le modèle animal le plus largement utilisé par la communauté scientifique en oncologie et étude de effets antitumoraux in vivo. Le modèle murin immunodéficient est le seul disponible pour la mise en place de modèles de leucémies induites à partir de lignées ou cellules humaines. Certaines lignées utilisées sont des lignées murines : le modèle murin syngénique sera alors utilisé.
Réduction
Le nombre d’animaux sera de 3 par groupe pour les étapes de mise au point des modèles et à 8 par groupe pour les expérimentations proprement dites, nombre modulé selon une évaluation statistique par tests non paramétriques pour atteindre une valeur statistique de p-value
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe afin d’éviter le stress de l’isolement et avec des enrichissements du milieu. Le personnel est compétent pour déterminer si l’animal n’est plus dans sa zone de confort et la Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) de notre plateforme garantit l’amélioration des soins et des conditions de vie des souris. Si l'un des points limites est atteint (perte de poids, détérioration irréversible de l’état de l’animal impactant sa survie, perte d’alimentation brutale, forte prise de poids, tremblements, secousses, convulsions, boiteries, décubitus permanent), l'animal sera euthanasié pour arrêter ou empêcher des souffrances.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le plus largement utilisé par la communauté scientifique en oncologie et étude des effets anti-tumoraux in vivo. Le modèle murin immunodéficient est le seul disponible pour la mise en place de modèles de leucémies induites à partir de lignées ou cellules humaines. Certaines lignées utilisées sont des lignées murines : le modèle murin syngénique doit alors être utilisé. Animaux injectés à 4-8 semaines (optimum de prise de leucémie décrit dans la littérature et validé antérieurement au laboratoire).
Etude chez la souris des effets neurophysiologiques d’une maladie causée par une mutation d’un canal calcique (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteuses d'une mutation d'un canal calcique décrite dans une maladie du cervelet de l'enfant, les souris de ce projet peuvent développer une atrophie du cervelet, une ataxie et des crises d'épilepsie de type absence. 438 souris vont être utilisées, 357 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 81 un niveau modéré. 294 passent pendant environ un mois des tests moteurs et cognitifs dits "standards" que le résumé ne nomme pas, dont 70 après une chirurgie stéréotaxique pour injecter un adénovirus qui déclenche l'expression du canal muté, 81 reçoivent des électrodes implantées dans le crâne pour un EEG de six heures par semaine pendant un mois, et 63 des séances d'échographie photoacoustique sous anesthésie. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau et leur cervelet.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation gain de fonction d’un canal calcique décrite dans une maladie cérébelleuse infantile. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation causale pourra être induite. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.
Bénéfices attendus
Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle du canal calcique dans le développement du cerveau, du cervelet en particulier. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.
Procédures
Pour ce projet, 294 animaux seront évalués pour leurs capacités motrices et cognitives dans des tests standards. 70 animaux subiront une injection i.v. d'adénovirus codant pour la cre recombinase par chirurgie « stéréotaxique » pour induire l'expression du canal calcique mutant dans le cerveau et le cervelet. Les autres animaux évalués dans cette 'procédure comportementale' sont issus de croisements permettant une expression conditionnelle de la mutation du canal. Ces différents tests, potentiellement générateurs de stress, se dérouleront sur une période d'environ 1 mois. 81 animaux subiront une chirurgie pour l'implantation crânienne d'électrodes pour l'enregistrement d’électroencéphalogramme (EEG). Sur ces animaux, l'EEG sera enregistré sur une période d'environ 1 mois, à raison d'une séance de 6 heures par semaine. 63 animaux participeront à une étude longitudinale des paramètres anatomofonctionnels par échographie photoacoustique du cerveau et du cervelet. Les mesures seront réalisées lors de courtes séances (15 min) d'acquisition sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des défauts neurologiques précoces qui vont résulter en une atrophie cérébelleuse et des troubles fonctionnels cérébelleux de type ataxie, ainsi que des crises épileptiques de type généralisée (absence). Nos procédures expérimentales pourront conduire à des effets indésirables. (i) les études comportementales du suivi locomoteur de l'ataxie pourront résulter en un stress des animaux lié à la préhension manuelle et la découverte de l'environnement expérimental que nous atténuerons par une habituation de ces animaux aux dites procédures. (ii) le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution des éventuelles dysmorphies cérébrales et cérébelleuses est une approche non invasive et non douloureuse. Comme en (i), le stress subi par les animaux se limite à la préhension par l'expérimentateur pour une courte période (15 min/animal). (iii) Le suivi du phénotype épileptique par enregistrement électroencéphalographique (EEG) peut induire une douleur modérée puisqu'il implique une chirurgie pour la pose d'électrodes intracraniennes.
Devenir
L'ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse physio/pathophysiologique de l'ataxie cérébelleuse. Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) ne pouvant être réalisées sur les modèles in vitro et in silico de la pathologie. Les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur l'activité du canal calcique seront étudiées dans des expériences d'électrophysiologie sur lignées cellulaires et des approches in silico seront développées pour modéliser les conséquences de cette mutation sur l'excitabilité neuronale. Ces stratégies in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact du canal muté à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau, puisque les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. Quant aux études phénotypiques, par exemple les conséquences motrices d'anomalies du cervelet, elles nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 438) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement relevant. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Nous réaliserons dans la mesure du possible l'expérimentation comportementale (in vivo), et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique et pour les scores les plus important, la mise à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par la recombinase Cre (lignées de souris driver, injection de virus codant pour la recombinase Cre) est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation de jeunes adultes et d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation d'intérêt, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.
Caractérisation in vivo de nanoparticules scintillatrices
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 265
750 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des tumeurs de glioblastome ou pancréatiques leur sont implantées, suivies d'injections de nanoparticules et de prélèvements sanguins répétés, pour tester la distribution de ces nanoparticules et leur accumulation dans les tumeurs en vue d'améliorer la radiothérapie. Le porteur cite comme effets attendus l'immunodéficience des souris, les douleurs des injections et le stress des contentions et anesthésies. Les animaux sont ensuite tués sous anesthésie pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Le but de ce projet est d’améliorer l’efficacité de la radiothérapie en utillisant des nanoparticules scintillatrices. L'objectif de l'étude proposée ici est de tester la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique, leur potentiel à s'accumuler dans les tumeurs, ainsi que le délai d'injection qui permet une accumulation optimale des composés dans les tumeurs. Les nanoparticules utilisées seront fluorescentes (fluorescence intrinsèque ou nanoparticules marquées avec un fluorophore). Dans ce cadre, nous prévoyons l'étude in vivo de 10 nanoparticules (5 nanoparticules pour des modèles de glioblastome et 5 nanoparticules pour des modèles pancréatiques). Nous étudierons deux modèles de glioblastomes (un modèle sous cutané implanté chez la souris et un modèle orthotopique implanté chez le rat) et deux modèles pancréatiques (un modèle sous cutané et un modèle orthotopique implanté chez la souris).
Bénéfices attendus
Nous espérons démontrer le bénéfice d'un nouveau mode de radiothérapie, basé sur des nanoparticules qui boostent l'effet de la radiothérapie, dans des modèles particulièrement agressifs et pour lesquels trop peu de solutions thérapeutiques existent. En cas de succès, ce type de traitement pourrait être proposé pour un grand nombre de pathologies tumorales.
Procédures
Pour l'étude 1: Du sang sera prélevé à différents temps après injection ( 30 minutes / 7 Jours / 14 Jours ) pour analyses ex vivo. Les prélèvement seront de 200μL pour les souris et 500μL pour les rats. Pour l'étude 2: Les prélèvements seront effectués 15 min après l'injection, puis à 1h, 2h, 3h, 5h et 7 heures post-injection. La quantité totale de sang prélevé sera d'environ 180μL soit moins de 1% du poids total de nos souris et moins de 1 millième du poids de nos rats. La mesure de 24h sera réalisée avec le sang récupéré lors du sacrifice. Pour l'étude 4: 500uL de sang seront prélevés dans la veine caudale des rats 5 heures et 24 heures après l’injection de nanoparticules. Ce volume total représente moins de 10% du volume de sang de nos rats et ne devrait ainsi pas entraîner de contraintes pour l’animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sont : immunodéficience des souris, douleurs et conséquences des injections sous-cutanées, orthotopiques et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies.
Devenir
Euthanasie sous anesthésie générale gazeuse (Isoflurane 4%) de l'ensemble des souris avec prélèvements de pièces anatomiques/organes/sang. L'euthanasie des rats sera effectuée par injection intra-cardiale de barbituriques (Exagon 1ml/kg) sous anesthésie gazeuse, avant le prélèvement de pièces anatomiques.
Remplacement
Ce projet a été initié depuis 2017. Afin de réduire le nombre de composés à évaluer, beaucoup d'essais visant à évaluer les caractéristiques des nanoparticules ont été réalisés en solution. L’ensemble des nanoparticules testées in vivo aura été préalablement testé et validé in vitro sur des cultures de cellules tumorales (2D / 3D). Seules les molécules les plus performantes seront testées chez l’animal. Cette étape d’expérimentation animale permet de progresser dans la mise au point de nouvelles thérapies anti-tumorales et de procéder à leur évaluation pré-clinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour réaliser ce travail.
Réduction
La stratégie de réduction a été réalisée grâce aux études préliminaires in vitro. De plus, nous avons choisi de réaliser les expériences de cinétique sanguine et de biodistribution avec 6 animaux par groupe pour obtenir des résultats statistiquement fiables (ANOVA). Afin d'employer au mieux les animaux, les protocoles présentés ont été optimisés afin d'obtenir le maximum d'informations sans augmenter la douleur infligée aux animaux. La collection d'échantillons post-mortem permettra notamment des études à postériori des organes.
Raffinement
Des mesures de raffinement ont été prises afin de réduire la douleur, la soufrance et l'angoisse notament en mettant en place des points limites. De plus, toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effectuées sous anesthésie gazeuze, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation.
Choix des espèces
Les souris Nudes permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ce modèle de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Les rats sont intéressants dans notre cas du fait de leur taille plus importante ; les injection intracérébrales sont plus faciles à mettre en œuvre de façon fiable et reproductible. Souris nudes de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK natural killer à l’âge de 8 semaines. Rats Fischer mâles de 6-8 semaines. Les rats mâles sont utilisés entre 6 à 8 semaines après la naissance, ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés mais néanmoins disponibles en plus grande série chez les éleveurs agréés. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficiles à gérer en animalerie.
Etude de l’effet d’un traitement prenatal avec la cholestyramine et/ou la vitamine E sur le rôle du placenta dans le développement de l’athérosclérose chez la descendance adulte de souris ApoE-/- traitées.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles génétiquement prédisposées à l'athérosclérose sont accouplées, reçoivent un traitement pendant la gestation et subissent des prélèvements de sang répétés, pour étudier l'effet d'un traitement prénatal sur l'athérosclérose de leur descendance. Le porteur affirme que la molécule employée n'a montré aucun effet indésirable ni sur les mères ni sur les petits dans ses essais antérieurs. Les femelles sont tuées au jour 18,5 de gestation pour prélever les placentas et les fœtus.
Objectifs
L’athérosclérose est la première cause de mortalité dans le monde. Les facteurs de risque associés à l’athérosclérose sont bien connus, le principal étant l’hypercholestérolémie. Cependant, ces facteurs n’expliquent pas toujours les variations inter-individuelles. Selon l’hypothèse de Barker formulée en 1993, des facteurs environnementaux agissant durant la période fœtale et périnatale peuvent induire des altérations prédisposant au développement de maladies cardiovasculaires plus tard dans la vie adulte. Des études chez l’homme et l’animal montrent que la présence d’une hypercholestérolémie chez la mère pendant la grossesse/gestation pourrait avoir un impact sur le développement de l’athérosclérose chez la descendance. Pendant la grossesse, le cholestérol peut augmenter jusqu’à 1,5 fois. Cette augmentation, bien que nécessaire au développement du fœtus, pourrait induire une empreinte expliquant le développement précoce de l’athérosclérose chez la descendance. Cette hypercholestérolémie gestationnelle, génère également un stress oxydant qui peut s’avérer délétère pour l’homéostasie vasculaire. Nous avons montré que la souris ApoE-/-, génétiquement programmée pour développer spontanément de l’athérosclérose, en développe moins quand elle est née de mère normocholestérolémique . Dans une étude en cours, nous avons montré qu’un traitement, avec un hypocholestérolémiant et/ou un antioxydant, pendant la gestation diminue le développement de l’athérosclérose. (Résultats en cours de rédaction pour publication) Étant donné que les mères sont traitées durant leur gestation ou gestation et lactation alors que les descendants des différents groupes étaient maintenus sous régime contrôle pendant 25 semaines, notre hypothèse que ces traitements périnataux sont responsables d’une modification de l’expression de transporteurs et d’enzymes impliqués dans la fonction placentaire aboutissant à la protection des descendants de mères traitées avec ces molécules. L’objectif de ce projet est donc d’étudier l’effet d’un traitement périnatal avec un hypocholestérolémiant) et/ou un antioxydant sur la fonction placentaire afin d’expliquer la protection contre la progression de l’athérosclérose chez la descendance adulte de souris ApoE-/- traitées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle du placenta dans le développement de l’athérosclérose de la descendance en cas d’hypercholestérolémie génétique. Les études ont montré les effets délétères du stress oxydant, entrainé par une hypercholestérolémie, sur le développement placentaire et par conséquent fœtal dès l’étape d’implantation. L’étude histologique du placenta envisagée permettra de visualiser la surface occupée ainsi que la vascularisation des différentes zones de placentas de mères recevant ou pas le traitement. Nous nous servirons de l’analyse des résultats issus à la fin de cette étude pour expliquer l’effet protecteur des 2 traitements en périnatal contre le développement de l’athérosclérose chez la descendance adulte à 25 semaines d’âge chez la souris ApoE-/- hypercholesterolémiques que nous avons récemment observé.
Procédures
Les premiers prélèvements sanguins seront effectués au démarrage du protocole puis pendant la gestation pour suivre la cholestérolémie des mères: - 1 prélèvement de sang (50 μL,
Impact sur les animaux
La cholestyramine est un médicament prescrit pour l’Homme dans le cas d’hypercholestérolémie. Chez la souris, les études n’ont montré aucun effet tératogène de la molécule. Nous avons utilisé une dose similaire de la molécule (3% de la masse du régime) pendant des périodes de gestation et nous n’avons noté aucun effet indésirable : ni perte de poids, ni diarrhée chez les mères. Aucun effet sur le développement des descendants est noté. La dose de supplémentation en vitamine E (2200 UI/kg de régime) est conforme aux doses quotidiennes recommandées. Cette dose était déjà utilisée sans effets indésirables sur les mères ni les descendants. Les prélèvements chez les femelles gestantes sont réalisés au niveau de la queue et sous anesthésie locale (lidocaïne 2% sous forme de pommade) en utilisant des microvettes à capillaire pour assurer la rapidité et l’efficacité de ces prélèvements. Les femelles gestantes subiront une douleur légère associée aux prises de sang.
Devenir
Dans la littérature, les différences placentaires et fœtales entre la première portée et les portées suivantes (deuxième portée, troisième portée…) sont bien décrites chez la souris ainsi que chez d’autres espèces. Comme nous avons choisi de s’intéresser qu’à la première portée, les femelles seront mises à mort au jour 18.5 de gestation afin de collecter les placentas pour des analyses histologiques et moléculaires. Les foetus au jour 18.5 de gestation afin de collecter le foie et faire des analyses du métabolisme de cholestérol.
Remplacement
Seule une étude in vivo, c’est-à-dire incluant la complexité des mécanismes physiologiques lors de la gestation mis en jeu lors du développement de maladies cardiovasculaires en période périnatale, peut permettre d’atteindre l’objectif de ce projet. Aucune méthode de remplacement ne peut donc être employée.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (80 femelles) pour permettre une bonne évaluation statistique d’une intervention nutritionnelle entre différents groupes indépendants sur le développement de l’athérosclérose (test ANOVA et Kruskal-Wallis)
Raffinement
Les animaux ne subiront que très peu de contraintes et la douleur sera minimisée. Les cages seront enrichies (frisottis), les rares prélèvements de sang seront effectués au niveau de la queue ou de la veine submandibulaire sous anesthésie à l’isoflurane des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter toute souffrance. Dans le cas d’une perte de poids, d’une modification de la prise alimentaire, de l’apparence générale ou du comportement, la surveillance sera accentuée et les souris seront soignées et/ou placées sous antidouleurs (buprénorphine à 0.05 mg/kg en sous cutanée pour le palier 1, 0,1mg/kg pour le palier 2 et euthanasie en présence de 3 signes notables) afin de minimiser toute souffrance, détresse ou inconfort. Les prélèvements de sang seront stoppés momentanément jusqu’au rétablissement de l’animal. Enfin, si l’animal ne parvenait pas à se rétablir, la mise à mort sera réalisée (annexe points limites).
Choix des espèces
La souris est un modèle adéquat car c’est une espèce docile et facile à manipuler possédant une période de gestation courte. Première lignée murine à avoir été séquencée, la souris C57BL/6 offre une documentation importante, facilitant les études génétiques. C’est également une lignée stable et c’est la souche la plus utilisée en ce qui concerne l’étude des maladies métaboliques et cardiovasculaires. Le modèle ApoE-/- est hypercholestérolémique, présente un profil lipidique proche de celui de l’homme et développe spontanément des plaques d’athérosclérose, similaires à celles de l’humain. Cela en fait un modèle de choix pour l’étude de l’athérosclérose. L’efficacité des traitements envisagés a été déjà démontré dans ce modèle de souris. Des souris ApoE-/- femelles âgées de 8 semaines environ seront utilisés pour la reproduction pour les différentes conditions étudiées. Les premiers prélèvements sanguins seront effectués au démarrage du protocole puis pendant la gestation pour suivre la cholestérolémie des mères: - 1 prélèvement de sang (50 μL,
Développement de nouvelles capsides et de nouveaux promoteurs pour augmenter la spécificité tissulaire des produits de thérapie génique par vecteur adéno-associé
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique puis des prélèvements de sang répétés sous anesthésie, certaines souris modèles de la maladie de Pompe développant une faiblesse musculaire évaluée par un test de force, pour optimiser le ciblage tissulaire de ces vecteurs. Le porteur signale une douleur possible à l'injection et un risque de cannibalisme chez les nouveau-nées. Toutes les souris sont tuées par dislocation cervicale pour analyser la distribution des vecteurs dans les organes.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but de développer des outils de thérapie génique pour améliorer les traitements de maladies rares. La thérapie génique est un outil de plus en plus utilisé pour le traitement d’un grand panel de pathologies génétiques (maladies hépatiques, musculaires, neurologiques, etc.), il est donc important de cibler spécifiquement les tissus touchés par telles ou telles pathologies. Néanmoins, certaines difficultés restent à être surmontées et d’autres points peuvent être améliorés. L'objectif de ce projet est d'optimiser un vecteur de thérapie génique, l'AAV (virus adéno-associé), afin de le rendre plus efficace et plus spécifique pour l'organe à traiter dans le cadre de la maladie. Pour cela, nous allons travailler sur deux éléments du vecteur : la capside, la partie externe du vecteur responsable du ciblage des organes, et le promoteur, un élément qui permet l'expression du gène thérapeutique (le transgène) dans l'organe à traiter. Ce projet utilisera des souris saines pour sélectionner les meilleures capsides et promoteurs, qui seront ensuite validés sur des souris adultes et juvéniles atteintes de la maladie de Pompe pour tester leur efficacité thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier les meilleurs vecteurs AAV pour cibler de manière spécifique les organes couramment touchés par les maladies génétiques : le foie, les muscles et le système nerveux central. Le développement de vecteurs optimisés pour le(s) organe(s) cible(s) permettra de réduire la dose de vecteur nécessaire pour atteindre l'effet thérapeutique et ainsi diminuer le risque d'effets indésirables du traitement (e.g. la réponse immunitaire contre le vecteur).
Procédures
L’injection intraveineuse des vecteurs dans la veine caudale pour les souris adulte ou dans la veine temporale pour les souris juvénile sera effectuée une seule fois au début de l'étude. Le prélèvement de sang sur les souris adultes sera réalisé sous anesthésie au niveau de la veine faciale à 1, 4, 7, 15, 30, 45 et 60 jours post-injection et après une fois par mois. Les souris juvéniles seront prélevées une fois par mois. Un test d’évaluation fonctionnel (grip test) sera réalisé sur les souris atteintes de la maladie de Pompe à 3 mois et 6 mois post-injection afin de vérifier l'efficacité du vecteur.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir une douleur instantanée due à l'injection du vecteur. Le stress de la manipulation peut durer jusqu'à 30 secondes. La prise de sang sera réalisée sous anesthésie, la souris ne ressentira donc aucune douleur, mais la manipulation (environ 1 minute) pourra être un facteur de stress. Les souris modèle de la pathologie de Pompe pouvaient développer le phénotype pathologique progressive (faiblesse musculaire) au cours des derniers mois de l'étude. Un risque de cannibalisme pourrait être observé chez les souris nouveau-nées.
Devenir
Tous les animaux sains utilisés pour la sélection des meilleures capsides et promoteurs seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin des procédures expérimentales afin de prélever des organes et analyser la biodistribution et l'efficacité des vecteurs dans les différents tissus. Toutes les souris atteintes de la maladie de Pompe utilisées pour tester l'efficacité thérapeutique des meilleures combinaisons capside-promoteur seront euthanasiées par dislocation cervicale à la fin des procédures expérimentales afin de prélever des organes et analyser la biodistribution et l'efficacité des vecteurs dans les différents tissus. Une procédure d'élevage de souris atteintes de la maladie de la Pompe est prévue dans cette étude, les souris de cette procédure seront utilisées dans les procédures expérimentales.
Remplacement
Afin de limiter au maximum le nombre de souris utilisé, nous avons réalisé un premier tri parmi notre liste des capsides et des promoteurs grâce à l'utilisation de culture cellulaire. Ces premiers tests nous ont permis de mettre en évidence 80 capsides et 50 promoteurs intéressants. Néanmoins, nous devons approfondir ces résultats en mesurant l’efficacité de ces traitements sur un organisme entier, pouvant réagir contre ce traitement (réponse immunitaire) et également mesurer sont efficacité de traitement d'une maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. Pour le garantir, nous avons établi une approche statistique autour du paramètre d’intérêt commun mesurable dans toutes les procédures : l’expression de notre transgène. Nous utiliserons 6 souris/groupe pour nous donner la possibilité de détecter une augmentation significative du transgène. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (798 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats. Les souris souffrant de la maladie de Pompe seront utilisées en dernier recours, afin de valider nos meilleurs candidats (252 souris).
Raffinement
Nous allons tout mettre en œuvre pour maximiser le bien-être des animaux (limitation du nombre de souris par cage, enrichissement des cages, limiter le stress lors de la manipulation des animaux, etc.). Chaque geste expérimental réalisé sur les animaux (injections et prise de sang) sera réalisé par du personnel formé, la mise en place d'anesthésies et des mesures de récupération (surveillance accrue des souris, utilisation de plaque chauffante jusqu'au réveil, etc.) seront utilisées lors de des prises de sang. Le prélèvement de sang sera réalisé au niveau de la veine faciale sur des souris préalablement anesthésiées afin de diminuer leur stress. L’injection intraveineuse des vecteurs dans la veine caudale sera réalisée après avoir favorisé la dilatation des veines (sous une source de chaleur) pour un maximum d’efficacité et de rapidité d’intervention sur l’animal, pour limiter le temps de passage en boîte de contention nécessaire à l’injection dans la queue.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux disponibles pour la maladie de Pompe (bovins, chats, moutons et caille), la souris Gaa-/- [B6;129-Gaatm1Rabn/J] est l'espèce animale la plus facile à produire. Elle reproduit la maladie de Pompe, car elle ne montre aucune activité enzymatique de GAA (dans le sang et dans les tissus), elle présente une accumulation de glycogène dans tous les tissus et l'activité locomotrice des souris est altérée. De plus, nous disposons déjà de ce modèle dans notre animalerie et nous disposons de toutes les techniques pour mesurer la réversion du phénotype liée à la pathologie. La maladie de Pompe est une maladie liée à une accumulation de glycogène dans différents tissus (foie, muscles, système nerveux central, etc.). Les outils développés ont pour but d’augmenter l’efficacité du traitement déjà disponible afin de réduire la dose de vecteur injecté. 1) Certaines souris seront injectées à l’âge adulte (4 mois) ; âge où les premiers symptômes de la maladie de Pompe apparaissent pour la colonie de souris Gaa-/-. Cette approche permettra de tester si notre stratégie permet de traiter la pathologie sur les organes matures. 2) D’autres souris seront injectées à la naissance (0-2 jours). Cette approche permettra de déterminer si notre stratégie perdure dans le temps malgré la croissance des souris et des différents tissus, notamment le foie. Les souris saines utilisés pour la sélection des meilleures capsides et promoteurs seront injectées à 6 semaines, âge pour lequel la souris est considérée comme adulte.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une toxine, la 6-OHDA, leur est injectée dans le cerveau sous anesthésie pour détruire des neurones et reproduire une maladie de Parkinson, avant l'administration d'apomorphine, d'amphétamine ou de L-DOPA et une série de tests d'activité et de coordination motrices, pour évaluer des candidats-médicaments. Le porteur indique une perte de poids possible après l'anesthésie, corrigée par des gels nutritifs. Les rats sont ensuite tués pour prélever le cerveau et mesurer la lésion.
Objectifs
Chez l’homme, la maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente après la maladie d’Alzheimer. Elle touche actuellement plus de 10 millions de personnes dans le monde et son impact socio-économique est en constante augmentation due à l’allongement de la durée de vie. La maladie de Parkinson se caractérise par l’apparition de troubles moteurs importants causés par la mort des neurones dopaminergiques dans une région particulière du cerveau appelée substance noire compacte. Actuellement, le traitement de référence de cette maladie est la lévodopa (ou L-DOPA) qui permet de compenser la diminution de dopamine dans cette région du cerveau. Toutefois, bien que ce traitement soit très efficace durant les premières années , ce qui est couramment comparé à une « lune de miel », ces patients voient rapidement apparaitre des mouvements involontaires anormaux appelés dyskinésies qui vont impacter très fortement leur qualité de vie. Dans ce contexte, il est capital de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cette maladie. Les objectifs de ce projet sont de modéliser la maladie de Parkinson en injectant la 6-OHDA un analogue de la dopamine dans le cerveau de rat afin de reproduire la destruction sélective des neurones dopaminergiques de la substance noire compacte. Après une récupération post-opératoire de 3 semaines, les animaux seront traités de façon chronique à la L-DOPA pendant 3 semaines afin de reproduire les dyskinésies observées chez l’homme. Nous pourrons ainsi évaluer l’effet de candidats-médicaments sur les symptômes moteurs de ce modèle de la maladie de Parkinson ainsi que sur les dyskinésies induites par la L-DOPA en utilisant différents tests de comportement.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la mise au point de nouveaux médicaments pour traiter la maladie de Parkinson chez l’homme, qui concerne plus de 10 millions de personnes dans le monde à l’heure actuelle. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendus.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet sera soumis à une anesthésie générale permettant l’injection de 6-OHDA dans le cerveau. Trois semaines après l'anesthésie, une administration périphérique d'apomorphine et/ou amphétamine sera réalisée afin de vérifier la présence de problèmes moteurs de type parkinsonien via des . Dans certains cas, un groupe d’animaux recevra également de la L-DOPA, le traitement de référence de la maladie de Parkinson chez l’homme afin d’induire des dyskinésies. Des candidats-médicaments seront administrés aux animaux durant l’étude afin d’évaluer leurs effets sur les symptômes moteurs du modèle. Les animaux seront testés dans différents tests de comportements (activité spontanée, fonction motrice, coordination motrice, évaluation des dyskinésies). Les animaux (vigiles ou anesthésiés) pourront également être soumis à des prélèvements de sang.
Impact sur les animaux
La procédure d’injection dans le cerveau est composée d’un protocole anesthésique et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. Dans les premiers jours après l’anesthésie générale, une perte de poids transitoire peut être observée et sera rapidement corrigée grâce à l’utilisation d’aliments riches et faciles à consommer tels que des gels nutritifs. Trois semaines après l’anesthésie générale, une administration périphérique d'apomorphine et/ou d'amphétamine permettra de mettre en évidence les symptômes moteurs de type parkinsonien via des tests de comportement. Les animaux vont ainsi tourner en rond quelques heures. Par la suite, certains animaux recevront une piqûre quotidienne de L-DOPA afin d’induire des mouvements involontaires comme ceux rencontrés chez les patients traités au L-DOPA. Les animaux vont ainsi présenter des mouvements anormaux comme des rotations ou des mouvements involontaires pendant quelques heures. Les effets potentiellement indésirables des candidats-médicaments qui seront testés dans ce modèle feront l’objet d’échange avec les inventeurs du médicament et les responsables du bien-être animal afin d’adapter les outils d’observations des animaux pour permettre la mise en place de traitements des potentiels signes cliniques. L’administration et le prélèvement de sang seront effectués par un personnel entraîné et la douleur associée sera réduite à son minimum et sera l’équivalent d’une piqure.
Devenir
A l’issue des tests de comportements, les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes, comme le cerveau, ce qui permettra d'évaluer la lésion cérébrale réalisée et l'éventuel impact d’un candidat-médicament sur cette lésion. Les animaux seraient également euthanasiés si des effets indésirables étaient provoqués par les candidats-médicaments et atteindraient les points limites fixés.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson ou sur les dyskinésies induites par le traitement de référence, la L-DOPA. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
En se basant sur la littérature et une évaluation rétrospective de notre précédent projet, nous avons été en mesure d’établir un nombre minimal et suffisant d’animaux requis afin d’obtenir des résultats rigoureux et significativement pertinent. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours aux procédures les moins invasives possibles, la détermination des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, un protocole analgésique adapté pour l’injection et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux.
Choix des espèces
Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un candidat-médicament sur les symptômes liés à la maladie de Parkinson. En effet, pour modéliser la physiopathologie associée à la maladie de Parkinson nous avons besoin d’un organisme entier afin de réaliser une évaluation comportementale avec des tests fiables, reproductibles, validés et reconnus par la communauté scientifique. Ce projet utilisera uniquement des animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Formation aux gestes techniques et chirurgicaux pour les études portant sur l’AVC
- Formation professionnelle
Rats : 100
2 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit un cathéter veineux puis sert à provoquer un accident vasculaire cérébral par thrombine, chlorure de fer ou électrocoagulation, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des expérimentateurs aux gestes techniques et chirurgicaux. Le porteur présente cette formation comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux utilisés dans les études de l'établissement. Les animaux sont tués par perfusion transcardiaque après imagerie.
Objectifs
L'AVC est une maladie qui survient de manière inattendue et a une issue désastreuse. Environ 17 millions de personnes connaîtront un épisode d'AVC chaque année dans le monde, dont 60% gardent des séquelles neurologiques, tandis que 40 % des cas entraîneront la mort. La thrombolyse avec l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant intraveineux (rtPA) est le seul traitement médicamenteux approuvé pour les patients ayant subi un AVC ischémique aigu, mais son utilisation est limitée par une fenêtre thérapeutique étroite, une efficacité sélective et des complications hémorragiques. Les projets associés à cette pathologie qui sont réalisés dans l'établissement utilisent des techniques méritant un apprentissage pour acquérir la finesse des gestes techniques et chirurgicaux. Cette formation pratique aura pour résultat de réduire le nombre d'animaux des groupes expérimentaux associés aux projets ultérieurs grâce à une meilleure reproductibilité des gestes chirurgicaux des expérimentateurs ainsi qu'une meilleure prise en charge du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Cette stratégie d'apprentissage a pour but d'améliorer les résultats des projets précliniques sur les AVC. Le nombre d'animaux utilisés dans les projets scientifiques ultérieurs sera réduit du fait de la meilleure reproductibilité des gestes des expérimentateurs. La prise en charge des animaux sera également améliorée (soins pré, post-opératoire), ce qui participera à l'amélioration du bien-être des animaux.
Procédures
1 - Pose d’un cathéter intraveineux pour injection de traitements (n=2500, durée de la procédure :15 minutes) 2 - Approches endovasculaires : (n=1800 souris = 12 personnes x 5 ans de projet x 10 souris par type de modèle x 3 modèles pour cette procédure) et (n =75 rats pour 3 personnes = 5 ans de projet x 5 rats par type de modèle x 3 types de modèles dans cette procédure) 2.1 - Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine (durée de la procédure :1.5 heures) 2.2 - Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par application de FeCl3 (durée de la procédure :1.5 heures) 2.3 - Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par électrocoagulation (durée de la procédure :1.5 heures) 3 - Approche extracranienne (n=600 souris = 12 personnes x 5 ans de projet x 10 souris pour ce modèle, durée de la procédure: 45 minutes) et (n=5 ans de projet x 5 rats pour ce type de modèle = 25 rats pour 3 personnes) 4 - Evaluation des lesions cérébrales par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) et/ou par échographie ultrasonore (n=2500, durée de la procedure :15 minutes). La totalité des animaux (n=2500) seront mis à mort par perfusion transcardiaque selon la dérogation. Chaque animal subira la procédure 1 : pose de cathéter dans la veine caudale de la queue, la procédure 2 ou 3 suivant le type d'approche et le type de modèle, la procédure 4 d'imagerie suite à l'induction de l'ischémie et seront enfin perfusés (dérogation de mise à mort).
Impact sur les animaux
Ce projet à titre d'apprentissage sera soumis à une attention et un encadrement strict pour garantir le bien-être des animaux pendant cette phase d'entrainement. Le stress de l'experimentateur qui manipule l'animal (préhension de l'animal dans sa cage) et la douleur occasionnée lors des procédures (gestes chirurgicaux) sont pris en charge par une couverture analgésiante, anesthésiante, du contrôle de la température des animaux et d'un encadrement supplémentaire. Un environnement contrôlé par des conditions d'hébergements réglementaires et une surveillance strict pallient également les nuisances attendus sur les animaux.
Devenir
A partir de la procédure 1 (Pose de cathéter sur la veine caudale), tous les animaux seront utilisés pour les procédures suivantes : un type de modèle selon l'approche pour induire l'ischémie (procédure 2 ou 3) et la procédure d'imagerie suivie de la perfusion transcardiaque.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques d'apprentissage de chirurgies actuelles de substitution ne permettent pas d'acquérir les gestes techniques. Nous avons sélectionné les modèles expérimentaux les plus utilisés dans la thématique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend ces espèces (souris et rat) particulièrement intéressantes dans le cadre des études portant sur l'AVC.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction tout en aquérant un certain niveau d'expertise technique. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure a été calculé par l'expérience de plus de vingt ans de formation aux gestes chirurgicaux des personnels dans l'établissement. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expériencen prédisposition pour ce type de gestes), le nombre de 10 animaux par modèle pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM, échographie) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les travaux de recherche pré-cliniques ont amené à développer l'utilisation de souris transgéniques (tPA null/tPA KO). Cela renforce l'intérêt de s'entrainer sur des souris : espèce qui sera utilisée par la suite. Le rat (Rattus norvegicus) reprend les caractéristiques de la pertinence de l'utilisation de la souris citées ci-dessus mais il est utilisé à moindre mesure, justifiant son nombre plus limité prévu ici. Il n'existe pas de rats transgéniques sur la thématique mais sa morphologie suscite son intérêt pour l'imagerie grâce à plus grande taille et à sa palette comportementale plus grande que la souris. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines et auront un poids de 35 g environ pour les SWISS et d'environ 20 g pour les C57BL/6J et d’environ 300 g pour les rats Wistar ou SPRAGUE DAWLEY âgés de 10 semaines également. Nous réaliserons nos modèle sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.
Etudes des conséquences mutationnelles de différentes génotoxines sur la réparation de l’ADN.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, une inhalation et une irradiation reproduisant l'exposition à des substances génotoxiques comme l'acétaldéhyde, le formaldéhyde ou les UV, pour étudier la réparation de l'ADN et le risque de cancer. Le porteur indique que les irradiations peuvent provoquer une inflammation aiguë de la peau et affirme que l'exposition aux produits mutagènes sera trop courte pour causer des lésions visibles. Les souris sont ensuite tuées pour analyse des tissus et organes.
Objectifs
Les ultraviolets et les psychotropes comme le tabac ou l’alcool contribuent au développement de tumeurs. L’exposition à la lumière UV ainsi qu’aux drogues récréatives endommagent l’ADN des cellules humaines et augmentent le risque de cancers dans la population en induisant des mutations sur l’ADN. Les altérations produites par ces substances nuisibles à l’ADN sont pris en charge par des systèmes de protection de l’ADN tels que la réparation par excision de nucléotides (NER) et, à défaut, par les polymérases translésionnelles (TLS). Des lésions non réparées entraînent des mutations qui augmentent le risque de cancers. Ces produits communément présents dans de nombreuses drogues récréatives, tels que l’acétaldéhyde, le formaldéhyde et le benzo(a)pyrène, ainsi que l’exposition prolongée et chronique aux UVs, produisent une large gamme de lésions à l’ADN qui sont réparées par le NER. Xeroderma Pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare causée par une déficience constitutive du NER. Les patients XPs ont un risque de cancer de la peau 10 000 fois plus élevé, dû à leur inaptitude à réparer les dommages induits par les UV. Il a été montré que les patients XP ont un risque de cancer interne plus de 100 fois plus élevé. Les processus mutationnels impliqués ne sont pas bien compris. Il est possible qu’ils soient dus à l’action de sources mutationnelles interne ou externe au corps, telles que l’acétaldéhyde ou le formaldéhyde. De plus, une augmentation du risque de cancers corrélé à des mutations délétère sur un allèle (mutation inactivant une copie d’un gène, c’est-à-dire une mutation hétérozygote) de gènes du NER a été montrée dans des modèles murins et humains. La consommation excessive des psychotropes cités pourrait impacter le risque de cancer chez des porteurs de ces mutations NER dans la population générale. Certaines populations présentent ces mutations hétérozygotes de manière particulièrement fréquente, allant de 0,5 à 2% de la population. L’évaluation de la susceptibilité aux cancers associés à l’abus de ces substances, ainsi qu’à l’exposition excessive aux UV est donc de haute pertinence clinique. Notre projet vise à identifier les conséquences au niveau de l’ADN et des mutations engendrées par l’exposition chronique d’animaux adultes et pendant la grossesse à ces substances cancérigènes et au rôle joué par le NER et la voie des TLS.
Bénéfices attendus
Identifier la quantité et le type de mutations engendrés par ces sources cancérigènes chez nos souris nous permettra de préciser les diagnostiques fait pour les cancers humains, ainsi que la mise en évidence d’une potentielle population particulièrement à risque pour l’exposition à ces substances.
Procédures
Gavages: nombre= 3, durée = 2 minutes . 4 injections intrapéritonéales :30 secondes:. Inhalation (1), durée: 10 minutes. Irradiation (1) : durée: 14 minutes.
Impact sur les animaux
Les irradiations sont susceptibles de provoquer des inflammations de la peau de manière aigue et contenue à la zone d’irradiation. L'exposition aux produits mutagènes ne sera pas d'une durée suffisante pour provoquer des lésions macroscopiques qui entraîneraient des nuisances.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les tissus et organes.
Remplacement
L’utilisation d’animaux se révèle essentielle pour l’étude de la mutagenèse dans un contexte prénatal. En effet il est impossible de répliquer ce processus complexe de développement ex vivo. Pour ce qui est de la tumorigenèse induite par les UV, les études In vitro, bien que points de départ nécessaires et importants, ne nous permettent pas de modéliser ni de prendre en compte le processus complexe qu’est la tumorigenèse chez un être vivant complet, avec toutes les interactions entre organes.
Réduction
Notre projet n’étudie pas de caractéristiques quantifiables sur les animaux mêmes, mais sur des séquençages fais à partir de tissus récupérés sur ces animaux. De ce fait, les statistiques elles-mêmes sont fait sur les résultats de séquençage, et ne prennent pas en compte le nombre d’animaux. Nous avons besoin de 10 individus différents par génotypes et traitements pour rendre nos statistiques robustes sur l’analyse haut débit.
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux, ceux-ci sont suivis quotidiennement par le même manipulateur et les mêmes animaliers. Pour les interventions et procédures des anesthésies seront effectuées. Un traitement d’appoint sous forme de crème analgésique est prévu en cas d’inflammation cutanée suite aux expositions aux ultraviolets. Des points limite et des critères d'arrêt de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Les 9 modèles nécessaires sont tous d’ores et déjà existants chez la souris sur un fond génétique C57BL/6 et/ou BALB/c. L’organisation du système vasculaire de la souris et les relations avec le microenvironnement tumoral sont très proches de celles observées chez l’Homme. L’utilisation de la souris permet d’obtenir des effectifs suffisants et des lots homogènes permettant une reproductibilité des résultats. Les stades choisis sont justifiés par les maladies qui peuvent apparaître, suivant les carcinogènes, à différents stades de la vie dans l'espèce humaine. Des femelles et mâles à maturité sexuelle (à partir de 8 semaines) pour les expériences sur les animaux adultes et pour permettre un maintien de la lignée. Des femelles pour les traitements au cours de la gestation. Pour analyser la mutagenèse prénatale après exposition aux différentes génotoxines, nous aurons besoin d'individus âgés de 2 à 3 semaines.
Etude des effets neuromodulateurs de la pregnénolone en réponse aux ligands endogènes et exogènes du récepteur aux cannabinoïdes de type-1 : Analyses comportementales et moleculaires chez des souris mutantes CB1-E134G.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à modéré, trente-deux étant opérées sous anesthésie sans réveil. Elles reçoivent une injection de THC ou d'autres composés, puis 912 d'entre elles passent des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier l'effet neuromodulateur de la prégnénolone chez des souris mutantes. Le porteur indique que la mise en cage individuelle peut provoquer un stress d'isolement et que les mises à mort se font par inhalation de CO2. Les souris ne sont pas réutilisées pour éviter tout effet cumulatif des traitements.
Objectifs
Le cannabis est une des drogues d’abus la plus utilisée dans le monde (166 millions d’utilisateurs dont 15 millions de personnes dépendantes). Le ∆9-tétrahydrocannabinol (THC) est le composant principal du cannabis et est responsable des effets toxiques et addictifs observés lors de la prise de cannabis chez l’homme. Le THC fait partie de la famille des cannabinoïdes et agit au niveau du cerveau via les récepteurs aux cannabinoïdes de type 1 (CB1). Ces récepteurs CB1 participent à la régulation de nombreuses fonctions biologiques, comme la régulation de comportements liés à la cognition, à la régulation de l’équilibre énergétique, ou encore des réponses liés au stress et à l’anxiété. Une dérégulation de l’activité de ces récepteurs CB1 en réponse à la prise de cannabis (ou de THC), peut donc être à l’origine de désordres psychiatriques et comportementaux importants. Le développement de thérapies pouvant atténuer les effets neurologiques d’une sur-activation CB1 est donc un enjeu de santé publique majeur. Il a été montré, chez le rongeur de laboratoire, un nouveau mécanisme de régulation endogène qui se met en place dans le cerveau et permet de diminuer fortement les effets toxiques d’une telle sur-activation par le THC. De fortes concentrations de THC vont activer le récepteur CB1 de façon excessive et un stéroïde, la pregnénolone, va alors être libérée dans le cerveau et agir directement sur le récepteur CB1 pour réduire son activité et bloquer les effets toxiques du THC. Notre projet de recherche consiste à mettre en évidence le rôle physiologique de la pregnénolone dans la régulation des récepteurs CB1. Pour cela, notre stratégie a été de développer une souris mutante, chez laquelle la pregnénolone ne peut pas se lier au récepteur CB1. Cette souris ne comporte pas de phénotype dommageable. Nous envisageons d’étudier des comportements non invasifs, et les mécanimes moléculaires qui y sont liés, chez ces souris à l’âge adulte en comparaison à des souris ayant un récepteur CB1 intact.
Bénéfices attendus
Les récepteurs aux cannabinoïdes CB1 comptent parmi les récepteurs métabotropiques les plus abondants dans le système nerveux, et participent à la régulation de nombreuses fonctions cérébrales. La dé-régulation de l’activité de ces récepteurs est ainsi associée à l’apparition de troubles neurologiques majeurs tels que l’addiction, les psychoses, la depression, ou encore les troubles du comportement alimentaire. L’idendification de mécanismes de régulation endogènes aux récepteurs CB1 offre donc de nouvelles pistes de recherche dans le but de développer des stratégies thérapeutiques innovantes permettant une amélioration de la qualité de vie des patients concernés. Ce projet consistera ici à produire une meilleure connaissance des mécanismes fondamentaux sous-tendant la régulation des récepteurs CB1 par la pregnenolone. Cela sera rendu possible par l’utilisation d’un nouveau modèle de souris mutantes pour le récepteur CB1, chez lesquelles le site de fixation allostérique de la pregnenolone est invalidé.
Procédures
1) Traitement: Un total de 1264 animaux recevra un traitement par injection dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux (10ml/kg pour la souris). L’ensemble des animaux ne recevra qu’une seule injection. 2) Tests d’étude des comportements : L’ensemble des tests prévus dans cette étude concernera 912 animaux. Les tests seront réalisés sur des animaux vigiles après administration aigüe d’un traitement (délai allant de 30 minutes jusqu’à 24h). 3) Procédure chirurgicale: La procédure sera réalisée chez 32 souris sous anesthésie générale sans réveil. 4) Mise à mort : elle sera réalisée chez l’ensemble des souris, soit pour faire des prélèvements de tissus pour des analyses ultérieures (chez 320 animaux), soit à la fin des expérimentations (chez 912 animaux), car les animaux ne pourront pas être réutilisés.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux pourraient survenir à leur mise en cage individuelle, qui pourrait entraîner un « stress » lié à l’isolement. Cependant, cet isolement sera fait sur un temps court et sera compensé par un enrichissement des cages et des contacts visuels et sonores entre chaque cage. Des effets indésirables pourraient survenir lors de l’induction de l’anesthésie. Les méthodes de mise à mort peuvent également entraîner des effets indésirables, cependant elles seront réalisées dans des conditions expérimentales appropriées afin de limiter toute souffrance ou angoisse pour l’animal.
Devenir
Procédures I à V et VIII : Les animaux des procédures ayant recours à l’injection de THC et l’analyse des effets comportementaux du traitement seront mis à mort par inhalation progressive d’un mélange air/CO2. Les animaux ne pourront pas être réutilisés ultérieurement afin d’éviter tout effet cummulatif des traitements sur le comportement des animaux. En outre, les effets cummulatifs de l’administration de THC chez les souris mutantes CB1-E134G n’est pas connu, en particulier sur les niveaux d’expression du récepteur CB1 et sur la synthèse de pregnénolone. Afin de pallier à ces éventuels biais expérimentaux, des groupes indépendants de souris seront utilisés. Procédure VII : Les animaux de la procédure VII seront mis à mort par injection d'euthanasiant couplé à une perfusion intracardiaque d’un mélange de paraformaldhéhyde (formaline 4%). La mise à mort des animaux et la fixation des tissus est ici nécéssaire pour l’analyse de l’expression du récepteur CB1 par des approches immunohistochimiques. Procédures VI et IX : Les animaux des procédures VI et IX seront mis à mort par décapitation rapide. La méthode de mise à mort par décapitation est nécessaire dans notre projet pour pouvoir prélever rapidement du sang afin de faire des analyses ultérieures. Nous ne pouvons pas utiliser d’autres méthodes, comme la dislocation cervicale, car la récupération ultérieure du sang serait difficile due à sa coagulation et ceci entraînerait un biais expérimental. Les études des voies de signalisations ainsi que la quantifications des endocannabinoïdes et neurostéroïdes ne pouvant être réalisées que sur des échantillons ex vivo. Ces procédures se feront sans utiliser d’anesthésie, celle-ci pouvant modifier les paramètres mesurés et induire ainsi des biais expérimentaux.
Remplacement
Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches subsitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Des analyses in silico nous ont permis d’identifier au préalable le site de fixation allostérique de la pregnenolone sur le récepteur CB1, ainsi que la probabilité d’invalider ce site de fixation par une mutation ponctuelle du gène codant pour le CB1. Cette mutation a ensuite été validée in vitro, nous permettant de vérifier que la pregnénolone ne pouvait pas se lier au récepteur muté. Ce projet s’applique maintenant à l’étude de systèmes intégrés qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal. Nous utiliserons ici un modèle de souris mutantes pour le récepteur CB1, ce qui nous permet de connaitre la faisabilité et les conditions appropriées des procédures expérimentales.
Réduction
Un nombre de 8 à 10 souris par groupe expérimental sera nécéssaire pour les prélèvements et analyses ex vivo, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. Ce nombre sera porté à 12 souris par groupe pour les analyses comportementales, afin de pallier à la variabilité inter-individuelle et pouvoir réaliser des analyses statistiques cohérentes. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets génotype. Les tests statistiques consisteront au préalable en un test de normalité, puis en un test d’analyse de variance à deux facteurs, suivi si besoin de tests post-hoc. Dans le cas où les données ne suivraient pas une distribution normale, des alternatives non-paramètriques aux tests cités ci-avant seront realisées. Enfin, les études réalisées en amont ainsi qu’une connaissance accrue de la bilbiographie sur le récepteur CB1 nous ont permis de déterminer les doses effectives pour les traitements pharmacologiques, en particulier pour les expériences ayant recours à l’utilisation de THC. Ceci nous permet de proposer des groupes expérimentaux pertinants avec des conditions témoins appropriées.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et ce dès leur réception. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites (Voir Annexe 1 ; tableaux 3 A, B, C et Annexe 2, Tableau 1). De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuissances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur réception, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Les animaux seront alors placés dans des cages individuelles transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. La mise en cage individuelle est ici nécéssaire afin de minimiser l’impact potentiel de la hierarchie sociale sur le phénotype des animaux (Varholick et al., ScientIfic Reports, 2019), et afin de reproduire les conditions d’hébergement des projets précédents. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation (Gouvela & Hurst, Plos one, 2013). Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie, et les animaux seront transférés au minimum 1h avant le début des tests dans la pièce d’expérimentation afin de les familiariser à ce nouvel environnement. Le cas échéant, un enrichissement supplémentaire pourra être apporté dans les cages d’hébergement afin d’optimiser le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal communément utilisé pour réaliser des mutations génétiques, de par la similitude du génome de la souris et celui de l’homme. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de l’homme, ce qui permettra une possibilité de translation chez l'homme dans des études de recherche & développement des résultats obtenus dans le projet de recherche. De plus, les effets comportementaux des cannabinoïdes ont été bien décrits et validés chez la souris. Enfin, des études préliminaires réalisées in vitro ont démontré la conservation du site de fixation de la pregnenolone sur le récepteur aux cannabinoïdes CB1 chez le récepteur murin et humain; ce qui encourage l’utilisation de ce modèle dans notre étude. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes-adultes (entre 2 et 5 mois de vie). Ce projet se fera dans la continuité de projets précédents chez ces souris au même âge et permettra de mieux appréhender les mécansimes de régulation endogène du récepteur aux cannbinoïdes CB1 par la pregnénolone.
Rôle d’un polluant environnemental (l’HBCDD) comme facteur de susceptibilité dans l’apparition des troubles du spectre autistique chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
458 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la grande majorité tuée à l'issue et dix-huit réutilisés. Quarante rates gestantes sont gavées quotidiennement pendant quarante-deux jours avec un polluant retardateur de flamme, le HBCDD, et reçoivent une injection intrapéritonéale, pour étudier son rôle dans les troubles du spectre autistique de leur descendance. Le porteur indique que les mères sont tuées au sevrage des petits et que les ratons en surnombre, au-delà de dix par portée, sont prélevés au hasard et tués. Les descendants restants subissent des tests comportementaux puis sont mis à mort.
Objectifs
Les Troubles du Spectre de l’Autisme (TSA) se manifestent par des déficits de communication sociale associés à des intérêts restreints et des comportements stéréotypés. Alors que la prévalence de ces troubles est en augmentation dans les pays développés, seuls 25% des cas impliquent la composante génétique questionnant le rôle des facteurs environnementaux, dont les polluants chimiques, dans cette pathologie. Des résultats obtenus chez l’Homme et chez l’animal montrent des modifications des capacités motrices, de l’anxiété et de l’attention chez des individus ayant été exposés précocement à des niveaux environnementaux de retardateurs de flamme bromés dont l’HexaBromoCycloDoDecane (HBCDD), justifiant sa classification en Europe en tant que substance à très haut niveau de préoccupation. La neurotoxicité développementale de l’HBCDD a été montrée par l’équipe porteuse de ce projet qui se propose maintenant d’étudier les mécanismes sous-jacents de cette toxicité cérébrale induite par une exposition périnatale à l’HBCDD et le rôle que cette exposition pourrait jouer en tant que facteur de susceptibilité dans un modèle expérimental de Troubles du Spectre de l’Autisme. Il est donc proposé ici d’étudier l’incidence et les mécanismes sous-jacents de l’exposition précoce à l’HBCDD comme facteur de susceptibilité dans l’apparition des TSA induite par l’administration d’acide valproïque au cours de la gestation.
Bénéfices attendus
Les retombées scientifiques de ce projet visent donc à associer le modèle de Troubles du Spectre de l’Autisme précédemment validé à une exposition de la mère à deux doses d’HBCDD (HexaBromoCycloDoDecane) au cours de la période périnatale (Jour de gestation 1 à 21 jours postnataux) dans le but ultime d’étudier l’impact de l’HBCDD en tant que facteur de susceptibilité pour cette pathologie dans la descendance.
Procédures
Ce projet d’une durée de 3 ans inclura un total de 40 rats femelles Wistar gestantes ainsi que leurs descendants. Les 40 rates adultes seront réparties en 4 groupes expérimentaux (n=10 par groupe) et constitueront le lot 1. La voie orale étant la voie principale de l’exposition humaine à l’HBCDD, le polluant sera administré via la même voie par gavage. Les animaux du groupe C seront administrés quotidiennement avec le polluant à la dose de 0.1 µg/kg et le groupe D à une dose 100 fois supérieure à celle-ci. Les groupes A et B recevront le véhicule (huile neutre). L'administration durera 42 jours couvrant ainsi les périodes de gestation (21 jours) et de lactation (21 jours) de manière à mimer une exposition humaine dans un environnement contaminé pendant les 9 mois de grossesse et les 6 mois d’allaitement (durée établie par l’OMS). A l’issue de la naissance, les ratons de chaque portée seront sexés et marqués pour pouvoir être suivis individuellement et le poids mesuré tous les 3 jours jusqu’au 21e jour de vie postnatale (PND) puis 1 fois par semaine. Un suivi de l’ouverture des yeux sera réalisé entre les jours 14 et 16 de vie postnatale en tant que marqueur précoce dans les premières semaines. Le lot 1 concernera également les ratons (n=400) lors du suivi de leur développement jusque PND21 puis une partie de ces descendants (n=240) seront mis à mort. Plusieurs tests comportementaux seront effectués par le lot 2 (n=96) au cours des semaines 9 à 11 après la naissance et viseront à étudier l’expression des 3 critères comportementaux (somesthésie, activité/anxiété et interactions sociales/stéréotypies) caractéristiques d’un phénotype autistique tels que mentionnés plus avant. A la fin de l’évaluation comportementale, les animaux de ce lot seront mis à mort pour collecter des tissus. Le lot 3 (n=64) sera dédié à l’étude de la réactivité à un stress psychologique lors d’un test de stress de contention qui sera réalisé à PND90. Les animaux de ce lot seront ensuite mis à mort pour réaliser des prélèvements.
Impact sur les animaux
- L'administration orale du polluant chez les mères se fera par gavage, les effets attendus sur les animaux sont une gêne de courte durée due à l'administration de la canule de gavage. - Une injection intrapéritonéale est ensuite prévue au 12ème jour de gestation pouvant entrainer une douleur légère au point d'injection. - Le marquage, le suivi de l'ouverture des yeux et le suivi de croissance des animaux par pesée n'entrainent aucun effet indésirable. Ces interventions nécessiteront une séparation de la mère de courte durée lorsqu'elles seront réalisées sur les animaux à un jeune âge pouvant entrainer un stress de séparation. - Le test de la plaque chaude prévue dans ce protocole entrainera une sensation de chaleur sous les pattes de l'animal suffisamment importante pour qu'il exprime une gêne sans aller jusqu'à une brulure car le test est stoppé en amont. - Le test de la pince calibrée entrainera une gêne de l'animal au niveau des pattes postérieures qui seront pincées par le dispositif sans aller jusqu'à une douleur. - Les tests du labyrinthe en crois surelevé et de l'open-field mettent les animaux dans une situation stressante pour eux, l'effet attendu est donc le ressenti d'une anxiété. - Les tests de l'enfouissement des billes et celui de sociabilité de Crawley n'ont pas d'effets indésirables prévus. - Le test du résident-intrus peut amener l'animal à exprimer une certaine agressivité envers l'autre congénère réalisant le test. - Le stress de contention aura pour effet indésirable le ressenti d'une anxiété par l'animal puisqu'il sera placé dans une situation stressante pour lui. Des prélèvements sanguins seront réalisés au début et à la fin du test et entraineront alors une douleur légère liée à la piqure des aiguilles. Un suivi de température sera également réalisé par l'administration d'une sonde rectale causant chez l'animal une gêne le temps de ce suivi.
Devenir
Procédure 1 : Les 40 femelles allaitantes (groupes A, B, C et D) seront gardées en vie jusqu’au sevrage des jeunes à 21 jours, puis seront mises à mort. A la mise bas, dans le cas de portées avec un nombre de ratons trop important (>10), les animaux en surnombre seront prélevés au hasard et mis à mort. Une partie des descendants seront également mis à mort (n=240) à 21 jours postnataux. Procédure 2 : Tous les animaux seront mis à mort (n=96) à 80 jours postnataux. Les 18 rats (9 femelles et 9 mâles) ayant servi d'intrus dans les tests de sociabilité pourront être gardés en vie à l'issue des tests de comportement et réutilisés selon les besoins Procédure 3 : Tous les animaux seront mis à mort (n=64) à 90 jours postnataux. Les prélèvements réalisés sur les animaux de tous les lots serviront pour des dosages tissulaires et plasmatiques.
Remplacement
Seul le recours à l'animal peut permettre de mimer la complexité comportementale et cérébrale des Troubles du Spectre Autistique (TSA) tels qu'ils sont observés chez l'homme, justifiant le recours à un modèle animal pour cette étude. Le modèle de TSA développé chez les rongeurs par administration d'acide valproïque (VPA) est reconnu pour générer des phénotypes comportementaux comparables à ceux observés chez les autistes chez l'Homme. Aucun système alternatif ne permet de simuler le niveau de complexité de l'organisme entier nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats avec l'assurance d'une puissance statistique adéquate (60 à 80%). Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est de 40 rats adultes (40 rates gestantes) ainsi que la descendance obtenue (400 ratons),18 rats (9 femelles et 9 mâles) qui serviront d’intrus pour les tests d’interaction sociale. Le nombre de 10 rates gestantes par groupe est estimé suffisant pour pouvoir s’affranchir d’un effet propre à la portée sur la variabilité des résultats. De plus, le nombre de descendants est ajusté à 10 par portée de façon à standardiser les effets de la taille de la portée sur la croissance et le développement dans l’ensemble des portées. Dans le cas d’un nombre de ratons supérieur à 10, les animaux en surnombre pourront être utilisés pour compléter des portées nées le même jour et comprenant moins de 10 ratons. Si ce n’est pas le cas, ces animaux surnuméraires seront mis à mort. En cas d’un nombre plus faible (inférieur à 10), l'ajout d'animaux excédentaires provenant d'autres portées du même groupe pourra être réalisé si les portées sont nées le même jour. Si cet ajout n'est pas possible, des portées de 8 ratons seront considérées comme de taille minimum. Les portées de taille inférieure seront écartées et les ratons mis à mort pour des prélèvements.
Raffinement
Les femelles gestantes puis allaitantes seront hébergées avec leurs jeunes jusqu’à 21 jours postnataux. Puis les jeunes rats seront hébergés ensemble par portée après retrait de la mère entre 21 et 28 jours de vie afin de maintenir les liens sociaux formés dans la portée. A 28 jours, les rats seront séparés par sexe. Les animaux seront finalement placés à 2 par cage selon les dispositions réglementaires en termes de rapport hauteur/surface au moment où leur poids et taille le nécessiteront. L'eau et la nourriture seront disponibles ad libitum durant tout le protocole. Les cages seront maintenues dans des conditions d'hébergement contrôlées en cycle lumineux inversé (lumière allumée à 19h). Le milieu sera enrichi avec des feuilles de papier absorbant de manière à éviter le grignotage des matières plastiques des objets habituellement utilisés qui contiennent des substances de toute sorte pouvant interférer avec le polluant (HBCDD). Les tests comportementaux se feront ainsi durant la phase d’activité naturelle (phase nocturne) des rats de manière à préserver leur période de repos. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les points limites suivants relevés (diminution de la consommation alimentaire et hydrique, ralentissement de la prise de poids, modifications de l'apparence physique externe et du comportement de l'animal). Si l'un de ces points limites est atteint, l’animal sera isolé et surveillé, voire mis à mort selon une méthode réglementaire (injection létale) en cas de persistance de l’état de mal-être de l’animal. Tous les animaux seront traités par les mêmes personnes entrainées de manière à réduire le stress de l’administration des produits et de la manipulation.
Choix des espèces
Alors que le modèle de Troubles du Spectre Autistique (TSA) induit par l'acide valproïque (VPA) a été développé chez le rat et la souris, les caractéristiques comportementales du rat, en particulier au plan du comportement social diffèrent de celles de la souris et font que cette espèce est à privilégier pour induire des phénotypes comportementaux de type autistique. De plus, cette espèce est celle qui a été utilisée lors des expérimentations animales précédentes visant à mettre au point ce modèle de TSA dans un contexte de co-exposition au polluant environnemental (HBCDD) rendant nécessaire de poursuivre avec la même espèce pour cette étude. Les femelles qui seront utilisées pour la reproduction seront utilisées au même stade adulte (12-13 semaines) que dans les études précédentes de manière à obtenir des résultats comparables. Les femelles seront placées au moins une semaine avant la phase d’accouplement dans une salle d’hébergement en cycle inversé. L’œstrus (période pendant laquelle la femelle est fécondable) sera confirmé grâce à l’utilisation d’un moniteur de cycle œstral digital pour rongeur, par un personnel expérimenté et habitué à ce geste de contention manuelle légère. Une fois l’œstrus confirmé, les rates seront placées en accouplement. Pour cette étape, une seule femelle est placée en présence d’un seul mâle pendant la 2ème partie de la phase d’obscurité (après-midi). Si la femelle montre des signes de réceptivité sexuelle (comportement caractéristique de lordose c’est-à-dire d’une position permettant la copulation et frémissement des oreilles qui normalement précèdent l'acceptation de la monte), la femelle sera laissée en présence du mâle jusqu’au lendemain matin (soit une période d’environ 12h). Leurs descendants seront utilisés aux stades postnataux PND1 à PND90 afin de valider d’un point de vue comportemental, l’expression phénotypique des trois critères principaux de diagnostic des TSA qui sont : i) un déficit d’interactions sociales et une stéréotypie, ii) une atteinte de la sensibilité au niveau du système somesthésique et iii) une hyperactivité et une hyperanxiété.
Effets de souche bactérienne sur la production d’hormone
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des souches bactériennes dans l'eau de boisson pendant vingt-sept jours, hébergées seules pour mesurer leurs prises alimentaire et hydrique, et subissent un prélèvement de sang à la queue puis un prélèvement terminal par ponction cardiaque sous anesthésie. Le porteur indique que l'apport bactérien pourrait perturber le transit intestinal et que la prise de sang initiale représente 15 % du volume sanguin. Toutes les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans le développement de composés thérapeutiques visant à moduler ou restaurer le microbiote afin de produire une hormone spécifique. Cette étude se déroulera en deux étapes avec une étape préliminaire ayant pour but de sélectionner la souche bactérienne la plus efficace. Dans un second temps, à partir de cette souche-candidat, une dose-réponse sera effectuée afin de déterminer la dose optimale pour les études futures.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés thérapeutiques visant l'humain. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouveau composé modulant ou restaurant le microbiote permettant la production d'une hormone spécifique.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux types de prélèvement, un prélèvement sanguin à D0 par la veine caudale (2x100µL) sur animal vigile et un prélèvement sanguin terminal par ponction cardiaque sur animal anesthésié par l'administration d'un mélange de kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.). Par ailleurs, les animaux auront des souches bactériennes par l'eau de boisson de D0 à D27. Les 24 souris seront ensuite euthanasiés par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
La nécessité de mesures individuelles de la prise alimentaire et de la prise hydrique implique l'hébergement individuel des animaux. L'administration des souches bactériennes par eau de boisson de D0 à D27 pourrait engendrer des modifications du transit intestinal (non prévue initialement dans l'étude). La seule manipulation pouvant engendrée une nuisance est le prélèvement sanguin à D0 (200µL) par la veine caudale (représentatif de 15% du volume sanguin total). L'ensemble des souris seront euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie réalisée par injection d'un mélange kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par l'administration d'un mélange de kétamine/Xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/Kg; i.p.). Les souris seront ensuite euthanasiés par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d'un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et hydrique et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudés sont les suivants : le poids corporel, la prise alimentaire, la prise hydrique, la cytokine IL-10 (serum) et l'hormone ocytocine (plasma). De plus, l'étape 1 du projet nous permet de réduire drastiquement le nombre d'animaux à utiliser pour la dose-réponse de l'étape 2. Cette étape préliminaire est indispensable pour le respect de la règle des 3R.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitement seront administrés via la nourriture ou la boisson, permettant de limiter les manipulations et le stress liés à l'administration des traitements. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois spécialement conçus pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques (Buprénorphine notamment). L'ensemble des souris sera euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie réalisée par injection d'un mélange kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J est le modèle de souris le plus classiquement utilisés et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de 7 semaines, au début des traitements. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population de jeune adulte.