Rongeurs

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de lymphome leur est implantée sous la peau par chirurgie sous anesthésie, puis suivie par des séances d'imagerie IRM sous anesthésie, jusqu'à quatre par animal, pour démontrer l'intérêt de cette imagerie en oncologie. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraîne la mise à mort de l'animal. Les souris sont tuées en fin de procédure pour congélation ou fixation des tumeurs.

Objectifs

Le projet présenté vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) en oncologie . L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée en clinique. Nous attendons de l'IRM qu'elle permette de raffiner les études précliniques et ainsi à terme d'optimiser la règle des 3R, mais également qu'elle permette de travailler avec des modèles tumoraux inaccessibles aux méthodes classiques. Le projet présenté rentre dans ce dernier cas de figure. Il porte sur le suivi par IRM d'un modèle de lymphome implanté en sous-cutané chez la souris immunocompétente. Ce modèle présente un intérêt fort pour comprendre les mécanismes d'apparition de résistances aux anticorps thérapeutiques, mais ne peut pas être étudié avec des méthodes conventionelles. En effet, après l'implantation sous cutanée du modèle tumoral, se développe à l'emplacement soit une masse tumorale, soit une masse inflammatoire, qui ne peuvent pas être discriminées par les méthodes d'observation et de mesure. L'IRM permettra de faire cette discrimination. Le projet prévoit d'utiliser 30 souris, 10 pour amplifier la modèle tumoral in vivo, 20 pour l'analyse IRM.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de caractériser un modèle de cancer du sang, le lymphome B, afin de développer un variant permettant de comprendre les mécanismes d’apparition de résistances à un anticorps thérapeutique. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive en oncologie préclinique, technique dont la précision permettra à terme d'optimiser les 3R dans ce contexte.

Procédures

-implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute, administration d’antalgiques au préalable ; traitement si douleur post opératoire 20 minutes maximum -anesthésie fixe durant l’IRM durée maximale 30 minutes de kétamine/Xylazine sur un total de 2/semaine durant 2 semaines soit 4 injectionx maximum.

Impact sur les animaux

- Perte de poids constatée : plus de 10% non améliorée par ajout de nourriture humide en maximum 24h ; une perte de plus de 20% qui serait liée à l'évolution de la croissance entrainera une mise à mort de l’animal - implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute administration d’antalgiques au préalable ; - croissance de tumeurs sous-cutanée au niveau du flanc - anesthésie fixe durant l'IRM pour une durée maximale de de 30 minutes,4 séances maximum espacées de 3 jours au minimum

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de chaque procédure (soit pour congelation des tumeurs pour le stock soit pour fixation en formol).

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire que sur l’organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement au taux d’anomalies de croissance tumoral. Nous utiliserons 10 souris + 20 souris soit 30 souris totales, et ferons une étude statistique d’analyse de contingence et un test de Fischer pour comparer avec une situation normale.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Des prélèvements en point final des tumeurs seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Pour les modèles implantés sous la peau par chirurgie, les animaux seront traités avec un antalgique avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie. La procédure d’imagerie IRM se fera sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 5 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.

305 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue et le reste réutilisé ou transféré. Ils reçoivent par voie orale ou injectable des substances hallucinogènes présentes dans l'ayahuasca, la DMT et une β-carboline, subissent des prélèvements de sang et sont observés isolés pendant deux heures pour compter leurs secousses de type wet dog shakes. Le porteur indique que l'ayahuasca peut provoquer une anxiété aiguë et perturber le comportement des rats plusieurs heures durant. Selon les besoins du commanditaire en échantillons terminaux, chaque rat est tué pour prélèvement d'organes ou gardé vivant pour des formations internes.

Objectifs

Dans ce projet, les effets hallucinogènes de principes actifs pharmaceutiques seront étudiés. La N,N- diméthyltryptamine (DMT) et la β-Carboline, un alcaloïde, sont des substances psychotropes puissantes considérées comme des stupéfiants en France. Ils sont retrouvés dans la composition de l’Ayahuasca, boisson amazonienne psychédélique, ingérée traditionnellement dans un cadre chamanique, principalement à des fins thérapeutiques, d’apprentissage ou de divination. Cette boisson est produite à partir de la décoction de Banisteriopsis caapi et Psychotria viridis, des plantes contenant respectivement de la BC et de la DMT. Il existerait des bénéfices thérapeutiques de l’Ayahuasca pour les patients souffrant de dépression, d’idées suicidaires ou de graves problèmes de santé mentale. Cependant, l’Ayahuasca présente de nombreux effets indésirables en fonction de la dose utilisée (nausées, vomissements, diarrhées ou psychoses aigus conduisant même à la mort). L’objectif du présent projet est donc d’évaluer les effets hallucinogènes de plusieurs doses et compositions à partir du breuvage traditionnel de l’Ayahuasca en comparaison avec le 2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine (DOI) qui est une substance psychédélique et une amphétamine substituée. Le DOI est un agoniste sérotoninergique puissant. Le DMT a une activité pharmacologique similaire mais sa biodisponibilité orale est très faible sans les composants de l'Ayahuasca, comme la β-Carboline, qui empêchent son métabolisme dans l'intestin. En jouant sur les doses et le ratio des composants du breuvage, le sponsor souhaite obtenir un composé qu’il pourrait développer en clinique dans l’indication de troubles psychiques en limitant les risques d’effets secondaires. Les effets du DMT seul, de la β-Carboline seule et de différents ratios de DMT et β-Carbolines seront mesurés. Le sponsor souhaite ensuite étudier les effets secondaires de type nausées et vomissements chez le furet (dans le cadre d’une autorisation de projets différente). L'activité hallucinogène sera étudiée en utilisant le test de "secouement du chien mouillé" (WDS pour wet dog shake). De nombreuses substances hallucinogènes qui agissent comme agonistes des récepteurs sérotoninergiques, tel que le DOI, provoquent un mouvement rotatif paroxystique et rythmique chez les rongeurs. Pour ce projet, le nombre de WDS et de secousses isolées de la tête (HS pour head shake) chez le rat seront comptabilisés pendant un total de 120 minutes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les effets hallucinogènes de l’Ayahuasca à différentes doses sur le modèle rongeur de WDS. L’Ayahuasca pourrait être prometteuse et être proposée comme nouvelle stratégie thérapeutique aux patients souffrant de dépression et troubles de santé mentale.

Procédures

Les rats seront traités par voie orale, par voie sous cutanée (ou par voie intrapéritonéale) avec une substance à tester ou son véhicule. Ces administrations seront réalisées sur animaux vigiles en contention et dureront moins d'une minute. Des prélèvements de sang seront réalisés pour l’étude du profil pharmacocinétique des substances. Un prélèvement sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (induction 4% pendant 4 minutes, entretien 2,5% mix air et oxygène) par ponction directe à la veine jugulaire sera réalisé. Le prélèvement de sang est très rapide (quelques minutes). Si le volume de sang souhaité par le sponsor est important, un prélèvement en intracardiaque avant la mise à mort est alors réalisé. L’effet hallucinogène des substances sera étudié avec le test du WDS qui consiste à observer les animaux sur une période de 2h et comptabiliser le nombre de WDS. Les animaux seront isolés pendant cette période et seront replacés dans leur cage d’hébergement avec leur paire dès le retour à un comportement normal. Dans le cas où le sponsor voudrait réaliser des analyses sur cerveau perfusé, alors une perfusion intracardiaque serait réalisée.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration de l’Ayahuasca et de DOI. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Ces molécules sont connues pour induire des effets indésirables et de forts effets hallucinogènes. Après administration de DOI, une activité locomotrice et exploratoire normale est décirt dans la littérature. Avec l'Ayahuasca, une anxiété aigue (diminution de l'exploration et de l'activité locomotrice) pourrait être observée. L’état comportemental des rats pourra donc être perturbé pendant les quelques heures qui suivront l’administration. L’observation des WDS nécessite d’isoler les animaux pendant 2h. Le stress de l’isolement est considéré comme aigu. Les animaux satellites subiront au maximum 3 prélèvements de sang par ponction de la veine jugulaire (technique faiblement invasive) sous anesthésie gazeuse de courte durée.

Devenir

Selon si le sponsor a besoin d’échantillons prélevés en terminal (volume de sang important et/ou organes) ou non, l’animal sera mis à mort ou gardé en vie. Les animaux maintenus en vie seront utilisés dans le cadre de formations internes ou d’améliorations de nos procédures (raffinement) ou bien seront réhabilités dans des centres de formation (université, formation d’expérimentation animale ou chirurgie).

Remplacement

Ce projet ayant pour but l’étude comportementale chez le rat de l’effet hallucinogène de préparations à tester, il est indispensable d’avoir recours à l’animal. De plus, même si les méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites pour caractériser le profil pharmacocinétique d'un composé (absorption, métabolisme et excrétion). L’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

L’étude est séquencée en plusieurs étapes afin de n’utiliser des animaux qu’après validation de chaque étape. Si l’induction avec le contrôle positif n’était pas concluante alors le projet serait interrompu. Un seul groupe contrôle négatif sera utilisé pour chaque étape afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les observations comportementales seront réalisées en aveugle, ce qui justifie de n'utiliser qu'un seul groupe contrôle négatif même si les voies d'administrations et les véhicules sont différents entre le contrôle positif et les préparations à tester. Le N a été déterminé en tenant compte de l'effet hallucinogène attendu du contrôle positif, décrit dans la littérature. Avec les premiers résultats obtenus au cours des études pilotes, un calcul de puissance sera réalisé.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance toute particulière sera portée au suivi des animaux afin de prévenir et de remédier au plus vite à toute apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites seront également fixés avant le début des expérimentations. Les administrations seront réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. Le matériel utilisé sera adapté à l’espèce (aiguille, canule de gavage, etc.). Si l’administration des substances entrainait l’apparition de diarrhées et/ou des difficultés à se nourrir alors des croquettes ou des gels pour la réhydratation seraient placés dans la cage de l’animal. Pendant, la semaine d’acclimatation, les animaux seront habitués au moins une fois à la pièce d’expérimentation où sera réalisée les tests de WDS. Si les secousses WDS se poursuivaient après les 2h d’observations et seraient assez intenses, alors l’isolement de l’animal serait prolongé jusqu’à un retour à un comportement normal. Les prélèvements de sang se feront sur tapis chauffant avec un rétrocontrôle afin de maintenir la température de l’animal à 37°C. Pour cela, une sonde rectale reliée au tapis chauffant sera placée dans l’animal pendant le prélèvement. Après chaque prélèvement de sang, un volume de sérum physiologique équivalent à 3 fois le volume prélevé sera injecté en sous cutanée afin de compenser la perte de volémie. Dans le cas où une incision est nécessaire, une injection d'un analgésique local au niveau du site de l'incision sera réalisée au moins 15 min avant. Une analgésie générale sera apportée avant la perfusion cardiaque.

Choix des espèces

L’activation des récepteurs sérotoninergiques est responsable des effets psychédéliques chez l’Homme et induit chez le rat une réponse comportementale caractéristique de WDS. Les hallucinogènes sérotoninergiques agissent via des mécanismes d’action similaires chez l’Homme et le rat. Ces résultats démontrent que le test de WDS chez le rat est un modèle préclinique intéressant pour l’étude pharmacologique des effets hallucinogènes. Des rats adultes de 5 à 8 semaines pourront être utilisés.

45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, puis des injections de nanoparticules et des séances d'imagerie IRM et scanner sous anesthésie, pour optimiser la dose à injecter. Le porteur qualifie la douleur chirurgicale de modérée, avançant que le cerveau n'est pas innervé et que seule l'incision du cuir chevelu fait mal. Il justifie le recours à l'animal par la complexité du développement tumoral, impossible selon lui à reproduire in vitro.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.

Devenir

Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.

120 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'un médicament entre le 12e et le 18e jour de gestation, avec des prises de sang sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser placentas et fœtus. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grave et signale qu'un tiers des animaux livrés peuvent ne pas être gestants. Il justifie le recours à l'animal par l'absence de modèle in vitro reproduisant l'interaction entre la mère, le placenta et le fœtus.

Objectifs

Décrire l'effet d'une classe médicamenteuse sur les marqueurs sanguins de la maladie (molécules circulantes dans le sang maternel) en cours de gestation animale. Décrire d'éventuels effets toxiques de cette classe méicamenteuse sur l’évolution des fœtus en cours de gestation animale.

Bénéfices attendus

Le développement de thérapeutiques est une priorité de la recherche en médecine périnatale. Le bénéfice attendu de nos recherches est d'apporter la preuve de concept sur un model d'animal gestant qu’une classe médicamenteuse permet potentiellement de ralentir l’évolution de la maladie sans effets secondaires indésirables sur le developpement foetal. Cette preuve de concept permettra de decliner des propositions d'études médicamenteuses avec des molécules déja commercialisées utilisables chez l'espèce humaine.

Procédures

L’injection quotidienne des médicaments est un acte peu douloureux et peu stressant quand il est réalisé par un opérateur entrainé. Cette procédure est réalisée quotidiennement par un très grand nombre d’équipes de recherche. L’injection de médicament sera effectuée entre le 12e et le 18e jour de la gestation. Les prises de sang (réalisées 3 fois dans notre protocole de recherche, 12e, 15e et 18e jour de la gestation) seront systématiquement réalisées sous anesthésie générale pour limiter au maximum à la fois le stress et la douleur des animaux.

Impact sur les animaux

Aucun effet secondaire, ni indésirable grave n’est attendu des gestes réalisés en cours de gestation (injection de médicament, prise de sang) au cours de notre protocole. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée sur les animaux jusqu’au jour de l'euthanasie.

Devenir

Chaque animal sera euthanasié en fin de procédure au 7ème jour du protocole expérimental c’est-à-dire au 18e jour de gestation. L'euthanasie se justifie par la nécessité d’une prise de sang maternel de plus gros volume et l’analyse systématique des placentas et des fœtus. Nos procédures d’analyses ne sont pas possibles après la parturition et la mise bas des portées.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de remplacer l’interaction entre la mère, le placenta et le fœtus au cours de la gestation. C’est pourquoi en recherche en reproduction le modèle d’animal gestant reste indispensable à ce jour. De plus cette étape experimentale est incontournable pour repérer les éventuels effets malformatifs ou délétères pour la gestation de classes médicamenteuses.

Réduction

Compte tenu de la variabilité du nombre de fœtus par portée et de la variabilité des dosages in vivo, le nombre nécessaire pour montrer une différence significative entre deux groupes est de 8 animaux par groupe. De plus, l’établissement éleveur qui nous procure les animaux gestants, ne peut nous assurer la gestation des animaux à la livraison. Les animaux non gestants peuvent représenter jusqu’à 1/3 de l’effectif total d’animaux prévus initialement. Nous profitons de cette procédure experimentale pour tester un appareil de monitorage du pH tissulaire in vivo le jour de l'euthanasie. Le fait d'effectuer ce test au cours de notre protocole sur souris gestante, ne biaise pas nos données experimentales, n'allonge pas la procédure de manière à perturber nos analyses et surtout permet de diminuer le nombre total d'animaux utilisés pour nos recherches.

Raffinement

Les critères objectifs de souffrance et/ou la détresse d’un animal seront quotidiennement évalués. L’expérimentation sera systématiquement interrompue pour chaque animal en cas d’atteinte des points limites préalablement définis par une grille de suivi. Nous prévoyons de tester systématiquement la dose la plus faible de médicament et d’arreêer en cas d’effet mesuré significatif.

Choix des espèces

Le modèle murin est choisi pour plusieurs raisons : - Son type de placenta est proche de celui de l’expèce humaine - Les molécules responsables de la maladie humaine sont également retrouvées dans le sang maternel au cours de la gestation chez la souris. Les dosages de ces molécules chez la souris sont commercialisés. - Le modèle de gestation chez la souris est systématiquement utilisé de par le monde pour étudier de potentiels effets deletères de classes médicamenteuses en cours de gestation.

Pour le compte de clients de l'industrie pharmaceutique, 4 050 rongeurs, 3 600 souris et 450 rats, vont être utilisés afin de fournir des échantillons de sang où mesurer la concentration de candidats médicaments, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rongeurs reçoivent les composés par gavage, par injection, par voie nasale ou intratrachéale, une fois ou pendant plusieurs semaines, puis subissent jusqu'à huit prises de sang en 24 heures, parfois sous anesthésie répétée. Certains sont opérés pour l'implantation d'un cathéter ou d'une pompe sous la peau et peuvent être isolés dans leur cage, et les plus gros volumes de sang sont prélevés dans le cœur, avec ouverture du thorax chez la souris. Le prestataire indique fixer ses effectifs en tenant compte des "besoins de nos clients" et ne réaliser "pas de tests statistiques" sur les données.

Objectifs

Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments. Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. En tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang prélevés chez le rongeur (rat ou souris) et dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique des candidats médicaments au cours du temps après une administration unique ou répétée.

Bénéfices attendus

Les échantillons de sang collectés seront traités et les plasmas ou sérums obtenus seront analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament et de déterminer les doses qui permettront d’obtenir un effet optimal avec des effets secondaires maitrisés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations de composés soit par voie PO, IP, SC (durée inférieure à 1 minute) ou IV à la veine de la queue (durée inférieure à 5 minutes) ; soit par voie IN, IT, topique (durée inférieure à 1 minute) ou IV à la veine jugulaire sous anesthésie gazeuse (durée inférieure à 5 minutes). Dans la majorité des cas il s’agira d’une administration unique, mais elles pourront également être répétées sur plusieurs jours ou semaines. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile via un cathéter vasculaire, à la veine de la queue ou submandibulaire (souris uniquement), soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire (durée: quleques minutes). Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24 à 72h suivant l’administration avec un maximum de 8 prélèvements sur 24h, mais ils pourront également être étalés sur plusieurs semaines (2 prélèvements par semaine maximum). Certains animaux subiront des chirurgies d’implantation de cathéters vasculaires (durée de la chirurgie : environ 40 minutes) et/ou de pompes osmotiques en SC (durée de la chirurgie : environ 20 minutes) . Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être effectué en intra-cardiaque de façon terminale (durée inférieure à 1 minutes) sous anesthésie chez le rat, sous anesthésie et analgésie morphinique chez la souris.

Impact sur les animaux

Pour les administrations de composés, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Un ou plusieurs gavages pourront être réalisés, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille. Certaines modalités d’administration nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux. Certains animaux subiront également une chirurgie d’implantation de pompe osmotique et/ou de cathéters qui pourra nécessiter de les isoler dans leur cage d’hébergement. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés toutes les 24h sur 24 à 72h, ou encore 2 prélèvements maximum par semaine pendant plusieurs semaines. Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être réalisé en intracardiaque de façon terminale : dans ce cas les animaux seront anesthésiés et une thoracotomie sera réalisée pour les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter différents organes.

Remplacement

Si des méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements, de voies d’administrations et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude. Nous ne réalisons pas de tests statistiques sur les données obtenues. Le nombre d'animaux par groupe (N=3 par dose ou par temps de prélèvement) a été déterminé sur la base de nos études précédentes où il est apparu qu'un nombre de 3 animaux est le nombre minimum permettant de conclure sur le profil pharmacocinétique d'un composé en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques à chaque procédure sont également préalablement établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie et les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins ainsi que les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de pompe osmotique ou de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.

Choix des espèces

Ces études de pharmacocinétique vont permettre de déterminer les doses qui seront ensuite utilisées pour les études d’efficacité et de pharmacologie de sécurité chez le rongeur, ce qui justifie le choix des espèces retenues pour ce projet. Le choix entre souris et rat sera ensuite conditionné notamment par l’historique des études déjà réalisées par nos clients, le choix du modèle de pathologie envisagé par la suite, et les volumes de sang requis pour les bioanalyses. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : - Des rats de tous âges soit environ 150 à 600g - Des souris de tous âges soit environ 20 à 40g L’âge des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester