Rongeurs

2 259 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou un carcinogène associé à un produit inflammatoire dans l'eau de boisson pour déclencher un cancer du côlon, puis du tamoxifène, avant leur mise à mort par dislocation cervicale. Le projet étudie le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les tumeurs. Le porteur indique que l'induction du cancer colorectal peut provoquer prolapsus et perte de poids, et affirme que seul l'animal permet une approche intégrée.

Objectifs

Les cancers représentent la première cause de décès en France. L'immunothérapie a permis de faire des avancées spectaculaires dans leur traitement. Des recherches précliniques et cliniques laissent espérer une augmentation du nombre de patients que nous pourront traiter dans le futur. Notre projet s’inscrit dans cette perspective. Il est maintenant clairement établi qu’une population de cellules du système immunitaire qu’on appelle lymphocytes T régulateurs, appelés plus simplement « Treg », a un rôle délétère dans les cancers en inhibant fortement les réponses immunes contre les tumeurs. Certains traitements efficaces en immunothérapie des cancers agiraient par destruction des Treg. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle joué par les Treg dans la physiopathologie des cancers et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies, nous devons avoir recours à l'animal pour mieux comprendre ces mécanismes et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le rôle fondamental du microenvironnement dans le développement tumoral ne peut être reproduit et analysé dans des modèles de culture cellulaire. Il est d'ailleurs important de rappeler ici que toutes les avancées récentes en immunothérapie des cancers proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme. Nous allons travailler sur le rôle joué par certaines molécules exprimées par les Treg infiltrant les tumeurs ou impliquées dans la régulation du métabolisme de ces cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dans lesquelles l’expression de ces différentes molécules est éliminée dans les seuls Treg. Mieux comprendre le rôle de ces molécules dans les Treg permettra de mieux comprendre la physiopathologie des cancers. De plus, le ciblage de certaines de ces molécules dans les Treg pourrait amener à de nouveaux traitements des cancers. C’est l’objectif général de ce projet.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement de la physiopathologie des cancers, notamment concernant la régulation de ces maladies par les Treg. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Le projet comprend 2 procédures. Pour la première procédure, l’expérience débutera par l’injection de cellules tumorales sous la peau chez des souris anesthésiée et maintenues sur une plaque chauffante. L’injection en elle-même des cellules ne durera pas plus de 30 secondes et l’anesthésie durera moins de 5 minutes par souris. On effectuera ensuite un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal, la taille des tumeurs avec un pied à coulisse et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 90 secondes par souris. Pour la mesure de la taille des tumeurs, on fera une contention par la peau du cou et pour la mesure du poids des souris, on fera une contention par la queue. Certaines de ces souris seront également traitées 10 à 17 jours après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 18 ou 30 jours après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris). Pour la deuxième procédure, le début de l’expérience consistera à injecter un produit carcinogène. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Puis, on donnera dans l’eau de boisson un produit déclenchant une inflammation dans l’intestin qui va favoriser l’apparition d’un cancer du colon sur le long terme. Ce dernier produit sera administré 3 fois (à 1 semaine, 4 semaines et 7 semaines après le début de l’expérience) pendant 1 semaine. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Certaines de ces souris seront traitées pendant 1 semaine, 6 semaines ou 9 semaines après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 12 semaines après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

A l'état basal, aucun phénotype dommageable n'a été reporté ou observé au laboratoire pour les différentes lignées utilisées dans ce projet. L’inoculation des 3 lignées tumorales n’entraine pas de douleur systémique spécifique. L'induction du cancer colorectal provoque l'apparition de tumeurs dans le colon distal en 1 à 3 mois avec risque de prolapsus rectaux et une perte de poids inférieure à 10% du poids initial. Le traitement par le tamoxifène entraine une perte de poids modérée (

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, tumeurs, colon etc…) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des cancers, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des cancers et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

REGLES GENERALES. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons 7 souris par groupe pour les analyses de croissance tumorale, d’immunophénotypage par cytométrie de flux et d’analyse histologique. Les groupes seront constitués de 4 souris pour les analyses transcriptomiques. Les expériences seront répétées 3 fois. Nous ne pouvons descendre en dessous de ces valeurs. La taille des effectifs et le nombre de fois où les expériences seront reproduites ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. STRATEGIE D’ANALYSES GROUPEES. Dans la plupart des cas, nos études portent sur des analyses multifactorielles. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences sur différentes lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin les comparer entre elles et par rapport au même groupe témoin. STRATEGIE D'UTILISATION DE SOURIS GENETIQUEMENT MODIFIEES HOMOZYGOTES. Dès qu'il sera possible de le faire, nous maintiendrons nos souris génétiquement modifiées à l'état homozygote pour les transgènes. De cette façon, toutes les souris seront utilisables pour les expériences. STRATEGIE D’OPTIMISATION DES ANIMAUX EUTHANASIES. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver le plus de données possibles par animal. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire le nombre de souris utilisées à un total de 2259 pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum dans des cages de Longueur 36,50 cm, largeur 20,5 cm et hauteur 12,5 cm). Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. L'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi pour permettre aux souris de faire un nid avec des lanières de papier Kraft. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs au moins 3 fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au vétérinaire responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. Une discussion sera engagée pour déterminer s'il y a lieu d'administrer un analgésique et si oui lequel. Le choix dépendra de l'intensité et de la durée de la douleur éventuelle. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, soit nous l'euthanasions et le sortons de l'étude soit on lui donne un analgésique. En général, on choisira plutôt de le sortir de l'étude car les analgésiques peuvent interférer avec le système immunitaire. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Le modèle d’induction de cancer du colon est un modèle préclinique mimant la pathologie humaine. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 6 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.

1 904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections quotidiennes de dérivés d'antidiabétiques et d'immunothérapies, puis des prélèvements de sang, pour évaluer l'effet de ces combinaisons sur le mélanome et les cancers du côlon et du pancréas. Le porteur indique surveiller les tumeurs qui saignent ou suintent et mettre à mort en l'absence d'amélioration. Il affirme que le passage par l'animal est une "étape cruciale" avant l'humain.

Objectifs

Ces dernières années, des résultats encourageants ont été obtenus dans le traitement du mélanome (cancer des mélanocytes qui sont les cellules de la peau responsables de la pigmentation), à l’aide de thérapies ciblées. Mais après une courte période de rémission, le mélanome acquiert, dans presque tous les cas, une résistance contre la drogue. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles molécules candidates pour la mise en place de thérapies spécifiques. Pour ce faire, nous avons fait synthétiser plusieurs dérivés d'anti-diabétiques (composés connus pour leurs propriétés anti- mélanome). Ces composés induisent la mort des cellules de mélanomes sans affecter la viabilité des cellules normales. De plus, certains de ces composés présentent des propriétés anti-invasives. Nos différentes molécules ont préalablement testé in vitro, seules les plus efficaces seront étudiées in vivo (dans un but de réduction du nombre d’animaux), afin de se placer dans un contexte plus physiologique.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, des résultats encourageants ont été obtenus avec l’inhibiteur d’une molécule retrouvée dans 50 % de mélanomes. Cependant, ces réponses restent transitoires. De nouvelles thérapies qui réactivent la réponse immunitaire chez les patients, ont aussi été développées récemment. Mais elles ne donnent une réponse positive que dans 10 à 30% des cas. Il est donc important de développer de nouvelles molécules pour la mise en place de thérapies spécifiques et de combiner ces nouvelles molécules avec les immunothérapies déjà utilisées chez les patients, afin de voir si nos molécules sont capables d’augmenter leurs effets. Les cellules cancéreuses seront injectées en sous cutané dans des souris (souche C57B6J ou BalbC) pour observer l’effet des composés sur la croissance de tumeurs primaires (mélanome, cancer du pancréas et du côlon), en combinaison ou non avec les immunothérapies. Nous étudierons aussi la formation et le développement de métastases et micro- métastases pulmonaires sur les souris. Et nous pourrons observer l’effet des différents composés en combinaison ou non avec les immunothérapies sur la croissance de tumeurs non primaires. Nos composés étants des dérivés d’antidiabétiques, il serait intéressant de comparer les effets du composé antitumoral le plus efficace sur la résistance à l’insuline et sur l’intolérance au glucose avec ceux de la metformine (médicament de référence).

Procédures

1 seule Injection sous cutanée ou intraveineuse (environ 30 sec). Injection intrapéritonéale quotidienne (environ 10 sec) pendant maximum 4 s de traitement. Anesthésie gazeuse au vetflurane tous les 4 jours (environ 15 min). Prélèvement d'une goutte de sang à la queue, 7 fois sur une durée de 2 heures après une seule incision au début de l’expérience. Le prélèvement prend environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour les Injections faites sur les animaux,les sites sont surveillés quotidiennement. Il peut y avoir une inflammation des sites, dans ce cas on traitera à la vétédine quotidiennement et si il n'y a pas d'amélioration au bout de 3 jours, la souris sera mise à mort. Concernant, l'aspect et la taille des tumeurs: il arrive qu'une tumeur saigne ou suinte, dans ce cas traitement à la vétédine quotidien et sans amélioration au bout de 3 jours, l'animal est mis à mort.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale

Remplacement

Après avoir caractérisé et testé in vitro les meilleurs composés antidiabétiques ayant des effets anti-tumoraux en système in vitro, il est maintenant nécessaire de réaliser des expériences chez le rongeur afin d‘avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer si ces drogues sont plus efficaces sur modèles de mélanome et de cancers colique et pancréatique chez la souris . Nous étudierons aussi le rôle de l’environnement tissulaire (interaction cellulaire, interaction cellule-microenvironnement et surtout réponse du système immunitaire) dans la réponse à ces drogues. Le passage chez l‘animal est une étape cruciale pour le développement potentiel de ces molécules chez l‘Homme afin de proposer une alternative à l'échec thérapeutique des traitements actuels.

Réduction

Nous avons choisi de faire des groupes de 10 souris et de faire 3 expériences indépendantes. Ceci nous permettra d’éviter de réaliser la 3ème expérience si, après 2 expérimentations, les résultats s’avèrent statistiquement significatifs, dans le but de réduire le nombre de souris. Dans notre laboratoire, nous réalisons depuis de nombreuses années des expériences de prise de tumeurs sur les souris. L’expérience nous a montré qu’il était plus pertinent de faire des groupes de souris moins importants et de faire des expériences indépendantes. Dans plusieurs de nos protocoles, seules 2 expériences ont été nécessaires pour avoir des résultats significatifs, ce qui nous a permis de réduire le nombre d’animaux. Pour la procédure 1, seules 2 expériences ont suffit pour avoir des résultats statistiquement significatifs. celà nous permet de rajouter une procédure pour mieux caractériser notre dérivé antidiabétique sans avoir besoin de rajouter des animaux dans notre PEA.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Les points limites que nous avons définis sont prédidifs et suffisamment précoses pour éviter toute souffrance ou mal-être des animaux. Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux, qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal- être ou une souffrance

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établie ainsi qu’une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Par ailleurs, la souris est un modèle reconnu et déjà validé pour l'étude de la réponse aux inhibiteurs d'immune checkpoint ce qui représente dans le cadre de notre projet et des molécules que nous voulons tester, un atout très important. Pour toutes les procédures, les souris seront utilisées au stade adulte (6 semaines). Elles seront commandées à 5 semaines et acclimatées pendant 1 semaine. La croissance tumorale est optimale pour les souris à cet âge là et ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà effectuées au laboratoire ainsi qu’avec les données de la littérature.

954 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes, elles reçoivent une greffe de tumeur du péritoine puis des gavages et injections d'antibiotique et d'antiangiogénique, avant un prélèvement de sang par ponction cardiaque, pour tester un traitement du pseudomyxome évitant une chirurgie lourde. Une partie des tumeurs est regreffée à d'autres souris pour entretenir le modèle. Le porteur affirme que cette tumeur, faite de gélatine, ne peut être étudiée in vitro.

Objectifs

Le but de ce nouveau projet est de tester l’effet combiné d’anti-angiogéniques et d’antibiotiques sur l’évolution du pseudomyxome et de ce fait pouvoir déterminer un traitement pour les patients qui ne peuvent supporter une chirurgie lourde.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir déterminer un traitement non invasif qui inhiberait l'évolution du pseudomyxome afin de traiter les patients qui ne peuvent pas supporter une chirurgie lourde et donc le traitement de référence.

Procédures

Les souris sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3%), après une injection sous cutanée locale de Lidocaïne (1mg/kg), seront soumis à une greffe intrapéritonéale d'une tumeur de pseudomyxome(1 fois 5-10min). Puis les animaux vigiles recevront en intrapéritonéale ou par gavage 2 fois par semaine pour l'anti-angiogénique (ou le solvant), et du lundi au vendredi pour le sorafenib et l'antibiotique (ou le solvant) (30secondes à chaque administration). A la fin de l'expérience, 4souris par groupe seront anesthésiées par un mélange dekétamine (80 mg/kg) et de xylazine (16 mg/kg) après une injection en sous-cutanée de buprénorphine 30 minutes avant (0,1mg/kg) (1fois 30secondes) pour l'examen de microangiographie (20- 25minutes). Enfin, les autres souris auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse post-mortem.

Impact sur les animaux

Il n'y a pas d'effets indésirables attendus sur les animaux traités par les antiangiogéniques car ils ont déjà été utilisés dans d'autres projets et sont utilisés à des doses non toxiques. Concernant les antibiotiques, nous n'attendons pas d'effets indésirables non plus mais comme chez l'homme, le risque d'effets notamment sur le système digestif n'est pas à écarté. Nous utiliserons les mêmes doses qui sont utilisées chez l'homme, rapporté au poids de la souris. Cependant, la surveillance quotidienne des animaux et plus précisément des points comme leur poids, leur apparence, leur comportement 2 fois par semaine notifiés dans un cahier de suivi des animaux nous permettront de déterminer si les traitements ont un effet néfaste sur la santé des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale pour la 1ère procédure, par dislocation cervicale sous anesthésie générale pour la deuxième procédure, dès que le poids aura atteint 33g. A la fin de la 1ère procédure, nous utiliserons le sang et la tumeur pour des analyses post-mortem; pour la 2ème procédure, une petite partie de la tumeur obtenue sera greffé à 3 autres souris pour maintenir le modèle.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin. En effet, cette tumeur est très peu cellulaire car essentiellement formée de gélatine, nous ne pouvons l’étudier in vitro. Il est nécessaire de reproduire la maladie par un modèle de greffe orthotopique par greffe de fragments de pseudomyxome en intrapéritonéal sur des souris nudes.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur les modèles de Pseudomyxomes (cancer rare du péritoine) et de la variabilité observée de ces derniers, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire pour tester une expérience. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Vu qu'il y a un risque de mortalité lié à l'intervention permettant la greffe de pseudomyxome, les groupes seront composés de 12 souris. Aussi, nous allons utiliser un seul groupe de souris contrôle pour 2 à 3 groupes de traitement quand cela sera possible. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests de Student et Anova en comparant le groupe Contrôle avec les groupes traités par les combinaisons.

Raffinement

Les souris auront une période d'acclimatation de 5 jours minimum. Les animaux seront observés quotidiennement. Afin d'effectuer la greffe intrapéritonéale de pseudomyxome, les animaux recevront une injection d'analgésie locale et seront sous anesthésie générale gazeuse. Avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie et seront ensuite sous anesthésie générale. Concernant l'examen de microangiographie, les animaux seront aussi sous anesthésie générale. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Nous utilisons l’espèce souris pour notre projet car nous avons besoin d’animaux immunodéficients (cas des souris NOD ou nude). En effet, dans ce cas les tumeurs greffées ont la possibilité de se développer sans risquer un rejet. Aussi, les essais pré-cliniques sur la souris dans le cas du pseudomyxome permettent d’obtenir des informations satisfaisantes pour l’Homme. Les souris seront utilisées à l’âge de 5-6 semaines pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement.

68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans le cerveau sous anesthésie, puis une occlusion de l'artère cérébrale provoquant un accident vasculaire, suivie d'une IRM, pour tester une molécule ciblant un transporteur du folate. Le porteur indique que l'AVC entraîne perte de poids et déficits sensorimoteurs, et que moins de dix pour cent des opérées peuvent mourir d'œdème ou d'hémorragie. Il affirme que l'évaluation d'un traitement suppose un modèle reproduisant l'ischémie puis la reperfusion.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la formation des lésions cérébrales suite à un AVCi est devenu une priorité pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection. L’objectif global du projet est d’évaluer l’impact d'une protéine de transport nommée RFC1 sur les dommages cérébraux dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral (AVC) transitoire. RFC1 (Reduced Folate Carrier 1) est un transporteur membranaire du folate, notamment au niveau de la barrière hématoencéphalique (BHE). Les variants génétiques (polymorphismes) de RFC1 jouent un rôle dans la survenue des AVCi chez l’Homme, ce qui suggère un rôle de RFC1 dans la pathogenèse de l’AVCi. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro et ex vivo sur cette nouvelle cible suggèrent un effet délétère de RFC1 sur l’unité neurovasculaire en condition d’ischémie-reperfusion cérébrale. Afin de confirmer ces résultats et d’aller plus loin dans l’exploration des effets in vivo de RFC1 dans l’AVCi, nous proposons d’évaluer les conséquences d’une mise sous silence transcriptionnelle de RFC1 par imagerie par résonance magnétique (IRM) multiparamétrique. L’objectif spécifique de cette DAP est d’évaluer l’effet de l’administration intracérébrale d’une molécule thérapeutique ciblant RFC1 sur la taille de la lésion cérébrale et l’intégrité de la BHE. Le groupe contrôle recevra une molécule inactive. Notre hypothèse est que ce silençage génique de RFC1 devrait diminuer la taille des lésions, et protéger la BHE.

Bénéfices attendus

Si l’effet neuroprotecteur du silençage de RFC1 est prouvé, cela validera RFC1 comme une nouvelle cible thérapeutique, et il sera possible de tester des molécules permettant d’inhiber RFC1 et de proposer un nouveau traitement de l’AVCi, avec l’espoir à terme de limiter les séquelles neurologiques pour les patients victimes d’un AVCi.

Procédures

L’injection d’un ARN interférent (siRNA) in situ nécessite une injection stéréotaxique, réalisée sous anesthésie générale (

Impact sur les animaux

Suite à l'accident vasculaire cérébrale, les animaux perdent du poids et présentent des déficits neurofonctionnels sensorimoteurs (par exemple hémiparésie et diminution de la sensibilité des vibrisses). La douleur concerne principalement la cicatrice due à l’abord chirurgicale (le cou) car les dommages au niveau du parenchyme cérébral n’engendrent pas de douleur (raison pour laquelle les patients présentant un AVC tardent à se rendre aux urgences). Les animaux sont gardés en vie 24 heures puis ils sont mis à mort à l’issue de l’examen IRM terminal. La principale complication du modèle est le décès par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne (

Devenir

les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement du cerveau pour les analyses complémentaires post-mortem (imagerie ex vivo haute-résolution, immunohistochimie).

Remplacement

Cette étude in vivo vient compléter des études déjà réalisées in vitro et ex vivo (notamment sur microvaisseaux cérébraux isolés) et montrant le rôle de la protéine RFC-1 dans l'ischémie-reperfusion. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des animaux de plus grande taille (chats, primate) grâce à l’utilisation d’un appareil d’imagerie à haut champ dédié aux petits animaux.

Réduction

Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude statistique en prenant en compte la variabilité attendue du modèle et les critères d'exclusion (absence d'infarct cérébral, hémorragie sous-arachnoïdienne). L’utilisation de l’IRM longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion à 24h par la taille de l’atteinte initiale en perfusion ou en diffusion en per-occlusion chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

L’imagerie réalisée pendant l'accident vasculaire cérébral permet de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. L’IRM per-occlusion est également efficace pour détecter les animaux présentant un hémorragie sous-arachnoïdienne précoce (

Choix des espèces

Les souris utilisées pour cette étude seront des souris SWISS car il existe une littérature importante rapportant l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVCi. En particulier, cette souche de souris a peu d'artères collatérales dans le cerveau ce qui permet d'avoir une lésion ischémique plus reproductible d'un animal à un autre. D'autre part, leur pigmentation de peau blanche rend plus facile la pose du cathéter caudal pour les examens IRM nécessitant l’administration d’un agent de contraste (imagerie de perfusion et de perméabilité). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : la maturité cérébrale est atteinte et le poids suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.

303 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie de lésion du cerveau par injection d'une toxine et la pose d'un cadre métallique sur le crâne, puis des séances d'imagerie et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, pour étudier la connectivité cérébrale dans deux modèles de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que la chirurgie de lésion réduit la motivation à se nourrir pendant une semaine environ. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit la complexité du cerveau, ce qui rend selon lui le modèle animal "indispensable".

Objectifs

La maladie de Parkinson touche jusqu'à 4% des personnes âgées 65 ans ou plus et est la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue. Elle est causée par une perte de neurones dopaminergiques entraînant des symptômes moteurs et non-moteurs. La reconstitution des niveaux normaux de dopamine via l’administration d'un médicament est le traitement le plus courant de la maladie de Parkinson. Le médicament atténue de nombreux symptômes, mais pas tous, induit des mouvements musculaires incontrôlables, avec un taux d'incidence rapporté de jusqu' à 80%, après 5 à 10 ans de traitement chronique. La physiopathologie de la maladie de Parkinson et de ces mouvements incontrôlables induits par le médicament n'est pas entièrement comprise, mais des dérèglements structurels et fonctionnels des réseaux neuronaux cortico-sous-corticaux et des modifications du réseau et de la connectivité du cerveau ont été observés. Les techniques de neuro-imagerie fournissent des informations importantes sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson, les mécanismes compensatoires potentiels et les effets liés au traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer, chez la souris, si la connectivité fonctionnelle des réseaux neuronaux est modifiée en fonction de l’état de dépletion de dopamine et de sa reconstitution. Nous utiliserons une technique d'imagerie de l'échographie rapide dans un modèle murin de lésion et un modèle murin génétique de maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier une modification de connectivité fonctionelle des réseaux neuronaux et des connectivité fonctionelles dans deux modèles différents de souris de la maladie de Parkinson. Cette technique sera hautement transposable puisqu'elle mésure le même paramètre physiologique, c'est-à-dire les changements de la perfusion cérébrale, que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle clinique et puisqu'elle produira des profils de réseau en corrélation avec la progression de la maladie et la réponse au traitement. Bien que le projet proposé soit une première étape pour déchiffrer les changements du connectome dans le cerveau de souris malades par rapport au cerveau de souris saines, nous envisageons que l'imagerie pourrait être utilisée dans le développement de médicaments, comme prédicteur de l'efficacité des médicaments et pour cribler de nouveaux candidats médicaments dans des modèles précliniques.

Procédures

Certaines souris subiront une chirurgie de lésion à l'aide d' une drogue et de preparation pour imagerie. Une partie des animaux sera soumise à des études d'imagerie fonctionnelle après une injection aiguë ou chronique de médicaments dopaminergiques. D'autres animaux subiront une évaluation comportementale par plusieurs tests comportmentaux. En tout, 240 souris subiront une chirurgie d'une durée de 20-30 min.

Impact sur les animaux

Certaines souris subiront une chirurgie : le montage d' un cadre metallique sur le crane, et d'autres subiront une opération supplémentaire : la chirurgie de lésion à l'aide d' une drogue. La chirurgie des lésions rendra les animaux moins motivés de se nourrir pendant environ une semaine.

Devenir

Tous les animaux seront mise à mort pour des analyses de tissus post mortem. Pour la fixation du cerveau, une perfusion intracardiaque avec une solution de paraformaldehyde sera utilisée et la procédure sera realisée sous une anesthésie générale profonde. Les tissus sont prélevés sur animaux morts.

Remplacement

Remplacement : A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire la complexité du cerveau, ce qui rend l’utilisation d’un modèle animal indispensable à la réalisation de ce projet. L’analyse de la connectivité sur animal éveillé n’a été mise au point à ce jour que chez la souris.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Nous estimons que N=12 animaux sont suffisants par groupe. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Raffinement : Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthesia générale. Les séances d'imagerie seront réalisées sur animal anesthesie et vigile dont la tête sera immobilisée mais dont le mouvement des pattes ne sera pas entravé ; des séances d'habituation seront effectuées au préalable. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur,souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques.

Choix des espèces

Cette étude vise à étudier la connectivité cérébrale. Le cerveau est un organe dont le fonctionnement est extrêmement complexe, qu’on ne sait pas encore modéliser dans une boite de pétri ou sur ordinateur. Donc, nous devons faire appel à des modèles animaux. Notre choix s’est porté sur la souris car l’étude d’imagerie par ultrasons chez l’animal éveillé a été mise au point seulement dans cette espèce. Les animaux ayant atteint un poids corporel de 30 gr (âgés d'environ 4-6 mois) seront soumis à une chirurgie d'injection intracrânienne de 6-OHDA, les tests comportementaux auront lieu 3 semaines après, pour toutes les groupes expérimentaux.

380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, ils reçoivent de fortes doses de fentanyl ou d'autres opioïdes puis l'antidote, pour comparer les effets respiratoires et leur réversion. Le porteur indique attendre une sédation pouvant aller jusqu'au coma, une rigidité musculaire et, du fait des doses choisies, possiblement la mort. Il affirme que ces effets sur le système respiratoire ne peuvent s'étudier que sur un "animal entier".

Objectifs

Le fentanyl est un opioïde synthétique peropératoire dont l’efficacité analgésique en comparaison à l’intensité des effets secondaires est à l'origine de l'essor de son utilisation en particulier en anesthésie mais aussi dans la prise en charge de la douleur. L’utilisation du fentanyl exposerait néanmoins au risque de toxicité opioïde typique avec survenue d’un trouble de conscience et d’une dépression respiratoire ainsi qu’un risque de dépendance et d’abus. De plus, on observe une rigidité thoracique et diaphragmatique survenant très rapidement après injection, durant près de 15 min et pouvant conduire au décès rapide en l’absence de prise en charge immédiate et optimale. Il a par ailleurs été rapporté la nécessité de plus grandes doses de naloxone, l’antidote utilisé pour reverser les effets des opioïdes. Depuis récemment, le Center for Disease Control (CDC) américain considère que les opioïdes représentent désormais la première cause de mort toxique aux États-Unis, avec une contribution supérieure à 85% du fentanyl et de ses dérivés aux décès. Les effets neurorespiratoires délétères observés en clinique en cas de surdosage par les dérivvés du fentanyl ainsi que la particularité des décès qui leur sont attribués (survenue dans les minutes suivant l'injection d'une forte dose, rigidité musculaire entrainant la paralysie des muscles respiratoires), nous ont conduits à concevoir ce travail expérimental chez le rat, avec pour objectifs d’abord, de caractériser de façon comparative, la réponse ventilatoire et diaphragmatique après administration d’une dose élevée de différentes molécules opioïdes. Ensuite, on étudiera l’efficacité de la réversion de leurs effets neurorespiratoires respectifs par l'antidote de référence.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément les mécanismes et les spécificités de la toxicité neuro-respiratoire à la suite d'overdose aux dérivés opioïdes et ainsi permettre l'optimisation ou le développement de nouvelles thérapeutiques pour la prise en charge des patients intoxiqués.

Procédures

Pour les animaux de la procédure 1 : Procédure chirurgicale (30 mins) et injection de substances (1-2 injections; 5 - 10 secondes). Pour les animaux de la procédure 2 : Procédure chirurgicale (30 mins), injection de la substance étudée (1 injection; 5 secondes) et prélevements sur animaux vigiles (8 prélèvements; environ 1 min). Pour les animaux de la procédure 3 : Procédure chirurgicale (45 mins) et injection de substances (1-2 injections; 5 - 10 secondes).

Impact sur les animaux

En raison du contexte d’exposition des animaux et des effets recherchés dans ce projet, on s’attend à plusieurs effets secondaires à l’utilisation des dérivés opioides y compris : Sédation allant d’une réduction de l’activité locomotrice jusqu’au coma, myoclonies, rigidité musculaire, ou encore l'élévation non contrôlée de la queue. De part le choix de la dose, on s’attend possiblement au décès. La présence de ces effets, leur durée ainsi que leur intensité varient en fonction de l’opioïde utilisé. De plus, les procédures 2 et 3 nécessiteront l'hébergement en cage individuelle des rats à la suite de leur chirurgie et jusqu'à la fin de la procédure.

Devenir

La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite (atteinte du volume sanguin de prélèvement maximal autorisé) qui requiert la mise à mort des animaux.

Remplacement

L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique du système respiratoire intégrée sur animal entier.

Réduction

Par nos expériences passées sur les mêmes modèles animaux, il est estimé qu’un groupe de 6 animaux exploitables est suffisant pour appliquer une analyse statistique et mettre en évidence des différences le cas échéant. Ce nombre est prédéterminé à l’aide du logiciel InVivoStat® (Essex, Royaume-Uni). Pour tous les tests, une valeur de p

Raffinement

Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques dans la limite du possible pour ne pas interférer avec l’expérience en cours et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. L'ensemble des chirurgies de ce projet sera réalisé sous anesthésie générale associé à une analgésie péri-opératoire. Enfin, une ouate en silicone sera utilisée en post-opératoire pour permettre une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement.

Choix des espèces

La quasi-totalité des études expérimentales in vivo effectuées sur les dérivés opioïdes ainsi que sur la physiologie neurorespiratoire a été faite chez le rongeur, et principalement chez le rat. De plus, le rat est un bon modèle pour les études de pharmacocinétique ayant un métabolisme semblable à celui de l’Homme. De par sa taille, les prélèvements sanguins, ainsi que la pose des sondes de télémétrie sont plus aisés et donc plus reproductibles. Enfin, les prélèvements sanguins peuvent se faire de manière repetée sur un même animal permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ces études. Nous utiliserons des rats Sprague-Dawley adultes, âgés de 8 à 9 semaines (jeunes adultes, poids : 250-350 g) au moment de l’expérimentation. Ce stade de développement a été choisi par analogie avec la littérature.

984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rendues obèses par un régime gras, soumises à des cycles de perte et de reprise de poids, à des gavages de tamoxifène ou de doxycycline et à des prélèvements sanguins répétés, certaines isolées cinq jours en cage de calorimétrie, pour étudier les cellules progénitrices du tissu adipeux. Le porteur écrit que "chaque animal sera exploité afin d'apporter le maximum d'information". Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces fonctions et que seule une approche in vivo permet de les explorer.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer l'implication des progéniteurs du tissu adipeux dans les fonctions du tissu adipeux et les conséquences métaboliques à l'échelle des tissus adipeux et systémiques Nous chercherons (i) à identifier des acteurs moléculaires importants dans la fonction fibrotique et inflammatoires de progéniteurs et (ii) à savoir si moduler la fonction des progéniteurs suffit à améliorer en locale les fonctions du tissu adipeux et le métabolisme systémique dans le contexte de l’obésité et des variations pondérales.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'identifier les acteurs moléculaires critiques de la fonction des progéniteurs du tissu adipeux, ce qui permettra à terme de développer des stratégies innovantes pour permettre de limiter les désordres métaboliques qui sont associés à l'obésité. De plus, nos résultats permettront également de trouver des moyens d'optimiser la perte de poids et ses effets métaboliques.

Procédures

Les animaux seront rendus obèses à l’aide d’un régime gras durant des périodes de 4 ou 8 semaines. Chez les animaux anciennement obèses, la perte de poids) est permise soit par le remplacement du régime gras par du régime chow sans restriction calorique et donc disponible ad libitum ; soit par une restriction calorique modérée opérée alors que les animaux sont toujours sous régime gras. Dans ces 2 cas de figure, la perte de poids s’étend sur une période de 4 semaines. Pour le modèle yoyo, l’obésité est induite par un régime gras durant des périodes de 4 ou 8 semaines, ensuite une perte de poids est induite par le remplacement du régime gras par du régime chow (ad libitum) pendant 4 semaines. Puis une ré induction de l’obésité est opérée par une réexposition au régime gras pendant 4 semaines. Chez les souris minces, obèses, anciennement obèses ou yoyo, pour l'étude du contrôle de la glycémie, les animaux seront mis à jeun pendant 4 heures et ils subiront des prises de petits volumes de sang (environ 150ul). Ainsi qu'un gavage ou une injection ip en début d'expérience. Le test de tolérance au glucose ou le test de sensibilité à l’insuline durent environ 2,5 heures. Chaque gavage ou injection dure moins de 20 secondes. Les prises de sang durent moins de 30 secondes. Pour les besoins de certains modèles OGM inductibles, les animaux se verront administrer du tamoxifène par gavage (5jours successifs, 150ul en moyenne, chaque gavage dure moins de 20 secondes) ou de la doxycycline (ajoutée au régime gras pendant 8 semaines ou ajoutée au régime chow pendant les 4 semaines de perte de poids). Afin d'étudier l'homéostasie énergétique, certains animaux seront analysés en cage de calorimétrie pendant 5 jours, ce qui nécessite l’isolement des animaux au cours de la période d’analyse. L’analyse de composition corporelle par RMN ne dure pas plus de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables du projet sont ceux liés à l'induction de l'obésité. En effet, la consommation d'un régime enrichi en lipides tel que celui utilisé ici peut mener à une élévation du taux de cholestérol sanguin, une altération de la glycémie et de la réponse au glucose, qui sont des facteurs de risque cardiovasculaire

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les différents tissus adipeux.

Remplacement

Dans le tissu adipeux, la fonction cellulaire des progéniteurs va être déterminée par le microenvironnement tissulaire complexe. De plus, nos données montrent que l’état d’activation des progéniteurs va en retour avoir des conséquences histologiques et fonctionnelles sur le tissu adipeux. Ainsi, il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire les fonctions des progéniteurs in situ. L’évaluation de l’activité des cellules progénitrices du tissu adipeux en réponse à des changements d'environnement métabolique sont des processus biologiques et physiopathologiques complexes qui ne peuvent être explorés que par des approches expérimentales in vivo.

Réduction

Chaque animal sera exploité afin d’apporter le maximum d’information. Si possible, nous utiliserons les données de manière transversale entre les protocoles afin de réduire le nombre d’animaux. Lorsque cela est possible techniquement, sans affecter la qualité des données recueillies, les modèles de souris partageant un même groupe contrôle seront étudiés en même temps afin de réduire le nombre d’animaux. L’approche de croisement pour produire les animaux génétiquement modifiés est optimisée pour qu’une majorité des animaux produits soient utilisés. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. 984 animaux sont impliqués

Raffinement

Les animaux sont regroupés à 4-5 animaux par cage et le milieu est enrichi avec des bandes de papier et des abris en carton à usage unique. Nous prendrons soin de faire exécuter toutes les manipulations par des personnes expérimentées et compétentes afin de réduire la sévérité et l’intensité de la douleur, ainsi que le stress généré au maximum. Nous avons également choisi un matériel et des procédures adéquats pour limiter la douleur et le stress, avec en particulier l’utilisation des sondes de gavage en plastique fines et souples. Un suivi quotidien sera réalisé afin de veiller au bon état de santé des animaux. De plus, la mise en place de points limites permettra de repérer au plus tôt tout problème. De plus, un suivi hebdomadaire de prise alimentaire et du poids sera réalisé, ce qui permet, en plus des données expérimentales, de s’assurer du bon état de santé des animaux ainsi que de les habituer aux manipulations et ainsi de générer moins de stress lors des procédures ultérieures (tests de tolérance au glucose).

Choix des espèces

Le modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. La présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Nos études requièrent que les animaux soient sexuellement matures avec un métabolisme adulte. Les souris seront donc mises sous régime à partir de l’âge de 8 semaines.