Rongeurs
Rôle du stress mécanique dans l’activation de l’inflammasome NLRP3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1332 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections déclenchant une inflammation, dont un modèle sévère au LPS qui altère fortement leur état général et peut entraîner la mort, la survie étant mesurée. Un modèle de maladie auto-inflammatoire porte sur des nouveau-nés dont l'espérance de vie ne dépasse pas quatorze jours. Le porteur affirme vouloir vérifier in vivo un mécanisme observé sur cellules et décrit le modèle murin comme déjà validé.
Objectifs
L’inflammation est la première réaction du système immunitaire à une agression externe (infection, traumatisme, brulure, etc…) ou interne (cellules cancéreuses) . C’est un processus universel qui concerne tous les tissus faisant intervenir l’immunité innée. L’inflammation est un processus de défense généralement bénéfique mais qui peut devenir délétère lorsqu’elle est dérégulée. Dans des maladies telles silicose, arthrite goutteuse, diabète de type 2, athérosclérose, maladie d'Alzheimer ou sepsis. ). Il existe également des pathologies génétiques spécifiques de l’inflammation appelées syndrome périodique associé à la cryopyrine (CAPS) dans lesquelles une mutation sur un gène entraine une dérégulation de l’inflammation. Ces maladies sont des maladies dites autoinflammatoires qui sont caractérisées par de l’urticaire, des atteintes oculaires, articulaires et neurologiques et qui peuvent engendrer de l’amylose (accumulation de protéines dans les organes). La cause de ces maladies est la mutation d’un gène codant pour une protéine clé dans le processus d’inflammation qui est appelée inflammasome. Cette mutation entraine un gain de fonction pour l’inflammasome dont la conséquence est une dérégulation de l’inflammation. Sur des cellules immunitaires en culture nous avons observé qu’en activant un type de protéines membranaires sensibles à la pression mécanique, nous les rendions plus sensibles aux stimuli déclenchant l’inflammation. Par ailleurs, toujours sur des cellules en culture mais porteuses d’une mutation de l’inflammasome analogue à celle retrouvée chez des patients atteints de CAPS, nous avons observé que la seule activation de ces protéines membranaires suffit à déclencher l’inflammation. Nous voulons maintenant confirmer ces observations dans un modèle murin in vivo afin de vérifier leur validité dans un contexte physiologique. Dans ce but, nous utiliserons une approche pharmacologique en administrant un activateur ou un inhibiteur de nos protéines d’intérêt sur des souris qui seront soumises à un modèle d’inflammation induite. Nous testerons également une approche génétique en générant des souris porteuses d’une mutation qui récapitule une maladie autoinflammatoire afin d’observer si le ciblage de nos protéines d’intérêt peut réduire l’intensité de l’autoinflammation.
Bénéfices attendus
L'industrie pharmaceutique fournit des efforts importants pour le traitement des maladies inflammatoires (silicose, arthrite goutteuse, diabète de type 2, athérosclérose, maladie d'Alzheimer ou le sepsis) et autoinflammatoires (Syndrome périodique associé à la cryopyrine - CAPS) médiées par un type particulier d'inflammasome. Lors de nos observations in vitro, nous avons montré sur des cellules immunitaires en culture, que des protéines membranaires sensibles à la pression mécanique jouent un rôle dans l’inflammation médiée par un type particulier d’inflammasome. Si nous confirmons cette découverte in vivo sur un modèle murin, alors ces protéines membranaires constitueront une nouvelle cible thérapeutique à explorer pour les maladies inflammatoires et autoinflammatoires.
Procédures
- Pour l’activation pharmacologique des protéines d’intérêt : au jour 1, les souris subiront une injection intrapéritonéale (IP) de l’activateur et une injection sous cutanée (SC) d’un antalgique puis, 1h après, une injection IP d’un facteur induisant une inflammation. L’injection d’antalgique est répétée toutes les 6h pendant la durée de l’observation (5j maximum) (252 souris). - Pour l’inhibition pharmacologique des protéines d’intérêt : les souris subiront, au jour 1, une injection IP d’un inhibiteur et une injection SC d’un antalgique puis, 1h après, l’injection d’un facteur induisant une inflammation. L’injection de l’inhibiteur est répétée 1x/jour pendant les 5 jours d’observation. L’injection SC de l’antalgique est répétée toutes les 6h pendant la durée d’observation (5 jours). La durée des injections n’excède pas 5 secondes (504 souris). Pour suivre les événements précoces de l’inflammation, nous avons prévus des cohortes qui subiront un prélèvement sanguin à la veine temporo-mandibulaire aux temps 3h ou 6h après induction de l’inflammation. La durée du prélèvement n’excède pas 15 secondes (504 souris). - Pour le modèle génétique de maladie autoinflammatoire : nous générerons des nouveaux nés qui subiront une injection IP d’un inhibiteur et une injection IP d’antalgique (si nécessaire) par jour pendant les 14 jours d’observation. La durée des injections n’excède pas 5 secondes (324 souris). - Pour le modèle génétique de maladie autoinflammatoire invalidé pour les protéines d’intérêt : nous générerons des nouveaux nés qui recevront une injection IP d’antalgique par jour. L’injection n’excède pas 5 secondes (108 souris)
Impact sur les animaux
Nous déclarons dans ce projet 2 modèles d’inflammation induite : - L’induction d’une péritonite : Dans ce modèle d’inflammation modéré, une inflammation localisée au niveau du péritoine (péritonite) apparaitra après l’injection d’une suspension de cristaux d’acide urique. Les souris sont mises à mort 6h après l’induction de l’inflammation pour analyse des marqueurs de l’inflammation. - Induction d’une inflammation systémique aigüe : un composant de la paroi de bactéries est injecté dans le péritoine et entrainera une inflammation systémique C’est un modèle d’inflammation sévère qui altère fortement l’état général des animaux pouvant aller jusqu’à la mort. La survie des souris sera mesurée pendant 5 jours après l’induction. Nous déclarons aussi la génération de souris modèles d’une maladie autoinflammatoire : les nouveaux nés portant une mutation sur un gène qui joue un rôle clé dans l’inflammation présenteront un syndrome inflammatoire important qui se traduit par une rougeur de la peau, un érythème, une inflammation des organes et un fort retard de croissance. L'espérance de vie de ces animaux ne dépasse pas 14 jours.
Devenir
A l’issue des procédures tous les animaux seront mis à mort : - induction d’une inflammation modérée : tous les animaux seront mis à mort pour analyses post mortem. - induction d’une inflammation sévère : Une partie des animaux est dédiée pour analyse post mortem à des temps précis après l’induction de l’inflammation. Une autre partie est dédiée pour les mesures de survie. Parmi ces animaux certains décèderont du fait de l’inflammation induite. Les survivants ne seront pas réutilisés et mis à mort. - Modèle de maladie autoinflammatoire : l’espérance de vie des nouveaux nés ne dépasse pas 14 jours. Les survivants ne seront pas réutilisés et seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons observé sur des cellules immunitaires en culture qu’en agissant sur un type de protéines membranaires mécano-sensibles on peut moduler le processus inflammatoire qui est pourtant médié par un autre type de protéines dans ces cellules. Nous voulons maintenant vérifier que ce mécanisme observé in vitro, sur un type cellulaire isolé, est toujours présent in vivo à l’échelle d’un organisme ou de nombreux types cellulaires interagissent. Le modèle murin constitue un modèle déjà validé dans le domaine des recherches sur l’inflammation. Par ailleurs des lignées de souris génétiquement modifiées qui récapitulent les maladies autoinflammatoires sont disponibles et validés.
Réduction
Ce projet nécessitera un total de 1332 souris Nous avons prévu dans ce projet une approche pharmacologique et une approche génétique. Pour l’approche pharmacologique, des souris seront traitées par différents composés puis soumises à un modèle d’inflammation induite. Nous avons prévu deux modèles d’inflammation : Le premier est un modèle d’inflammation modéré (péritonite induite) dans lequel 18 souris par groupe seront nécessaires pour comparer statistiquement les niveaux des cytokines inflammatoires entre les groupes. Le deuxième modèle est un modèle d’inflammation sévère dans lequel 18 souris par groupe seront nécessaires pour pouvoir comparer statistiquement la mortalité entre les groupes. Dans ce modèle nous comparerons aussi, à 2 temps différents après l’induction, les niveaux sanguins des cytokines inflammatoires. Pour que la comparaison soit statistiquement fiable, les groupes seront composés de 18 souris. Par souci de réduction, si le modèle modéré nous permet de répondre à nos questions pour l’approche pharmacologique alors nous ne testerons pas le modèle sévère, évitant ainsi l’utilisation de 864 animaux Pour l’approche génétique, nous générerons dans un 1er temps, des souris invalidées pour nos protéines d’intérêt. Ces animaux seront soumis à un des 2 modèles d’inflammation décrits plus haut. Si le modèle modéré nous permet de répondre à nos questions, alors nous ne testerons pas le modèle sévère, évitant ainsi l'utilisation de 216 animaux. Dans un 2ième temps, toujours pour l’approche génétique, nous générerons des nouveaux nés présentant une maladie autoinflammatoire, traités ou non par un inhibiteur de nos protéines d’intérêt, ainsi que des nouveaux nés présentant la maladie autoinflammatoire dans lesquels nos protéines d’intérêt sont invalidées ou non. Pour que la comparaison de la mortalité entre les groupes soit staistiquement fiable, ils devront être composés de 18 animaux. Par ailleurs, les marqueurs sanguins de l’inflammation seront comparés entre les groupes à 2 âges différents. Ici encore, pour une comparaison statistique fiable, les groupes seront composés de 18 individus.
Raffinement
Pour l'approche pharmacologique, les animaux seront soumis à des modèles d'inflammation induites dont un induit une inflammation sévère. Afin de limiter autant que possible leur souffrance, des traitements antalgiques puissants (analogue de morphine) seront administrés préventivement et curativement aux animaux testés. Pour les mesures de survie, des points limites sont fixés en fonction de l'état général des animaux. Au-delà des point limites, l'état de l'animal sera considéré irréversible et il sera euthanasié. Nous avons prévu pour cette approche 2 modèles d'inflammation induite : un modèle modéré (induction par cristaux de MSU) et un sévère (induction au LPS). Si le modèle d'inflammation modérée nous permet de répondre à nos questions, alors nous ne testerons pas le modèle d'inflammation sévère. Pour l'approche génétique qui consiste en la génération de nouveaux nés présentant une maladie autoinflammatoire, nous avons établi une grille d'évaluation spécifique pour les nouveaux nés. Cette grille permettra d'établir un score en fonction des différents paramètres observés. Les nouveaux nés seront observés quotidiennement et, en fonction du score, différentes actions seront réalisées (réchauffage de la cage, réhydratation en injectant du NaCl 0.9%, traitement avec un analogue de morphine). Ce scorage spécifique nous servira également à déterminer le point limite au-delà duquel les nouveaux nés seront mis à mort. Par ailleurs, une attention particulière sera portée à la manipulation des souriceaux : passage dans la litière sale avant remise en contact avec la mère, matériel de nidification placé dans la cage, volumes injectés et aiguilles adaptés aux souriceaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal déjà validé dans le domaine de l’inflammation Par ailleurs, plusieurs lignées génétiquement modifiées sont disponibles : lignées de souris invalidées pour nos protéines d'intérêt et lignées de souris modèle d'une maladie autoinflammatoire (animaux exprimant une mutation analogue à celle retrouvée chez les patients). Pour les modèles d’inflammation induite les souris seront utilisées au stade adulte (à partir de 8 semaines). À ce stade, le système immunitaire est complètement développé. Si les souris sont trop jeunes, le système immunitaire ne sera pas mature. Si les souris sont trop âgées, le système immunitaire ne sera plus assez efficace. Pour les souris modèles d'une maladie autoinflammatoire les animaux seront utilisés dès la naissance.
Impact de l’injection de vésicules extracellulaires avec des profils coagulolytiques différents sur un thrombus veineux in vivo
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ligature partielle de la veine cave pour provoquer une thrombose veineuse, puis une injection de vésicules extracellulaires, pour étudier leur rôle dans la coagulation. Le porteur reconnaît un stress et une douleur liés à la chirurgie. La mise à mort se fait par surdosage anesthésique afin de récupérer le caillot formé.
Objectifs
La thrombose est un sujet de santé publique important puisqu'elle touche environ 70000 personnes par ans en France. L'étude des vésicules extracellulaires dans ce domaine est prometteur car elles sont de potentiel biomarqueur du risque de thrombose. Les vésicules extracellulaires sont produites par toutes les cellules de notre corps et sont impliquées dans de notre processus grâce à leur contenu en protéine. Des travaux préliminaires ont montré qu'elles transportent des protéines décrites dans les processus de coagulation, c'est à dire de formation des caillots mais également dans la dégradation, la lyse, de celui-ci. Ce projet a donc pour but de montrer la contribution des vésicules extracellulaires dans la formation et la dégradation de ces caillots.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du rôle de ces vésicules extracellulaires dans la formation des caillots permettra d'améliorer la prise en charge des patients. En effet, le dosage des vésicules extracellulaires à partir d'un prélèvement sanguins chez les patients permettrait de les classer en fonction de leur risque de thrombose et ainsi d'instaurer un traitement préventif pour éviter l'apparition d'un caillot.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale qui consiste à une ligature partielle de la veine cave inférieure pour produire un phénomène de stase veineux pour reproduire les conditions de formation de thrombose veineuse profonde humaine. Cette intervention est de courte durée, environ 15 minutes. Les animaux recevront une injection de vésicules extracellulaires par voie caudale 30 minutes après l'intervention. De plus les animaux recevront par injections des traitements antidouleurs toutes les 12 heures après la chirurgie.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir une période de stress et/ou de douleur liée à la procédure de chirurgie qui sera exercée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par un surdosage en anesthésiant à la fin de la procédure dans le but de récupérer le thrombus formé dans la veine cave inférieure. Nous effecturons différentes analyses sur celui-ci et nous procèderons à un prélèvement sanguin de l'animaux pour mesurer différents paramètres reflétant les mécanismes de coagulation et de fibrinolyse chez l'animal.
Remplacement
Des expériences réalisées in vitro, dans le but d'étudier l'impact du profil coagulolytique de vésicules extracellulaires, nous ont permis de mettre en évidence leur mise en jeux lors de la formation et de la lyse d'un thrombus. Mais ces modèles in vitro sont très simplifiés. En effet, la formation d'un thrombus in vivo est un processus complexe mettant en jeu de nombreuses entités cellulaires, sub-cellulaires et protéiques. L’étude d'un système aussi complexe n’existe pas in vitro d’où la nécessité de l’explorer in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux strictement nécessaire pour atteindre un résultat significatif a été calculé. Avec comme objectif de résultat une diminution de 50% de la prévalence de formation d'un thrombus dans la veine cave inférieure 10 animaux seront nécessaires par bras expérimental.
Raffinement
L'angoisse des animaux sera dépistée et évitée. Les animaux seront hébergés en groupe (5 individus par cages) dans des conditions d'accès à l'eau et l'alimentation et leur milieu sera enrichi (sous la forme de carré de coton pour fabriquer leur nid) afin de limiter le stress. Des visites régulières post-chirurgie seront effectuées toutes les 12 heures pour s'assurer du bien-être de l'animal grâce à différents critères d'apparence générale (amaigrissement et posture), d'apparence de la peau et du pelage, et de l'interaction avec les autres animaux (hyperactivité, hypoactivité, prostration). Ces observations peuvent conduire à l'euthanasie de l'animal si les points limites sont franchis (par exemple une perte de poids importante). De plus, lors de ces visites une injection d'antalgique sera effectué pour limiter la souffrance de l'animal.
Choix des espèces
La souris est le modèle in vivo disponible le plus simple à exploiter aux vues des données existantes dans la littérature, de sa taille et de sa disponibilité. Les animaux seront utilisés entre 6 et 8 semaines de vie (poids compris entre 18 et 25g) ce qui permet d'avoir un modèle comparable aux données décrites dans la littérature.
Implication du recepteur TREM-1 au cours du syndrome des anticorps antiphospholipides (SAPL)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
138 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 128 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une thrombose est provoquée par sténose chirurgicale de la veine cave, suivie d'injections d'anticorps de patients, pour étudier le syndrome des anticorps antiphospholipides. Le porteur indique que la thrombose peut provoquer douleur, œdème des membres et une possible insuffisance rénale. La mise à mort se fait par ponction cardiaque pour prélever le sang et la veine cave.
Objectifs
Ce protocole in vivo se justifie par la nécessité d’améliorer la compréhension des mécanismes de l’immunité impliqués dans la thrombose liée aux anticorps antiphospholipides : dans le syndrome des anticorps antiphospholipides (SAPL) et dans la COVID-19. Le syndrome des anticorps antiphospholipides est une maladie autoimmune définie par la présence d’anticorps dirigés contre des composants cellulaires de son propre organisme et de thrombose (occlusion) veineuse, artérielle et/ou de la microcirculation. Cette maladie, actuellement non guérissable, favorise la survenue de thrombose telle que l’embolie pulmonaire, la phlébite ou les accidents vasculaires cérébraux. Elle touche environ 0.5% de la population d’une moyenne d’âge de 40 ans au diagnostic. Le traitement anticoagulant habituellement prescrit ne permet pas toujours un bon contrôle de la maladie. Ainsi, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la survenue d’une thrombose due à ces anticorps afin de disposer de thérapeutiques nouvelles. Des travaux ont permis de montrer qu’une partie des globules blancs, les neutrophiles participent à la défense de l’organisme en s’activant et en libérant des pièges cellulaires qui jouent un rôle dans la survenue de la thrombose. Ces anticorps ont la capacité d’activer la production des pièges cellulaires. Au cours d’une infection, ils semblent en partis produits après activation des neutrophiles par le triggering receptor on myeloïd cells 1 (TREM-1). Ce récepteur (protéine capable d’activer les cellules et de transmettre un message après fixation par un composé biologique) semble impliqué dans le SAPL. Notre hypothèse est que TREM-1 joue un rôle dans la formation de la thrombose au cours du SAPL, par l’intermédiaire de l’activation des neutrophiles. Par ailleurs, dans la COVID-19, l’activation très importante de la coagulation contribue à la gravité de la maladie. Chez les patients COVID-19 hospitalisés, la présence d’anticorps antiphospholipides est inhabituellement importante suggérant leur implication dans l'activation de la coagulation. Plus ce taux est élevé, plus les thromboses sont importantes et corrélées à l’activation des neutrophiles, eux même corrélés à la sévérité de l’atteinte respiratoire. De plus, plus la maladie est sévère, plus TREM-1 est activé. Notre hypothèse est ainsi que les anticorps antiphospholipides seraient impliqués dans la COVID-19 de la même manière qu’au cours du SAPL, en activant TREM-1 et les neutrophiles
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus devraient permettre de confirmer le rôle de TREM-1 dans l’inflammation générée par la présence d’anticorps antiphospholipides dans le syndrome des anticorps antiphospholipides et dans la COVID-19 si les anticorps antiphospholipides sont pathogènes dans cette maladie virale et permettre d’envisager une nouvelle cible thérapeutique puisqu’un inhibiteur de TREM-1 est développé.
Procédures
Une thrombose veineuse sera induite chez tous les animaux en réalisant une sténose (rétrécissement du diamètre de la veine favorisant la stagnation du sang et donc la formation d’une thrombose) de la veine cave. Cette procédure chirurgicale réalisée sur des animaux anesthésiés dure environ 1h. Les souris recevront des anticorps (anticorps antiphospholipides, contrôle ou de patients avec COVID-19 avec ou sans antiphospholipides) en injection intrapéritonéale dont le nombre d'injection (1 ou 2) sera determinée lors d'une 1ère phase préliminaire. Les animaux seront ensuite anesthésiés de nouveau pour réalisation d'une échographie de veine cave, prélèvement sanguin par ponction intracardiaque puis mis à mort. Cette échographie d'une durée de 5 minutes environ sera réalisée à 24h ou 48h de l'intervention chirurgicale (délai determinée lors d'une 1ère phase préliminaire). 10 souris réutilisées d'un projet antérieur permettra l'optimisation de la chirurgie et seront mises à mort à l'issue de celle ci. 40 souris permettront l'optimisation du modèle en determinant le nombre d'injection intrapéritonéale d'anticorps et le délai de réalisation de l'échographie. Si les résultats de cette 1ère phase sont satisfaisants, la 2ème phase correspondant à l'étude proprement dite sera réalisées en utilisant 88 souris sauvage ou invalidées pour le recepteur TREM-1.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer un thrombose de veine cave. Cela peut engendrer de la douleur (prise en charge par un médicament antalgique dérivé de la morphine : la buprénorphine) ainsi que de l'oedème des membres inférieurs. Le risque infectieux lié à la chirurgie est peu probable puisqu'elle sera réalisée de façon aseptique et par le porteur de projet qui se sera ré-entrainé grâce aux souris de la phase 1 groupe 1. Il existe également un risque d'insuffisance rénale car la veine rénale droite sera thrombosée. Ce risque est limité car la sténose sera réalisée en dessous de la veine rénale gauche qui sera donc épargnée. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur bien être sera évalué à l'aide d'un score.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour récupération d'un volume sanguin important par ponction intra-cardiaque et récupération de la veine cave inférieure.
Remplacement
Les tests in vitro sont de réalisation difficile pour plusieurs points : premièrement l’activité des anticorps antiphospholipides est différente in vitro et in vivo. Un des anticorps possède une activité anticoagulante in vitro (d’où son nom) et une activité pro coagulante in vivo. D’autre part, un des acteurs clés du SAPL est la béta2GPI. Il s’agit d’une abondante protéine du plasma se trouvant habituellement en conformation circulaire, qui sous l’effet de certains stimuli va se déplier en « J » permettant alors la liaison aux anticorps. La survenue d’une thrombose fait intervenir de nombreux composants cellulaires : cellules endothéliales (cellules constituants la parois des vaisseaux en contact avec le sang), globules blancs (dont les neutrophiles), plaquettes (cellules du sang intervenant également dans la formation d’une thrombose) donc il est difficile d’être proche de la physiopathologie humaine avec un modèle in vitro.
Réduction
Réduction : Le calcul du nombre de souris nécessaire a été effectué via le logiciel G-Power (Université de Düsseldorf). Le risque de première espèce (alpha) a été fixé à 0.05 pour une puissance statistique minimum requise de 80%. Il a été escompté une diminution du thrombus par 3 dans le groupe étudié TREM-1 ko. Ainsi l’effectif minimum pour obtenir une puissance statistique suffisamment fiable était calculé à 11 souris par groupe. Par ailleurs la Phase 2 ne sera débutée que si les souris de la phase 1 ne montrent pas de signes de souffrance que l’on ne peut soulager, ce qui n'est pas attendu.
Raffinement
Les animaux ne seront pas manipulés dans la même pièce que celle où ils sont hébergés. Les souris seront hébergées à 2 par cages individuellement ventilées. Cet hébergement par deux permettra de limiter le sentiment d’isolement tout en réduisant les conflits de dominance au sein des cages et le risque de blessure au niveau des points de suture suite à la chirurgie. Elles seront opérées toutes les 2 le même jours et remises ensemble une fois parfaitement réveillées. Elles seront nourries ad libitum avec les croquettes. Le milieu sera enrichi (buchettes en peuplier, tunnels, matériel de nidification). Les souris seront surveillées quotidiennement par l’utilisation d’une grille de score individuelle. A visée antalgique, les souris recevront une heure avant la chirurgie puis en post-opératoire à 6h de la première injection, un médicament antalgique dérivé de la morphine (buprénorphine) en injection sous-cutanée. Ce même médicament sera administrée dans l’eau de boisson pendant la 1ère nuit. Nous ne pouvons pas utiliser d’anti-inflammatoire puis que nous étudions la voie TREM-1 impliquée dans la réaction inflammatoire générée par l’organisme. La Phase 1, Groupe 1 permettra un ré-entrainement du porteur aux gestes chirurgical sur 10 souris sans réveil, pour optimiser la récupération des suivantes. La phase 2 ne sera pas lancée si la phase 1 est jugée néfaste ou trop sévère sur le bien être animal ce qui n'est pas attendu.
Choix des espèces
Il s’agit du seul modèle animal transgénique KO TREM-1 disponible. D’autre part, la souris est l’espèce la plus utilisée dans la littérature pour l’étude du SAPL. L’induction d’une thrombose veineuse par sténose de veine cave chez la souris est bien décrite dans la littérature et est celui qui se rapproche le plus de la physiologie humaine (absence de discontinuité endothéliale). Notre équipe maitrise l’utilisation de ce modèle chirurgical et l’utilisation d’animaux transgéniques particulièrement ceux déplétés de TREM-1. Les animaux seront des souris adultes C57BL/6, reçues à 6-7 semaines d’âges et inclues dans l’étude à 10 semaines. Le SAPL est une pathologie se développant à l’âge adulte motivant l’âge des souris utilisées.
Evaluation de nouveaux composés pharmacologiques ciblant les hétéromères opioïdes mu-delta pour soulager les douleurs neuropathiques (établissement 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2432 souris vont être utilisées, dont 848 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit une lésion partielle du nerf sciatique qui provoque une douleur neuropathique irréversible, avant des injections quotidiennes et des tests de sensibilité, pour évaluer des composés analgésiques. Le porteur indique que les administrations répétées peuvent provoquer constipation, tolérance, addiction et dépression respiratoire. Une partie des souris est tuée pour analyse des tissus, l'autre transférée vers l'établissement partenaire du projet.
Objectifs
La douleur neuropathique affecte 8 à 10% de la population et, dans nombre de cas, est réfractaire aux traitments actuellement disponibles. Les hétéromères opioïdes mu-delta représentent une nouvelle entité fonctionnelle formée par l'association des récepteurs mu et delta opioïdes. Les données de la litérature indique que l'activation de ces hétéromères induit une analgésie associée à moins d'effets indésirables telles que tolérance et dépendance. Toutefois, les ligands actuellement disponibles présentent de sérieuses limitations soit ils ne passent pas la barrière hématoencéphalique, ce qui limite leur potentiel pour la clinique, soit ils manquent de sélectivité. Le CYM51010 réduit la sensation douleureuse en conditions neuropathiques mais active les récepteurs mu ou delta non associés. Le MP135 présente une séléctivité accrue mais également des effets indésirables forts chez l'animal naïf. Son efficacité n'a par ailleurs pas été évaluée en conditions neuropathiques. Notre projet a pour but de synthétiser des dérivés du CYM51010 qui soient sélectifs des hétéromères mu-delta, présentent une analgésie forte avec peu d'effets indésirables tels que tolérance, dépendance et dépression respiratoire. L'évaluation des molécules sera réalisée en souris naïves ou neuropathiques après lésion partielle du nerf sciatique. Ces nouveaux composés seront comparés à la morphine, composé de référence en clinique, et aux deux petites molécules ciblant les hétéromères mu-delta déjà disponibles, le CYM51010 et le MP135. L'utilisation de lignées de souris déficientes pour l'un ou l'autre récepteur permettra de vérifier la sélectivité des composés. Finalement, l'utilisation de nos lignées génétiquement modifiées exprimant des versions fluorescentes des récepteur mu et delta permettra d'étudier in vivo les mécanismes sous-jacents à l'action des composés, notamment leur internalisation . L'objectif est à terme de proposer de nouveaux composés pour traiter la douleur chronique.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront une meilleure connaissance du rôle physiopathologique des hétéromères mu-delta. L’obtention de composés sélectifs des hétéromères permettra de les cibler in vivo, d’isoler et d’étudier leur contribution spécifique à différents processus dont la nociception. Cet aspect est très fondamental car il permettra d’engager une étude mécanistique des voies de signalisation et des circuits neuronaux impliqués. Ceci est impossible actuellement car les composés existants activent également les récepteurs non associés. D’autre part, obtenir des composés sélectifs permettra, nous l’espérons, d’obtenir une bonne réponse analgésique avec moins d’effets secondaires et d’ouvrir une nouvelle voie thérapeutique.
Procédures
Un groupe de souris adultes sera testé quotidiennement pendant 10 secondes sur une durée de 15 jours et recevra une injection quotidienne d’une durée de 10 secondes pendant 10 jours (soit au total 3 minutes de test et moins de 2 minutes d’injection sur une période de 15 jours). A l'issue de cette période, une partie d'entre elles sera testées pendant 30 minutes dans un second test. Un deuxième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes, recevra après la chirurgie une injection quotidienne de 10 secondes pendant 10 jours et sera testé 20 fois dans deux tests de durée respective de 10 secondes et 3 minutes (soit au total 63 minutes de test et moins de 2 minutes d’injection sur une période de 35 jours). A l'issue de cette période, une partie d'entre elles seront testées pendant 30 minutes dans un troisième test. Un troisième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes et sera testé 10 fois dans deux tests de durée respective de 10 secondes et 3 minutes (soit au total 32 minutes de test sur une période de 35 jours). A l'issue de cette période, elles seront testées pendant 4heures dans un troisième test
Impact sur les animaux
La lésion partielle du nerf sciatique induit une douleur de type neuropathique non réversible qui se traduit par une sensibilité accrue au froid transitoire et sensibilité mécanique augmentée de façon persistente. Pour cette raison, l'efficacité des composés sera tout d'abord testés en souris non douloureuses afin de réduire le nombre d'animaux subissant cette procédure. L'administration répétée des composés pourra induire de la constipation, tolérance, addiction et dépression respiratoire. Les trois derniers sont l’objet de l’étude. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable.
Devenir
une partie des animaux est euthanasiée à la fin de chaque procédure pour analyse des tissus in vitro, une autre partie est transférée dans l'établissement partenaire du projet
Remplacement
L'effet analgésique et les effets indésirables des composés ne peuvent être évalués que sur organisme entier et vivant et ne peuvent être mesurés par une approche en cellules ou en organoïdes.
Réduction
le nombre d’animaux nécessaires au projet a été évalué mathématiquement pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes de 2-5 animaux du même sexe pour respecter leur besoins d'interaction sociale et leur cage enrichie avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation. Le changement de litière se fait avec des tunels pour éviter la prise par la queue et reduire le stress des animaux. L'apparition éventuelle de signes de souffrance ou de détresse est surveillée quotidiennement en portant une attention particulière à tout changement de l’état général (perte de poids supérieure à 15%, défaut de toilettage, plaie ouverte, blessure, déshydratation) ainsi qu'à l'état comportemental (prostration, dos arqué, réticence au déplacement, léthargie, agressivité). Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur est réalisée. Dans les tests comportementaux, un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires) même en absence de réaction de l'animal. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et du gel oculaire est apliqué durant la procédure. Un suivi postopératoire quotidien (pesée, observation de l'œdème inflammatoire) est effectué pendant 3 jours.
Choix des espèces
la souris a été choisie car ces animaux peuvent être modifiés génétiquement et cette espèce est un modèle validé du comportement humain pour les questions abordées dans ce projet. L'utilisation des souris génétiquement modifiées n'exprimant que le récepteur opioïde mu ou delta permet d'évaluer la sélectivité des composés pharmacologiques à tester et celle des animaux exprimant une version fluorescente des récepteurs mu et delta permet de visualiser directement les changements dans leur distribution induits par les traitements. Ces lignées de souris ont déjà été utilisées avec succès pour évaluer des traitements de la douleur neuropathique et la distribution des récepteurs en conditions physiopathologiques. L'étude comportementale nécessite le développement complet du système nerveux soit des souris agées de 6 semaines ou plus
Elucider le rôle du cil primaire dans le développement de la fibrose et de l’inflammation rénale à l’aide d’un modèle murin de néphronophtise.
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont gavées cinq jours de suite pour déclencher une maladie rénale héréditaire, puis suivies par recueil d'urine en cage métabolique. Le porteur signale que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et que les animaux peuvent développer une soif et des urines excessives. Il affirme que les modèles cellulaires, y compris les organoïdes rénaux, ne permettent pas d'étudier un rein vascularisé.
Objectifs
La néphronophtise est une maladie rénale héréditaire rare affectant l’enfant et le jeune adulte. La maladie se révèle par une augmentation du volume des urines et une soif excessive. En parallèle, le rein subit de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein aboutissant à sa transformation en un tissu fibreux non fonctionnel. A terme, la maladie aboutit à l’insuffisance rénale terminale nécessitant le recours à la dialyse ou la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. La néphronophtise est une maladie rénale dont les mutations affectent le cil primaire. Dans le rein, le cil primaire baigne dans l’urine et agit comme une antenne de signalisation. Les mécanismes liant les altérations du cil primaire à la destruction du rein ne sont pas bien compris. L’étude proposée ici a pour objectif d’évaluer le rôle du cil primaire sur le développement de la maladie rénale. A cette fin, nous générerons des lignées de souris génétiquement modifiées permettant de développer un modèle murin qui récapitule la néphronophtise humaine et d’enlever le cil primaire spécifiquement dans le rein dans ce même modèle. Ceci sera obtenu par gavage sur des souris adultes. Le phénotype rénal sera observé à différents temps après le gavage (1, 2, 3, 5 et 11 mois).
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats de ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de la néphronophtise.
Procédures
Les 600 animaux seront soumis à l’âge de 4 semaines à un gavage sur 5 jours consécutifs à l’aide de sondes de gavage à bout arrondie adaptées à la taille de l’animal. La durée de l’acte de gavage est d’environ 1 minute. Chaque semaine les animaux seront pesés. Pendant la durée de la procédure, chaque mois, un spot urinaire sera prélevé par massage ventral pour évaluer le défaut de concentration urinaire. Si ce défaut est observé chez certains animaux à un temps donné, l’ensemble des animaux sera soumis à une mise en cage métabolique, dans le calme dans une pièce dédiée, pendant 48 h : 24h d’adaptation et 24h de recueil des urines. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Enfin, l’ensemble des animaux sera soumis à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale le jour de la mise à mort à l’aide de micro-capillaires héparinés. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Les patients atteints de néphronophtise souffrent de polydipsie (consommation excessive d’eau) et de polyurie (volume d’urine augmenté). Les animaux utilisés dans ce projet sont donc susceptible de développer ces symptômes après gavage au tamoxifène. Chez l’homme l’évolution des maladies rénales chroniques est indolore. A un stade très avancé lorsque la fonction rénale est très altérée (nécessitant le recours à la dialyse ou la transplantation rénale), ces maladies induisent une baisse de l’appétit et une diminution de la masse musculaire. Le protocole établit dans ce projet ne va pas jusqu’à ce stade. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement.
Devenir
A l’issue de la Procédure 1, les 600 animaux seront euthanasiés afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires (cellules épithéliales, cellules endothéliales, fibroblastes et cellules immunitaires) ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro (y compris les organoides rénaux) ne permettent pas l’étude d’un rein in vitro ayant une vascularisation, un flux urinaire, des fibroblastes et des cellules immunitaires. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Pour l’étude statistique, nous utiliserons une ANOVA à 1 facteur suivi d’un test de Tukey pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin de réduire le traumatisme lié aux gavages répétés et réduire les risques de perforation de l’oesophage, des sondes de gavage à bout arrondie adaptées à la taille de l’animal seront utilisées. Afin de limiter les nuisances induites par le développement de la néphronophtise (polyurie, polydispie), une attention particulière sera portée à l’accès en eau avec vérification et remplacement des biberons d’eau régulièrement pour éviter toute souffrance hydrique. La propreté des cages sera également contrôlée régulièrement. Afin de limiter les nuisances induites par la mise en cage métabolique, une période d’adaptation de 24h est réalisée. De plus, la mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Ces souris seront mises à mort 3/4 jours suivant la fin du recueil et une attention particulière sera portée sur les mâles remis ensemble pendant cette période. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Des points limites spécifiques à la procédure ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort par inhalation de CO2 dans un système dédié.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, à la différence des poissons ou des insectes, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons (unités fonctionnelles du rein) fixés après la fin de la néphrogenèse et développe des maladies rénales très semblables à celles observées chez l’homme. Le développement du rein se termine, chez la souris, aux alentours du 14ème jour après la naissance. La procédure décrite dans ce projet sera réalisée sur des souris âgées de 4 semaines donc après la fin du développement rénal. Les souris seront sacrifiées à l’âge adulte à différents temps après l’induction de la délétion (1 mois, 2 mois, 3mois, 5 mois et 11 mois), temps qui ont déjà été étudiés dans d’autres pathologies rénales.
Evaluation de la fonction contractile cardiaque par échographie de stress
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
600 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils subissent une échographie de stress cardiaque après pose d'un cathéter, pour tester des candidats médicaments sur la fonction du cœur. Le porteur décrit une procédure sans douleur du fait de l'anesthésie générale continue. Il indique que le rat possède un système cardiaque proche de l'humain et sert de modèle courant pour ces études précliniques.
Objectifs
L’échographie cardiaque est un examen permettant une analyse précise de la fonction cardiaque et des dimensions des différentes cavités du cœur. Elle est indiquée dans la majorité des maladies cardiaques, pour le diagnostic lors d’apparition de douleurs thoraciques par exemple, mais aussi pour le suivi d’une maladie cardiaque suite à un infarctus ou pour l’évaluation de la fonction cardiaque lors d’une insuffisance cardiaque. La meilleure compréhension des maladies cardiaques a permis de développer de nouvelles classes de médicaments qui ont pour but de diminuer la réponse du cœur à un stress aigu, tel que l’infarctus, et qui vont ainsi le préserver de l’apparition de lésions futures conduisant à l’insuffisance cardiaque. Ces médicaments vont notamment limiter la contractilité du cœur (effet inotrope) ou l’accélération de la fréquence cardiaque (effet chronotrope). L’examen de référence pour étudier ces effets est appelé échographie de stress. Elle a pour but d’évaluer la fonction contractile du ventricule gauche et la fréquence cardiaque en situation de repos et durant une stimulation artificielle du cœur. Un composé induisant un stress cardiaque, l’isoprotérénol, la dobutamine ou la norépinéphrine, est administré dans une veine par perfusion et va donc stimuler les effets inotropes et chronotropes du cœur. Le médicament à tester est alors administré en amont ou conjointement au composé stressant et l’échographie va permettre d’évaluer la capacité de ce médicament à limiter le stress induit. Ainsi, le recours à cette échographie de stress va permettre de tester les effets cardiaques bénéfiques des candidats médicaments. Elle permettra également de valider les doses présentant la meilleure efficacité pour limiter le stress cardiaque. Ultimement, ces validations permettent d’améliorer la connaissance des candidats médicaments avant de les tester sur les modèles d’études plus complexes (infarctus) et chroniques (insuffisance cardiaque).
Bénéfices attendus
Les intérêts d’avoir recours à l’échographie de stress sont multiples : dans un premier temps, c’est un acte simple qui permet de valider l’efficacité d’un candidat médicament sur la contractilité du ventricule gauche et la fréquence cardiaque avant l’utilisation de modèles plus complexes tels que des modèles d’infarctus ou d’insuffisance cardiaque. En cas d’absence d’efficacité, cela permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés dans ces modèles. Ensuite, le recours à l’échographie permet d’améliorer de manière significative le raffinement. En effet, l’échographie est une technique d’imagerie non invasive, de courte durée (environ 30 min dans le cadre de ce projet). Enfin, l’utilisation de l’échographie de stress permet de tester l’effet dose-réponse d’un candidat médicament et donc de déterminer la dose présentant la plus grande efficacité. Cela permet ainsi de maximiser les tests d’efficacités sur des modèles chroniques et/ou des modèles plus complexes. Ainsi, bien que les modèles d’infarctus ou d’insuffisances cardiaques demeurent les modèles de références pour étudier l’évolution des pathologies ischémiques cardiaques, l’échographie de stress représente une alternative fiable aux stades précoces des tests d’efficacités de candidats médicaments sur la fonction cardiaque.
Procédures
Lors de ce projet, l'induction du stress et les traitements avec les candidats médicaments se feront par des voies d’administrations uniques nécessitant une anesthésie générale gazeuse et l’usage dans certains cas d’aiguilles (sous-cutanée, intra-veineuse). L’évaluation de l’efficacité des nouveaux traitements se fera lors d’une procédure effectuée sous anesthésie générale gazeuse à l’issue de laquelle l’animal inconscient sera mis à mort. La préparation de l'animal, qui comprend l'anesthésie gazeuse (isoflurane) + l'administration de lidocaïne (SC)+ la tonte de l'animal + la mise en place de la sonde rectale de température durera 10 min. Ensuite, la mise en place du cathéter durera 10 min. L'échographie basale 1 min et la perfusion du composé stressant 5 min, durant lesquelles seront réalisées des échographies toutes les minutes. Enfin, les animaux anesthésiés seront mis à mort par un administration intracardiaque (1 min). Ainsi la procédure dans sa totalité durera environ 30 minutes.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure, les animaux sont anesthésiés par anesthésie gazeuse (isoflurane) qui peut être génératrice de stress lors de l'induction. La procédure expérimentale n’entraine pas d’effets indésirables chez les animaux, du fait du déroulement sous anesthésie générale. De plus, la procédure étant classée sans réveil, les animaux seront mis à mort sans réveil préalable. Le stress cardiaque sert à reproduire une épreuve d’effort chez l’animal et n’entraine pas de douleurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à l'issue de la procédure
Remplacement
De nombreuses études expérimentales sur les maladies cardiaques, tels que l’infarctus et l’insuffisance cardiaque, utilisent les rats. En effet, cette espèce possède un système cardiaque similaire à celui de l'Homme et l'ensemble des paramètres étudiés est identique à celui mesuré chez le patient humain. Néanmoins, malgré leurs efficacités prouvées pour le développement de nouvelles thérapeutiques, ces études sont complexes et chroniques. L’utilisation de l’échographie de stress permet de développer et de tester de nombreux candidats médicaments en amont de ce type de modèles. En effet, cette procédure va permettre de tester l’effet de nombreux candidats médicaments sur la fonction cardiaque. L'utilisation du modèle animal in-vivo est nécessaire dans ce projet car le but recherché est d'étudier l'effet spécifique d'une molécule au niveau cardiaque suite à une administration dans le système sanguin, tel que classiquement décrit lors de la prise en charge des maladies cardiovasculaires comme l'infarctus. La souche de rat choisie lors de la procédure dépend exclusivement de la demande des laboratoires pharmaceutiques. Elle correspond à celle préalablement sélectionnée pour les données pharmacologiques et sur laquelle est présente l'expression de la cible thérapeutique. L'objectif du projet étant d'obtenir une preuve de concept d'efficacité de ces nouveaux composés in vivo, l'utilisation de rats est nécessaire afin d'évaluer l'effet sur un organe entier et les conséquences fonctionnelles (fonction cardiaque, fréquence cardiaque).
Réduction
Les données préalables obtenues sur ce modèle ont permis d'établir les effectifs d'une série expérimentale à 40 animaux répartis en 5 groupes de 8 animaux. Le nombre d'animaux par groupe a pu être fixé à 8 sur la base de notre expérience passée et de nos données antérieures sur ce modèle ainsi que sur le retour d'expérience des responsables de projet. En effet, chaque animal étant son propre contrôle grâce à l’échographie basale (avant la perfusion du composé stressant), nombre d’animaux utilisé pour chaque série expérimentale est considérablement réduit. L'étude d’efficacité d’un composé constitue une série expérimentale. A raison de 15 séries expérimentales réparties sur 5 ans, le nombre total d'animaux pour ce projet est de 600. L'analyse des données, sera effectuée en aveugle (sans connaissance des groupes) par une seule personne pour éviter tout biais dans l'évaluation de la fonction cardiaque. Les données obtenues seront soumises à des tests statistiques adéquats (non paramétriques). Des t-tests et/ou des ANOVA une voie seront réalisés entre les différents groupes afin d'évaluer l'efficacité du composé testé aux différents temps de l’infusion.
Raffinement
Les animaux sont hébergés pendant leur durée d'acclimatation dans des cages aux dimensions conformes aux recommandations en vigueur et ceci jusqu'au protocole sans réveil. Des enrichissements multiples sont placés dans les cages. À réception, les animaux sont collectivement hébergés (3 ou 2 rats par cage selon le poids). L'eau et la nourriture sont données ad libitum et les animaux ont accès à différents types d’enrichissements (cubes de bois, rouleaux de carton). Lors de la procédure, les animaux sont profondément anesthésiés par anesthésie gazeuse (isoflurane) et ventilés à l’aide d’air enrichi en oxygène afin de prévenir une désaturation artérielle en oxygène. La température corporelle est également finement contrôlée à l’aide d’une sonde rectale reliée à un tapis chauffant. Une analgésie locale est réalisée avant la pose des cathéters veineux. La procédure expérimentale n’entraine pas d’effets indésirables chez les animaux, du fait du déroulement sous anesthésie générale profonde. Le stress cardiaque induit pour l’échographie de stress sert à reproduire une épreuve d’effort chez l’animal et n’entraine pas de douleurs.
Choix des espèces
Un grand nombre d'études expérimentales portant sur l’étude des pathologies cardiaques sont menées sur le rat. En effet, le rat possède un système cardiovasculaire proche de l’Homme et développe des lésions cardiaques reproductibles ce qui en font un modèles de choix dans les études d'efficacités précliniques. Des rats mâles ou femelles en croissance (à partir de 6 semaines) au moment de leur arrivée en acclimatation sont utilisés. Le choix du stade de développement est basé sur l'usage couramment référencé dans la bibliographie, le retour d'expérience et une sensibilité accrue des animaux trop âgés à l’échographie de stress, qui pourrait entrainer une réponse au stress trop intense et risquerait de masquer les effets du candidat médicament. En tant que prestataire, le choix de la souche pour chaque série expérimentale se fera en accord avec le sponsor.
Evaluations de l’efficacité du RCT001, un inhibiteur de CXCR1/2, dans le traitement des cancers de la tete et du cou et mélanome uvéal
- Recherche appliquée
- Cancers
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
110 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des cellules tumorales humaines en sous-cutané puis un composé par gavage quotidien, pour tester un inhibiteur dans le cancer de la tête et du cou et le mélanome uvéal. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable hormis la croissance de la tumeur, alors même que la gravité est déclarée sévère. Il affirme qu'il n'existe aucune méthode alternative à la souris pour ces objectifs.
Objectifs
Ce projet vise à étudier l‘efficacité d’un nouveau traitement anticancéreux dans le mélanome uvéal et dans le cancer de la tête et du cou. Comme dans de nombreux cancers, la néovascularisation et l'inflammation chronique induite par les cellules tumorales stimule la dissémination métastatique et la croissance des métastases de mélanome uvéal et du cancer de la tete et du cou. Cette angiogenèse et inflammation pro-tumorales et pro-métastatiques, dépendraient en partie des cytokines ERL+CXCL et de leurs récepteurs CXCR1/2. Nous proposons de cibler les vette voie de signalisation dans un cancer rare en impasse thérapeutique, le mélanome uvéal, et un cancer « fréquent » mais en impasse thérapeutique après la seconde ligne de traitement. Nous avons choisi ces deux cancers car cette voie de signalisation est associée à un très mauvais pronostic dans ces deux types de cancers. Nous avons développé des inhibiteurs de CXCR1/2. Notre inhibiteur de CXCR1/2 de première génération est efficace in vivo, dans un modele de cancer de la tete et du cou (meme modèle que celui proposé ici), notamment en induisant une diminution de l’angiogenèse et de la prolifération des cellules tumorales. Nous avons amélioré la molécule dont nous souhaitons évaluer l’efficacité in vivo. Nous avons néanmoins des résultats préliminaires sur le modèle de mélanome uvéal démontrant qu'elle est efficace (même modèle que celui utilisé dans cette demande). Les objectifs de ces deux protocoles sont donc de démontrer l’efficacité, dose (3 doses) et fréquence (1 ou deux fois par jours) dépendante de notre inhibiteur de deuxième génération dans deux types de cancers différents. L’efficacité sera évaluée sur l’inhibition de la croissance tumorale mais également sur l’augmentation de la survie des souris.
Bénéfices attendus
Ce projet nous premettra de démontrer l'efficacité de notre candidat médicament (RCT001) dans deux modèles de cancers très agressifs, avec une formulation orale et de manière dose et fréquence d'administration dépendente. Il s'agit d'étude préclinique nécéssaire et obligatoire reglementairement pour une demande d'une première adminstration chez l'homme.
Procédures
Injection de cellules tumorales en sous-cutanée (durée de l'injection : 5minutes) une injection Traitement orale (temps de gavage : 3 minutes) - tous les jours Sacrifice par dislocation cervivale (durée : 1 minute)
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n'est attendu à l'exception de la croissance de la tumeur en sous-cutanée. Nous avons déjà déterminé de la dose maximale tolérée de notre composé avec une administration orale, sur la même souche murine et avec la même formulation. A 1200mg/kg/jours en oral, notre composé n'induit aucune perte de poids ni toxicité hépatique ou rénale. Cette dose est 2 fois supérieure à la dose maximale utilisée dans ce projet (600 mg/kg).
Devenir
Les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale lors de l'atteinte des points limites. Les souris ayant été injectées avec des cellules tumorales, elles ne pourront pas être réutilisées, replacées ou adoptées.
Remplacement
Il n‘existe pas de méthodes alternatives ni substitutives à l‘utilisation de souris pour nos objectifs.
Réduction
Avant de passer au modele in vivo, toutes nos expériences ont été préalablement validées in vitro et in vivo. Nous avons également effectué une large recherche bibliographique. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous baserons sur les données de la littérature et sur nos résultats antérieurs pour les doses administrées de composés pharmacologiques. Le nombre minimum de souris est établi à 10 par groupe pour être statistiquement significatif (en nous basant sur le fait que les traitements expérimentaux induiront une diminution de la prise/croissance tumorale d’au moins 20%).
Raffinement
Les animaux agés de 6 à 8 semaines seront mis dans des cages enrichies (maison et morceaux de papiers) sur portoirs (5 animaux/cage), nourriture et boisson ad libitum. De plus, les expériences seront menées de sorte qu'aucune souris ne reste isolée. Les expérimentateurs procéderont à une évaluation quotidienne de l'état général des souris pour déterminer la présence de signes de stress ou de souffrance (attitude soumise, dos vouté, respiration difficile, extrémités pales, démarche anormale, diarrhée). En cas de stress ou de souffrance important et/ou persistant, les animaux seront systématiquement euthanasiés (cf.section des points limites).
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris : - NOD-SCID, qui constituent le meilleur modèle pour le mélanome uvéal avec injection de cellules humaines sans rejet (données publiées et confirmées par l'équipe). - NMRI-_Foxn1nu /Foxn1nu (nude), qui constituent le meilleur modèle pour le cancer de la tête et du cou avec injection de cellules humaines sans rejet (données publiées et confirmées par l'équipe). Toutes les souris seront traitées par gavage tous les jours durant 1 à 2 mois. Nous utiliserons ici des animaux agés de 6 à 8 semaines. Une fois les groupes expérimentaux réalisés, les animaux seront acclimatés durant une semaine avant de réaliser les injections sous-cutanées des cellules tumorales, ce qui implique de débuter les expériences sur des animaux agés de 7 à 9 semaines (utilisation de souris jeunes mais ayant déjà atteints leur maturité sexuelle et ayant une courbe de poids stable).
Implication d’une isoforme courte de protéine structurale des jonctions communicantes dans les capacités tumorales des cellules cancéreuses prostatiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
152 souris athymiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules cancéreuses prostatiques par implantation sous-cutanée ou par chirurgie intraprostatique, pour évaluer le rôle d'une isoforme protéique dans la croissance tumorale et les métastases. Le porteur mentionne une possible perte de poids et une mobilité réduite en cas de cachexie liée aux métastases. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico ne permet d'étudier la progression tumorale dans un "organisme entier".
Objectifs
Malgré les nombreux progrès réalisés au cours des dernières années dans les domaines de la prévention, de la détection précoce et du traitement du cancer, cette maladie reste un problème majeur de santé publique. Lors de la croissance tumorale, certaines cellules cancéreuses acquièrent la capacité d’envahir les tissus environnants avant de disséminer dans des organes éloignés de la tumeur d’origine. Contrairement aux tumeurs primaires, cette capacité de dissémination n’est ciblée par aucune thérapie spécifique alors qu’elle est la cause majeure des décès par cancer. L’acquisition de la capacité d’invasion et le développement de métastases représentent donc un défi thérapeutique majeur qui nécessite d’en élucider les mécanismes moléculaires. Or, les mécanismes activés pendant la migration et l’invasion tissulaire sont complexes. Des travaux antérieurs ont pu préciser qu'une protéine structurale des jonctions communicantes intercellulaires, lorsqu’elle est localisée à la membrane plasmique, jouait un rôle important dans ces mécanismes moléculaires favorisant les capacités invasives des cellules de cancer de la prostate et dans la sensibilité au microenvironnement osseux dans le contexte des métastases. Il a également été rapporté qu’une isoforme courte particulière de cette protéine, située en intracellulaire, favorise, lorsqu’elle est surexprimée, le transit de la forme structurale longue vers la membrane des cellules cancéreuses prostatiques, les rendant alors plus agressives in vitro. Le présent projet a pour objectif d’évaluer in vivo le rôle protumoral de cette isoforme courte en étudiant l’effet de sa surexpression sur la croissance tumorale et sa capacité à induire et former des métastases.
Bénéfices attendus
Dans le domaine de recherche très peu exploré de cette isoforme courte, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à la présence membranaire de la forme longue de la protéine structurale et son rôle dans la sensibilité au microenvironnement dans le cadre des métastases osseuses. La validation in vivo de l'isoforme courte en tant facteur pro-tumorigénique permettra d’une part de la reconnaitre comme un marqueur prédictif de progression du cancer de la prostate et d’autre d’en faire une cible thérapeutique anti-cancéreuse. Ce dernier aspect nous semble particulièrement important car à l’heure actuelle aucun traitement ne cible particulièrement cette capacité métastatique.
Procédures
Pour cette validation in vivo, 3 procédures expérimentales différentes vont être mises en place mais utilisant toujours les 4 mêmes clones de cellules tumorales à des fins de comparaison. Chacune des procédures correspondra à un site d’implantation/injection différent. La procédure 1 correspondra à une implantation sous-cutanée des différents clones de cellules prostatiques à des souris anesthésiées par voie gazeuse (durée de l'intervention entre 5 et 10 min). La procédure 2 correspondra à une implantation chirurgicale intraprostatique des différents clones de cellules prostatiques à des souris anesthésiées par voie gazeuse (durée de l'intervention entre 20 et 30 min). Enfin, la procédure 3 correspondra à une injection intravasculaire des différents clones de cellules prostatiques à des souris vigiles afin d'étudier l'impact de l'isoforme courte sur leur capacité à développer des métastases dans différents sites secondaires (durée de l'intervention environ 10 min). Le suivi du développement tumoral primaire ou métastatique se fera par imagerie in vivo sur animaux anesthésiés par voie gazeuse au maximum deux fois par semaine pendant 4 semaines pour la procédure 1 et pendant 5 semaines pour les procédures 2 et 3 (durée totale de chaque mesure entre 5 et 10 min).
Impact sur les animaux
Il existe une possibilité de perte de poids et une mobilité réduite en cas de développement de métastases liées à une potentielle cachexie pour les procédures 2 et 3.
Devenir
Tous les animaux des trois procédures seront mis à mort en fin d'expérience par anesthésie gazeuse (isoflurane) puis dislocation cervicale. Les tumeurs primaires seront ensuite systématiquement récupérées lors des procédures 1 et 2. En cas de signal in vivo révélant la présence de métastases, les tissus correspondants seront prélevés. Ces animaux, ayant subi une induction tumorale et développant potentiellement des métastases, ne pourront pas être réutilisés pour un autre projet.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale sur souris par d'autres alternatives in vitro en l'absence de modèles virtuels ou in silico disponibles pour etudier la progression tumorale et la dissémination métastatique dans un organisme entier.
Réduction
Par une approche statistique (Snedecor et Cochran), la réduction au maximum du nombre d'animaux nécessaires en expérimentation a été prise en compte, tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour conduire une étude statistiquement interprétable. Le suivi de la croissance tumorale par bioluminescence par un imageur dedié au petit animal permet non seulement de suivre la croissance tumorale au cours du temps mais également de réduire le nombre d'animaux utilisés en permettant de collecter un nombre important de données par individu.
Raffinement
Ce projet fait suite à des projets antérieurs qui nous ont permis d'affiner au mieux les procédures expérimentales, notamment pour la définition de points de contrôle et limites (comportementaux et physiques). Ainsi, les modalités d'injection des cellules tumorales sont réalisées sous anesthésie générale, avec contrôle de la température corporelle, en présence d'antalgiques et d'anti-inflammatoires en péri et post phase opératoire afin de limiter au maximum la douleur. Des grilles de suivi ont été élaborées pour suivre au plus près le bien être animal. En cas d'apparition de signes de mal-être, un traitement à base de dérivés morphiniques est mis en place immédiatement. De plus, les conditions d'élevage sont optimisées au mieux (hébergement en groupe social de 4 à 5 souris, environnement enrichi avec des conditions de température et d'hygrométrie controlées) afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales et de l'absence d'interférences sur les résultats. Ce projet utilise des animaux immnodéprimés. Les conditions d'hébergement sont adaptées et compatibles pour le maintien du statut sanitaire requis pour ces animaux génétiquement altérés.
Choix des espèces
Afin de pouvoir comparer les résultats que nous obtiendrons à ceux de la littérature, l’utilisation de souris est complètement justifiée. C’est également un modèle animal où l’induction des tumeurs dans les souches Nude est rapide et le suivi de leur croissance facilité par un imageur du petit animal. Les souris athymiques Nude sont très largement usitées dans les études oncologiques qui utilisent des cellules cancéreuses humaines rendant impossible le recours à des souris non immuno-déprimées. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience pour les 3 procédures expérimentales. Cet âge correspond à des animaux matures sexuellement et dont la prostate est suffisamment développée pour permettre une injection standardisée.
Etudes des interactions hôtes-pathogènes appliquées à la recherche de nouveaux types d’antituberculeux.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
6704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1676 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la tuberculose, parfois co-infectées par le SARS-CoV-2, la grippe ou le pneumocoque, et reçoivent des composés par gavage jusqu'à sept jours par semaine. Le porteur indique que les surinfections peuvent provoquer des signes cliniques graves pouvant aller jusqu'à la mort des animaux. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'infection et revendique la souris comme un "modèle incontournable".
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier l'effet de composés (médicaments, substances chimiques ou produits biologiques) à visée thérapeutique contre la tuberculose, et d'évaluer la pathogénicité de différentes souches bactériennes de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou mutantes, ainsi que la contribution de l'hôte à la pathogénicité des mycobactéries in vivo chez la souris. L'intéraction entre la tuberculose chronique et d'autres pathogènes pulmonaires étant encore mal caractérisée, un autre objectif de ce projet sera de caractériser et d'étudier l'évolution de la co-infection (tuberculose et agents pathogènes viraux/bactériens pulmonaires, tels que les virus SRAS-CoV-2 et Influenza H3N2/H1N1 et les bactéries Streptococcus pneumoniae Sérotype 1) dans un modèle de souris.
Bénéfices attendus
Selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé, 9,9 millions de personnes ont développé la tuberculose dans le monde, et 1,5 million de personnes sont mortes de la tuberculose en 2020 (dont 214 000 présentaient également une infection à VIH). À l’échelle mondiale, la tuberculose est la 13e cause de mortalité et la deuxième due à une maladie infectieuse, derrière la COVID-19 (et avant le sida). Cette évolution est principalement liée à la recrudescence de la tuberculose chez des patients immunodéprimés, ainsi qu'à l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nos projets visent (i) à identifier de nouveaux types d'antituberculeux efficaces sur les souches multirésistantes de Mycobacterium tuberculosis, (ii) à comprendre les mécanismes fondamentaux de l'interaction de l'hôte avec ces mycobactéries, afin de comprendre les mécanismes responsables de l’infection, et (iii) à caractériser et étudier l'impact d'une co-infection pulmonaire chez la souris atteinte d'une tuberculose latente.
Procédures
Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés quotidiennement (5 à 7 jours par semaine) par gavage ou voie intrapéritonéale ou une fois par semaine par voie intraveineuse (dans la veine caudale) aux souris non-anesthésiées, pendant 3 à 8 semaines. L’administration par voie endotrachéale ou intranasale peut également être utilisée 3 à 4 fois par semaine et pendant 1 à 3 semaines sur souris préalablement anesthésiées. L'infection des souris avec les différents agents pathogènes pulmonaires est réalisée par voie intranasale sous anesthésie ou par voie intraveineuse ou sous cutanée sur animaux vigiles. Dans le cadre des expériences de co-infections, les animaux seront infectés à deux reprises, (i) avec Mycobacterium tuberculosis, puis (ii) un des autres pathogènes pulmonaires étudiés. Pour l'imagerie, les animaux sont anesthésiés et placés dans une cassette de contention pendant une durée de 5 minutes pour permettre l'acquisition des images (1 à 2 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Lors des expériences de surinfection, des signes cliniques graves pourraient etre observés, pouvant aller jusqu'à entrainer la mort des animaux.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d'expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Remplacement
Aucun modèle expérimental in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la tuberculose pulmonaire évolutive, ni de reproduire la physiopathologie de l’infection respiratoire, ni d’étudier les mécanismes de défense contre l’infection. Seules les études in vivo permettent de déterminer l'efficacité de composés face à une épreuve virulente de M. tuberculosis. Et l’efficacité chez la souris constitue un pré-requis avant toute phase clinique sur l'homme. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du bacille tuberculeux in vivo et l’étude de l’interaction entre l’hôte et les mycobactéries. Les différentes stratégies innovantes de vaccination contre les mycobactéries pathogènes peuvent être évaluées et validées chez la souris qui, infectée efficacement par des souches de M. tuberculosis pathogènes humaines, développe une tuberculose pulmonaire active.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, une partie des organes est également utilisée et analysée par histologie ou par FACS, afin de visualiser la localisation des bactéries dans différents types cellulaires. Une approche par imagerie du petit animal, sous anesthésie, sera développée au sein du Laboratoire de Haute Sécurité pour permettre le suivi de l'infection d'un seul groupe d'animaux au cours du temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Nous espérons à terme que cela puisse réduite le nombre d'expériences.
Raffinement
De façon à réduire le stress, l'inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées avant l''infection ou le gavage. De plus, la surveillance sera accrue, 2 à 3 fois par semaine ou quotidienne, selon les procédures. L'apparence physique, l'alimentation et le comportement des anmaux seront surveillés, afin de détecter le plus tot possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques a été établie et est utilisée pour évaluer un "score" de douleur et permet d'évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables seront euthanasiés. Les souris seront sacrifiées au maximum 10 semaines post-infection, i.e. avant l'apparition des signes de morbidité, sur la base des connaissances de la souche de M.tuberculosis de type sauvage qui est la plus pathogène parmi les mycobactéries que nous étudions. Si des signes de morbidité étaient observés, les points de cinétiques serons revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocément par rapport à celles initialement prévues.
Choix des espèces
1)La possibilité d’induction d’une tuberculose chronique chez la souris par des souches de M. tuberculosis pathogènes pour l’homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2)L’existence de nombreuses similitudes de l’immunité anti-mycobactérienne entre l’homme et la souris, 3)Les nombreuses connaissances disponibles pour cette espèce, font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles. Les animaux (Balb/C et C57BL/6, wild-type et KO) utilisés sont âgés de 6 à 10 semaines au moment de l'infection par M. tuberculosis. Cet intervalle d’âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.
Développement de candidats vaccins ARNm anti-cytokine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenues vigiles par contention, elles reçoivent des injections de nanoparticules lipidiques puis cinq injections quotidiennes de luciférine, avant prélèvements sanguins et imagerie sous anesthésie. L'expérience ne teste pas encore un vaccin mais sert à choisir la meilleure formulation lipidique à l'aide d'un ARNm marqueur. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue la réponse à un vaccin et juge le recours à la souris "incontournable".
Objectifs
Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la surexpression ou dérégulation de certaines cytokines et conduit à l’apparition de la pathologie. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie d’immunothérapie active (stimulation du système immunitaire du patient) reposant sur la production d’anticorps anti-cytokine après administration d’un vaccin appelé ‘Kinoïde’. Ce dernier est présenté soit sous forme de protéine, soit sous forme de vaccin ARN véhiculé par des lipides. L’injection du vaccin Kinoïde™ a pour but d’induire chez la souris des anticorps contre la cytokine d’intérêt. Il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous oblige à les tester chez la souris. Afin de développer ces nouveaux candidats vaccins, nous devons sélectionner dans un premier temps les transporteurs lipidiques permettant de protéger l’ARN et de l’acheminer aux bonnes cellules afin d’induire la production d’anticorps. PPour cela, nous souhaiterions définir la composition des formulations lipidiques (nanoparticules lipidiques ou NPL) optimale dans lesquels seront encapsulés les ARNm afin de permettre une meilleure délivrance aux cellules et ainsi une meilleure expression de la protéine d’intérêt. Pour ce faire, nous utiliserons comme modèle un ARNm codant pour la Firefly luciférase (ARNm-FLuc). Cette dernière, après réaction avec son substrat, la luciférine, émet un photon lumineux, qui permettra d’évaluer par imagerie optique, technique non invasive et non traumatisante, le profil de distribution des différentes formulations lipidiques et l’expression de la protéine en fonction du temps. Ces travaux nous permettrons de sélectionner la meilleure formulation lipidique pour encapsuler nos constructions d’ARNm constituant ainsi une nouvelle voie de protection contre les pathologies allergiques chez l’homme.
Bénéfices attendus
L’évaluation du profil de distribution des différents transporteurs lipidiques en fonction du temps nous permettra de sélectionner la formulation lipidique optimale pour encapsuler nos ARN pour pouvoir ensuite évaluer leur d’immunogénicité .
Procédures
Les 1500 animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes recevront une injection unique de formulation lipidique NPL par voie intramusculaire dans le muscle de la patte arrière (750 souris) ou une injection sous-cutanée dans le flanc (750 souris). De plus, chaque animal vigile maintenu par contention pendant 30 secondes recevra au total 5 injections de luciférine par voie péritonéale, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours. L’anesthésie des souris lors des injections n’est pas prévue. Le prélevement sanguin est réalisé en moins de 30 secondes sur souris anesthèsiees à l'isoflurane. Chaque animal subira 3 prélèvements au total. L’imagerie sera réalisée sous anesthèsie isoflurane sur une durée de 15min, au total. Chaque animal sera imagé 1 fois par jour pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Ainsi, la température de la pièce, la ventilation et l’éclairage seront contrôlés pour limiter le stress des animaux. De plus, le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage afin de leur assurer l’espace nécessaire. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau sera fourni ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal. Les animaux disposent d'une période d'acclimatation (minimum 7 jours) avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter l'angoisse subie. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées par voie intramusculaire, sous-cutanée ont lieu de façon unique et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Seul le stress de la contention impacte brièvement leur comportement. Des effets indésirables peuvent se produire aux sites d’injection (intramusculaire, sous-cutané) tels que des rougeurs, des gonflements ou des lésions pouvant durer quelques heures à quelques jours. Une douleur musculaire localisée pourra entre autres être détectée si l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse.
Devenir
Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. Après la dernière imagerie réalisée, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.
Remplacement
Des tests cellulaires in vitro seront effectués au préalable pour sélectionner les formulations NPL constituées de différents lipides par analyse de l’expression de la luciférase par les cellules. Cette première sélection permettra de ne tester chez l’animal que les formulations optimales et de réduire ainsi le nombre d’animaux.
Réduction
L’utilisation de l'imagerie nous permet de suivre l’évolution de l’expression et de la biodistribution des formulations lipidiques encapsulant l’ARNm injectées chez la souris en fonction du temps. Cette technique non invasive nous permet ainsi de réduire le nombre d'animaux. Si une absence de réponse pour une formulation est observée, l’étude sera interrompue et de ce fait le nombre d’animaux sera réduit.
Raffinement
Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les animaux subissent des contraintes très modérées puisque les procédures effectuées seront légères. Les injections, réalisées par voie intramusculaire et sous-cutanée ont lieu de façon unique et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Seul le stress de la contention impacte brièvement leur comportement. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance (Buprénorphine à 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée) Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. Si un animal présente l'un des points limites à un seuil critique, une injection d’analgésique sera effectuée ou en fonction du grade il sera mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Les souris utilisées seront des souris adultes, de 7 semaines avec un système immunitaire mature pour tenir compte de leur réponse humorale. En effet, il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immune à un vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, préférentiellement la souris, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins.
Rôle des cellules souches et progénitrices dans le développement et la tumorigenèse mammaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie développe des tumeurs mammaires, d'autres reçoivent une greffe de cellules tumorales, y compris des femelles pré-pubères de trois semaines, pour étudier le rôle d'intégrines dans le cancer du sein lié à BRCA1. Le porteur renvoie les retombées thérapeutiques au long terme et au conditionnel, l'étude visant d'abord à comprendre des mécanismes. Il revendique la souris comme un "modèle incontournable" et juge "indispensable" le recours à l'expérimentation in vivo.
Objectifs
Le cancer du sein représente la première cause de décès par cancer chez la femme, principalement dû à une connaissance encore incomplète des mécanismes moléculaires et cellulaires qui induisent le développement tumoral. La glande mammaire est une structure épithéliale constituée d’un système de canaux ramifiés et d’alvéoles. L’épithélium mammaire adulte est composé de cellules luminales sécrétrices du lait et de cellules basales myoépithéliales qui, en se contractant, aident à l’expulsion du lait vers les canaux. Ces deux types de cellules dérivent de la prolifération et de la différenciation de cellules souches mammaires. Or, des études récentes ont montré que l’amplification aberrante des cellules souches est à l’origine de cancers du sein agressifs associés à des mutations du gène BRCA1 (Breast Cancer 1), un gène connu pour être un suppresseur tumoral. Ces cancers appartiennent à un groupe des tumeurs pour lesquelles les thérapies ciblées utilisées dans le traitement d’autres types de cancers du sein (par exemple, les thérapies hormonales) se sont avérées inefficaces. Les intégrines sont des protéines présentes dans la surface des cellules qui permettent leur adhésion et régulent de nombreuses fonctions. Certaines intégrines sont indispensables à la multiplication et la différenciation des cellules souches nécessaires à une gestation et lactation normales. Nous souhaitons étudier le rôle de ces intégrines dans un modèle murin connu pour développer des tumeurs mammaires dont l’origine et les caractéristiques sont très similaires aux cancers du sein avec mutation en BRCA1 chez la femme. Nos premiers résultats indiquant que la perte des intégrines dans ce modèle diminue l’apparition des tumeurs mammaires, nous projetons d’analyser les mécanismes qui expliquent cette inhibition. On déterminera en particulier l’impact de la perte des intégrines dans la glande avant l’apparition des tumeurs (statut pre-néoplasique) et sur son contenu en cellules souches tumorales, connues pour leur implication dans les récidives et la dissémination métastatique.
Bénéfices attendus
L’interaction des intégrines avec la matrice extracellulaire qui entoure les cellules joue un rôle important au cours des différentes étapes de la progression tumorale mammaire, du carcinome in situ (tumeur en stage initiale, souvent bénin) à l’invasion tissulaire (tumeur invasif mais encore localisé à la glande mammaire) et la métastase (invasion d’autres tissues). De façon notable, certaines intégrines sont surexprimées dans les tumeurs du sein et leur expression est associée à un mauvais pronostic et à des taux de survie réduits. Notre étude permettra de déterminer la contribution des intégrines dans le développement tumoral de la glande mammaire et la régulation des cellules souches tumorales, responsables des récidives et de la dissémination métastatique. Notre approche permettra d’évaluer la contribution de ces intégrines dans les anomalies de croissance cellulaire, différenciation et invasion observées dans les carcinomes mammaires humains. A long terme, ces informations permettront de mieux appréhender les mécanismes impliqués dans la communication entre cellules épithéliales et matrice extracellulaire et notamment d’évaluer si des signaux anormalement émis par les intégrines dans le contexte tumoral peuvent constituer des cibles thérapeutiques efficaces pour le traitement de certains cancers du sein.
Procédures
Un suivi des animaux développant spontanément des tumeurs mammaires (observation et palpation) sera réalisé pendant toute la durée de l’expérience (au maximum 4 semaines après la détection des tumeurs). Des expériences de transplantation (greffe) de cellules tumorales dans le tissu adipeux mammaire de souris receveuses seront réalisées. Cette intervention chirurgicale est peu invasive, le péritoine (membrane entourant la cavité abdominale), restant intact. Elle est de courte durée (15-20 min par animal) et s’effectue sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nos souris transgéniques sont viables et ne présentent aucun problème sévère de santé à l’âge adulte. Le modèle de tumorigenèse que nous étudions n’entraînent pas de souffrance notable. Les nuisances liées au développement tumoral sont faibles et les souris portant des tumeurs seront analysées en moyenne 2 semaines après leur détection, avec un maximum de 4 semaines pour les tumeurs à croissance lente. Les tumeurs restent localisées à la glande mammaire et ne sont pas métastatiques dans notre fenêtre expérimentale. L’apparition de tumeurs sur d’autres organes reste extrêmement rare dans ce modèle. De possibles mais rares ulcérations peuvent se produire dans les tumeurs mammaires chez certains animaux. Les animaux opérés pourront éventuellement développer des tumeurs mammaires qui, d’après la littérature, reproduiront le phénotype de la tumeur originale avec, notamment, une absence de développement métastatique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour analyses post-mortem
Remplacement
Notre projet repose sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées (souris transgéniques) pour définir les mécanismes qui régulent les cellules souches et leur contribution dans les cancers du sein. La glande mammaire est un tissu spécifique aux mammifères dont le fonctionnement normal est contrôlé par un ensemble complexe de régulateurs hormonaux et locaux. La souris reste à ce jour le modèle le plus pertinent pour étudier la biologie des cancers du sein. Les souris transgéniques sont reconnues comme des modèles incontournables pour explorer les mécanismes de tumorigénèse et développer des thérapies. Bien que nous utilisions des méthodes alternatives réduisant l’utilisation des animaux, en particulier des cultures pour modéliser le comportement des cellules tumorales in vitro, il est indispensable d’effectuer des expériences in vivo pour comprendre la formation et la progression des tumeurs dans leur environnement physiologique.
Réduction
Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible pour maintenir une signification statistique. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements de glande mammaire, on utilise chaque glande mammaire d’une même souris donneuse, celle-ci étant pourvue de 5 paires de glandes. Des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées.
Raffinement
Les animaux seront manipulés le moins possible. Les souris seront surveillées soigneusement pour détecter tout signe de détérioration des conditions cliniques. L’apparition de tumeurs sera surveillée à partir de l’âge de 4 mois (l’âge moyen d’apparition de tumeurs dans ces souris est de 7,5 mois). Des palpations seront effectuées trois fois par semaine. Un examen complet au moins hebdomadaire (fréquence adaptée à l’évolution) des souris développant des tumeurs permettra de détecter des signes précoces de détresse et de maladie. Les points limites sont soigneusement définis avec une surveillance attentive des signes cliniques. Des fiches d'évaluation clinique sont mises en place pour ce projet spécifique. Les expériences de transplantation se font sous anesthésie générale. Pour minimiser les risques d’infection, les instruments de chirurgie sont stérilisés et les surfaces et la loupe utilisées, soigneusement lavées et rincées à l’éthanol. Pendant l’opération un gel de protection oculaire est appliqué aux animaux pour éviter le desséchement. Des analgésiques, sont administrés 20 min avant l’anesthésie (buprenorphine, carprofen), puis relais 24h après l’opération (ibuprofène). Après l’intervention, nous utilisons du fil de suture stérile résorbable pour refermer la plaie. En post-opératoire, les souris encore anesthésiées sont réhydratées et placées sur une platine chauffante pour éviter l’hypothermie. Les souris greffées sont surveillées tous les jours afin de déceler tout signe de mal-être et pour détecter l’apparition de tumeurs (palpation trois fois par semaine). Si elles présentent des signes de mal-être (amaigrissement, prostration), elles sont mises à mort avant la fin programmée de l’expérience.
Choix des espèces
Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Par ailleurs, la connaissance du génome murin, sa forte homologie avec le génome humain et l’existence de divers modèles génétiques murins rendent ce modèle puissant. Enfin, c'est un animal facile à anesthésier, ce qui permet de réduire au maximum le stress qui pourrait être provoqué chez l'animal. Ainsi, ce modèle animal est le meilleur compromis entre l’étude d'un modèle animal mammifère et l’obtention de réponses pertinentes aux questions posées. Pour l’analyse des tumeurs, les souris avec un phénotype potentiellement dommageable sont euthanasiées à l’âge adulte (à partir de 5-6 mois d’âge lors de l’apparition des tumeurs ou avant, pour analyse de la glande pre-néoplasique). Les tumeurs sont analysées avant qu’elles ne génèrent de signes de souffrance chez les souris. Les souris receveuses utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles pré-pubertaires âgées de 3 semaines. A ce stade, l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du tissue adipeux resté intact.
Étude de la plasticité neuromusculaire et cardiaque dans un modèle murin de laminopathie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié tuée sous anesthésie avant tout réveil. Elles portent une mutation qui reproduit une laminopathie humaine et les fait décliner jusqu'à la mort par atteinte cardiaque vers huit mois. Trente-six subissent des électroneuromyographies avec aiguilles intramusculaires et des mesures de force, trente-six une perfusion intracardiaque, pour mieux comprendre la maladie. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro, ex vivo ou in silico n'existe et décrit un modèle qui ne peut pas être remplacé.
Objectifs
Les laminopathies constituent un ensemble très hétérogène de maladies génétiques caractérisées par des mutations dans des gènes codant des protéines nucléaires appelées lamine A et C. Parmi elles, plusieurs sont des maladies à expression préférentiellement neuromusculaire dont l’une d’entre elle se caractérise par une apparition précoce des symptômes souvent associés à une atteinte cardiaque appelée cardiomyopathies. Ce projet a pour but l’exploration des modifications fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et cardiaque permettant une meilleure compréhension de ces maladies et une prise en charge adaptée des patients dans un modèle murin de la pathologie. Le modèle murin de référence utilisé dans ce projet est porteur d’une mutation décrite chez l’homme et récapitulant, à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques musculaire et cardiaques décrites chez l’homme et détectable dès 3 mois allant jusqu’au décès des animaux à 8 mois.
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats obtenus permettront de progresser sur les connaissances physiopathologiques synaptiques et cardiaques dans le cadre de défauts de protéine de l’architecture nucléaire, permettant ainsi une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les laminopathies.
Procédures
Dans ce projet, 36 animaux subiront une étude Electroneuromyographiques (ENMG) sur la patte gauche des souris (gastrocnemius) mutantes et contrôles (d’une durée de 8 minutes/animal) à 3 âges de la pathologie (3, 6 et 8 mois) et une semaine après des mesures de la force musculaire directe et indirecte (d’une durée de 20 à 30 minutes) sur la patte droite des souris mutantes et contrôles à 3 âges de la pathologie (3, 6 et 8 mois). Les 36 autres animaux subiront un acte de perfusion intracardiaque permettant une analyse macroscopique du cœur des souris mutantes et contrôles (d’une durée de 15 minutes) à 3 âges de la pathologie (3, 6 et 8 mois). Tous les actes du projet sont effectués sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Dans chaque acte du projet des risques anésthesiques incluant un possible réveil ainsi qu’une détresse respiratoire peuvent survenir. Pour l'acte d'électromyographie, des nuisances post opératoire dû aux aiguilles intra-musculaire peuvent apparaître tel que une infection, inflammation et une douleur ou incorfort. Le modèle utilisé dans ce projet présente des atteintes cardiaques qui pourraient accentuer le risque d'anesthésie lors de chaque acte.
Devenir
Le protocole compte un lot 72 animaux (souris). Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des 2 procédures du projet. Des prélèvements de nombreux tissus et organes seron prélevés par la suite pour procéder à des analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
Dans ce projet nous anticipons l’utilisation d’un nombre total de 72 animaux respectant ainsi les règles des trois R de remplacement, de réduction et de raffinement. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la pathologie neuromusculaire et cardiaque. Selon les connaissances actuelles, il n’existe aucune alternative in vitro, ex vivo ou in silico pour répondre à la question scientifique à la fois pour l’analyse fonctionnelle et structurelle des jonctions neuromusculaires mais également l’étude macroscopique du coeur.
Réduction
Les souris modèles et contrôles seront étudiées à différents stades allant de 3 mois (stade précoce de la pathologie, 6 mois (forme installée de la maladie) et 8 mois (stade tardif de la pathologie avec mort des animaux causé par une atteinte cardiaque) permettant une analyse aux différents stades de la pathologie. Il y aura 3 groupes de 12 souris selon l’âge des animaux. Les évaluations réalisées dans le cadre de ce projet sont réalisées en routine depuis de nombreuses années dans l’établissement et le nombre d’animaux requis pour atteindre les objectifs scientifiques est par conséquent bien établis et déjà réduit au strict minimum (n=3 groupes de 12 souris suivant l’âge des souris, soit un nombre total de 72 animaux au maximum).
Raffinement
Les souris seront stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). Le milieu est enrichi avec des igloos (maisonnettes) en polypropylène sont disposés dans les cages permettant les jeux et le repos des souris. Au cours des procédures, seuls les animaux sur lesquels il y a une intervention seront amenés dans la pièce d’expérimentation. Les animaux seront anesthésiés avec un mélange d’analgésique et d’anesthésique en intrapéritonéal ou bien par anesthésique gazeux. Pour les deux procédures, une injection d’analgésique sera administrée pour le bien-être de l'animal. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (suivi de poids hebdomadaire, évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de nécroses ou escarres) et des points limites ont été définis. Cependant, l'expérimentateur référent de l'électroneuromyographie assure une reprise totale de l'animal et n'a observé aucun état de mal-être à la suite de cette acte.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé dans ce projet de recherche récapitule à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la pathologie neuromusculaire et cardiaque étudiée. Les premiers symptômes sont détectés dès 3 mois chez les mâles homozygotes et évoluent rapidement jusqu’au décès des animaux vers 8 mois provoqué principalement par l’aggravation du phénotype cardiaque. Ce modèle permettra d’étudier les modifications fonctionnelles et structurelles des jonctions neuromusculaires et cardiaques, conséquences des défauts de l’enveloppe nucléaire dans ce modèle murin qui ne peut pas être remplacé.