Rongeurs

552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées quotidiennes sous anesthésie, des prises de sang répétées et un adénovirus par voie intraveineuse pour induire une sclérodermie systémique, une maladie auto-immune, avant le prélèvement de la peau et des poumons. Le porteur indique que l'induction ne dégrade pas l'état général, mais qu'un fort dosage de l'adénovirus peut causer une perte de poids importante. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne reconstitue la complexité de la maladie.

Objectifs

La sclérodermie systémique (ScS), une maladie auto-immune rare (9/100000 habitants) et au pronostic vital sombre dans les formes sévères. Elle associe une atteinte des petits vaisseaux, des anomalies immunologiques (présence d’auto-anticorps) et une fibrose touchant la peau et les organes internes. A ce jour, il n'existe aucune stratégie thérapeutique efficace, notamment contre la fibrose qui est responsable d'une altération profonde de la qualité de vie des patients et qui grève leur espérance de vie. Ainsi il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourrait améliorer le devenir des patients atteints de ScS. Des études récentes montrent que 50% de patients atteints de ScS présentent une augmentation systémique de la molécule pro-inflammatoire : l’interféron de type I (IFN-I). La présence de d’IFN-I chez ces patients semble être associé à une sévérité plus importnante de la pathologie. Cependant, quelle est la fonction de l’IFN-I dans la dans le développement de la ScS n’est pas encore connu. Nous proposons de tester l’impact de la déficience en IFN-I ainsi que de sa surexpression sur le développement de la ScS dans deux modèles de souris représentatifs de la pathologie. Si nos résultats, montrent que l’IFN-I contribue et exacerbe la ScS, nous proposons également d’étudier l’intérêt thérapeutique du ciblage de l’IFN-I par des anticorps dans nos modèles de ScS.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser le rôle de l’interféron de type I dans la pathogenèse de la ScS et ces mécanismes d’action. En cas de résultats positifs ce projet permettra de proposer de nouvelles approches thérapeutique pour les patients atteints de ScS

Procédures

Les souris sont soumises à des injection sous cutanée journalière après anesthésie des animaux. Des prises de sang sous mandibulaires sont effectuées toutes les trois semaines après anesthésie des animaux. Des injections intraveineuses sont effectuée dans le sinus veineux retro-orbitaire après anesthésie des animaux. Des injections intrapéritonéales sont effectuées sur des animaux vigiles.

Impact sur les animaux

L’induction de la ScS ne cause pas une détérioration de l’état général de l’animal. L’apparition de la fibrose sera suivie de manière quotidienne et les animaux seront euthanasiés 6 semaines après l’initiation de la ScS avant une possible détérioration de leur état général. Cependant les injections répétées sous cutané causent un inconfort des animaux du fait de leur anesthésie et manipulation journalière. Les gestes sont maitrisés par les personnes impliquées dans le projet, ce qui réduira leur temps de la manipulation et de l’anesthésie des animaux. L'Adénovirus (AV) qui permettent la surexpression de l’IFN-I est injecté par voie intraveineuse dans les animaux anesthésiés. Cette procédure très rapide (

Devenir

Procédure 1: A la fin de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prelever la peau et des poumons pour évaluer l’impact de l’IFN-I sur la ScS. Procédure 2: 12 animaux dans une expérience pilote seront mis à mort à la fin de cette procédure. Les autres animaux (180) seront gardés en vie et utilisés afin d’induire le développement de la ScS (procédure 1). Procédure 3 : Tous les animaux dans cette procédure seront mis à mort à la fin de la procédure afin de vérifier l’efficacité du traitement par l’anti-IFNAR sur le développement de la ScS

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle de souris récapitulant la maladie observée chez l'homme, peut apporter la preuve du rôle de l’IFN-I dans le développement de la ScS. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro ou ex vivo, qui ne reconstituent pas la complexité de la maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Nous utilisons les souris femelles pour notre projet, cependant les souris males issues de nos croisements ne seront pas mis a mort. Celles-ci sont utilisées dans le cadre d’un projet sur l’obésité (DAP 33484).

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bienêtre (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang sous mandibulaires, les injections i.v et les injection s.c sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort leur douleur.

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Les souris génétiquement modifiées sont uniquement disponibles dans cette espèce et sur ce fond génétique. De plus, elles sont sensibles aux traitements par le HOCl et la Bléomycine qui induisent le développement de la fibrose cutané et pulmonaire respectivement, qui sont des traits caractéristiques de la ScS. Les animaux seront utilisés dès qu’ils atteignent l’âge adulte de 6 semaines pour l’expérimentation. C’est l’âge au quel les souris ont été décrites pour répondre au traitement et donc développer une ScS.

207 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de peau humaine et une injection de cellules humaines qui déclenche une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et mise à mort dès 20 % du poids perdu, pour tester un inhibiteur de MEK contre le rejet de greffe. Le porteur renvoie au conditionnel les arguments attendus pour l'humain. Il présente ces souris humanisées comme une alternative aux primates.

Objectifs

Les inhibiteurs de calcineurine permettent de prévenir le rejet aigu précoce néanmoins après quelques années survient une dysfonction chronique du greffon liée à la néphrotoxicité des inhibiteurs de la calcineurine et à un mauvais contrôle de la réponse immune. La fibrose interstitielle et l’atrophie tubulaire en elle même participent aussi à la dysfonction chronique du greffon. Ainsi l’amélioration de la survie des greffons nécessite de nouvelles stratégies immunosuppressives contrôlant mieux la réponse immune et la progression de la fibrose. Dans cette optique, les inhibiteurs de MEK sont une piste encourageante. Les mutations de la voie MAPK (mitogen-activated-protein-kinase) classique sont parmi les plus rencontrées en cancérologie. Ainsi des inhibiteurs de cette voie (inhibiteur de MEK) ont été développés, dont le trametinib, qui depuis 2013 a une autorisation de la FDA (Food and Drug Administration) dans le traitement du mélanome. La voie MAPK classique étant située en aval du TCR (T Cell Receptor), les inhibiteurs de MEK ont un effet immunosuppresseur. En transplantation, ce dernier a été décrit dans des modèles murins de Graft versus Host Disease et de greffe cardiaque et dans un modèle de transplantation pulmonaire chez le rat. Dans ces modèles les inhibiteurs de MEK s’opposent à l’activation des CD8 et favorisent l’épuisement des lymphocytes CD4 allo-réactifs. Par ailleurs les inhibiteurs de MEK favorisent le développement des lymphocytes T régulateurs. Enfin, dans des modèles murins, les inhibiteurs de MEK permettent de prévenir la fibrose rénale. Avec un très bon profil de tolérance, ces molécules apparaissent comme une bonne alternative aux anti-rejets conventionnels. C’est pourquoi nous souhaitons étudier l’effet d’un inhibiteur de MEK sur la prévention du rejet de greffe de peau humaine chez la souris NSG (Nod Scid Gamma) humanisée. Dans un 1er temps, nous étudierons l'effet de l'inhibiteur de MEK sur l'humanisation (105 souris) des souris.Dans un 2nd temps,nous étudierons l'effet des inhibiteurs de MEK sur la greffe de peau (102 souris)

Bénéfices attendus

Les inhibiteurs de MEK ont montré une bonne efficacité pour prévenir le rejet de greffe et un effet anti-fibrotique dans des modèles murins. Cependant, ces modèles ne peuvent valider l’efficacité d’une molécule sur les cellules du système immunitaire humain. Le passage dans un modèle in vivo mimant la situation complexe que constitue le système immunitaire humain apportera des arguments supplémentaires quant à leur efficacité pour prévenir le rejet de greffe chez l’homme.

Procédures

Une greffe de peau sous anesthésie générale, durée de l’opération 1 heure. Une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, 5 min. Administration quotidienne du traitement par voie orale, 1 min. Prélèvement de sang , 1 fois par semaine, 5 min.

Impact sur les animaux

La greffe de peau humaine chez la souris NSG n’entraîne pas de signe clinique chez la souris. L'humanisation des souris avec des cellules hPBMC entrainera des signes cliniques liés à l’apparition d’une xéno-GVHD (graft versus host disease) lorsque la quantité de cellules humaines sera suffisamment importante, notamment des lymphocytes T. Les souris seront surveillées quotidiennement au niveau comportemental et pesées 3 fois/semaine puis tous les jours lorsque les premiers signes cliniques apparaîtront ; chute de poids notamment. L'animal sera euthanasié si le poids atteint une perte de poids de 20% du poids initial. Le comportement général de la souris sera observé et l’animal sera euthanasié si un comportement anormal est constaté (par exemple, animal isolée du reste de ses congénères, dos vouté, poils hérissés).

Devenir

Toutes les souris de la procédure 1 seront utilisées pour la procédure 2. A l’issue de la procédure 2, les souris seront euthanasiées.

Remplacement

La molécule que nous souhaitons tester chez la souris NSG humanisée a déjà été étudiée in vitro et in vivo dans des modèles murins. Le passage dans un modèle in vivo mimant la situation complexe que constitue le système immunitaire humain apportera des arguments supplémentaires quant à son efficacité pour prévenir le rejet de greffe chez l’homme.

Réduction

Les données issues de ce projet devront donc être suffisamment robustes (c'est-à-dire validées avec tests statistiques). Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques (Test de Mann- Whitney) car nous ne pourrons pas nous assurer d’une distribution normale (non gaussienne) (n < 30). (Nombre total d’animaux 207).

Raffinement

Lors des manipulations pouvant générer une douleur les animaux bénéficieront en amont d’une analgésie adaptée. Les souris seront hébergées sur des portoirs ventilés, avec un enrichissement adapté. Elles seront suivies quotidiennement lorsque les cellules humaines seront injectées et les signes cliniques notables et sévères décrits dans le tableau en annexe de cette saisine seront notés. Lorsque 3 signes cliniques notables ou un seul signe clinique sévère seront notés alors les animaux seront sortis du protocole et euthanasiés. Tous les animaux seront analysés post-mortem avec des prélèvements d'organes en vue d'études immunohistochimiques ou histologiques permettant de caractériser au mieux l’effet de la molécule testée.

Choix des espèces

Les souris immunodéficiences NSG sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre. Il est possible de reconstituer un système immunitaire humain dans ces souris, par injection de PBMC humains. Ces souris ainsi humanisées offrent une alternative à l'utilisation de primates en recherche clinique. Nous choisissons volontairement de tester notre modèle sur les souris NSG ne connaissant pas à ce jour l’impact des anti-MEK dans l’humanisation de ces deux types de souris immunodéficientes. Lors des greffes de peau les souris NSG seront adultes (âgées de 6 à 8 semaines). Le modèle d'humanisation avec des hPBMC se réalise sur des souris adultes de 8 à 15 semaines (par expérience et sur les données de la littérature). La prise des greffes de peaux, après une phase de rétractation/asséchement, n'est effective qu'après 4/5 semaines ce qui justifie l'âge des souris lors de la greffe et de l'humanisation. Au moment de l’humanisation avec des hPBMC elles seront agées de 11 à 13 semaines pour permettre à ces cellules humaines de se développer et nous permettre d'utiliser ces animaux humanisés vers 2-3 semaines post humanisation avec les hPBMC.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de candidats vaccins contre l'allergie par voie intramusculaire ou sous-cutanée, puis des prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire, une technique qui peut provoquer des atteintes oculaires décrites par le porteur. Ce dernier indique tester plusieurs doses, formulations et voies d'administration pour sélectionner le meilleur candidat avant un passage chez l'humain. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'évaluer la réponse immunitaire à un vaccin, ce qui le conduit à recourir à la souris.

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la dérégulation de certaines cytokines et conduit à l’apparition de la pathologie chez l’individu. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie de vaccination qui permet de produire, chez le patient, des anticorps contre la cytokine sur-exprimée. Ce vaccin appelé ‘Kinoïde™’ peut se présenter soit sous forme de proteine, soit sous forme d’un acide ribonucleique messager (ARNm). Il n’existe pas à ce jour de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous contraint à les tester chez la souris. L’efficacité du vaccin sera évaluée selon sa capacité à induire une réponse immunitaire capable de bloquer l’activité biologique de la cytokine. Dans le cadre de ce développement, nous devons sélectionner le meilleur candidat vaccin qui induira une réponse immunitaire efficace et de longue durée chez la souris. Pour cela, nous devons dans un premier temps tester plusieurs paramètres spécifiques à chaque vaccin. Nous allons ainsi tester un nombre croissant de doses de vaccin (en deux et trois injections), plusieurs formulations vaccinales ainsi que deux voies d’administration (intramusculaire et sous-cutanée). Ces études permettront de valider et de sélectionner le vaccin induisant la meilleure réponse immunitaire. Dans un second temps, nous confirmerons l’efficacité du vaccin grâce à des modèles expérimentaux d’allergies développés chez la souris. Une fois l’effet thérapeutique démontré, le vaccin entamera les étapes de fabrication en vue des phases cliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à définir les meilleures conditions d'administration du vaccin developpé au sein de notre laboratoire; à savoir, la dose de vaccin à injecter, la voie d’administration et le schéma d’immunisation et de prélèvements sanguins. Les candidats vaccins sélectionnés seront ensuite évalués pour leur efficacité dans des modèles expérimentaux d’allergies developpés chez la souris et à plus long terme chez l'homme.

Procédures

1) Administration du vaccin: L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. -310 animaux seront injectés par voie intramusculaire avec du vaccin (100 µl au maximum, 50 µl par patte). Parmis ces animaux, un groupe de 10 souris recevra deux injections de vaccin au jour 0 et à jour 21 et un groupe de 300 souris recevront trois injections de vaccin au jour 0 , à jour7 et à jour 21. -110 animaux seront injectés par voie sous-cutanée avec du vaccin (100 µl au maximum, 50 µl par patte). Parmis ces animaux, un groupe de 10 souris recevra une injection unique de vaccin au jour 0. Un groupe de 20 souris recevra deux injections au jour 0 et à jour 21. Enfin, un dernier groupe de 80 souris recevra trois injections de vaccin au jour 0, à jour 7 et à jour 28. 2) Prèlévement sanguin: Les animaux sont anésthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. Un groupe de 220 souris subira trois prélèvements à jour -7, à jour 38 et à jour 58. Un groupe de 200 souris subira quatres prélèvements à jour -7, à jour 21, à jour 38 et à jour 58.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possiblement observés sont principalement liés à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus et n’ont pas été observés dans les phases préliminaires du développement. Des effets indésirables peuvent se produire au site d’injection et sur les ganglions lymphatiques adjacents tels qu’œdème et érythème pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection se faisant par voie intramusculaire dans le muscle de la patte arrière. Une douleur musculaire localisée pourra entre autres être détectée si l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’œil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'œil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. Après le dernier prélevement (J58), les 310 animaux de la procédure 1 et les 110 animaux de la procédure 2 seront mis à mort par dislocation cervicale.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour laquelle un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques, i.e. Wilcoxon).

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées en intramusculaire et en sous-cutanée et les prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance (Buprénorphine à 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée). Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Dans ce projet, on utilisera des souris adultes, c’est-à-dire de 7 semaines, soit environ 20-25g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie implante une sonde de microdialyse, parfois couplée à une fibre optique, dans leur cervelet, les animaux étant tués dans les 24 heures pour vérification anatomique, afin d'étudier le rôle des cellules gliales dans la neurotransmission. Le porteur qualifie cette chirurgie intracérébrale de gêne légère et de mineure au motif que le cerveau serait dépourvu de fibres de la douleur. Il réduit les bénéfices attendus à la mise en évidence d'un rôle de ces cellules, sans application décrite.

Objectifs

Notre projet vise à édudier le role des cellules de Bergmann (les cellules gliales du cervelet) dans les neurotransmissions monoaminergiques (Sérotonine, Noradrénaline, Dopamine) dans le cervelet de souris.

Bénéfices attendus

La mise en évidence de l'implication des cellules gliales dans la neurotransmission monoaminergique

Procédures

Chirurgie : implantation stéréotaxique de sonde de microdialyse couplées ou non avec une fibre optique dans le cervelet. Ceci concerne l'ensemble des animaux la durée totale entre l'implantaion et le sacrifice des animaux est de 24 heures.

Impact sur les animaux

Techniquement les expériences menées impliquent la microdialyse mise en oeuvre seule ou avec l'optogénétique. Ces implantations intracérébrales constituent une gène légère pour l'animal. Le cerveau est dépourvu de fibres sensibles à la douleur, à titre d'exemple des chirurgies similaires ontvréalisée chez l'humains sous simple anesthésie locale.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure, pour vérification anatomique des implantations intracérébellaires

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes comme les interactions neurones-glies sur une structure cérébrale en fonctionnement dans des conditions physiologiques, n'est à ce jour pas modélisable.

Réduction

Le calcul de puissance est effectuée pour les expériences de microdialyse a été réalisé avec le logicile biostatGV. Un écart type de 20 % (issue des données de la littérature et de notre propre expérience) et la possibilité de discriminer un effet de 25% a été envisagé. Une puissance de 0,9 et un alpha de 0,05 ont été choisis. Ceci indique 14 animaux par groupe nombre qui est augmenté à 15 pour pallier aux aléas expérimentaux. Une approche statistique sera envisagée

Raffinement

Un anesthésique est utilisé pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse. Le cerveau est un organe dépourvu de fibres nerveuses libres dédiées à la nociception, bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux

Choix des espèces

L'utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. Les souches modifiées génétiquement ne sont disponibles que pour cette espèce. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines ainsi la chirurgie sera menées sur les animaux agés de 14 à 16 semaines.

960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le septième jour de vie, une chirurgie lèse leur hippocampe pour induire un modèle de schizophrénie, puis ils sont exposés jeunes à l'alcool et à des cannabinoïdes avant une seconde chirurgie d'implantation de canules, pour étudier l'impact de ces drogues sur la consommation d'alcool. Le porteur signale des douleurs postopératoires après chaque chirurgie. Il présente ce modèle par lésion comme le plus utilisé et le plus complet pour cette comorbidité.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact d'expositions précoces aux drogues sur les troubles de la consommation d'alcool à l'âge adulte dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'acool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agents cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission. En effet la dérégulation des systèmes de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la consommation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie.

Bénéfices attendus

Il n'existe à l'heure actuelle aucune étude visant à étudier l'impact de la co-exposition précoce à l'alcool est aux cannabis ni chez l'Homme, ni chez l'animal alors que la consommation de ces drogues est relativement fréquentes chez les adolescents et jeunes adultes. Grâce aux expériences proposées dans ce projet nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact d'une exposition précoce à des drogues couramment utilisées sur les systèmes dopaminergiques. Nous ajouterons à cette étude neurobiologique un aspect purement comportemental qui nous permettra d'évaluer l'impact de cette exposition précoce aux drogues sur les comportements associés à la consommation d'alcool et à ceux associés à la schizophrénie.

Procédures

Tous les animaux subiront une chirurgie à l'âge de 7 jours. Chacune de ces opérations ne durera jamais plus de 20 minutes. Par la suite à l'âge adulte 320 rats subiront une seconde chirurgie qui ne durera pas plus de 30 minutes. Lors de ces chirurgies les animaux subiront une anesthésie gazeuse et recevront une injection d'analgésiques adaptés. En soins post-opératoires, les animaux (au 7ème jour de vie et à l'âge adulte) recevront pendant au moins 2 jours post-opératoires au moins 2 injections quotidiennes d'analgésique adapté.

Impact sur les animaux

- Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à J7 suite à la lésion de l'hippocampe ventral par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. - Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à l'âge adulte suite à l'implantation des canules par chirurgie stéréotaxiques. Durée attendue : 3-4 jours.

Devenir

Procédures 1, 2, 3: Ces procédures ne sont que des étapes qui nous permettent de générer nos animaux modèles de comorbidité. Tous les animaux issus de ces procédures seront répartis soit dans la procédure 4 (640 rats) soit dans la procédure 5 (320 rats). Procédure 4 : A la fin des analyses comportementales les cerveaux de ces animaux devront être récupérés pour des analyses post-mortem en vue d’étudier l’expression de marqueurs biologiques importants dans ces pathologies et iront donc en procédure 6. Procédure 5: Tous les animaux seront euthanasiés pour vérifications histologiques des sites d'implantation des électrodes d'enregistrement et de stimulation. Procédure 6: Tous les animaux seront euthanasiés au cours de cette procédure.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant le même modèle en prennant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Pour chacune des procédures nous avons mis en place un série de points limites ainsi qu'une grille de scoring du bien-être animal. Une action thérapeutique adaptée sera déclenchée dès q'un point limite sera atteint. « En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe tout au long du projet sauf pendant les périodes d'évaluation de la consommation d'alcool. Ces périodes seront limitées au strict minimum nécessaire et l'isolement sera contrebalancé par une manipulation accrue par les expérimentateurs (enrichissement inter-espèce).

Choix des espèces

Le modèle de lésion choisi pour induire des symptômes de schizophrénie est le plus utilisé en recherche sur la comorbidité addictive car ce modèle est sans doute celui qui représente le mieux l'évolution de la maladie. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. Ce modèle nécessite une lésion du cerveau au 7ème jour de vie. Tous les petits seront ensuite soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle pré-exposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.

1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du pancréas leur sont injectées sous la peau, dans le pancréas ou dans le sang, provoquant tumeurs, ascite ou métastases pulmonaires, puis elles reçoivent des traitements, pour comparer la réponse selon la localisation de la tumeur. Le porteur décrit une possible altération de l'état général liée au cancer induit et aux effets des chimiothérapies. Il conclut que l'évaluation de traitements anticancéreux doit se faire sur un organisme vivant.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association immunothérapie (anti-PD-1) et chimiothérapies utilisées en clinique dans des modèles de cancers du pancréas avec différentes localisations (sites d’injections différents) chez la souris. Nous étudierons également les infiltrats immunitaires dans les tumeurs. Ainsi nous pourront 1) évaluer l’efficacité des traitements selon la localisation et 2) déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée en fonction du traitement et de la localisation du cancer. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

En France, en 2018, le cancer du pancréas était le 9e cancer le plus fréquent chez l’homme et le 7e cancer le plus fréquent chez la femme. Le pronostic de ce cancer, souvent diagnostiqué tardivement, reste sombre, expliquant que la mortalité ne baisse pas. A tel point que l’adénocarcinome pancréatique pourrait devenir la seconde cause de mortalité par cancer dans les années 2030-2040. L’un des critères d’agressivité de ce cancer est sa capacité à former des métastases dans d’autres organes, comme le foie ou le poumon. Actuellement, le traitement de ce cancer repose sur l’utilisation de chimiothérapies qui sont malheureusement peu efficaces, car souvent administrées tardivement, notamment lorsque le cancer a métastasé. L’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité anti-tumorale d’une association immunothérapie et chimiothérapies utilisées en clinique dans différents modèles de cancers du pancréas. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux traitements par chimiothérapie et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, jusqu’alors inefficace dans le cancer du pancréas.

Procédures

- Injection par voie sous-cutanée de cellules de cancer du pancréas murines : - 288 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Injection orthotopique de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - 160 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Injection par voie intra-veineuse de cellules de cancer du pancréas murines : - 160 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Traitements par voie intrapéritonéale : - 576 souris C57BL/6 et 432 souris BalbC/nude.

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans différentes localisations : - Sous-cutanée : masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. - Orthotopique : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale monitorée par palpation abdominale. Possible dissémination de la maladie au niveau du péritoine avec apparition d’ascite. - Métastatique : croissance de métastases intra-pulmonaires, pas d’effet masse attendu. - Dans tous les cas : possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. -Éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux : les chimiothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherche clinique sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. -Concernant le modèle orthotopique, possible complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, lâchage de suture, douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Certains seront autopsiés (modèles orthotopique et intra-veineux).

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles sera réalisée en début de projet. Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés sur la localisation des tumeurs ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné à l’étape de faisabilité (partie I). Si aucun effet bénéfique des composés seuls ou en association sur la réponse anti-tumorale (croissance et infiltrats immunitaires) n’est observé, l’étude sera arrêtée à l’étape II. En choisissant de transposer uniquement le ou les modèles ayant le mieux répondu aux combinaisons de traitements en partie II, dans les souris Balb/nude, nous réduirons également le nombre de souris utilisées pour cette lignée. Enfin pour les modèles orthotopiques et intra-veineux les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe. Elle sera entretenue pour la greffe orthotopique, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (Ketoprofen 4mg/kg) seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4mg/kg + bupivacaine 2mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidienne pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Points limites : - perte de poids dépassant 20% par rapport au poids maximum enregistré à arrêt des traitements à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - posture ou autre expression de la douleur à arrêt des traitements à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - absence de toilettage à arrêt des traitements et surveillance de l’apparition d’autres points limites ; - léthargie, immobilité à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - une mauvaise cicatrisation ou une ouverture des sutures à sacrifice de l’animal. - Points limites spécifiques à la présence de tumeurs et dont l’atteinte entrainera l’euthanasie des animaux : - volume tumoral supérieur à 2000 mm3 ; - tumeurs gênant les fonctions vitales et motrices ; - ulcération ou nécroses de la tumeur sous-cutanée supérieure à 20% de la surface totale de la tumeur ; - palpation d’une masse abdominale localisée dans la zone du pancréas et entrainant une gêne ou une douleur ; - envahissement du péritoine de la souris conduisant à un une carcinose péritonéale ou la formation d’ascite et ainsi un gonflement de l’abdomen ; - difficultés respiratoires. Le projet se déroule en 3 parties. L’absence de faisabilité ou de résultats, conduira à l’arrêt de certains modèles.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Des souris génétiquement modifiées seront également utilisées afin de montrer l’importance du système immunitaire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux interventions chirurgicales créent un défaut osseux dans leur crâne puis y implantent un biomatériau, pour évaluer une méthode de régénération osseuse. Le porteur présente ce test in vivo comme la validation de résultats obtenus in vitro, avant un passage vers un modèle plus proche de l'humain. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la réparation osseuse dans ce contexte.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’évaluer l’efficacité sur la régénération osseuse chez le rat d’une méthode originale d’ingénierie tissulaire osseuse utilisant un assemblage tridimensionnel couche par couche de cellules souches mésenchymateuses autologues et d’un biomatériau imprimé en 3D.

Bénéfices attendus

On attend de ce projet qu’il vienne valider les résultats expérimentaux préliminaires obtenus in vitro. On a pu montrer que le matériau utilisé était biocompatible, non cytotoxique et qu’il permettait de guider la néoformation osseuse. Sa dégradation est également compatible avec une utilisation in vivo. Les bénéfices attendus sont donc de valider cette procédure de régénération osseuse dans un modèle de petit animal, avant de pouvoir passer sur un modèle plus proche de la clinique humaine.

Procédures

Selon les recommandations de l’annexe VIII de la directive 2010/63/UE du 22/09/2010, la procédure chirurgicale est considérée comme modérée en termes de souffrance (chirurgie sous anesthésie générale et analgésie appropriée). Les opérations seront réalisées sous anesthésie générale. La réduction de la douleur sera assurée par une analgésie pré-opératoire avec injection sous cutané de 0.05 mg/kg de Buprénorphine et l’injection sous cutané de 1 mg/kg de Meloxicam en post-opératoire. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Le poids des animaux sera relevé en continu. La cicatrisation des plaies sera suivie : en cas de problème, les animaux seront anesthésiés pour effectuer des soins nécessaires : selon la gravité, la plaie sera nettoyée et un traitement antibiotique sera délivré. L’estimation de la souffrance sera réalisée en suivant des critères spécifiques. Au-delà du score limite de 14, l’animal sera euthanasié. Les critères permettant cette évaluation sont l’apparence de l’animal, la prise d’eau et de nourriture, les signes cliniques et les comportements naturels et provoqués (les points limites sont décrits dans la partie 4.2) Toute souffrance plus modérée sera traitée par l’administration de Meloxicam pendant 3 jours. La persistance de douleurs malgré ce traitement entraînera la mise à mort de l’animal. Les rongeurs seront maintenus en fratrie (4 à 5 par cage selon la taille des animaux) en respectant la composition du groupe pré-opératoire. Chaque cage sera composée d’un milieu d’enrichissement adapté favorable au bien-être de l’animal. Afin d’avoir un nombre suffisant d’échantillons à la fin de l’étude, en prenant en compte le risque de perte d’animaux, nous ferons des groupes de 10 animaux pour chaque condition. Pour l’analyse statistique, nous comparerons les résultats pour les échantillons appariés à l’aide du test de Wilcoxon, le test t de Student, et pour les échantillons non appariés avec le test U de Mann-Whitney. La durée de le pemière procédure (prélèvément de tissu adipeux) est de 10 minutes (anesthésie, chirurgie et réveil) La durée de la seconde procédure (défaut osseux de calvaria et implantation) est de 15 minutes (anesthésie, chirurgie et réveil).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux sont principalement en rapport avec la douleur associée aux deux interventions chirurgicales prévues dans le déroulé de l’expérimentation. Comme décrit plus bas, ces douleurs sont de classe modérée et seront prises en charge avec un protocole antalgique déjà validé dans ce modèle chirurgical. Par ailleurs, les activités des animaux ne seront pas modifiées par la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés en fin d'expérimentation car nous devrons prélever les tissus d"intérêt (os de la calvaria et tissus attenants)

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier la réparation osseuse dans ce contexte.

Réduction

Ces expériences sont conçues pour limiter le nombre d’animaux à 10 par temps et pour chacune des conditions expérimentales, en utilisant des tailles de groupes basées sur des travaux antérieurs et permettant des comparaisons statistiques. Du fait des expérimentations prévues, nous envisageons d'utiliser 50 rats.

Raffinement

Une méthode d’analgésie des animaux en pré- et post-opératoire sera réalisée par injection d’analgésique 30 minutes avant l’opération et une injection d’un AINS en post-opératoire. Après l’intervention, les animaux seront replacés en fratrie avec des conditions d’hébergement et un milieu d’enrichissement adaptés, favorables au bien-être de l’animal (litière avec copeaux de peuplier, tuyaux pour jouer).

Choix des espèces

Un test in vivo en site osseux chez le petit animal est indispensable, et constitue la première étape de la démarche scientifique du projet. Le défaut de calvaria chez le rat est un modèle largement utilisé au laboratoire BIOTIS, validé dans la littérature. C'est un modèle de choix pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. De plus, les cellules souches mésenchymateuses issus de tissu adipeux de rat sont bien décrites dans la littérature. Des modèles autologues ont déjà été utilisés et leur capacité à aider la réparation osseuse également. La souris n’est pas adaptée à la taille des matériaux et à la taille de défaut envisagé. Le lapin n’est pas envisagé pour des raisons de coût et à cause de sa fragilité. Nous avons choisi une souche de rat robuste et adaptée à nos besoins : les rats WISTAR. Nous utiliserons des animaux adultes (10 à 12 semaines). Cela permettra d’éviter que la croissance osseuse des animaux vienne interférer avec les processus de régénération.