Rongeurs
Effet des anticorps monoclonaux anti-RAMP2 et anti-RAMP3 dirigés contre les récepteurs de l’adrénomédulline sur la croissance tumorale.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des tumeurs humaines leur sont greffées (glioblastome, prostate, rein, poumon) puis traitées par des anticorps monoclonaux, la charge tumorale pouvant atteindre 1 500 mm³ et provoquer nécroses et métastases entraînant la mise à mort. Le porteur revendique un dispositif "ON/OFF" arrêtant les étapes suivantes en cas d'échec, censé réduire les effectifs. Il affirme que l'étude in vivo est "indispensable" pour prendre en compte le microenvironnement tumoral que le in vitro ne reproduit pas.
Objectifs
La croissance des tumeurs malignes nécessite un débit sanguin adapté, fourni par des vaisseaux néoformés, permettant l’apport d’éléments nutritifs et d’oxygène nécessaires à cette croissance pathologique. Ce phénomène est le résultat d’actions coordonnées entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement de la tumeur. Parmi les facteurs potentiels, une protéine fortement impliquée notamment dans le phénomène de vascularisation intra-tumorale a été mise en évidence : l’Adrénomédulline (AM). L’implication de l’AM dans le processus tumoral a fait l’objet de nombreux articles de recherche scientifique publiés dans des journaux internationaux. Son rôle a également été valorisé par plusieurs publications sur différents modèles tumoraux in vitro mais également in vivo. L’utilisation d’anticorps polyclonaux anti-système de l'AM, provoque une diminution de la croissance tumorale in vivo sur des modèles de xénogreffes tumorales. Cependant les anticorps polyclonaux ne peuvent être utilisés en thérapie humaine. Ainsi dans cette optique, des anticorps monoclonaux ont été développés. Cette étude permettra d’évaluer l’efficacité des différents anticorps monoclonaux produits sur différents modèles tumoraux et de les valider comme potentiel outil thérapeutique.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est de démontrer que les anticorps monoclonaux bloquants anti-récepteurs de l’AM dirigés contre la région extracellulaire peuvent déstabiliser la vascularisation tumorale par apoptose des cellules vasculaires endothéliales et promouvoir une régression tumorale faisant de ces anticorps un outil thérapeutique visant à améliorer le traitement des cancers et permettant de répondre à l’échappement de certains patients aux thérapeutiques actuellement utilisées.
Procédures
3 procédures expérimentales vont être menées: 1/Test d’angiogenèse sur souris C57BL6. Nous aurons différents groupes d’expérimentation : 1 groupe contrôle placebo recevant une solution saline ; 1 groupe positif traité avec un anticorps polyclonal ayant montré dans une étude in vivo antérieure une efficacité ; 5 groupes correspondant aux 5 anticorps monoclonaux anti-RAMP2 validés comme efficaces in vitro ; de même 5 groupes pour les 5 anticorps monoclonaux anti-RAMP3 validés in vitro. Pour chaque groupe, 10 souris seront nécessaires. Nous aurons donc besoin pour une expérimentation de 12 groupesx10 souris soit 120 souris. Cette expérience sera réalisée en duplicate pour valider les résultats obtenus et montrer leur reproductibilité, nous aurons donc besoin de 240 souris C57BL6. Les souris seront mises à mort au 21ème jours. 2/Effet anti-tumoral sur des xénogreffes hétérotopiques de cellules tumorales humaines issue de glioblastomes, prostate, rein et poumon. Suite à l’angiogenèse in vivo, seuls les 3 meilleurs anticorps monoclonaux anti-RAMP2 et les 3 meilleurs anticorps anti-RAMP3 seront utilisés. Il y aura toujours un groupe placebo et un groupe contrôle positif traité avec l'anticorps polyclonal. Pour les modèles du cancer de la prostate, du rein et du poumon, on a 8 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 80 souris par modèle soit pour 3 modèles = 240 souris. Pour le modèle du glioblastome (prise tumorale 100%), on a 8 groupes x 7 souris = 56 souris. Cette expérience sera dupliquée, ce qui fera un maximum de 592 souris athymiques. Le temps de traitement sera dépendant de la vitesse de croissance tumorale et du suivi clinique des animaux. 3/Effet anti-tumoral sur des xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales humaines issue de glioblastomes, prostate, rein et poumon. Pour les anticorps monoclonaux, suite aux expériences hétérotopiques, seuls les 2 meilleurs anticorps anti-RAMP2 et les 2 meilleurs anticorps anti-RAMP3 seront utilisés, nous aurons toujours un groupe placebo et un groupe contrôle positif. Pour chaque modèle, on a donc 6 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 60 souris, soit pour l’ensemble des modèles 4x60 = 240 souris. Cette expérience sera dupliquée pour montrer sa reproductibilité ce qui montera le besoin en souris à 480. Le temps de traitement sera dépendant de la perte de poids de l'animal et du suivi clinique, sans modification le temps maximum de traitement sera de 5-6 semaines.
Impact sur les animaux
Pour détecter toute souffrance, nous observons quotidiennement le comportement des souris : mobilité, alimentation, agressivité, prostation, déshydratation, abcès, hémorragies. La souris ne devra pas perdre plus de 20 % de son poids et la charge tumorale ne devra pas excéder 10% du poids de l'animal ou un volume de 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux (2 fois/semaine mais tous les jours si la perte de poids est supérieure ou égale à 10%) et par mesure de la masse tumorale avec un pied à coulisse dans le modèle hétérotopique (3 fois/semaine). Si un des critères pré-établis selon la grille d'évaluation de la souffrance ou de détresse mise en place, il sera mis à mort immédiatement. Des phénomène de nécrose peuvent également être observés sur les xénogreffes hétérotopiques. Ils sont associés au développement tumoral des glioblastomes sans traitement au préalable ceci étant due probablement à la vitesse de croissance tumorale très importante. Les autres modèles tumoraux peuvent également présenter des phénomènes de nécrose de la tumeur suite à un traitement anti-angiogénique. Enfin des métastases peuvent apparaître, les animaux seront alors immédiatement mis à mort.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Prélèvement de tissus après mise à mort : sous hotte stérile prélèvements du Matrigel, des tumeurs et des organes afin de réaliser des études permettant l'analyse de la croissance tumorale et du microenvironnement en fonction des traitements appliqués.
Remplacement
Le processus de développement d'une substance originale comme médicament exige, après l'étude in vitro sur des cellules en culture, de valider son utilisation in vivo. En effet préalablement à cette étude in vivo, des études ont été menées sur 12 anticorps anti-RAMP2 et 12 anticorps anti-RAMP3 pour déterminer leur efficacité sur la prolifération de cellules tumorales, sur la migration/invasion des cellules endothéliales et sur leur capacité à bloquer l'angiogénèse in vitro. Suite à ces résultats, nous avons pu réduire le nombre d'anticorps à tester in vivo ainsi parmi les 24 anticorps, seuls les 5 anticorps anti-RAMP2 et les 5 anticorps anti-RAMP3 les plus efficaces ont été retenus pour passer à l'étape in vivo. Cette étude in vivo sur modèles tumoraux ne peut être remplacée car elle est indispensable pour prendre en compte le microenvironnement tumoral sachant de nombreuses études publiées au niveau internationnal montre que ce compartiment est un partenaire très actif avec la cellule maligne influançant le processus tumoral, celui-ci n'étant pas pris en compte in vitro. Il est également nécessaire de déterminer s'il existe des effets physiologiques de ces anticorps. Les retours d'expériences in vivo sont donc indispensables au développement de potentiel médicament et sont des pré-requis à l'étude clinique.
Réduction
Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de souris de 1312 cependant ces études seront menées avec un système de ON/OFF et en affinant le nombre d'anticorps à tester. Préalablement à cette étude in vivo, des études ont été menées sur 12 anticorps anti-RAMP2 et 12 anticorps anti-RAMP3 pour déterminer leurs efficacités sur la prolifération de cellules tumorales, sur la migration/invasion des cellules endothéliales et sur leur capacité à bloquer l'angiogénèse in vitro. Suite à ces résultats, nous avons pu réduire le nombre d'anticorps à tester in vivo à 5 anticorps et par conséquent le nombre de lots d'animaux à utiliser. Ainsi une première étude d'angiogénèse sera réalisée avec 5 anticorps anti-RAMP2 et 5 anticorps anti-RAMP3. Si l'expérience est infructueuse, elle sera arrêtée. Si des résultats positifs sont obtenus, l'étude sur xénogreffes hétérotopique (étape 2) sera lancée mais avec un maximum de 3 anticorps anti-RAMP2 et 3 anti-RAMP3 à tester. Pour l'étape 3 s'agissant de l'étude sur xénogreffes orthotopiques, seuls les modèles tumoraux positifs à l'étape 2 et un maximum de 2 anticorps ant-RAMP2 et 2 anti-RAMP3 seront lancés. Cependant si les résultats sont négatifs à l'étape 2, l'étude sera arrêtée après les modèles hétérotopiques. Ce nombre de 1312 souris correspond aussi à un nombre de souris n=10 par groupe d'expérimentation sauf pour le modèle hétérotopique du glioblastome où n=7. Ce nombre de 10 souris (ou 7) par groupe d'expérimentation nous permet d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable au niveau de la réponse au traitement et de faire face aux problèmes de prises tumorales. Pour analyser les résultats obtenus nous utilisons le test de variance ou de Fischer PLSD, Statview 512. Pour valider les résultats, les expériences devront être dupliquées pour prouver leur reproductibilité et leur non-dépendance par exemple au lot de production des souris.
Raffinement
Les expérimentations seront débutées au plus tôt 15 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Les souris seront hébergées dans des cages de tailles adéquates. Un enrichissement du milieu par igloo teintés en polycarbonate qui réduit le stress induit par les facteurs environnementaux et les interactions sociales sera utilisé. Les facteurs physiques de l'environnement (lumière, bruit, température et renouvellement) d'air sont contrôlés et adaptés au modèle murin. Les souris seront surveillées quotidiennement par un personnel expérimenté. Pour diminuer la souffrance au moment de l'acte chirurgical, une analgésie pré et post-opératoire sera appliquées. Le temps d’analgésie post-opératoire sera adapté en fonction du suivi clinique des souris. Au moment de l'injection du Matrigel ou des cellules tumorales, une anesthésie gazeuse sera réalisée. Dans le cas du modèle orthotopique, une anesthésie fixe sera utilisée. Si des nécroses de la tumeur apparaissent, nous soulagerons la douleur des souris par application d'une analgésie adaptée. Pour détecter toute souffrance, leur comportement est observé régulièrement : mobilité, alimentation, agressivité, prostration, déshydratation, abcès et hémorragies. La souris ne devra pas perdre plus de 20% de son poids et la charge tumorale ne devra pas représenter plus de 10% du poids de l'animal sans excéder 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux et la mesure du développement des tumeurs avec un pied à coulisse dans le modèle hétérotopique. Si un des critères pré-établis survient chez l'animal, il sera mis à mort immédiatement par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Pour les tests d’angiogénèse in vivo, nous utiliserons des souris C57BL6, modèle général polyvalent. L’immunocompétence de ces souris est importante car l’objectif est d’étudier l’ensemble des cellules recrutées par l’AM au sein du Matrigel, cellules pro-angiogéniques et cellules du système immunitaire. Certes il y a un risque d’immunisation active des souris contre l’anticorps injecté cependant le temps de traitement de maximum 15-20 jours va permettre de limiter au maximum ce biais potentiel. Ce modèle a été validé et publiés dans de nombreux articles internationaux. Pour les études sur la croissance tumorale, la souris athymique nude, laquelle a un système immunitaire déficient, a été choisi afin de pouvoir implanter des cellules cancéreuses (lignées cellulaires humaines établies) permettant la formation de tumeur. Les souris seront âgées de 7-8 semaines afin d'avoir un poids adulte stable. Pour les souris C57BL6, cet âge est également adapté à l’immunocompétence attendue dans le modèle d'étude de l'angiogénèse in vivo.
Implication d’un facteur de croissance spécifique et de ses récepteurs dans le développement de fibrose pulmonaire dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose pulmonaire leur est provoquée par injection dans la trachée après dissection de la peau, suivie d'injections répétées visant à faire varier l'expression d'un facteur de croissance, pour en évaluer le rôle protecteur. Le porteur indique que l'induction de la fibrose peut provoquer des difficultés respiratoires et une perte de poids, avec mise à mort si les points limites sont atteints. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d'un organe entier" et retient la souris pour ses outils génétiques.
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique grave, entrainant la mort en 3 à 5 ans. La cause et les mécanismes qui sous-tendent le développement et l’évolution de cette maladie sont inconnus. Elle se manifeste par une perte d’élasticité du tissu de soutien pulmonaire, résultant en une altération des échanges entre les alvéoles contenant l’oxygène et les vaisseaux sanguins. Le poumon devient progressivement trop abimé pour assurer l'oxygénation du sang et le patient développe une insuffisance respiratoire chronique conduisant au décès. Les médicaments disponibles sont uniquement capables d’en ralentir la progression avec une efficacité faible sur les symptômes et des effets indésirables importants. Une meilleure compréhension des mécanismes entrainant la maladie est donc cruciale afin de développer de nouveaux traitements. Certains facteurs de croissances impliqués dans le développement pulmonaire au cours de l'embryogénèse semblent être impliqués dans la maladie. Ces facteurs de croissance sont impliqués dans les différentes étapes du développement pulmonaire normal, ainsi que dans les processus de réparation tissulaire physiologiques. Certains de ces facteurs de croissance vont favoriser le developpement de la fibrose pulmonaire, alors que d’autres vont être protecteurs. Nous nous intéressons en particuler à l’un d’entre eux, dont le rôle anti-fibrosant a été est démontré dans le foie, le rein ou le myocarde, et est questionné dans la fibrose pulmonaire. Ce facteur est synthétisé par le foie avant d'être libéré dans la circulation sanguine puis aux organes cibles. Notre hypothèse que ce facteur joue un rôle protecteur dans le développement de la fibrose pulmonaire. Le modèle murin est pertinent du fait de son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme. De plus, les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon.
Bénéfices attendus
Nous utiliserons des modèles de fibrose pulmonaire établis chez la souris, impliquant une injection au niveau de la trachée sous anesthésie générale de différentes molécules favorisant le développement de la fibrose pulmonaire. Dans une première série d'expériences, nous étudierons l’expression du facteur de croissance d’intérêt et de ses récepteurs au cours du développement de la fibrose pulmonaire induite par voie pharmacologique. Puis nous évaluerons l’effet d’une surexpression du facteur de croissance sur le développement de la fibrose pulmonaire induite par voie pharmacologique. La surexpression du facteur sera obtenue par injection sous-cutanée d’un médicament validé dans le traitement de la stéatose hépatique. Nous étudierons également l’impact sur le développement de la fibrose de l’absence d’expression de ce facteur, spécifiquement obtenue chez des souris transgéniques, déficiente pour son gène, et n’exprimant donc pas cette molécule. Les souris seront euthanasiées à la fin de la procédure après anesthésie profonde. Plusieurs prélèvements seront ensuite effectués afin de répondre précisément à la question du rôle joué par ce facteur de croissance dans le développement de la fibrose pulmonaire. Si l'effet protecteur de cette molécule était démontré chez la souris, cela ouvrirait la porte à de nouvelles perspectives thérapeutiques. Un analogue de ce facteur a déjà montré son efficacité dans le traitement de la stéatose hépatique avec un profil de tolérance acceptable chez l'homme et est utilisé dans cette indication.
Procédures
En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétéé. Les souris recevront ensuite en cours de procédure 1 à 4 injections au maximum d'un analogue pharmacologique du facteur de croissance par voie sous cutanée, sur animaux vigile du fait du caractère peu traumatique et rapide du geste à effectuer. D'autres groupes de souris recevront une injection unique par voie intraveineuse dans la veine de la queue d'une molécule permettant également de surexprimer le facteur de croissance. Cette injection sera faite sous anesthésie générale. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées après anesthésie profonde. Après anesthésie profonde, plusieurs prélèvements seront effectués. Un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le prélèvement des poumons afin de définir le rôle de ce facteur de croissance dans le développement de la fibrose pulmonaire.
Impact sur les animaux
L'induction de la fibrose pulmonaire chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Une surveillance quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance au moins 3 fois par semaine minimum des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon la grille d'évaluation des points limites (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et motricité, etc.). La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. Nos expériences permettront de déterminer si le facteur de croissance cible protège les souris du développement de la fibrose pulmonaire.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédures (surdosage en anesthésiques). Les prélèvements (LBA, poumons, sang, foie) seront effectués après euthanasie de l'animal. Les animaux ne subiront qu'une seule procédure au cours de leur vie.
Remplacement
Le modèle murin est pertinent du fait de la petite taille de l’animal, et de son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme. De plus, les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire.
Réduction
Nous avont réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l'analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints.
Raffinement
Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures; ainsi que des antalgiques. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance clinique au moins 3 fois par semaine des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon la grille d'évaluation en annexe 2 (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et motricité, etc.). La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids.
Choix des espèces
Le modèle souris est pertinent du fait de son temps de gestation court et de par son système respiratoire, proche de celui de l’Homme. Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature scientifique. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 12 semaines.
Etude du rôle du récepteur P2X7 dans un modèle d’uvéite
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une uvéite auto-immune leur est induite par injection d'une toxine et transfert de cellules immunitaires, avec un suivi par imagerie de la rétine sous anesthésie, pour évaluer le récepteur P2X7 comme cible thérapeutique. Le porteur décrit une maladie qui n'entraînerait pas de douleur perceptible, tout en prévoyant la surveillance de signes tels que prostration, abattement ou perte de poids. Il justifie l'effectif élevé par la "grande variabilité" du développement de la pathologie entre souris et affirme que les études in vitro ne permettent pas d'étudier les signes cliniques.
Objectifs
Le projet vise à induire un modèle d'uvéite, l'Uvéite Autoimmune Expérimentale (EAU) chez des souris et d'évaluer le rôle du récepteur P2X7 comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) ou traiter en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'oeil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer lesquelles sont impliquées. Nous allons donc induire une EAU chez des animaux n'exprimant pas ce récepteur de manière constitutive ou de manière induite sur certains types cellulaires spécifiquement ou traiter des animaux qui développent une uvéite avec des agonistes ou antagonistes de ce récepteur afin de déterminer l'effet potentiellement bénéfique de cette cible pour inhiber la réponse immunitaire au cours de l'uvéite.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'évaluer le rôle du récepteur P2X7 comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) ou traiter en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'oeil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer lesquelles sont impliquées.
Procédures
Induction de l’Uvéite Auto-immune Expérimentale (EAU) par injection d’une toxine, transfert adoptif de cellules immunitaires par injection IV et suivi de l’évolution de la maladie (EAU) par des actes non invasifs (imagerie rétinienne (fond d’œil) et OCT (tomographie en cohérence optique). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal. Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet.
Impact sur les animaux
Avec ce projet les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). L’induction de l’EAU est un phénotype qui n’entraîne pas de douleur perceptible (pas de changement du comportement de la souris). L’évolution de la maladie est surveillée par des actes non invasifs qui n’engendrent donc pas de douleur ou de détresse. Les animaux sont anesthésiés au cours de ces explorations également pour le maintien de l’animal immobile.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude.
Réduction
Nous devons induire plusieurs expériences en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Certains ne développeront pas la maladie, d’autres la développeront à un stade plus avancé ou la sévérité de l’inflammation sera différente. Nous aurons donc besoin de 10 animaux par lots pour un total de 900 souris. Le nombre de 10 animaux par groupe est basé sur les résultats de nos expériences dans notre laboratoire afin de permettre la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
La seule anesthésie mise en oeuvre sera la gazeuse à base d'un mélange dioxygène/isoflurane. Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Tous signes d’inconfort ou de détresse avant l’apparition des signes cliniques autres que ceux de l’EAU, tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, couché sur le côté; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Les critères absolus sont: État de choc, léthargie, inconscience, immobilité. Difficultés respiratoires. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6J sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour l'EAU. En outre, il est relativement simple d'examiner le système visuel et d'autres tissus chez la souris, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée le modèle d'invalidation génique conditionnelle et le modèle de uvéité, EAU. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois, âges auquels ils sont succeptibles de développer la pathologie. Les animaux sont identifiés par bague numérotée ou tatouage. Les animaux sont génotypés par PCR après prélèvement d’un bout de leur queue.
HTAM IL1: Etude du rôle de l’inflammasome dans l’hypertension artérielle maligne chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant cinq jours, l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe sous-cutanée et des séjours en cage métabolique, pour reproduire une hypertension artérielle maligne pouvant atteindre le coeur, les reins et la rétine. Le porteur indique que tous les organes seront prélevés après mise à mort pour analyser les atteintes microvasculaires. Il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité de la maladie et retient la souris comme "modèle classique de mammifère".
Objectifs
L’intérêt de ce projet est de comprendre pourquoi certains patients avec hypertension artérielle vont développer une forme grave de cette hypertension, appelée hypertension artérielle maligne, avec une atteinte sévère du coeur, des reins et de la rétine et du cerveau pouvant conduire à la mort des patients. Notre équipe a identifié des mécanismes pouvant expliquer cette aggravation sévère de l'hypertension artérielle et cherche à valider ces mécanismes complexes dans un modèle d'hypertension artérielle chez la souris.
Bénéfices attendus
Si notre projet confirme nos hypothèses, cela pourrait permettre d'identifier les patients hypertendus susceptibles de développer une forme grave d'hypertension artérielle maligne. Nous pourrions également identifier des marqueurs prédictifs et/ou diagnostic de l'hypertension artérielle maligne. De plus, la démonstration qu’une altération des petts vaisseaux est en cause dans certains troubles graves du rythme cardiaque pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
Injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours. Une procédure chirurgicale: implantation d'une mini-pompe osmotique sous-cutanée. Prélèvement urinaire en cage métabolique sur animal vigile. Prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés au traitements: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire. Effets du modèle pathologique d'HTA: potentiellemnt atteinte des organes cibles, coeur, reins et rétines
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes microvasculaires des organes cibles de l'hypertension artérielle.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés à l'hypertension artérielle, incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours de l'HTA comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Un calcul d'effectif a été réalisé au préalable permettant d'évaluer le nombre d'animaux requis. Nous prélevons un maximum d'organes d'intérêt par animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élévés en cages enrichies en coton et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendus urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changés plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Les échographies cardiaques qui sont non invasive sont réalisées sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère et d’utiliser la recombinaison homologue ou l’excision allélique dirigée afin de connaître la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. Souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.
Évaluation des potentiels effets curatifs et protecteurs d’un mélange nutritionnel contre le développement de l’insulinorésistance et du diabète de type 2 chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont soumis à un régime hypercalorique pour induire une obésité, puis à un gavage quotidien pendant quatorze semaines, des prélèvements de sang et de fèces, un test de tolérance au glucose et un prélèvement d'organes final après anesthésie et exsanguination par l'aorte, pour tester un mélange de berbérine et d'extraits de pomme et de citrus. Les retombées annoncées pour la santé humaine restent hypothétiques face à l'obésité et aux complications métaboliques provoquées chez les animaux. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut remplacer le "modèle animal intégré" et conclut à l'impossibilité du remplacement.
Objectifs
Cette procédure aura pour objet d’explorer l’effet curatif synergique de la berbérine et des extraits de pomme et de citrus sur l’apparition de l’insulino-résistance et du diabète sucré chez le rat. Cet effet pourrait résulter d’une action multiple impliquant d’une part, les effecteurs de perte de poids (augmentation de la dépense énergétique, diminution de l’absorption de nutriments et diminution de l’appétit), et d’autre part, la mise en jeu sur le long terme d’actions anti-inflammatoire et régulatrice du métabolisme, incluant le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les résultats générés par les techniques in vitro ou ex-vivo ne permettent pas d'avoir des résultats suffisamment fiables puisque le diabète (lié à l’obésité) est une maladie systémique caractérisée par des altérations mutiorganiques (une intolérance au glucose, un stress oxydatif, un dysfonctionnement endothélial, anomalies des fonctions cardio-vasculaire et rénale). Il est donc impossible de créer l'environnement à facettes multiples de cette pathologie et le recours au modèle animal intégré est donc plus adapté à la problématique de ce projet. De plus, les produits évalués dans ce projet ont une action systémique, l’étude du lien entre le microbiote et la physiopathologie du diabète n’est possible que par une approche expérimentale in vivo et il n'existe pas de moyens alternatifs permettant de l'étudier dans un contexte qui doit tenir compte de la physiologie globale de l'animal.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions. Un gavage (environ 30 secondes par rat) sera effectué quotidiennement pendant les 14 dernières semaines du protocole expérimental. Le prélèvement de sang (environ 20 minutes par rat), le catwalk (environ 30 minutes par rat), le prélèvement de fèces (environ 1h par rat) et le test de tolérance au glucose (1h30 par rat) seront effectués en début, milieu et fin de protocole (0, 14, 28 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements d'organes (après 28 semaines) après leur anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg) puis euthanasie par exsanguination au niveau de l'aorteabdominale.Ces interventions concernent les 120 animaux sur une durée totale de 28 semaines.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux du groupe avec le régime contrôle. Les animaux soumis au régime HFD vont développer une obésité avec des complications métaboliques qui est l'objet de l'étude. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par l'obésité.
Devenir
Tous les animaux des lots étudiés sont concernés par l’euthanasie. Cette dernière est pratiquée par exsanguination au niveau de l’aorte abdominale après anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) /médétomidine (150 μg/kg). L'euthanasie est justifiée par les prélèvements d'organes qui serviront aux analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Remplacement
Le remplacement des animaux n’est pas possible pour répondre aux questions du présent projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in-silico et in-vitro).
Réduction
De manière à respecter la règle de réduction, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum permettant d’anticiper les différences interindividuelles. Le nombre de 12 rats est nécessaire et suffisant pour réaliser une analyse descriptive. Ce nombre est basé sur notre expérience précédente de mise en œuvre de protocoles de pharmacologie expérimentale lors desquels nous avions obtenus des résultats reproductibles et exploitables.
Raffinement
- Un hébergement qui respecte les recommandations en vigueur, une animalerie contrôlée (température, hygrométrie) et un enrichissement des cages (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). - Un suivi régulier des animaux par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires) - La définition de points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. - L’optimisation des protocoles expérimentaux pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
L'exposition des rats Wistar à un régime hypercalorique permettra d'étudier la capacité du mélange nutritionnel testé à prévenir le développement de la résistance à l’insuline, de l’hyperglycémie chronique et les perturbations cardiovasculaire associées. Incluant également l’étude du lien entre les perturbations cardio-vasculaires et la modification du microbiote intestinal. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6-7 semaines.