Rats
Développement de stratégies pharmacologiques pour limiter la sévérité des Accidents Vasculaires Cérébraux survenant en contexte de Maladie Rénale Chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
Rats : 920
3 180 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour la plus grande partie d'entre eux. Ils subissent une chirurgie provoquant un arrêt transitoire de la circulation cérébrale, équivalent d'un AVC, ou l'ablation de cinq sixièmes de la masse rénale, une maladie rénale pouvant aussi être induite par un régime enrichi en adénine. Le porteur reconnaît que ces interventions provoquent "indubitablement" douleur, altération de l'état général et stress. Il affirme que la communication entre rein et cerveau est "impossible à modéliser autrement que [par] l'animal", le bénéfice pour les patients restant présenté comme une possibilité.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser les atteintes cérébrales au cours d'une maladie rénale chronique, et après un Accident Vasculaire Cérébral survenant dans un contexte de Maladie Rénale Chronique, particulièrement sur la dysfonction de la barrière-hémato-encéphalique (barrière biologique séparant la circulation sanguine du système nerveux) et de neuroinflammation (inflammation au niveau cérébral), dans différents modèles murins. En complément, nous développerons une approche pharmacologique afin d’identifier des voies impliquées et proposer des cibles thérapeutiques innovantes dans ce contexte.
Bénéfices attendus
La possibilité d'améliorer la prise en charge et le pronostic neurologique des patients atteint d'une maladie rénale chronique présentera un bénéfice en santé humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie (acte chirurgical d'environ 30 minutes) visant à induire un arrêt de la circulation cérébrale transitoire (équivalent à un accident vasculaire cérébrale) ou une néphrectomie (retrait de 5/6 de la masse rénale totale). Les animaux seront soumis à une administration d'un candidat médicament. Les imageries (jusqu'à 4 par animal) seront espacées d'au moins 24h pour une durée maximale de 30minutes. Enfin une quantité de sang des animaux sera prélevée à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
L'ablation de 5/6e de la masse rénale totale, l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne et l'induction d'une maladie rénale par un régime riche en adénine provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : douleur provoquée par la procédure chirgurgicale - une alétration de l'état général : une perte de poids, une déshydratation - hémorragie per-opératoire (rare). L'imagerie et l'injection de traceurs nécessiteront une anesthésie et pourront engendrer un stress. Les tests comportementaux pourront induire un stress par des manipulations quotidiennes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure.Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses histologique et biochimique
Remplacement
Partant de nos résultats observés chez le rat et la souris. Nous étudions une communication entre des organes qui sont le rein et le cerveaux et qu'il est impossible de modéliserautrement que pour l'animal. De plus, pour caractériser les atteintes neurologiques fonctionnelles lors d'une maladie rénale chronique, nous réalisons des évaluation neuro-comportementales des animaux, qui n'est pas modélisable in vitro ou in silico.
Réduction
Comme évalué dans des expériences précédentes notamment concernant les études neurocomportementales, des lots de 9 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences significatives entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre et ainsi obtenir un échantillon de taille suffisante pour l’étude de nos résultats. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants pour s’affranchir d’une variabilité liée au lot.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et s'accompagneront d'une prise en charge peri-opératoire de la douleur (injection d'analgésique avant, pendant et après la chirurgie). Après chirurgie de la nourriture humidifiée sera mise à disposition des animaux à volonté pour anticiper des difficultés de mobilité de l'animal. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne, par du personnel qualifié et formé, de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole. Les critères d’arrêt sont la prostration, la présence de plaies ne cicatrisant pas, ou la perte de 20% du poids initial.
Choix des espèces
Les modèles de MRC proposé ont été développé et validé chez le rongeur. De plus, ces espèces permettent également le recours à des techniques validées d’évaluation neurocomportementale, d’imagerie cérébrale, et d’immuno-histochimie cérébrale, permettant de répondre à nos hypothèses. Tous les rats sont livrés à l'âge de 5 semaines. Une période d'acclimatation d'une semaine est respectée avant le début des procédures. Les rats sont donc soumis aux procédures à l'âge de 6 semaines. Toutes les souris sont livrés à l'âge de 7 semaines. Une période d'acclimatation de 2-3 semaines est respectée avant le début des procédures. Les animaux sont donc soumis aux procédures à l'âge de 9-10 semaines. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l'accumulation de tissu adipeux autour du pédicule rénal, qui peut géner l'interruption de la circulation.
Modèle de rat pour l’étude préclinique des maladies chroniques rénales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système urogénital
1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'ablation d'un rein, des administrations répétées de composés jusqu'à deux fois par jour, des prélèvements sanguins, des échographies cardiaques et des séjours en cage métabolique, pour mettre au point un modèle de maladie rénale chronique. Le porteur qualifie la chirurgie d'induction d'invasive et douloureuse et décrit un stress chronique lié aux gestes répétés. Il reconnaît que des modèles in vitro à base de sphéroïdes ou d'organoïdes sont en développement dans la société, tout en concluant à l'usage du rat, la finalité restant le développement de thérapies pour les patients.
Objectifs
Les maladies rénales chroniques peuvent avoir diverses origines : inflammatoires, insuffisances aigues, associées au diabète, infectieuses, …. Elles ont pour conséquence d’induire une perte de fonctionnalité rénale dont les traitements envisagés actuellement se résument à la dialyse ou la transplantation rénale. De plus, ces maladies peuvent induire des altérations cardiaques graves menant à l’insuffisance cardiaque. L'objectif de ce projet est de développer des modèles mimant les maladies rénales chroniques pour permettre le développement de thérapies moins impactantes pour la vie du patient que celles dont on dispose actuellement.
Bénéfices attendus
Seuls la dialyse ou la transplantation rénale sont envisagées pour traiter ces maladies rénales. Ce sont des traitements lourds qui impactent de façon importante la vie du patient. Ainsi, il est nécessaire de trouver de nouveaux axes thérapeutiques pour éviter d’arriver à ces thérapies relativement lourdes. La mise en place de ce type de modèle préclinique le permettra. De plus, des thérapies ciblant les conséquences au niveau du cœur peuvent être également testés.
Procédures
1 – l’induction de l'insuffisance rénale aigue : La chirurgie consistant à retirer un rein se déroule en plusieurs étapes et dure 1h30. 2 - Les composés à tester/de référence seront administrés jusqu’à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutannée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié (pendant maximum 2 semaines). L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. 3- Des prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (quelques jours avant la chirurgie, puis 24h, 48h et 72h après la chirurgie et une fois par semaine pour les projets chroniques ) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. 4 - Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies et des mesures de pression artérielle sur animal anesthésié en début et fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration du rein (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang.)
Impact sur les animaux
1 – l’induction d'une insuffisance rénale aigue : cette chirurgie est invasive et douloureuse pour l’animal. En induisant la pathologie, une différence de production d’urine peut être attendue. De la même façon, une différence de prise hydrique peut être attendue. 2 - Les prélèvements de sang peuvent engendrer des hématomes, les sites de prélèvements seront observés de près. La mesure de débit de filtration du rein nécessitant une anesthésie isoflurane et une injection intraveineuse à la veine caudale entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. L'echographie et la mesure de la pression artérielle sont non invasives mais nécessite une anesthésie légère, le reveil des animaux sera surveillé de près. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. 3 – Les traitements : le geste de traitement, i.e. gavage, injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, réalisé à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le rein, paramètres métaboliques et de fonction rénale dans le sang...)
Remplacement
L’insuffisance rénale aigue pourrait être étudiée à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. Des modèles in vitro à partir de système sphéroïde ou organoïde sont en cours de développement au sein de la société.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. D’autre part, nous réduisons le nombre d’animaux du groupe de rats sains (non néphrectomisés).
Raffinement
Lors de la chirurgie et en post-chirurgie, des stratégies analgésiques locales et systémiques seront utilisées pour réduire la douleur. L'animal est placé sur tapis thermorégulé avec sonde rectale de température avec mesure instantanée de la température corporelle, garantissant le maintien de l'animal à 37°C pendant la chirurgie. Un concentrateur à dioxygène est couplé à l'appareil à isoflurane pour favoriser la respiration des animaux anesthésiés. Les rats seront hébergés par deux pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque le rat est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin de répondre aux différents besoin des rats. Une double litière pourra être déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. Après la chirurgie, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids, comportement) par les personnes qui ont réalisé la procédure et la SBEA. Après la chirurgie et jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points suivants : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier sera euthanasié. En raison de l’évolution rapide de la pathologie, les animaux seront visités de façon biquotidienne et des mesures d’approches et de préhension seront adaptées pour ne surprendre et stresser l'animal. En cas de déshydratation, un gel d'hydratation peut être ajouté ou une injection sous cutanée de solution saline peut être envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage à métabolisme pour limiter le stress de l'animal. De la même façon, la prise hydrique sera monitoré plusieurs fois par semaine.
Choix des espèces
L’utilisation de rat permet d’étudier à la fois le pan rénal et le pan cardiaque de façon robuste. De plus, les traits de la pathologie sont comparables à ce qui est observé chez l’homme. Les animaux utilisés seront étudiés à l’âge adulte afin que la maturation de leur physiologie (hormonale, immunitaire) soit stable et garantir une homogénéité des résultats.
Nitrites et cancer colorectal : effets de la diminution ou du retrait des nitrites dans les charcuteries sur les paramètres fécaux et urinaires associés au cancer colorectal dans un modèle rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime contenant de la charcuterie pendant dix-huit jours puis passent jusqu'à 48 heures seuls en cage à métabolisme, source de stress, pour recueillir urines et fèces. À l'issue, le porteur indique que 150 rats seront adoptés, environ 250 réutilisés en formation et le reste tué. Il affirme qu'aucune étude in vitro ne permet d'évaluer l'effet des nitrites sur l'"organisme entier".
Objectifs
Les études épidémiologiques réalisées chez l’Homme montrent une association entre la consommation de charcuteries et le développement du cancer colorectal. Les additifs nitrés (nitrites et nitrates) sont utilisés dans les charcuteries pour limiter le développement de bactéries pathogènes mais aussi pour retarder la date limite de consommation. Les charcuteries contiennent également du fer héminique, constituant important des muscles ou viandes. Les études épidémiologiques et celles réalisées chez le rat montrent que ces additifs nitrés et le fer héminique pourraient être responsables de cet effet néfaste, car pendant la digestion, ils favorisent la formation de composés toxiques. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de la diminution ou du retrait des additifs nitrés dans les charcuteries sur la formation des composés toxiques. Les doses de nitrites et nitrates seront choisies pour évaluer l’effet d’une diminution importante de l’utilisation de ces additifs dans les charcuteries les plus consommées en France. Les charcuteries représentatives des 20 charcuteries les plus consommées seront produites avec quatre doses d’additifs nitrés : la dose actuellement utilisée dans la production des charcuteries, deux doses plus faibles et une charcuterie sans additif. En plus d’un groupe sans charcuterie, l’effet du retrait ou de la diminution des additifs nitrés sera testé en ajoutant ces différentes charcuteries à la ration des rats. Dans ce projet, 800 rats seront nourris avec un régime contenant ou non de la charcuterie pendant 18 jours. Leurs urines et leurs fèces seront récupérées. Ces échantillons permettront des mesures des produits toxiques formés pendant la digestion de ces charcuteries contenant un gradient d’additifs nitrés.
Bénéfices attendus
L’objectif est d’identifier une dose d’additifs nitré la plus basse possible afin de préconiser des doses faibles voire nulle d’additifs dans les charcuteries. Ainsi cela aurait comme bénéfice de proposer un levier de prévention du risque du cancer colorectal associé à la consommation de charcuterie.
Procédures
Pour les prélèvements des fèces et urines de 24 h, tous les rats seront hébergés en cage individuelle spécifique pendant maximum 48h en continu. Les rats seront en habituation pendant 3h dans ces mêmes cages la veille. Les prélèvements sont en fait des recueils dans des réceptacles sous la cage à métabolisme. Nous recueillons toute la production de 24h en fèces et en urine séparément, 2 fois, au bout de 24 et 48h à J17 et J18. Les rats ne sont pas manipulés.
Impact sur les animaux
Le projet comporte un passage en cage spécifique pendant 48h (après 3h d’habituation) ce qui peut générer du stress chez le rat (rat isolé). Nous sommes très attentifs au suivi des animaux pendant cette période (ouverture d’une fiche de suivi sanitaire scoré avec 9 points de contrôle en 2.5 jours). Pour compléter, nous réaliserons une mesure de la consommation alimentaire et d’eau de boisson le deuxième jour et une mesure de poids corporel.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux rentreront dans un processus de don après une période de 7 jours d'adaptation à une alimentation conventionnel, afin que - 150 rats maximum soient adoptés via une association d'adoption d'animaux. - qu’environ 250 rats soient réutilisés lors de formation. - Le reste des animaux sera euthanasié.
Remplacement
Aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions des doses de nitrites dans les charcuteries d'un organisme entier, sur la physiologie, sur le métabolisme et sur les formations des composés toxiques au niveau de la lumière colique. Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l’écosystème colique.
Réduction
Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, pour ces études nutritionnelles, sur la base un test statistique, le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=8 animaux/lot) et la durée de l’étude au maximum (18 jours). Notre expérience, nos publications et une analyse statistique montrent que ce nombre de 8 animaux par lot est nécessaire pour observer un effet sur les indicateurs précoces du cancer colorectal.
Raffinement
L’environnement des rats sera enrichi avec une niche. Les cages utilisées seront transparentes pour maintenir un contact visuel et le suivi sanitaire sera plus fréquent. Pour les interventions potentiellement stressantes (hébergement individuelle pendant 48h), les rats seront habitués au préalable. Les interventions des opérateurs seront minimales hors observation sanitaire, de manière à les maintenir dans un lieu d’hébergement le plus calme possible.
Choix des espèces
Le rat Fisher est un bon modèle pour étudier la modulation de la cancérogenèse colorectale associée à la consommation d’un régime riche en charcuteries et pour étudier le rôle des nitrites et du fer héminique. Les mâles sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur la cancérogenèse). Les études se feront sur des rats adultes. Ils seront âgés de 5 à 6 semaines à leur arrivée et leurs organes seront matures en particulier ceux de l'appareil digestif et l’écosystème colique L'ensemble des études précédentes du laboratoire ont été menées sur des rats adultes du même âge dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec ces études précédentes, il est important de rester au même stade de développement.
Formation et maintien des compétences aux techniques d’administrations et de prélèvements chez le rat
- Formation professionnelle
300 rats vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures classées légères ou menées sous anesthésie sans réveil, non pour produire des connaissances mais pour entraîner du personnel aux gestes d'injection et de prélèvement. Les animaux vigiles reçoivent jusqu'à trois injections ou gavages espacés d'une semaine, le gavage pouvant irriter l'œsophage, tandis que les gestes plus invasifs sont pratiqués sous anesthésie terminale. Le porteur indique s'entraîner d'abord sur des "rats factices" et récupérer la majorité des animaux dans d'autres projets terminés ou surnuméraires. Il affirme que la réglementation "requiert" un personnel formé et que ses projets sur animaux vivants imposent ce type d'entraînement.
Objectifs
La règlementation en vigueur concernant la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, requiert que le personnel soit compétent et formé. Le personnel de notre Institut suit les formations théoriques obligatoires. Afin de compléter cette formation, nous offrons à nos nouveaux arrivants ainsi qu’au personnel souhaitant maintenir ses compétences techniques, la possibilité de réaliser les techniques d’administration ou de prélèvements sanguins faits en routine dans nos animaleries. Cette formation permettra ainsi à nos techniciens d’être compétents et de réaliser l’ensemble des projets de l’institut dans les meilleures conditions pour les animaux. Ils seront sous la supervision d'un tuteur en interne qui maîtrise parfaitement ces gestes techniques. L’ensemble de nos projets se déroulant sur animaux vivants, il ne nous est pas possible de réaliser des formations autrement qu'avec des rats. Cependant, il existe des rats factices sur lesquels nous nous entrainerons aux différents prélèvements et administrations avant d'utiliser des animaux vivants.
Bénéfices attendus
Cette formation continue permet ainsi à nos techniciens d’être compétents et de réaliser l’ensemble des projets de l’institut dans les meilleures conditions pour les animaux. Elle permet donc un meilleur raffinement des procédures. Ces formations permettent également de garantir un résultat robuste et sans biais expérimental dans les divers projets menés qui font appel à des techniques de prélèvement ou d'administration sur les rats.
Procédures
Les procédures de classe légères (injections et gavages) seront réalisées sur animaux vigiles. Une contention de quelques secondes sera nécessaire pour réaliser le geste technique. Chaque animal pourra recevoir deux injections et un gavage avec un délai minimum d'une semaine de repos entre chaque procédure. Les procédures de classes sans réveil seront réalisées sous anesthésie générale après injection d'un mélange d'anesthésiques et les animaux seront mis à mort directement après la fin des gestes techniques, sans réveil. L'injection se fera sous contention de quelques secondes. L'anesthésie durera maximum une heure durant laquelle les gestes de prélèvements et administrations seront réalisés, puis l'animal sera mis à mort directement avant son réveil.
Impact sur les animaux
Pour certains types de gestes techniques à réaliser, ils doivent être réalisés sous contention. La contention, est un geste non invasif et de courte durée qui permet l'immobilisation de l'animal le temps de réaliser l'acte souhaité. Le gavage est réalisé à l'aide d'une sonde qui est introduite dans l'oesophage pour aller déposer directement une substance dans l'estomac. La sonde peut créer une légère irritation temporaire de l'eosophage. Les autres modes de prélèvements et administrations ont recourt à l'utilisation d'une aiguille (tailles différentes en fonction de l'acte réalisé) Les sites d'injection seront surveillés pour éviter toute inflammation ou infection (rougeur, gonflement, écoulement...)
Devenir
Les animaux utilisés pour les procédures peu invasives peuvent recevoir un maximum de 3 actes d'administration à une semaine d'intervalle à chaque fois, puis seront mis à mort. Pour les actes plus invasifs, ils seront réalisés sous anesthésie, sans réveil de l'animal.
Remplacement
L’ensemble de nos projets se déroulant sur animaux vivants, il ne nous est pas possible de réaliser des formations autrement que chez l'animal. Cependant, il existe des rats factices sur lesquels nous nous entrainerons aux différents prélèvements et administrations avant d'utiliser des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux par procédure a été évalué en fonction des besoins des différents services de l'Institut en termes de formation initiale des personnes n'ayant jamais manipulé de rat d'une part et selon les besoins de maintien des compétences au fil du temps d'autre part. Voici le détail du calcul : Pour la première partie du projet : • Formation initiale nouveaux arrivants : 8 rats prévus par personne sur 5 ans • Maintien des compétences : 1 rat x 4 personnes tous les 4 mois sur 5 ans. Pour les animaux de la seconde partie du projet : • Formation initiale nouveaux arrivants : 10 rats prévus par 1 personne sur 5 ans • Maintien des compétences : 1 rat x 5 personnes tous les 2 mois sur 5 ans. Le nombre d'animaux utilisés est plus grand et la fréquence d'entrainement est plus grande pour la seconde partie du projet car les gestes techniques à réaliser nécessitent plus d'entrainement. Il existe des rats factices sur lesquels nous nous entrainerons aux différents prélèvements et administrations avant d'utiliser des animaux vivants. Par ailleurs, afin de réduire au minimum le nombre de rats utilisés, la très grande majorité des animaux servant aux formations proviendront d’autres projets terminés ou surnuméraires.
Raffinement
Les rats sont hébergés en groupe pour respecter leur caractéristique d'animaux grégaires. De l'enrichissement sera placé dans les cages d'hébergement ( nid, bâton et balle à ronger, croquettes d'alimentation dans le fond de la cage). Pour les premières phases d'entrainement sur les différents prélèvements sanguins, des rats factices seront utilisés. Les animaux utilisés en vigile seront particulièrement surveillés post manipulation pour déceler toute forme d'inconfort ou de douleur. Les points limites selon la procédure que les rats auront subi seront particulièrement surveillés. -Point d’injection : une attention particulière est mise sur ces sites afin de s’assurer qu’il n’y a pas d’infection./d’inflammation (rongeur, écoulement…). Dans ce cas, les animaux seront soit traités, soit euthanasiés. -Gavage : l’animal sera surveillé après l’administration pour s’assurer de l’absence de fausse route. En cas de fausse route, l’animal sera immédiatement euthanasié. La bonne prise alimentaire et de boisson sera surveillée après le gavage. En cas de problème decelé, l'animal sera mis à mort. Afin de garantir une non douleur de l'animal et un confort de manipulation de l'expérimentateur, nous ferons les procédures les plus invasives sur animaux anesthésiés et sans réveil.
Choix des espèces
L’Institut développe de nouveaux modèles de rats génétiquement modifés depuis quelques années. Une fois ces modèles prêts, il s'avère scientifiquement nécessaire de les caractériser et pour cela, le personnel doit être formé aux différentes techniques de manipulation, administration et prélèvements. Les animaux seront adultes (8 semaines à 20 mois) car pour la majorité issus d’autres projets d’une part et d’autre part parce que les projets de l'institut se font sur adultes et le personnel doit donc se former à ce stade. Les animaux seront indifféremment des mâles ou des femelles selon la disponibilité en animaux «inutilisés» dans les animaleries.
Evaluation de la distribution de nanoparticules métalliques dans un modèle de tumeur cérébrale chez le rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intracérébrale de cellules tumorales à travers un orifice pratiqué dans le crâne, puis une injection de nanoparticules et deux séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être tué. Le porteur décrit surtout les nuisances liées à la chirurgie et prévoit un isolement d'une nuit pour éviter que les animaux ne rongent leurs sutures. Il indique que des tests cellulaires ont présélectionné trois nanoparticules mais que l'évaluation de leur accumulation tumorale n'est "pas remplaçable" sans animaux.
Objectifs
Bien que l'incidence du glioblastome soit faible (~6/100000) la médiane de survie post-diagnostic est de l'ordre de 15 mois malgré un traitement agressif associant une chirurgie et une chimio/radiothérapie. Parmi les améliorations thérapeutiques possibles, l’apport de nanoparticules radio-sensibilisante est envisagée. L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer la distribution de nouveaux agents nanoparticulaires dans un modèle dans un modèle murin de glioblastome.
Bénéfices attendus
Le bénéfice à court terme est de documenter l’accumulation de différents nanovecteurs radiosensibilisants avant de réaliser une étude d’efficacité thérapeutique en utilisant leurs propriétés radiosensibilisantes mais également l’association avec des chimiothérapies.
Procédures
Tous les animaux seront injectés en intracérébral avec des cellules tumorales. La durée totale de la chirurgie est de 15 minutes et est implique une anesthèsie. L'injection unique intraveineuse de thérapie est réalisée en bolus sur une durée de moins de 5 secondes. Deux séances d'imagerie sont planifiées et impliquent une anesthèsie de 10 minutes à 4heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont relatives à la chirurgie incluse dans le protocole. En effet, la chirurgie consistera à injecter les cellules tumorales au travers d'un orifice de diamètre inférieur à 1mm dans le crâne du rat après incision cutanée. Enfin, après chaque chirurgie, les animaux seront isolés pendant une nuit afin d’éviter qu’ils ne se rongent mutuellement les sutures. Au moment des sessions imageries, les animaux seront anesthèsies.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Il existe de nombreux tests d’évaluation de toxicité sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous ont permis de présélectionner les 3 types de nanoparticules que nous allons évaluer. Toutefois, pour cette phase d’évaluation de l’accumulation tumorale des nanovecteurs, le recours à des animaux n’est pas remplaçable.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante. En effet, une simulation en utilisant G-power, montre que pour mettre en évidence une éventuelle différence d’accumulation de nos nanovecteurs supérieure ou égale à 20%, nous groupes doivent être constitués de 12 individus, avec un risque alpha de 0.05 et beta 0.95.
Raffinement
Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux recevront en per opératoire une injection sous cutanée de buprénorphine et au site d'incision une injection de lidocaïne. Ils seront maintenus en normothermie pendant toutes les procédures chirurgicales ainsi que lors de l’examen IRM - normothermie assurée par une couverture chauffante asservie à la température rectale. Pendant l’examen IRM un suivi du rythme respiratoire sera réalisé afin d’évaluer la qualité de l’anesthésie. Le suivi régulier des animaux sera réalisé afin de s'assurer que les points limites adaptés à l'étude ne sont pas atteints. Un arbre descisionnel est mis en place pour arrêter toute souffrance à laquelle les animaux pourraient être exposés.
Choix des espèces
Le rat est retenu pour cette étude dans la mesure ou le modèle est bien documenté et établi dans notre laboratoire.
Implantation sous-cutanée de biocapteurs sans fil pour la mesure en continu du glucose avec auto-recalibration
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
44 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit sous la peau un biocapteur de glucose de deux centimètres de diamètre par chirurgie, subit des prélèvements de sang et des mesures sous anesthésie, puis est tué entre un et vingt-huit jours pour analyser les tissus autour de l'implant. Le porteur indique que la taille du dispositif justifie de préférer le rat à la souris et reconnaît une gêne ainsi qu'une douleur postopératoire. Il affirme que l'étude de la réaction à corps étranger impose le recours aux animaux, le projet visant une "preuve de concept" pour un futur "pancréas artificiel".
Objectifs
L'ensemble du projet vise à développer des biocapteurs de glucose capables de communiquer sans fil et sans pile avec un récepteur pour de futures applications de mesure en continu de la glycémie (la concentration de glucose) au profit de patients diabétiques. Les biocapteurs seront composés d'un biomatériau biocompatible, portant deux régions conductrices en or de chaque côté ; le signal électrique produit en présence du glucose créera une onde électromagnétique détectée à distance par un récepteur. Ce biocapteur ne nécessitera pas de pile pour la transmission sans fil. La technologie développée dans ce projet vise également à analyser la formation de fibrose autour du biocapteur pour, à terme, éviter aux patients diabétiques de se piquer le doigt quotidiennement. La finalité du projet s'inscrit dans la dynamique de recherche portant sur le concept de "pancréas artificiel".
Bénéfices attendus
Ce projet vise à établir une preuve de concept de la technologie. "L'épidémie" de diabète à travers le monde, et en particulier dans les pays pauvres, justifie le développement de biocapteurs dont le coût de production soit aussi réduit que possible, ce qui est le cas pour la technologie dont dépend le projet présenté ici. Le biocapteur développé dans un premier temps pour la preuve de concept est de taille assez importante pour s'assurer d'un signal électromagnétique suffisant pour être détecté à distance et à travers les tissus de l'animal. Par la suite, nous ferons évoluer la technologie pour miniaturiser le dispositif implanté. D'autre part, l'évaluation de la fibrose autour du biocapteur vise à développer des biocapteurs "2 en 1", qui permettent à la fois une mesure en continu de la glycémie avec communication sans fil vers un récepteur et une auto-calibration qui pourrait dispenser les patients de la piqûre du doigt, ou au moins en diminuer la fréquence. La finalité du projet s'inscrit dans la dynamique de recherche portant sur le concept de "pancréas artificiel".
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale sous anesthésie d'une durée inférieure à 20 min. Certains seront soumis au prélèvement sous anesthésie d'une goutte de sang à une ou plusieurs reprises (durée maximale de l'anesthésie : 10 min). Pour les mesures sans fil sur animaux anesthésiés, la durée maximale de l'anesthésie (profonde pour la chirurgie puis légère pour les mesures) sera d'une heure.
Impact sur les animaux
Les biocapteurs implantés sont de taille relativement importante à ce stade (diamètre de 2 cm) et entraineront donc une gêne (non douloureuse) pour les animaux. C'est la raison pour laquelle les rats ont été préférés aux souris. Il s'agit d'une implantation en sous-cutané. Une douleur post-chirurgicale due à l'incision devra donc être prise en compte par un traitement analgésique adapté.
Devenir
Les animaux devront tous être euthanasiés, entre 1 jour et 28 jours après l'implantation, de manière à prélever et analyser les tissus situés autour de l'implant.
Remplacement
Les premières expériences (choix d'une résine non toxique, optimisation des biocapteurs, développement des récepteurs pour la communication sans fil) ont été/seront effectuées in vitro et n'impliquent pas l'utilisation d'animaux de laboratoire. Dans les expériences suivantes, où la réaction à corps étranger doit être présente pour les études de développement pré-clinique, il n'est pas possible de remplacer les animaux.
Réduction
Comme il s'agit à ce stade d'un projet "preuve de concept" où la question est surtout de montrer que le système électronique fonctionne in vivo, nous prévoyons de faire les étapes d'optimisation sur un seul rat à chaque étape et sur trois rats pour chaque condition de l'analyse de biocompatibilité. Ensuite, des petits groupes de rats (n = 3/groupe) permettront d'évaluer la reproductibilité des dispositifs et du système de détection.
Raffinement
Lors de la chirurgie et dans les jours suivants si nécessaire, une analgésie suffisante sera mise en place (morphinique, anesthésiques locaux à durée d'action courte et moyenne, anti-inflammatoire non stéroidien). Un seul biocapteur pourra être implanté sur chaque animal pour limiter la gêne ressentie. Afin de limiter autant que possible le stress des animaux, ceux-ci seront maintenus dans leur groupe d'origine après la chirurgie et les mesures qui nécessitent une immobilisation des animaux seront effectuées sous anesthésie légère si nécessaire. Les cages sont pourvues d'un enrichissement (frisons, tunnels en plastique) ; après chirurgie, les animaux se réveilleront dans une cage isolée avant d'être remis avec leurs congénères. Une grille d'évaluation utilisée pour suivre les animaux impliqués dans une expérimentation permettra de définir un score à ne pas dépasser ; en cas de dépassement (atteinte de point limite), l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Compte tenu de la taille des biocapteurs (2 cm de diamètre), les rats ont été préférés aux souris. Pour la même raison et parce qu'il ne s'agit pas d'une étude en lien avec le développement, nous utiliserons des animaux adultes (12-30 semaines).
Identification des neurones du tronc cérébral impliqués dans la régulation de l’activité cardiovasculaire pendant la respiration
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 1320
2 472 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les animaux subissent dès l'âge d'une semaine une amputation de phalange sur animal vigile, puis une à deux chirurgies d'une à deux heures et demie, des injections intracérébrales de virus, la pose de cathéters et de sondes et des injections répétées, avant d'être tués pour prélever le cerveau. Le porteur qualifie la phalangectomie de "nuisance" et reconnaît le stress des contentions et des chambres de pléthysmographie, tout en affirmant l'absence d'inflammation liée aux virus. Il indique qu'aucune approche autre que l'expérimentation animale n'est envisageable en l'état, espérant que ces données fonderont de futures études in silico.
Objectifs
La respiration et l'activité du cœur et des vaisseaux sanguins sont contrôlées par des réseaux de neurones situés dans une partie du cerveau nommée tronc cérébral. Ces deux fonctions vitales participent ensemble au renouvellement de l’oxygène (O2) et du dioxyde de carbone (CO2) dans l’organisme. Cependant, nous ne savons toujours pas précisément quels sont les mécanismes nerveux qui permettent à l’activité cardiovasculaire de varier pendant la respiration. L’objectif général du projet est d’identifier les neurones impliqués dans ce processus et d’en expliquer les mécanismes. A l’aide de techniques innovantes basées sur l’utilisation de virus modifiés, nous localiserons d’abord ces neurones avec une grande précision dans le tronc cérébral. Ensuite, il s’agira de stimuler les neurones que nous aurons identifiés afin de mesurer les effets physiologiques provoqués. Dans d’autres expériences basées sur des techniques récentes d’imagerie, l’activité électrique de ces neurones sera enregistrée. Enfin, nous chercherons à savoir comment les paramètres cardiovasculaires et respiratoires contrôlés par ces neurones varient dans le cadre de comportements spécifiques. Les expériences proposées devraient permettre de démontrer que les neurones identifiés participent bien au contrôle cardiovasculaire pendant la respiration, notamment grâce à notre capacité de les activer ou les inactiver. Chez l’homme, ce contrôle nerveux cardiovasculaire que nous étudions est présent chez les individus en bonne santé, tandis qu’il est altéré dans de nombreuses pathologies. Notre projet a donc pour ambition de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ces processus physiopathologiques dans l’espoir de disposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche proposé vise a améliorer nos connaissances sur le contrôle nerveux de deux fonctions vitales que sont la respiration et le système cardiovasculaire. Les résultats obtenus devraient permettre d'élucider les mécanismes neuronaux à l'origine de la genèse du rythme respiratoire et du couplage cardiorespiratoire. Plus précisément, il s'agit d'itentifier les populations de neurones qui contrôlent l’activité respiratoire et qui régulent l’activité cardiovasculaire et ainsi de mieux comprendre l’origine de la synergie entre les activités respiratoire et cardiovasculaire. Ces mécanismes sont d’une importance cruciale tant d’un point de vue fondamental que clinique. En effet, le fonctionnement normal de ces systèmes garantit l'oxygénation optimale de toutes les cellules de l'organisme, tandis que l’altération de ces mécanismes conduit à des pathologies mortelles telles que l’hypertension artérielle ou encore l’insuffisance cardiaque chronique. Les explorations fonctionnelles réalisées dans ce projet permettront pour la première fois d’établir une relation de cause à effet entre l’activité des neurones identifiés et le fonctionnement en synergie des activités respiratoire et cardiovasculaire. Ces découvertes pourraient donc permettre d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles et de lutter plus efficacement contre ces maladies. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront également de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.
Procédures
Une biopsie de la phalange distale sera effectuée sur tous les animaux (rats et souris) âgés d'une semaine. En effet, le jour postnatal 7 (P7) semble être l'âge le plus adéquat pour réaliser cette biopsie. Une seule intervention chirurgicale d'une durée comprise entre 1h30 et 2h30 sera réalisée dans deux procédures chez le rat et/ou la souris. Dans les deux autres procédures, deux interventions chirurgicales d'une durée comprise entre 1h30 et 2h30 seront effectuées chez la souris et/ou le rat. Ces deux interventions seront séparées d'une vingtaine ou d'une quarantaine de jours. Selon les procédures, les animaux seront soumis à différents types d’interventions. Tous les animaux recevront une ou plusieurs micro-injections cérébrales de virus modifiés (une seule fois, durée de l’intervention : 20-30 minutes). Chez certains animaux, une ou deux canules optiques intracérébrales seront fixées à la surface du crâne (une seule fois, durée : 45 minutes environ) et un cathéter sera également inséré dans une artère pour mesurer la pression artérielle (une seule implantation fixe, durée : environ 35 minutes). Dans d’autres cas, une sonde de télémétrie sera implantée en sous-cutané chez les animaux pour mesurer l’activité électrique cardiaque (une seule implantation fixe, durée : environ 40 minutes). Chez d’autres animaux, plusieurs injections de composés pharmacologiques seront réalisées par voie intrapéritonéale (fréquence : 2 injections par jour espacées de 12h, pendant 15 jours ; durée d’une injection sous anesthésie légère: 5 minutes). Enfin, pour mesurer les paramètres respiratoires sur le long terme, certains animaux seront d’abord acclimatés dans un pléthysmographe (1h par jour pendant 10 jours), avant de les placer de nouveau dans cet appareil pour les enregistrements chroniques (1h par jour, pendant 2 semaines environ).
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables attendus sur les animaux sont inhérents à la mise en œuvre de plusieurs protocoles décrits dans le présent projet. C’est notamment le cas de la phalangectomie sur animal vigile qui représente une nuisance et de l’anesthésie qui en soi génère du stress. Le test de contention utilisé afin de mesurer le niveau de stress des animaux génère également du stress. Le fait de placer les animaux dans une chambre de pléthysmographie de manière répétée ou encore d’effectuer plusieurs fois des injections de composé 21 sous anesthésie induit un stress. Dans tous les protocoles, la douleur, la souffrance et le stress liés aux procédures chirurgicales seront réduits à un niveau minimum grâce à l'emploi d'une anesthésie, d'une antalgie et de soins médicamenteux appropriés. Les responsables de projet ont une grande expérience dans la mise en œuvre des techniques de chirurgie et de la prise en charge ainsi que du suivi post-opératoire des animaux. Une réduction transitoire, plus ou moins marquée de l'activité locomotrice est observée pendant 12 à 24h environ suivant la chirurgie. La cicatrisation complète des plans cutanés suturés est observée dans les 5 à 7 jours qui suivent la chirurgie. Enfin, il n'y aura pas de nuisances ou effets indésirables suite à l'injection intracérébrale des virus utilisés dans ce projet. En effet, il s’agit de virus non-réplicatifs dont le génome a été altéré dans le but de ne produire que certaines protéines essentielles à la fonction virale souhaitée (ciblage et manipulation des neurones d’intérêt). Les données de la littérature et notre propre expérience indiquent que les conditions dans lesquelles ces virus sont injectés (niveau de titre, volumes injectés etc.) n'induisent pas d'inflammation notoire au niveau du site d'injection ou ailleurs dans le cerveau (tissu nerveux sain dans la zone d'injection, cellules aux aspects normaux etc).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, dans la plupart des cas le cerveau des animaux devra être prélevé dans le but de localiser les neurones d’intérêt. Dans d’autres cas, le modèle expérimental mis en œuvre nécessitera une euthanasie préalable.
Remplacement
Ce projet a pour but d'élucider les mécanismes de genèse du rythme respiratoire et de couplage entre neurones respiratoires et cardiovasculaires. Pour l’instant, les connaissances incomplètes sur le sujet ne permettent pas d’envisager d’approches autres que l’expérimentation animale pour répondre à ces questions (comme une étude in silico par exemple). En effet, il s'agit de mécanismes physiopathologiques fondamentaux pour lesquels il n'existe que très peu ou pas de résultats antérieurs. Cette absence de connaissances a priori sur ces mécanismes explique donc l'incapacité actuelle à modéliser le fonctionnement des réseaux cardiorespiratoires centraux. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.
Réduction
Le présent projet repose sur l’utilisation de techniques modernes, encore jamais employées pour étudier le contrôle central cardiorespiratoire. L'aspect novateur de l'étude garantit des avancées majeures et indispensables sur la physiopathologie de ces systèmes. En particulier, la technique d’enregistrement des activités cellulaires par imagerie du voltage sur la préparation perfusée in situ nous permettra de répondre à de nombreuses questions grâce à la mise en œuvre de plusieurs protocoles expérimentaux. Cela sert le double objectif d’optimisation des aspects scientifiques et éthiques. De plus, la variabilité interindividuelle sera réduite par l’utilisation de souches murines fixées génétiquement. Enfin, une analyse de puissance statistique sera réalisée systématiquement avant chaque expérimentation afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à la question expérimentale. Une fois les expérimentations réalisées, des tests statistiques appropriés permettront de valider ou non la question initiale posée. Les différentes stratégies expérimentales proposées ici nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour servir les objectifs scientifiques de cette étude en utilisant les outils, approches techniques et modèles murins les plus appropriés à chaque partie de l’étude. En particulier l'usage de souches transgéniques chez la souris et le rat, combiné aux approches opto- ou pharmacogénétiques, permet de cibler beaucoup plus spécifiquement les neurones d'intérêt par rapport aux autres techniques existantes, ce qui contribue à la réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie conventionnelle, dans des pièces où la température est contrôlée et dans des cages avec environnement enrichi. Le nombre limite d’animaux par cage sera respecté et les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures expérimentales induisant de la douleur, ici des approches chirurgicales. Cette anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards, notamment pour ce qui concerne les pourcentages de gaz dans l’air lors des phases d’induction et de maintien. Elle sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire rigoureux en utilisant notamment une fiche individuelle de suivi. Les responsables du projet possèdent une grande expérience dans ce domaine.
Choix des espèces
Dans ce projet, deux espèces d’animaux seront utilisées, souris et rats. L’intérêt général de ces deux modèles repose essentiellement dans leur proximité physiopathologique avec l’Homme (transférabilité des résultats), la reproduction rapide des animaux, et les conditions requises pour leur stabulation qui sont relativement peu contraignantes. Le modèle souris présente l’avantage d’être très permissif à la transgenèse, il existe aujourd’hui une banque importante de souris transgéniques qui nous permettra d'identifier précisément les mécanismes en jeu grâce à la variété de recombinaisons génétiques possibles. Le modèle rat présente l’avantage d’être plus robuste physiologiquement que le modèle souris, notamment en ce qui concerne l’approche in situ (voir procédure 3), permettant d’utiliser moins d’animaux (car moins de perte expérimentale) pour chaque objectif expérimental. Les animaux adultes provenant des établissements éleveurs seront maintenus dans l'établissement utilisateur et les expériences seront effectuées sur la descendance. Une biopsie de phalange distale (phalangectomie) sera d'abord effectuée à l'âge d'une semaine (P7), ce qui permettra de réaliser le génotypage et d’identifier ainsi chaque animal. Pour pouvoir comparer les résultats obtenus dans l'ensemble du projet de recherche, toutes les expérimentations reposeront sur des injections virales effectuées à l'âge de trois semaines (P21). A cet âge, le génotype des animaux sera donc connu. Les expérimentations finales des procédures 1, 2 et 4 seront réalisées chez le rat et/ou la souris à l’âge adulte (2-5 mois), et celles de la procédure 3 sera réalisée chez le rat à un stade juvénile (P30-35). Nous cherchons à déterminer les mécanismes générant le rythme respiratoire et le couplage central cardiorespiratoire dans les conditions les plus physiologiques possibles, chez des organismes pleinement développés et non-sénescents. Ces mécanismes sont pour l’instant mieux connus pour les stades développementaux précoces, notamment grâce aux approches in vitro qui ne fonctionnent qu’à ces âges. La préparation in situ, utilisée en procédure 3, est optimale chez le rat juvénile à condition d'être réalisée à P30-35 maximum. C'est donc cette contrainte temporelle qui justifie d'effectuer les injections virales à P21 (sevrage) pour permettre un temps d’expression suffisant des transgènes.
EFFET DE L’IMPACT DU DIABETE DE TYPE 2 SUR L’HEMATOPOIESE DANS LA MOELLE OSSEUSE
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont piqués à la queue chaque semaine pour la glycémie et subissent trois prélèvements de moelle osseuse fémorale sous anesthésie sur deux mois, pour étudier l'effet du diabète de type 2 sur la production des cellules sanguines. Le porteur indique que l'état diabétique provoque une polyurie sévère imposant des changements de cage fréquents, et prévoit la mise à mort des rats perdant plus de 20 % de leur poids. Il affirme qu'aucune alternative de remplacement n'existe pour cette approche "physiologiste", les rats Wistar et GK étant présentés comme de bons modèles du diabète humain.
Objectifs
Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique, c'est-à-dire un taux de sucre dans le sang au-dessus des valeurs normales. Cette hyperglycémie est due à un déficit, dans le pancréas, des cellules β qui sécrètent l’insuline, seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Nous avons montré que l’inflammation des îlots de Langerhans, structures majoritairement composés par les cellules β, est impliquée dans le développement du DT2. Cette inflammation implique l’arrivée et linfiltration de cellules immunitaires dans les îlots diabétiques. Toutefois, les mécanismes à l’origine de l'expansion des cellules immunitaires dans les îlots DT2 ne sont pas encore bien compris. Notre hypothèse est que l’environnement diabétique entraîne dans la moelle osseuse (MO), le principal site de production des cellules du sang, un déséquilibre en faveur de la production des cellules immunitaires retrouvées dans les îlots.
Bénéfices attendus
Le bénéfice majeur de cette étude sera l'apport d'une preuve solide que l’hyperglycémie chronique induit des perturbations sur la différenciation et le lignage des cellules sanguines (aussi bien chez les mâles que chez les femelles). L’utilisation des 2 modèles de diabète – diabète induit et diabète spontané – permettra de montrer que respectivement l’hyperglycémie seule ou l’hyperglycémie couplée aux facteurs génétiques, induisent des modifications de l’hématopoïèse. En plus de mieux comprendre l’impact de l’état diabétique sur la moelle osseuse (lieu de fabrication des cellules sanguines), les résultats obtenus permettront d’établir les bases d’une étude sur le dialogue entre les îlots de Langerhans et la moelle osseuse.
Procédures
2 types d'interventions : - Une fois par semaine les rats seront piqués à la queue pour récupérer la goutte de sang (10µL) nécessaire à la mesure de la glycémie. Cette intervention dure une dizaine de secondes sur des animaux vigiles . - Cinétique de prélèvements de MO fémorale. 3 prélèvements sur une durée de 2 mois. Cette procédure est réalisée sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Une fois par semaine les rats seront piqués à la queue pour récupérer la goutte de sang (10µL) nécessaire à la mesure de la glycémie. Cette procédure ne nécessite pas de prise en charge analgésique. L'état diabétique des rats induit une polyurie sévère, ce qui nécessite un change des cages 2 fois par semaine.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront gardés en vie pendant une période de 2 mois. A l'issue des 2 mois, les animaux seront euthanasiés dans le but de récupérer les organes d'intérêt pour l'étude : les os longs (fémurs et tibias) et le pancréas.
Remplacement
Ce projet s'inscrivant dans une approche physiologiste, il n'y a, à ce stade, aucune alternative de remplacement à celle faisant appel aux modèles animaux. Ils sont les seuls à nous permettre d’analyser l’impact pathologique de l’hyperglycémie sur la synthèse des cellules sanguines. En outre, les rats Wistar et GK représentent de bons modèles d'étude pour les pathologies diabétiques, avec des caractéristiques assez proches de celles observées dans le diabète humain, et sont largement reconnus dans la littérature scientifique.
Réduction
Les groupes expérimentaux comporteront un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de l’impact du diabète sur l’hématopoïèse et de valider statistiquement, par t-test, les différences détectées entre les groupes. Un groupe de 40 rats Wistar STZ (20 mâles et 20 femelles) nous semble suffisant pour cette étude, en tenant compte des animaux qui seront écartés, faute de ne pas développer de diabète ou à l’inverse de développer une hyperglycémie trop sévère (> 5g/L) suite à l’injection de STZ. Au vu de l'expertise de l'équipe sur ce modèle, une perte de moins de 10% est à prévoir. Une réduction du nombre d'animaux du groupe Wistar contrôles (20 mâles et 20 femelles) sera appliquée en regard du nombre d'animaux Wistar STZ qui sortira de l'étude.
Raffinement
Tous les rats seront surveillés quotidiennement (aspect global, signes de stress ou de douleur). De même pour les paramètres environnementaux des pièces d'hébergement : la température, les horaires des cycles jours/nuits, les taux d'hydrométrie. Pour les rats Wistar le change de litière est fait une fois par semaine avec un enrichissement sous forme de cubes de papier pour qu'ils puissent faire un nid et un bout de bois à ronger. Le changement de l'eau des biberons est fait 2 fois par semaine. Pour les rats Wistar STZ et les rats GK diabétiques qui ont une augmentation du volume et de la fréquence des urines, le change des biberons sera fait 3 fois par semaine. Pour ces rats, le change des cages est fait 2 fois par semaine dans une litière ultra absorbante pour leur apporter un maximum de confort ; nous éviterons le nid qui une fois souillé par l'urine entraine des mauvaises odeurs et de l'humidité ; sera disposé dans la cage un bout de bois à ronger. Les prélèvements de MO seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane et la prise en charge de la douleur prévue avant et pendant la procédure. Quant aux prélèvements sanguins, la douleur engendrée lors de la prise de sang de 10µL à la queue de l'animal ne nécessite pas de prise en charge analgésique. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine et les rats ayant perdu plus de 20% par rapport au poids initial seront euthanasiés. Une fois par semaine nous évaluerons par grille de score adapté, l'apparence, le comportement, et l'hydratation des animaux. Seront euthanasiés les rats ayant un score caractéristique de souffrances sévères.
Choix des espèces
Le choix du rat pour cette étude réside dans le fait que cette espèce présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celles de l’humain. Les rats Wistar seront utilisés à l’âge adulte de 12 semaines. De même pour les rats GK qui à cet âge ont développé le diabète et voient leurs cellules β du pancréas fortement altérées. Les animaux seront maintenus en vie 2 mois après avoir développé le diabète (induit pour les rats STZ ou spontané pour les rats GK).
Modèle de rat pour l’étude préclinique de la néphropathie et la neuropathie diabétiques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
- Système urogénital
1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur retire un rein par une chirurgie décrite comme invasive et douloureuse, avant des traitements répétés par gavage ou injection, des tests de sensibilité de la voûte plantaire, des mesures de filtration glomérulaire et un hébergement en cage métabolique, pour constituer un modèle des complications du diabète. Le porteur reconnaît que l'ablation d'un rein aggrave la maladie, que des oedèmes peuvent apparaître et que les gestes répétés génèrent un "stress chronique". Il présente ce modèle comme une offre destinée à un "client" pour "implémenter le marché" de nouveaux traitements, et affirme que la neuropathie diabétique n'est pas reproductible in vitro.
Objectifs
Le diabète de type 2, associé à l’obesité, est associé à de nombreuses commorbidités telle que la neuropathie et la néphropathie diabétique. La neuropathie diabétique est une conséquence invalidante du diabète entraînant des conséquences sur la santé et la qualité de vie des patients. Elle se traduit par de l’incontinence fécale et urinaire, des désordres gastrointestinaux, des douleurs chroniques, entre autres. La conséquence la plus grave étant les altérations nerveuses au niveau cardiaque pouvant entrainer des arythmies. La néphropathie diabétique touche 20 à 40% des patients atteints de diabète (type 1 ou type 2). On observe dans d’abord un stade d’hyperfiltration rénale. Des lésions rénales précoces vont se mettre en place afin de normaliser le stade d’hyperfiltration rénale. Ces processus finissent par s’aggraver avec le temps et entrainent à terme une albuminurie et une protéinurie. La filtration glomérulaire finit par atteindre un stade d’insuffisance rénale entrainant une dialyse à vie. L’altération de la fonction rénale a des conséquences très importantes sur les fonctions cardiovasculaires augmentant le risque de maladies cardiovasculaires. La maladie du foie gras, ou NASH (non-alcoolic steatohepatitis), touche 25 à 30% de la population générale et ce chiffre va augmenter dans les prochaines années. Cette maladie a pour conséquences principales une évolution vers la fibrose hépatique puis la cirrhose voire le cancer du foie. Cette atteinte augmente également le risque cardiovasculaire. Aujourd’hui, aucune stratégie thérapeutique efficace n’est envisagée ou prescrite dans le cadre de ses commorbidités. Les seules stratégies envisagées sont le contrôle de la glycémie par les anti-diabétiques classiques et des recommandations diététiques et/ou le traitement par anti-dépresseurs dans le cas de la neuropathie. Ainsi, la mise en place d’un modèle animal présentant ces différents aspects de la maladie permettra au client de tester des molécules anti-diabétiques sur ces comorbidités ou bien de tester des molécules hépatoprotectrices, néphroprotectrices ou neuroprotectrices afin d’implémenter le marché de nouveaux traitements. L’objectif de ce projet est de proposer un modèle préclinique présentant les caractéristiques de la NASH, de la neuropathie et de la néphropathie. L'amélioration du risque cardiovasculaire est également évalué pour démontrer l'efficacité des traitements. Un seul traitement ou une combinaison de deux traitements sera testé.
Bénéfices attendus
En proposant un modèle de rat d’étude préclinique de neuropathie, de néphropathie diabétiques et de NASH, nous ouvrons notre catalogue de modèle préclinique à ces comorbidités du diabète qui aujourd’hui ne disposent pas de traitements efficaces et qui ont pourtant des conséquences dramatiques sur la vie du patient. Également par la mise en place de modèle, nous permettrons d’éclaircir les mécanismes mis en place pour le développement de la pathologie et nous permettrons ainsi un gain de connaissance.
Procédures
La chirurgie consistant à retirer un rein se déroule en plusieurs étapes et dure environ 30 minutes. Elle n'est réalisée qu'une seule fois, au cours de la phase précoce du diabète de type 2, elle débute la phase expérimentale. Les animaux subiront différents prélèvements de sang au cours de la procédure en respectant la fréquence et le volume par prélèvement fixés par la réglementation. Un prélèvement de sang dure moins d'une minute. Les animaux seront traités avec des molécules à viser therapeutiques par gavage, injections sous cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuses régulières, par le régime ou par mini-pompe osmotique sous cutanée. Une administration dure moins de 30 secondes. Les animaux subiront également un électrocardiogramme ou une échocardiographie (une seule fois) pour évaluer les paramètre cardiaque. Ils subiront un test de tolérance au glucose oral d'une durée de 2,5 heures une seule fois. L’analyse de la sensibilité mécanique et thermique au niveau de la voûte plantaire sera réalisée 5 fois maximum avec un temps de 5 minutes entre chaque mesure. La mesure de débit de filtration glomérulaire sera réalisée deux fois, en début et en fin de procédure, sur une durée de 3 heures. La récolte d'urine ou de fecès par l'utilisation de cage métabolique se fera une seule fois, en fin de procédure, sur 18 heures.
Impact sur les animaux
1 – l’induction de la néphropathie diabétique : La chirurgie est invasive et douloureuse pour l’animal. La cicatrisation est plus difficile chez un animal diabétique et nécessite un suivi particulier. Le système rénal et urinaire est déjà modifié par le diabète, retirer un rein accélère et aggrave la maladie. Des oedèmes peuvent apparaître au niveau des pattes suite à la retention d'eau qui peut être observée chez ce modèle de rats présentant une néphropathie diabétique. 2 - Les mesures réalisées : aucun effet indésirable est attendu après le test de tolérance au glucose et les prélèvements de sang associés, l’électrocardiogramme, la pléthysmographie caudale ou l'échocardiographie. L’analyse de la sensibilité mécanique au niveau de la voûte plantaire peut induire un inconfort ou possiblement une douleur. La mesure de débit de filtration glomérulaire nécessitant une anesthésie gazeuse et une injection intraveineuse à la veine caudale entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. 3 – Les traitements : le geste de traitement, i.e. gavage, injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, réalisé à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, ce qui permettra de collecter le sang et les organes et faire des analyses biochimiques plus poussées afin d'évaluer l'efficacité des traitements réalisés
Remplacement
Le diabète est une pathologie touchant de nombreux organes et la neuropathie, la néphropathie et la NASH sont des conséquences de ce dérèglement multi organique. La neuropathie diabétique n’est pas mimable in vitro. La néphropathie diabétique peut être étudiée à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. La NASH associée au diabète peut être étudiée in vitro à partir de système sphéroïdes ou organoïdes et sont actuellement mis en place au sein de la société.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses commorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclus dans l'étude. D’autre part, nous réduisons le nombre d’animaux du groupe de rats sains, non diabétiques. Compte tenu de l'hétérogénéité des paramètres mesurés et pour pouvoir conclure sur l'efficacité d'un traitement en terme de puissance statistique, un nombre de 10 points mesurés et donc un nombre de 10 animaux par groupe au minimum est nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront, en première phase expérimentale, au cours des stades précoces du diabète, hébergés par deux pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque le rat est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin de répondre aux différents besoin des rats. Une double litière sera déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. La chirurgie sera réalisée selon un protocole d'anesthésie et d'analgésie adaptée. Après la chirurgie, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids, comportement) par les personnes qui ont réalisées la procédure et faisant parties de la structure chargée de la santé et du bien-être animal (SBEA). Après la chirurgie et jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points limites suivants sur plusieurs jours: hypothermie, prostration, perte de poids supérieurs à 20%, ce dernier serait euthanasié sous un protocole d'anésthésie associée à de l'analgésie. En raison de l’évolution rapide de la pathologie, avec une apparition de cécité sur les stades avancés, les animaux seront visités de façon quotidienne et des mesures d’approches et de préhension seront adaptées pour ne suprendre et stresser l'animal. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution hydratante est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectué en cours d’étude comme cela est le cas au cours du test de tolérance au glucose se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage à métabolisme, la mesure de sensibilité thermique et mécanique (sans stimulation) pour limiter le stress de l'animal. En cas d'apparition d'oedème, la patte concernée sera massée et mobilisée quotidiennement jusqu'à disparition de l'oedème comme préconisé par notre vétérinaire.
Choix des espèces
La souche de rats utilisés au cours de ce projet sont des rats qui développent rapidement un obesité et un diabète de type 2. Comme la maladie se développe relativement vite, les animaux seront commandés à 4 semaines d’âges car à cet âge, ils n'ont pas encore de signes associés au diabète et peuvent voyager sans crainte. Ils seront étudiés jusqu’à 10-15 semaines d’âges c’est-à-dire les stades les plus avancés de la maladie.
Ménopause modélisée chez le rat pour l’étude de composés pharmacologiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
900 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ablation des deux ovaires sous anesthésie pour modéliser la ménopause, puis reçoivent des composés à tester pendant parfois six mois, avec cystométrie de quatre heures après pose d'un cathéter intravésical et prélèvements de sang et d'urine. Le porteur indique un inconfort possible après chirurgie et administration, et précise que les interventions varient selon les recommandations d'un partenariat avec une entreprise pharmaceutique. Il affirme que la rate ovariectomisée est le "modèle de choix" et qu'aucun modèle in vitro pertinent ne rend l'usage d'animaux vivants évitable, qualifié d'"indispensable".
Objectifs
La ménopause est un événement physiologique qui survient entre 45 et 55 ans chez la femme, et qui correspond à l’arrêt du fonctionnement ovarien entraînant un arrêt de la production de progestérone puis des œstrogènes, marquant ainsi la fin des menstruations et donc de la fertilité. Cette carence en œstrogènes peut se manifester par des symptômes pouvant affecter la qualité de vie des patientes tels que des bouffées de chaleur, des modifications génitales, des dysfonctions sexuelles et urinaires. C’est aussi une période où, des pathologies potentiellement graves peuvent survenir du fait des changements hormonaux et de l’avancée en âge (fractures ostéoporotiques, maladies cardiovasculaires, cancer). Un traitement hormonal de la ménopause (THM) destiné à remplacer les œstrogènes et la progestérone qui ne sont plus produites par l’organisme, constitue le traitement le plus couramment prescrit aux femmes ménopausées. Cependant, depuis 2002, plusieurs études ont rapporté des effets indésirables graves dont un risque accru de cancer du sein et de l'utérus, et de maladie cardiovasculaire. Ainsi depuis 2003, il n’est plus recommandé d’utiliser un THM de façon systématique ou à titre préventif. Afin de soulager leurs symptômes, certaines femmes sont aussi tentées de se tourner vers des solutions alternatives, dont les potentiels risques ne sont pas encore connus. Dans ce contexte, il est donc nécessaire de conduire une recherche préclinique intensive visant à mettre en évidence et/ou à développer un traitement des symptômes de la ménopause efficace et offrant une sécurité d’emploi optimale. À ce titre, la rate ovariectomisée s’avère être un modèle préclinique de choix pour la compréhension des événements physiopathologiques associés à la ménopause et pour le développement de nouvelles thérapies efficaces. Des études préalables ont d’ailleurs montré, une diminution du taux d'œstrogènes circulants chez la rate ovariectomisée, imitant les modifications physiologiques post-ménopausiques humaines.
Bénéfices attendus
Depuis la parution de l’étude montrant les risques des traitements THM, moins de 6% des femmes ménopausées prennent actuellement ces traitements. Certaines femmes se tournent donc vers des solutions alternatives dont on ne connaît pas toujours les risques. Il est donc nécessaire d’identifier ou de développer des traitements efficaces qui offrent une sécurité d’emploi optimale. Cette étude vise à évaluer l’efficacité, et dans certains cas les effets indésirables, des nouveaux candidats médicaments dans la prise en charge des symptômes chez les femmes ménopausées, dans un modèle animal validé.
Procédures
Les animaux vont avoir une ovariectomie bilatérale sous anesthésie afin de modéliser la ménopause chez la femme. Cette opération est faite une seule fois au début de l'étude dure au maximum une demi-heure. Ensuite, les animaux seront traités par le composé à analyser ou ses contrôles, la fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (généralement moins de 6 mois). Tout type d’administration dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min si l'administration nécessite une anesthésie. Une cystométrie peut être faite pour évaluer l'effet du composé administré, l’expérience dure 4 h au maximum, précédée de l’implantation d’un cathéter intravésical. Enfin, des prélèvements de sang, d’urines ou d'organes après sacrifice pourront être envisagés. Chaque prélèvement de sang durera moins de 3 minutes. Une collecte d’urine se fait en cage à métabolisme et en moins de 24h. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ces interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.
Impact sur les animaux
L’ovariectomie et l’implantation de cathéter sont réalisées sur des animaux anesthésiés, sous antalgiques et avec une antibiothérapie prophylactique. Toutefois, une sensation d’inconfort peut apparaître chez l’animal après ces procédures. De même, l’administration des composés ou les prélèvements sanguins et ou d’urine peuvent entraîner un stress et ou une sensation d’inconfort chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront ovariectomisés afin de mimer la ménopause et vont être traité avant ou après par les composés à évaluer. L’efficacité des nouveaux traitements vont être évalués par cystométrie, et ou par l’analyse des différents prélèvements de sang, d’organe ou d’urine. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude.
Remplacement
La rate ovariectomisée est le modèle préclinique de choix pour la compréhension des événements physiopathologiques associés à la ménopause et pour le développement de nouvelles thérapies efficaces. Une diminution du taux d'œstrogènes circulants est observée chez la rate ovariectomisée, imitant les modifications physiologiques post-ménopausiques humaines. A ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro pertinent rendant ainsi indispensable l’utilisation d’un modèle intégré faisant appel à des animaux vivants.
Réduction
Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. De plus, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : les rats sont hébergés par 2 animaux par cage quand cela est possible, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Ensuite,des points limites sont fixés afin que les zootechniciens puissent signaler aux responsables des soins et du projet l’apparition des critères nécessitant les traitements nécessaires pour arrêter les souffrances. Tous les actes chirurgicaux se font sous analgésie et anesthésie générale, et un traitement antibiotique est aussi mis en place pour éviter toute complication infectieuse. A noter que toutes les procédures expérimentales ne seront pas forcément appliquées aux animaux. Les procédures expérimentales appliquées à chaque groupe de rats seront attribuées en fonction de leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.
Choix des espèces
L’expérimentation animale est nécessaire pour l’étude de modifications physiologiques multi-symptomatiques consécutives à la diminution des hormones féminines à la ménopause. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitent l’utilisation de gros animaux tels que le chien. De plus ces derniers présentent comme chez la femme une ovulation spontanée contrairement au lapin qui a une ovulation provoquée suite à un accouplement. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Concernant l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Des rates adultes de plus de 6 semaines sont employées, âge auquel les organes sexuels sont à maturité. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.
Evaluation de substances pharmacologiques sur le système nerveux périphérique chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 300
600 rats et souris vont être utilisés, dont 500 tués à l'issue et 100 animaux témoins réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des substances agissant sur les récepteurs cholinergiques sous anesthésie d'environ une heure, pour évaluer une dizaine de molécules candidates avant un éventuel passage en clinique. Le porteur indique que seuls les animaux traités sont mis à mort, l'effet à moyen et long terme des traitements n'étant pas connu, et qu'un prélèvement de sang terminal peut être réalisé sous anesthésie. Il affirme que ces tests ne peuvent être remplacés par des méthodes alternatives, tout en reconnaissant l'existence de tests in vitro et in silico pour présélectionner les molécules.
Objectifs
Le projet concerne des tests chez le rongeur visant à étudier les effets de substances pharmacologiques sur le système nerveux périphérique (plus spécifiquement sur les récepteurs cholinergiques), permettant de lutter contre différentes pathologies (symptômes de la maladie de Parkinson, troubles de la sécrétion de l'estomac ou de glandes, traitement du glaucome). Les anticholinergiques sont utilisés pour augmenter le rythme cardiaque, atténuer les symptômes de la maladie de Parkinson, diminuer les sécrétions de l'estomac ou de glandes (salivaires par exemple). Les agonistes cholinergiques ont par exemple un intérêt dans le traitement des troubles des glandes salivaires dus à la radiothérapie ou dans le traitement du glaucome. Le projet consistera à évaluer une dizaine de substances pour l’ensemble du projet par type de test (induction et inhibition).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer les potentiels effets de substances pharmacologiques sur les récepteurs cholinergiques. Il pourra permettre d’écarter des molécules qui auraient des effets néfastes (excès de salivation) ou de garder des molécules qui pourraient faire preuve d’efficacité (inhibition de l'excès de salivation); ceci avant le passage en phase clinique des nouveaux traitements dans certaines pathologies.
Procédures
Les principales interventions subies sont l'administration des substances à tester et anesthésiques (3 max au total, max 30 sec chacune). L'anesthésie est maintenue pendant environ 1 heure.
Impact sur les animaux
Les manipulations / contentions réalisées au cours des procédures d'administration peuvent entrainer un léger stress. Il n'est pas attendu de nuisances liées à cette procédure, l'animal étant sous anesthésie pendant le test qui est de courte durée (maximum 1 heure).
Devenir
L’effet à moyen et long terme des traitements reçus n'étant pas connu (par exemple, risque de toxicité non détectable immédiatement au niveau d'un organe : foie, reins...), seuls les animaux contrôles pourront être gardés, tous les animaux traités seront euthanasiés à la fin de l’étude.
Remplacement
Ces tests ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la capacité de régulation du système nerveux périphérique. Cependant, il existe des tests in vitro et in silico permettant de sélectionner en amont des molécules efficaces et dont la toxicité n’est pas avérée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet et la comparaison par rapport à une substance de référence. L' effectif a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Aussi, un prélèvement sanguin en fin d'étude pourra être envisagé, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse . L'éventual prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie (type isoflurane) pouvant être associé à un traitement analgésique (carprofene à 5 mg/kg ou équivalent) afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouet, litière, objets de nidification, objets à ronger...). Les animaux sont également hébergés en groupe.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le système nerveux périphérique chez le rongeur est prédictif de leur efficacité en clinique. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris, conformément à la bibliographie scientifique.
Etude de la pharmacocinétique d’une formulation innovante intraveineuse de mitotane chez le rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose un cathéter veineux sous anesthésie pour administrer une formulation injectable de mitotane et réaliser un prélèvement sanguin quotidien pendant sept jours, afin d'établir le profil pharmacocinétique de la molécule avant un passage chez l'humain. Le porteur indique que le traitement peut provoquer diarrhées, vomissements et anorexie, et précise avoir réduit les doses par rapport à la littérature. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, les modèles cellulaires ne permettant pas selon lui d'établir un tel profil.
Objectifs
Le but de ce projet est de réaliser les premières étapes d’un essai pré-clinique dans le but de développer une formulation injectable de mitotane, qui aura pour objectif de réduire drastiquement de délais d’action de la molécule, de réduire les effets indésirables par la diminution des posologies efficaces, et donc à terme d’améliorer l’efficacité du traitement et la qualité de vie du patient.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet Atteinte de l’intervalle thérapeutique du mitotane compris entre 14 et 20mg/L en une semaine avec libération du mitotane principalement dans les glandes surrénales chez les Rats bénéficient de la formulation optimisée. Cela permettra la validation d’un modèle pré-clinique et de passer à des essais cliniques de phase chez l’Homme. Les bénefices sont une meilleure prise en charge des patients et une baisse des effets indésirables.
Procédures
Les animaux auront un catheter veineux de posé (temps de pose évalué à une demi-heure), afin de pouvoir leur administrer un traitement avec une nouvelle formulation, ainsi que pour les prélèvements (1 prélèvement par animal et par jour , pour une durée de 7 jours, intervention quotidienne de cinq minutes).
Impact sur les animaux
Troubles Gastro-intestinal fréquemement obervés et troubles psychologiques observès -pour les troubles digestifs : diarrhées, vomissements -pour les troubles psychologiques : anorexie -afin de réduire ces troubles, le dosage utilisé pour réaliser les études de pharmacocinétique sont bien plus faible que ceux décrient dans la littérature.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements et les les organes.
Remplacement
Il est indispensable pour notre étude d’avoir recours à l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne permettent pas la réalisation d’un profil pharmacocinétique. Il est donc primordial avant de passer sur un modèle Humain de définir la pharmacocinétique chez l’animal.
Réduction
Des recherches sur la DL 50 ont été effectuées, afin de ne pas sacrifier inutilement des animaux. Seuls deux groupes seront utilisés, de 10 Rats chacun, ce qui nous semble le strict minimum pour établir la pharmacocinétique de notre formulation et afin d’éviter les variabilités inter-individuelles. Le nombre d'animaux a été obtenu, afin d'avoir une approche statisitique idéale.
Raffinement
Une chirurgie est réalisée à J0 (sous analgésie et anesthésie générale (buprecare 0.1 mg/kg et isofurane 2%), afin de poser un cathéter veineux aux animaux, afin de limiter les prélèvements sanguins répété au niveau de la queue de l’animal. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale (ISOFLURANE). La chirurgie et les prélèvements sanguins sont réalisés dans une pièce isolée, calme avec seulement un seul ou deux manipulateur expérimentés présents. Les doses utilisées dans ce projet sont considérablement plus faibles que ce qui est décrit dans la littérature.
Choix des espèces
Le Rat est un modèle couramment utilisé et reconnu pour sa pertinence pour étudier la pharmacocinétique d’une molécule Les animaux utilisés sont au stade adulte, la taille à cet age permet une réalisation facile de la partie opératoire (pose du catheter) et de plus , correspond à un age habituel dans la littérature scientifique.