Rats

20 rats Sprague-Dawley vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent des tests comportementaux puis subissent deux chirurgies de 90 minutes sous anesthésie, dont une injection virale dans le nerf vague, la dernière se terminant par une mise à mort sans réveil. Le projet, présenté comme pilote, étudie la propagation de l'alpha-synucléine du cerveau vers le cœur dans la maladie de Parkinson. Le porteur affirme qu'une modélisation informatique ou in vitro est impossible parce qu'il étudie des systèmes entiers en interaction.

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par une accumulation pathologique de la protéine alpha-synucléine au niveau cérébral mais également dans des organes périphériques tels que le coeur induisant des symptômes moteurs et également un dysfonctionnement cardiaque avec une hypotension orthostatique, une augmentation de la variabilité de la pression artérielle, une altération des baroréflexes et une hypertension nocturne. Ces symptômes augementent donc considérablement le risque d'arythmies, de crise cardiaque et de mort cardiaque subite. Les dysfonctionnements cardiaques dans la maladie de Parkinson sont liés à la dégénérescence des neurones du noyau dorsal moteur du nerf vague. Le noyau dorsal moteur du nerf vague est rapidement impacté par l'accumulation d'alpha-synucléine et induit une propagation pathologique bidirectionnelle de la protéine : vers le cerveau et vers le coeur. Le projet est une expérimentation pilote ayant pour but de réaliser une étude de la propagation pathologique et de l'accumulation d'alpha-synucléine dans la voie allant du noyau dorsal moteur du nerf vague vers le système nerveux cardiaque. Nous permettant ainsi de déterminer comment le système nerveux cardiaque intrinsèque est modulé, la vulnérabilité des neurones cardiaques et les dysfonctionnements cardiaques qui en découlent.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en évidence les effets cardiaques dans la maladie de Parkinson en déterminant comment le système nerveux cardiaque intrinsèque est modulé par l'agrégation protéique pathologique d'alpha-synucléine, quelle serait la vulnérabilité des neurones cardiaques et les dysfonctionnements cardiaques qui en découlent.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux tests comportementaux, un premier test d'évaluation de l'activité locomotrice spontanée ne nécessitant pas d'intervention directe de l'expérimentateur et durant 1 heure et un second test moteur nécessitant une légère contention mais ne durant que quelque secondes. Ils seront ensuite soumis à une chirurgie d'une durée de 90 minutes où ils seront endormis et sous couverture médicamenteuses anti-douleurs. Puis après deux ou quatre mois, les animaux passeront de nouveau les deux tests comportementaux et une seconde chirurgie de 90 minutes où ils seront endormis et sous couverture médicamenteuses anti-douleurs sera effectuée à la suite de laquelle les animaux seront mis à mort sans réveil préalable.

Impact sur les animaux

Les tests moteurs peuvent induire un léger stress transitoire du respectivement à l'isolement de l'animal au cours de la réalisation du test d'openfield et à la légère contention au cours du stepping test. La chirurgie d'injection virale peut induire un léger stress au réveil des animaux ainsi qu'une légère perte de poids et des douleurs/un inconfort au cours de premiers jours suivant l'acte chirurgical.

Devenir

Tous les animaux (n=20) seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à obtenir des résultats de l'activité cardiaque et des analyses histologiques des coeurs et cerveaux récupérés.

Remplacement

Les approches de modélisations informatiques ou basées sur des cultures cellulaires in vitro sont impossibles à mettre en place dans ce projet puisque nous nous intéressons à l'intégration et aux modifications de réseaux et systèmes entiers.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus dans ce projet pilote est restreint à son maximum pour nous permettre d'avoir des résultats préliminaires avant le lancement d'un projet où le nombre de rats par groupe sera estimé par un calcul de puissance. Nous avons donc 5 rats/groupe/temps de mise à mort soit 20 rats au total.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (médicamentation définie avec le vétérinaire référent et tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux ou très rapide et ne nécessitant qu'une légère contention). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec monitoring de la température corporelle, additionnée d’une analgésie locale en présence d’antalgique périphérique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie voire 48h postopératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis au bout de cet arbre décisionnel. Les rats sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement par bâton de bois est disposé dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Une phase d'habituation à l'animalerie et aux expérimentateurs est prévue en amont de l'étude. Le binôme d'expérimentateur reste le même tout au long de l'étude.

Choix des espèces

L'espece animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il sagit de l'espèce la plus utilisée pour l'étude de la maladie de Parkinson. Des méthodes d'injection dans le nerf vague sont également décrites chez cette espèce ainsi que les enregistrements des paramètres physiologiques. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes entièrement développés.

90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus de lignées obèses et diabétiques, ils reçoivent une charge quotidienne de sel qui aggrave leur insuffisance cardiaque, subissent des échographies, des prises de pression à la queue et des prélèvements sanguins pendant un mois, puis sont mis à mort par décapitation pour prélever le cœur. Le porteur indique surveiller les effets délétères de ces interventions par des contrôles quotidiens. Il affirme que l'étude systémique de la fonction cardiaque ne peut être simulée autrement et qu'il est "vital" de disposer de ces animaux pour isoler les cardiomyocytes.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque aiguë décompensée (ICAD) et son précurseur, l'insuffisance cardiaque, sont un problème médical en croissance rapide qui présente le taux de mortalité le plus élevé après le cancer du poumon dans les pays développés. Lors d'épisode d' insuffisance cardiaque et en particulier d'un dysfonctionnement diastolique, un remodelage cardiaque se produit, provoquant un dépôt excessif de tissu cicatriciel conduisant à une rigidité accrue de la matrice extracellulaire (MEC), diminuant la capacité à se détendre et à se remplir. Hormis l’hypertrophie des cardiomyocytes, cet effet sur la structure des cardiomyocytes est actuellement relativement inconnu. De plus, les études mécanistiques approfondies du cœur sont limitées par l’accès aux tissus cardiaques sains et malades. L'objectif est d' évaluer les mécanismes métaboliques présents et l'étendue du remodelage de la MEC qui sera en corrélation avec la raideur, lors du remodelage dans un modèle de rongeur de syndrome métabolique et d'insuffisance cardiaque; ensuit d'étudier l'effet de ce remodelage sur la morphologie et la fonction des cardiomyocytes; de d'analyser les protéines transmembranaires responsables de la mécano-transduction des cardiomyocytes et d'étudier l'effet de toute différence dans les protéines transmembranaires mécano-transductrices des cardiomyocytes résultant du remodelage cardiaque et métabolique.

Bénéfices attendus

Nous espérons que les résultats de ce travail aideront à déterminer les mécanismes de l'insuffisance cardiaque et du dysfonctionnement diastolique en ce qui concerne le remodelage métabolique et ce développement d'une progression précoce et légère à une progression plus sévère pour aider à identifier les cibles thérapeutiques potentielles. De plus, ce projet fournira un aperçu de la réponse et de la fonction des cardiomyocytes isolés en ce qui concerne ce remodelage. Cela permettra de cibler de nouveaux domaines de recherche potentiels en matière de recherche mécaniste et thérapeutique.

Procédures

Aucun animal ne subit un acte chirurgical. Chaque animal subira 3 interventions. Les animaux seront évalués par échocardiographie (durée : 20 min/animal), plethysmographie (prise de pression artérielle par brassard sur la queue – durée 15 min/animal) et prélèvement de sang (durée : 10 min/animal) au niveau de la queue pendant 1 mois. Certains animaux recevront du sel dans l'eau de boisson pour les 2 groupes décompensés. Concernant l’euthanasie ; entre le début de l’anesthésie, la mise à mort par décapitation et l’ablation du cœur, nous comptons un délai de 15 min par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux obèses ZSF-1 et Zucker présentent déjà un syndrome métabolique et un diabète qui seront exacerbés par divers degrés d'insuffisance cardiaque et/ou de remodelage cardiaque avec la charge quotidienne de sel et l'IDAC (stade final) avec la charge de sel de lavage gastrique. Nous surveillerons de près tout autre effet délétère de ces interventions avec des contrôles quotidiens par le chercheur.

Devenir

Les animaux doivent être euthanasiés, dans le but de récupérer le cœur indemne, afin de procéder à l’analyse des cardiomyocytes.

Remplacement

Les expériences in vivo ne peuvent pas remplacer les informations qui seront générées dans ce projet. Le but est d'étudier l'effet systémique des cardiomyocytes, de la fonction cardiaque et du remodelage et ne peut donc pas être simulé d'une autre manière. Sur cette note, les rats représentent les caractéristiques physiopathologiques présentées chez les humains aux stades précoces et tardifs de l’insuffisance cardiaque. Cependant, nous avons conçu ce projet pour tenter de remplacer certaines des investigations in vitro en cultivant les cardiomyocytes isolés ex vivo. Nous pouvons effectuer une partie de l'analyse et de la réponse à la rigidité sans ajouter plus d'animaux, ce qui permet d'avoir plus de points d'investigation sur ce nombre de animaux. Cela signifie qu’il est vital que nous disposions de ces animaux pour l’isolement des cardiomyocytes.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous avons développé une nouvelle méthode d'isolement des cardiomyocytes qui permet d'utiliser un morceau de tissu cardiaque, laissant le reste pour d'autres analyses biochimiques, ce qui a considérablement réduit notre nombre d’animaux. De plus, sur la base de données antérieures obtenues chez des rats et de nos propres simulations pour chaque paramètre étudié chez des rats sains témoins non traités, nous avons un taux de réussite minimum de 90%, de plus par une approche statistique, nous estimons que le nombre d'animaux sera de 90 rats dans total.

Raffinement

Une fois que les rats auront atteint l'âge d'environ 15 semaines, ils seront autorisés à s'acclimater pendant une semaine et maintenus pour permettre au remodelage cardiaque de commencer à se produire naturellement avec l'âge avant l'intervention à 20 semaines lorsque l'expérimentation commence. Ils resteront en cage par groupes de trois pour la socialisation avec du carton pour la construction du nid et les enrichissements. Pour les conditions générales de soins, ils resteront dans une pièce ventilée avec des cycles lumière/obscurité de 12 heures, une surveillance quotidienne de la nourriture et de l'eau et un nettoyage hebdomadaire de la cage. Pour les conditions de soins en ce qui concerne les méthodes utilisées dans le projet, le plus grand soin sera pris pour garantir qu'il y ait un minimum, voire aucun, de douleur, de détresse ou de souffrance par une surveillance quotidienne tout au long du protocole pour détecter l'un de ces signes. Pour évaluer, les animaux seront observés pour leur comportement (mouvement, vigilance et toilettage), leur état physique et émotionnel (état de la peau, position du pelage, posture de l'animal, yeux et profondeur de la respiration). Le poids et la température seront surveillés chaque semaine et si une fluctuation de la perte de poids se produit de 2 à 5 % par rapport à une température de 2 à 4 °C, l'animal sera surveillé quotidiennement au cas où des seuils seraient atteints de 10 % pour la perte de poids et une fluctuation de température de 5 °C. quand l'animal sera euthanasié. En présence d'une légère détresse, l'animal peut recevoir une prémédication à base de buprénorphine par voie sous-cutanée et sous une anesthésie (gazeuse, afin de ne pas causer de détresse supplémentaire à l'animal par contention.

Choix des espèces

L'insuffisance cardiaque est plus fréquente chez les individus obèses et se manifeste généralement chez ceux qui souffrent du syndrome métabolique. C'est pourquoi le rat obèse Zucker (FA/FA) (ZF) est utilisé comme modèle pour l'obésité, le syndrome métabolique et le diabète de type 2, ce qui rend ce rat sensible à l'hypertension. et le remodelage lorsqu'il est exposé à une consommation accrue de sel et en utilisant Zucker maigre comme contrôle sain. Le rat ZFS-1 est un modèle de syndrome métabolique plus sévère et de dysfonctionnement diastolique (insuffisance cardiaque avec fraction d'éjection préservée) qui est affecté par la charge de sel pour induire "l'DAIC". Ces deux modèles démontreront différents niveaux d’insuffisance cardiaque et de progression. Les rats Zucker Lean control, Zucker FA/FA (Met-S), Lean control ZSF-1 et ZSF-1 obèses seront âgés de 15 semaines à l'âge d'arrivée et gardés jusqu'à 20 semaines ayant donc un syndrome métabolique au moment de l'inclusion dans l'étude. L'âge d'arrêt sera de 24 semaines après soit une charge quotidienne de sel pendant 4 semaines. Le choix de l'âge et des types de rats est justifié par les données publiées et l'expérience en laboratoire sur différents modèles de syndrome métabolique au cours des 15 dernières années, montrant le développement du remodelage cardiaque à cet âge et l'effet de la charge saline provoquant une insuffisance cardiaque.

1344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit jusqu'à six séries de distensions colorectales par ballonnet, des administrations de molécules et des lavages coliques, la distension pouvant provoquer une diarrhée et, comme effet indésirable, une perforation du côlon. Le porteur étudie les mécanismes de la douleur viscérale du syndrome de l'intestin irritable, en concluant que l'expérimentation animale est "incontournable" malgré des travaux préalables sur organoïdes. Le projet se déroule dans trois établissements.

Objectifs

La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients SII (atteints de syndrome de l’intestin irritable). Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients SII. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale. Un modèle rat est choisi dans cette étude car c’est le modèle animal de référence pour étudier le stress psychologique et ses effets, notamment sur la douleur viscérale. Ce projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouvelles molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques contre la douleur viscérale

Procédures

Dans l'EU 1/3 et 3/3: Un minimum de 3-4 séries de distensions colorectales sera réalisé (2-3 séries de distensions «basales» et 1 série post traitement) par animal et espacées de minimum 3 jours pour les basales. Si les séries de distensions colorectales «basales» (sans traitement) présentent une variabilité importante, nous pourrons décider d’augmenter leur nombre. Nous pourrons aussi décider d’évaluer la reproductibilité des séries de distensions colorectales au cours du temps (sans traitement) sur le même animal ainsi que l’effet de la distension sur les paramètres protéolytiques (mesurés dans les lavages coliques et selles). Ainsi, au maximum, nous pourrons faire jusqu’à 6 séries de distensions colorectales par animal (la durée d'une série de distensions est de 1h15 et inclue 30 min d'habituation au ballon, c'est à dire que le ballon n'est pas gonflé). Des administrations de molécules pourront être effectuées (par voie intrapéritonéale, intra colique, orale, sous cutanée) avant la dernière série de distensions colorectales. Administrations intrapéritonéales et intra coliques de molécules (2 par animaux). Lavages colique (maximum 3 par rat). Dans l'EU 2/3: Nous pourrons évaluer la réponse du système nerveux central (cerveau) en réponse à la distension colorectale par imagerie IRMf (30 min-1h par animal)

Impact sur les animaux

Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale, ainsi qu’une diarrhée dès 15 min post traitement. La motilité et la perméabilité intestinales sont modifiées dès 15 min, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h post-traitement. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés

Remplacement

La douleur chronique intestinale, dont souffrent les patients atteints de syndrome de l'intestin irritable (SII), peut affecter fortement leur condition de vie. Cependant, les causes de cette douleur chronique sont encore mal comprises, notamment si c'est la perception de la douleur en centrale qui est altérée, et/ou bien si c'est la sensibilisation des neurones en périphérique et/ou en central qui est perturbée. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception est ainsi indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive chronique. In vitro, il est possible d’étudier des échantillons coliques provenant de patients SII (biopsies, selles, organoïdes en culture...), nous avons par exemple montré dans des études préliminaires que le traitement d’organoïdes intestinaux par des hormones de stress modifiait la balance protéolytique. Suite à la preuve de concept in vitro d’un effet des hormones de stress sur les médiateurs d’intérêt au niveau de l’intestin (techniques de culture d’organoïdes intestinaux), l'expérimentation animale est nécessaire pour valider ces résultats, c’est a dire pour évaluer la conséquence de l’altération de ces facteurs sur la douleur viscérale (en condition de stimulation nociceptive c'est à dire par exemple en réponse à la distension colorectale). L’étude des mécanismes de nociception requiert une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.

Réduction

La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (par opposition à d’autres méthodes d’évaluation de la douleur viscérale comme par exemple l’implantation d’électrodes au niveau des muscles abdominaux par chirurgie) permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, les résultats de distension obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: série de distensions avant traitement versus série de distensions après traitement). Cependant, il existe de la variabilité de la réponse à la distension au sein du même animal au cours du temps et entre les animaux entre eux. Cette variabilité peut être associée notamment au stress dû à la distension, ainsi, pour réduire cette variabilité au maximum, nous habituons les animaux avant la première série de distensions et nous reproduisons les distensions au sein du même animal plusieurs fois afin de réduire le stress et donc la variabilité intra et inter-individus et en conséquence le nombre d’animaux requis pour une étude. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h durant les 3 jours précédant la première série de distensions (habituation au manipulateur et habituation aux tubes de contention) afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet et expérimentateurs ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; et en particulier aux techniques spécifiquement utilisées ici (distension colorectale, injections intra coliques). L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Transport de moins de 50 km. Nous nous assurerons que les animaux sont protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil, des températures extrêmes (climatisation du véhicule 19-21 degrés), conduite souple, limitation au bruit

Choix des espèces

Le rat est un modèle communément utilisé dans les études de stress psychologique et de mesure de douleur viscérale, il a ete choisi par rapport a une publication de reference du modele cortagine Les rats seront ages d'au moins 7 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 200g.

2000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales, des traitements répétés par voies orale, intraveineuse ou intracardiaque, des prélèvements de sang et de moelle osseuse, et pour certains une mesure de mécanique pulmonaire par trachéotomie sous anesthésie profonde avant euthanasie. Le porteur prévoit une cinquantaine d'études sur cinq ans pour évaluer des médicaments anticancéreux sur des cancers disséminés, en admettant que les modèles alternatifs in vitro restent "marginaux" et difficilement transposables. Le développement tumoral peut provoquer perte de poids, difficultés locomotrices et respiratoires, la mise à mort étant déclenchée à des points limites définis.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, - l’impact du développement de métastases pulmonaires sur les paramètres ventilatoires fonctionnels (pléthismographie) Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Induction tumorale sous anesthésie (moins de 10 minute s, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 5 heures aller, 5 heures retour). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 heure). Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 10 minutes) . Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 10 minutes). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 10 minutes) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : -Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, des mesures de paramètres mécaniques pulmonaires pourront être réalisées. Cette mesure impliquera la réalisation d’une trachéotomie. La mesure prendra environ 15 minutes avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal : -Transport vers le site où est réalisée l’éventuelle irradiation ou l’éventuelle imagerie ou l’éventuelle radiothérapie -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale par IV -Traitements -Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie) Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique -Induction en intraartérielle et intracardiaque. Si nécessité d’incision Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : -Prélèvements de sang par ponction dans une veine. -Prélèvements de sang sous contention. -Prélèvement de moelle osseuse Les prélèvements de moelle osseuse pourraient générer des fractures dans de rares cas (point limite). Le développement tumoral induira une perte de poids, des difficultés locomotrices. En cas de développement de métastases pulmonaires, des difficultés respiratoires pourraient éventuellement apparaître. Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles impliqueront une trachéotomie, donc l’anesthésie inclura l’administration de buprénorphine et un alpha-2 agoniste. Par ailleurs, elles seront réalisées sous anesthésie profonde et suivies d’une euthanasie sans réveil.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort afin de collecter de grands volumes de sang et les organes pertinents.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Nous prévoyons environ 50 études sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 10 études sont réalisées chaque année , mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisée dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. En général, en oncologie et du fait de la randomisation, le nombre d’animaux greffés est supérieur au nombre d’animaux utilisés randomisés dans chaque groupe. Pour les modèles disséminés ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Au-delà, une dérogation sera demandée et le modèle sera expertisé pour évaluer si plus de 10% des animaux sont réellement nécessaires. Dans tous les cas, il sera recommandé l’utilisation d’un minimum d’animaux surnuméraires La taille des groupes nécessaires pour obtenir des modifications statistiquement significatives de paramètres mécaniques pulmonaires ou de saturation en oxygène sera optimisée suite à des études pilotes utilisant ces technologies. En première approximation, 10 animaux par groupe seront utilisés, s’agissant du nombre qui a été déterminé pour les mesures similaires dans d’autres modèles. S’agissant d’une mesure terminale, s’il est nécessaire d’évaluer la mécanique pulmonaire à plusieurs points de temps, un groupe d’animaux par point de temps sera constitué.

Raffinement

Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par la SBEA. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis et des antalgiques pourront être prescrits. Dans la mesure du possible, les animaux seront achetés déjà irradiés. Cependant, dans ce cas, la période d’acclimatation devra être réduite à 24h minimum, avec implantation dans les 24-72h suivant l’irradiation. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse (Intradermique, intramusculaire), les animaux recevront une antalgie adaptée. L’induction en intraartérielle et intracardiaque se fera sous anesthésie En cas d’ouverture chirurgicale, une administration de buprénorphine (30 minutes avant minimum) sera prévue. Les injections intracardiaques seront accompagnées d’une analgésie (alpha2 agoniste et un opiacé).. Des soins opératoires (maintien de la température) seront apportés, et feront l’objet d’une surveillance et de soins post opératoires adaptés. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations de la SBEA en termes de volume, fréquence et antalgie. Ces prélèvements seront réalisés sous anesthésie avec l’analgésie appropriée (administration d’anti-inflammatoires non-stéroïdiens et/ou d’antalgiques opiacés/alpha-2 agoniste). Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux et un scoring sera mis en place. Dans toutes les cages, un gel nutritif sera rajouté, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés. Les scores cliniques les plus élevés constitueront des points limites, ainsi que l’accumulation de scores intermédiaires (cf procédure). Les pertes de poids élevées ou prolongées constitueront un point limite. Des points limites adaptés et prédictifs permettant de limiter la souffrance des animaux sont indiqués dans les procédures.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une à deux chirurgies du cerveau reproduisant la maladie de Parkinson, des prélèvements sanguins, des tests moteurs, un test d'anxiété et un test de motivation répété chaque jour pendant dix-sept semaines, avant d'être mis à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique des douleurs postopératoires et, aux stades avancés du modèle, des déficits moteurs entraînant des difficultés à se déplacer, à se nourrir et une perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer à la fois le comportement, la mort des neurones et les marqueurs sanguins, et qu'une étude des stades précoces est impossible chez l'humain.

Objectifs

Notre objectif principal est de mieux comprendre les mécanismes qui sont à l’origine de la mort des neurones dans la maladie de Parkinson afin de développer une stratégie de détection précoce de la maladie et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques, en explorant particulièrement le rôle des marqueurs métaboliques.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre l'origine de la maladie de Parkinson pour proposer une nouvelle cible thérapeutique plus efficace que celles existantes.

Procédures

Les animaux subissent une à deux neurochirurgies d'une durée maximale de 1h, anesthésie incluse. Ils subissent 2 à 3 prélèvements sanguins, espacés de plus de 5 semaines et n’excédant pas plus de 10 minutes, anesthésie incluse. Ils sont soumis 2 ou 3 fois à 2 tests moteurs complémentaires (durée maximum 1 heure) et un test d’anxiété (durée maximum 5 minutes), chaque session de tests étant séparée de la suivante d’au moins 6 semaines. Ils sont également soumis quotidiennement à un test pour mesurer la motivation (durée maximal 1 heure) pendant 17 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Pour les procédures de chirurgie du cerveau, une nuisance ou des effets indésirables modérés pourront concerner essentiellement les douleurs post-opératoires. Pour les modèles de la maladie utilisés, ceux-ci peuvent présenter uniquement des déficits psychiatriques légers telle qu’une baisse de motivation (stade précoce) n’entraînant pas de difficulté à s’hydrater ou se nourrir ; ou également des déficits moteurs (stade avancé) pouvant conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids. Une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère due au stress généré par la préhension des animaux par l’expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leur cerveau pour réaliser les analyses nécessaires à l'étude

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation à la fois du comportement, de la mort des neurones et des modifications des niveaux de certaines molécules exprimées dans le sang et le cerveau. D’autre part, une étude sur les stades précoces de la maladie de Parkinson ne peut pas être réalisée chez l’homme pour le moment car nous ne savons pas détecter la maladie si précocement.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire et suffisant par groupe afin d’avoir une chance de détecter une différence significative. Ce nombre a été estimé à l’aide d’approches statistiques appropriées à chaque type de données.

Raffinement

Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Ins sont hébergés selon la procédure mise en place par l’animalerie afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les animaux endormis puis maintenus sous anesthésie volatile permettant un recueil de sang dans la queue. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les chirurgies du cerveau sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe modérée chez le rongeur. Deux modèles sont utilisés car ils miment des aspects différents mais complémentaires de la maladie. Pour les animaux mimant la phase avancée de la maladie, les déficits moteurs peuvent conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids qui sera limitée par l’ajout dans la cage d’hébergement d’une nourriture appétante hypercalorique et humidifiée. Dans tous les cas, le suivi biquotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et à mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat apparaît comme l’espèce adéquate car il possède un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux impliqués dans le développement de la maladie de Parkinson, et il est couramment utilisé (modèle animal principalement utilisé) pour les études sur cette maladie. Par ailleurs, cette étude étant basée sur de précédents résultats de la littérature obtenus dans la même espèce, il semble cohérent de continuer sur cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (7-8 semaines), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois.

Pour suivre dans le sang le devenir d'un candidat médicament, 3 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les études, ils peuvent être opérés pour recevoir un cathéter dans une veine ou une artère, une minipompe ou une administration dans l'intestin, isolés jusqu'à cinq jours après la chirurgie, mis à jeun, puis soumis à des prises de sang répétées, l'expérience pouvant s'achever par un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien. 875 d'entre eux peuvent être réutilisés dans d'autres projets, par exemple de formation, et les autres sont tués, notamment après ce prélèvement, en cas d'effets marqués du produit ou s'ils portent un dispositif implanté. Le porteur présente le recours au rat comme "un passage obligatoire" avant toute administration à l'humain, sans nommer ni le produit testé ni la maladie visée.

Objectifs

Le projet consiste à étudier le devenir dans l'organisme d'un candidat médicament chez le rat (éveillé ou anesthésié), grâce à des prélèvements répétés dans le temps d'échantillons de sang après administration du produit à tester ainsi qu'un prélèvement terminal de liquide cephalo-rachidien.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la maladie humaine qui est visée par le/les produit(s) testé(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouveaux médicaments. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques de l’espèce utilisée (le rat) et le développement de méthodes pour améliorer le bien-être des animaux. Ces méthodes sont de plus en plus adaptées à l’espèce animale la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour introduire un tube très fin dans les veines et/ou les artères ou bien introduire une minipompe qui libère progressivement le produit (20 à 45 minutes) ou une chirugie pour l'administration du candidat médicament dans l'intestin (20-30 min). Les rats seront administrés (moins de 2 minutes) avec les produits à tester par différentes voies: orale, intrapéritonéale (au niveau de l'abdomen), sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, dans la trachée, ou intraveineuse (avec une dose unique ou par injection lente). Les animaux pourront être mis à jeun la veille de l'administration pour une durée qui est dépendante du produit à tester. Des prélèvements de sang (moins de 2 minutes) pourront être réalisés: - Au niveau de la veine sous la langue de l’animal transitoirement anesthésié - Au niveau de la veine de la queue, du cou ou des pattes sur l’animal actif au moyen d'un maintien adapté de l'animal - Au niveau de l'artère qui distribue le sang du coeur vers la tête (carotide) ou de l'artère de la cuisse (fémorale) sur animal préalablement implanté d'un tube très fin.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échange avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Post-chirurgie, les animaux pourront être hébergé individuellement: 5 jours maximum post chirurgie. Cet hébergement individuel engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'hébergement individuel permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture et à l'hébergement individuel en cage de mise à jeun. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non utilisés pour d’autres projets ou si implantés avec les dispositifs médicaux. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (en milieu artificiel ou par informatique) pour évaluer la pharmacocinétique d’un nouveau produit. Ou si ces méthodes existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses pharmacocinétiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse pharmacocinétique : 5 par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.