Rats
FORMATION DES CHIRURGIENS A LA REALISATION DE MODELES DE RONGEURS OPERES
- Formation professionnelle
Rats : 1250
2 500 animaux non-humains vont être utilisés, moitié souris moitié rats, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil ou modéré. Chaque animal subit une chirurgie unique de trente minutes à une heure et demie sous anesthésie, avec parfois des injections répétées et un hébergement isolé jusqu'à 21 jours, pour entraîner des techniciens à produire des modèles chirurgicaux standardisés. Le porteur présente cette formation comme un moyen de fournir aux chercheurs des modèles prêts à l'emploi et de mieux prendre en charge la douleur des animaux opérés. Il indique commencer l'entraînement sur cadavres et simulateurs quand la technique le permet, mais juge l'apprentissage sur animal vivant nécessaire pour valider la viabilité du modèle dans le temps.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’assurer le développement et le maintien des techniques du personnel dédié à la réalisation de modèles de rongeurs opérés pour répondre aux besoins des chercheurs dans le cadre de leurs études et protocoles de recherche. Ces formations s’adressent à des techniciens habilités et dédiés aux activités de chirurgie. Les techniciens sont considérés comme habilités après avoir participé à la formation réglementaire en chirurgie expérimentale et avoir reçu, en interne, la formation théorique commune à tout modèle chirurgical par le formateur du service ou le vétérinaire désigné: anatomie générale du rongeur, formation à l’anesthésie et l’analgésie et leur gestion per opératoire, formation à l’asepsie.
Bénéfices attendus
La formation de chirurgiens, selon des procédures et des protocoles prédéfinis, permet de proposer à la communauté scientifique, des modèles d’intérêts prêt à l’emploi, leur permettant d’accroître leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines (mécanismes physiologique, physiopathologiques, essais thérapeutiques, recherche fondamentale, prévention…) tout en réduisant les nuisances possibles sur l’animal. Elle permet aussi de proposer des modèles standardisés et homogènes dont la communauté scientifique a besoin pour leurs études. La formation initiale du chirurgien à un modèle cible est nécessaire au préalable à toute mise à disposition d’un modèle chirurgical permettant une bonne anticipation de la procédure, une meilleure reproductibilité par la suite du modèle ainsi qu’une meilleure prise en charge per opératoire de l’animal, contribuant à son bien-être et à la minimisation des nuisances subies.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet analgésiés, anesthésiés et non réveillés ou analgésiés, anesthésiés puis réveillés seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure et demi sous anesthésie général. Selon le modèle et en cas de besoin (douleur, récupération post oépratoire difficile), les animaux pourront être soumis à des injections sous cutanées ou intra péritonéales (maximum 10 injections par jour). Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 21 jours.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids pouvant être provoqué par les contentions, les procédures chirurgicales, la présence du matériel implanté pour les modèles de cathétérisation et d’implantation et la récupération post-opératoire (48-72h). Hébergement individuel jusqu’à 21 jours si besoin selon le modèle (par exemple : cathétérisation vasculaire couplé à un harnais, partie externe pouvant être dégradée par un congénère).
Devenir
Les animaux sont mis à mort.
Remplacement
La formation des chirurgiens a pour objectif d’acquérir des gestes techniques permettant de mettre à disposition des modèles rongeurs opérés reproductibles et standardisés prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Avant tout entraînement sur un modèle animal, une formation théorique basée sur l’utilisation de supports papiers et vidéos est effectuée. Lorsque cela est possible, l’entrainement pour certains gestes techniques pourront être réalisés sur des supports inertes (simulateur de suture, mannequin de formation). Pour les différents modèles, la validation du chirurgien sera évaluée sur la technique dans un temps imparti, sur la viabilité et la fonctionnalité du modèle dans le temps : cette partie ne peut être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux défini dans notre procédure et utilisé pour la qualification et la requalification de chaque modèle est basé sur la criticité et la technicité du modèle (faible / moyen / forte) ainsi que les expériences précédentes Ce nombre est composé d’un minimum (3 pour la formation, 1 pour la reformation) et d’un maximum (de 25 pour la formation, 10 pour la reformation) afin de pouvoir qualifier le chirurgien lorsque la technique est maîtrisée, dès lors que le nombre minimum est atteint. Cela nous permet également d’avoir un nombre maximum au-delà duquel le technicien n’est pas considéré comme formé. La formation ou reformation s’arrête dès lors qu’un taux de réussite de 100% est atteint pour un lot de 3 ou 1 animaux respectivement, même si le nombre maximum d’animaux n’a pas été effectué. Lors d’une qualification ou requalification sur cadavre ou sur animal analgésié, anesthésié et non réveillé, nous pouvons utiliser un animal pour l’entraînement de plusieurs gestes techniques de plusieurs modèles, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces animaux peuvent être les surnuméraires non opérés de commandes ou surplus de stock, ce qui contribue aussi à la réduction.
Raffinement
Les animaux utilisés seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, et dans un milieu enrichi et des points limites en fonction des spécificités du modèle en formation seront appliqués. La première phase de qualification sera effectuée sur des cadavres frais, dès lors que la technique le permet puis sur des animaux analgésiés, anesthésiés et non réveillés. Après les gestes maîtrisés, les chirurgiens effectueront une phase d’entraînement sur animaux analgésiés, anesthésiés et réveillés. Après évaluation de la douleur possible induite par le modèle, le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin (signes d’inconfort ou de douleur, absence de fécès). L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire (ouverture invasive, ouverture de la cavité abdominale, ouverture au niveau de la région crâniale). Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux avant réveil. Pour nos modèles chirurgicaux dont le taux de survie est inférieur ou égal à 80%, une habituation par la manipulation des animaux est effectuée dès la phase d’acclimatation. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche pour ce projet est directement lié au modèle chirurgical ciblé pour la formation. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Ne sont concernés ici que les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec le modèle d’intérêt en formation, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Enseignement pratique de physiologie et d’expérimentation animale sur rongeur (rats et souris)
- Enseignement supérieur
Rats : 200
675 animaux non-humains vont être utilisés, 475 souris et 200 rats, en majorité tués et 25 souris proposées à l'adoption, dans des procédures allant du sans réveil au léger. Les étudiants s'entraînent à la contention et aux injections, mesurent la glycémie après injection de glucose et prélèvements de sang à la queue, tandis que d'autres souris sont euthanasiées pour prélever l'intestin et que les rats sont canulés puis tués sans réveil pour prélever le cœur. Le porteur décrit une formation à la physiologie couplée à la formation réglementaire, réservée aux étudiants volontaires ayant validé leurs examens, et affirme utiliser surtout des animaux de réforme déjà destinés à l'euthanasie. Il revendique le maintien de travaux pratiques sur animaux non-humains comme nécessaire à l'apprentissage des gestes, malgré des simulations numériques employées en amont.
Objectifs
Le projet que nous proposons est un projet de formation des étudiants à la physiologie animale et s'inscrit dans la troisième année de notre parcour. Afin de réduire l'utilisation d'animaux pour la formation d'un étudiant à la physiologie nous avons modifié notre programme de cours afin qu'il soit couplé à la formation réglementaire d'applicateur des procédures et de soins aux animaux décernéé par notre établissement et habilitée par le ministère de l’Enseignement supérieur et la CNEA. Notre formation nécessite la réalisation de travaux pratiques sur des rongeurs pour compléter les connaissances acquises pendant les enseignements par des études expérimentales et pour initier aux techniques de l’expérimentation animale (préhension, contention, anesthésies des animaux, prélèvements d’organes, études de mécanismes in vitro et in vivo). Le maintien des travaux pratiques permet d’augmenter les chances de réussite des étudiants à leur arrivée sur le marché du travail. Ils permettent aussi de maintenir une confrontation directe des étudiants avec l’expérimentation animale et de les conforter dans leur plan de formation ou au contraire de leur laisser la possibilité d’une réorientation afin d’éviter des prises de conscience trop tardive, source d’échec et de difficultés pour les étudiants. Tous les étudiants de la formation n'effectuent pas ces travaux pratiques nécessitant l'apprentissage des techniques d'expérimentation animale. Seul les étudiants volontaires et ayant validés les enseignements de physiologie avec une note supérieure à 10/20 et un examen éthique et réglemantaire avec une note supérieure à 12/20 peuvent réaliser les procédures décrites dans cette saisine. Les autres étudiants réalisent des travaux pratiques sur des logiciels de simulations.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de maintenir une confrontation des étudiants destinés à la recherche médicale avec la manipulation et l'expérimentation animale. Cette confrontation de l'étudiant à la réalité de l'expérimentation animale permet de conforter ou à l'inverse d'infirmer les choix d'orientation des étudiants. Ce projet est aussi nécessaire pour l'initiation des étudiants à la physiologie animale. Avec ce projet, chaque étudiant qui travaille en trinôme aura utilisé en tout 1 animal pour apprendre la contention d'animaux vigiles, les injections sur rongeurs, pour étudier la régulation de la glycémie, la régulation de la pression artérielle, la régulation de la fonction digestive et cardiaque, l’analyse électrocardiographique du cœur, la réalisation d’une culture primaire, mais aussi l’anesthésie d’une souris. Avec un animal (majoritairement des animaux de réformes qui étaient destinés à l'euthanasie pour tri génétique par exemple), les étudiants volontaires, sélectionnés sur leur maitrise de l'éthique et la réglementation en expérimentation animale et ayant les prérequis académiques necessaires à la poursuite de leur cursus en physiologie pourront valider leur diplome de physiologie et la formation réglementaire d'application des procédures et de soins aux animaux. Le couplage de notre formation avec la formation réglemantaire agréeé par la CNEA permet de former directement les étudiants aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale et à l'utilisation de méthodes alternatives quand cela est possible. Pour les laboratoires de recherche, cela permet de recruter dès le master 1 des étudiants formés aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale et detenteur d'une habilitation d'applicateur des procédures.
Procédures
Durant nos trois procédures les animaux seront soumis à différentes interventions. Dans la première procédure , les animaux seront manipulés par les étudiants afin d'apprendre la préhension, la contention, l'injection intrapéritonéale et la mesure de glycémie. Dans cette procédure ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose suivie de 5 prélevements de 3µl de sang au bout de la queue afin de mesurer la glycémie. Dans la seconde procédure, les souris recevront une injection d'anésthésiant et une injection intrapéritonéale soit d'un régulateur sympathique soit d'un régulateur parasympatique. Certaines souris seront euthanasiées afin de prélever l'intestin et du tissu adipeux dans l'objectif d'étudier la physiologie intestinale et de réaliser une culture primaire d'adipocytes. Dans la troisième procédure les rats reçoivent une injection de morphinique suivie d'une anesthésie sans réveil. Pendant l'anesthésie, les rats sont canulés sur la jugulaire et la carotide afin de mesurer la pression arterielle et de recevoir une injection en intraveineux d'un régulateur sympathique et parasympathique. Ensuite le coeur de ces animaux est prélevé afin de réaliser un TP la physiologie cardiaque.
Impact sur les animaux
Afin d'éviter toute nuisance pour les animaux, les travaux pratiques sont réalisés par trinôme d'étudiants dans un box isolé en présence d'un enseignant. Lors de nos protocoles la préhension des animaux pourra générer du stress. Afin de le limiter, la préhension sera réalisée avec un tube et les animaux seront habitués à être manipulés. Ensuite lors de la contention et des injections intrapéritonéales qui dureront moins d’une minute les animaux ressentiront du stress et la douleur d’une piqure d’aiguille. Pour le protocole de mesure de glycémie comme pour le protocole de mesure d’un électrocardiogramme les nuisances attendues seront aussi du stress lié à la manipulation des animaux et la douleur d’une piqure d’aiguille. Cette nuisance sera très courte et durera moins d’une minute. Pour la mesure de glycémie le protocole nécessite aussi le retrait de la nourriture pendant 6h. Pendant ces 6 heures les animaux pourront néanmoins boire à volonté. Pour les deux protocoles, suite à l’injection qui générera la douleur d ‘une piqure d’aiguille nous gardons la souris sous surveillance pendant 1 heure afin d’observer les signes cliniques et de comportement. Si le comportement de la souris est anormal après l’injection (souris prostrée, qui évite les interactions avec les congénères, saignements apparents) nous procédons immédiatement à son euthanasie. Pour le protocole sur les rats les nuisances attendues seront aussi un stress lié à la préhension et la douleur d’une piqure d’aiguille. Sinon pendant la période d’hébergement le projet n'aura aucun impact sur les 5 libertés individuelles de l'animal. Nos animaux pourront s'alimenter à leur convenance ce qui n'induira aucune sensation de faim ou de soif. Comme nos conditions d'élevages seront adaptées à la physiologie des animaux, nos souris ou nos rats n'auront aucune sensation de peur, de détresse, de stress physique ou thermique et de manque d'interaction sociale. Enfin, notre surveillance régulière aura pour but de prévenir toute douleur, lésion ou maladie sur nos animaux.
Devenir
Quand cela sera possible nous essaierons de placer à l'adoption des souris. Par expérience nous arrivons à faire adopter tous les ans quelques souris aprés l'accord de la vétérinaire responsable de notre animalerie en lien avec la ddpp. Les autres souris seront euthanasiées car non replaçable dans d'autres procédures. De plus dans la plupart des cas, il s'agira de souris qui étaient déja destinées à l'euthanasie et reutilisées pour nos séances de travaux pratiques. Pour les rats il s'agit d'une classe sans réveil ou le coeur est prélevé
Remplacement
Afin de remplacer les animaux nous avons arrété tous les travaux pratiques qui utilisaient des animaux jusqu'en fin de deuxieme année de notre formation. Nous les avons remplacés par des expériences de simulation numérique ou par des vidéos (par exemple pour le comportement). En trosième année de notre formation nous utilisons des logiciels de simulations afin de remplacer au maximum l'utilisation d'animaux. L'utilisation de logiciels de simulation permet parfaitement aux étudiants avec des prérequis académique trop faible , ou n'ayant pas validé les examens sur l'éthique et la réglemantion avec une note supérieure à 12 /20, ou ne désirant pas utiliser d'animaux d'acquerir les compétences en physiologie animale. Pour les autres étudiants le maintient de travaux sur animaux et l'apprentissage des techniques d'expérimentation (contention, préhension, injection ...) l'utilisation d'animaux est necessaire pour l'obtention du niveau d'applicateur des procédures et de soins aux animaux. Cependant pour remplacer les animaux vivants, les étudiants commencent l'apprentissage sur des souris de substitutions en Latex.
Réduction
Pour réduire au minimum le nombre d'animaux utilisés nous avons remplacé des séances de TP initialement pratiquées sur des animaux par des méthodes alternatives utilisant par exemple des logiciels de simulation en expérimentation animale, mais aussi par des supports vidéos que nous avons réalisés. L’enchainement des travaux pratiques est effectué de façon séquencée, cad que nous commençons par les expériences in vivo, puis après mise à mort nous récupérons les organes pour les expériences ex-vivo. Enfin, concernant les souris nous utilisons quand cela est possible des souris de réforme, normalement destinées à l’euthanasie pour tri génétique ou fin de protocole. Pour terminer, afin de réduire le nombre de rats et de souris utilisés dans l'étude, les groupes sont constitués en fonction du nombre strict nécessaire d’animaux pour chaque groupe de TP (il y a 5 trinômes dans chaque groupe d’étudiants et il y a 6 à 8 groupes en moyenne chaque année). Nous prévoyons pour la formation d’un étudiant qui dure 3 ans qu’il utilisera 1 animal. Enfin, pour réduire nous permettons seulement aux étudiants volontaires, avec des prerequis académiques solides et validant des compétences en éthique et reglementation de réaliser les TP necessitant l'utilisation d'animaux. Par cette approche quand dans le passé tous les étudiants utilisés environ 3 souris et 3 rats pour leur formation, aujourd'hui seulement 60 à 70% des étudiants vont utiliser des animaux à raison de 1 animal par étudiant.
Raffinement
Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse, infligées aux animaux nous avons réorganisé complétement nos programmes de physiologie pour intégrer des nouveaux enseignements sur la réglementation, l’éthique, les modèles murins, la prise en charge de la douleur, etc ... Cela permet de sensibiliser et de former les étudiants avant toute manipulation. Concernant l’hébergement, tous nos animaux sont dans un environnement enrichi de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour réaliser des nids. Afin de réduire le stress et la souffrance des animaux au maximum, nous utiliserons un prétraitement avec un morphinique avant l’anesthésie. Les animaux sont manipulés dans des petits box isolés pour réduire tout le stress pouvant venir de l'environnement. Enfin pour terminer l'entrainement des étudiants est d'abord réalisé sur des souris en latex permettant d'apprendre le geste avant d'utiliser des animaux vivants.
Choix des espèces
Nous adaptons les espèces en fonction des besoins. Les rats présentent l’avantage de pouvoir être manipulés plus facilement pour les expériences in et ex vivo. Les souris sont parfaites pour apprendre aux étudiants à manipuler un animal avec moins d’appréhension. Enfin, notre formation d'applicateur des procédures et de soins aux animaux est agréée sur rongeurs souris et rats. Pour les rats nous utilisons une lignée non-consanguine (Srague-Dawley) de 10-14 semaines c’est l’âge idéal d’utilisation des animaux et celui le plus utilisé dans la littérature. Pour les souris : nous utiliserons des souris adultes et quand cela est possible de réforme. L'âge précis n'a pas d'importances dans notre cas. Pour la souche elle peut varier avec les animaux de réforme mais dans la majorité des cas nous aurons des souris de lignée consanguine (C57BL6) et quand nous les commandons nous achetons des souris non consangunes (Swiss) de 10 semaines.
Etude de la distribution tissulaire d’un médicament radiomarqué par imagerie après une injection intracrânienne chez des rats adultes mâles et femelles.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
18 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'administration intracrânienne, un isolement de 24 heures, un examen d'imagerie sous anesthésie et quatre prélèvements sanguins, dont trois sur animal vigile sans analgésique pour ne pas fausser les dosages, afin de suivre un médicament radiomarqué injecté dans le cerveau. Le porteur indique avoir mené en amont des analyses in silico, in vitro et sur organe artificiel, mais affirme qu'elles ne reproduisent pas la distribution réelle dans un organisme vivant. L'étude ne comporte que 18 animaux, répartis en une phase pilote de deux rats et une phase principale conditionnée à ses résultats.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’étudier la distribution dans l’organisme entier d’un médicament pour traiter les patients souffrant de certaines pathologies neurologiques. L’objectif est de vérifier la bonne libération du médicament marqué par radioactivité après l’avoir administré directement dans le cerveau grâce à un suivi par imagerie .
Bénéfices attendus
Ce médicament testé est conçu grâce à de nouvelles technologies qui devraient permettre d’accroître sa sécurité d’utilisation (moins d’effets secondaires) et d’améliorer son efficacité dans le traitement de certaines pathologies neurologiques .
Procédures
Les 18 animaux subiront tout d’abord une procédure chirurgicale pour permettre une administration intracrânienne d'un composé (20 minutes environ). Suite à cela, ils seront placés durant 24 heures maximum (durée totale de l’étude) en cage individuelle. ils auront un examen d'imagerie durant 15 min maximum sous anesthésie générale .Un prélèvement sanguin effectué en 1 minute environ sera réalisé sur ces 18 animaux dans la veine de la queue à 3 reprises, puis un dernier prélèvement juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale pourra induire une souffrance des animaux. L’hébergement en cage individuelle des rats opérés, nécessaire après la procédure chirurgicale et pour le suivi par imagerie durant 24h maximum, pourrait conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. Les 3 prélèvements sanguins s’effectueront sur animal vigile sans aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire pour ne pas perturber l’activité des animaux et les dosages réalisés. L’anesthésie générale est susceptible de causer une hypothermie.
Devenir
Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin du suivi par imagerie à la fin de la procédure expérimentale (24H maximum).
Remplacement
Les alternatives non animales ne peuvent être envisagées dans le cadre de ce projet, car la détection et la mesure du médicament radiomarqué, dans le cerveau et d'autres organes d'intérêt nécessitent un suivi temporel sur un animal vivant avec toute la complexité du système biologique dans son ensemble (organes, sang, environnement et microenvironnement, …). Avant la planification de ce projet, des alternatives non animales et des méthodes de remplacement partielles ont également été utilisées. Des analyses in silico avec des simulations pharmacocinétiques ont été utilisées pour prédire la formulation et la biodistribution du médicament. Des analyses in vitro sur des échantillons de tissus isolées ont été également réalisées pour analyser la distribution du médicament et son mécanisme d’action. Pour l’imagerie, une simulation avec un organe artificiel a été utilisé en amont pour vérifier la faisabilité et la pertinence du protocole au vue des quantités très faibles du médicament administré. Ces approches de remplacement ont permis d’avoir une évaluation préliminaire précieuse. Cependant, l'utilisation d'organes artificiels, d’échantillons tissulaires et cellulaires ou de modèles informatiques ne permettent pas de reproduire fidèlement les conditions réelles de distribution dans un organisme vivant.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation du projet qui nous permettront néanmoins d’obtenir des résultats représentatifs Pour la Phase 1 de faisabilité de notre étude, nous allons tester notre méthodologie sur 2 animaux, un rat mâle et un rat femelle. Pour déterminer le nombre de points temporels nécessaires et optimaux pour les examens, afin de suivre le passage du médicament radiomarqué de manière séquentielle : une analyse de régression est envisagée. La phase 2 ne sera réalisée que si, et seulement si la phase 1 et concluante. Pour la Phase 2 : Le nombre d’animaux a été calculé en envisageant un niveau de signification α à 0,05 et une puissance de 0,80. Pour comparer la biodistribution entre deux sites d'injection (ICV vs. IPC), un test t de Student est envisagé. Pour analyser la dosimétrie, un test de variance (ANOVA) est utilisé pour comparer la captation du médicament entre les différents organes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles avec un enrichissement (papier kraft), ils auront un accès non restreint à de la nourriture et de l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie qui sera réalisée dans des conditions d’asepsie strictes (analgésie pré-opératoire, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection et anesthésie locale du site d’incision) ainsi qu’après (analgésie post-opératoire). Durant les examens, les animaux seront placés sur un lit chauffé avec une surveillance permanente de leur respiration et rythme cardiaque par un expérimentateur qualifié qui pourra intervenir si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront effectués par du personnel ayant les compétences requises et une observation régulière des animaux sera effectuée après réalisation de chaque prélèvement. Si un animal présente des signes de souffrance ou détresse qui ne peuvent être soulagés, il sera immédiatement euthanasié dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
Le choix du rat comme espéce utlisé est un choix technique imposé par la résolution spatiale de notre appareil d'imagerie afin de mieux visualiser la biodistribution du radiotraceur de façon objective dans le carveau et les autres organes . Les animaux seront des rats âgés de 3 mois à leur arrivée au laboratoire, les expérimentations déburteront 1 semaine après leur arrivée. Cela correspond à des rats adultes pour être dans des conditions identiques à celles souhaitées chez l’Homme .
Modèle expérimental de rétinopathie induite par l’oxygène.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1440
2 400 animaux non-humains vont être utilisés, 960 souris et 1 440 rats, en majorité tués et pour partie réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés sont placés en atmosphère enrichie en oxygène pour provoquer une atteinte des vaisseaux de la rétine, puis reçoivent des gouttes ou des injections répétées, avec anesthésies et examens d'imagerie jusqu'à leur mise à mort. Le porteur teste des traitements contre les rétinopathies vasculaires et indique réutiliser les mères gestantes dans d'autres procédures après avis vétérinaire. Sur le remplacement, il affirme avoir besoin d'un œil perfusé en développement, que seul l'animal vivant fournirait.
Objectifs
Les pathologies de la rétine ou rétinopathies sont liées en grande partie à des anomalies de la vascularisation rétinienne. Parmi elles, on retrouve la rétinopathie du prématuré. Cette maladie liée à un mauvais développement du système vasculaire qui touche 30% des prématurés de moins de 31 semaines est la principale cause de cécité infantile dans le monde avec 30000 cas de malvoyance. Le but de ce projet est de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques et de trouver de nouveaux traitements en utilisant un modèle qui va mimer cette atteinte vasculaire chez le rongeur après une exposition à une atmosphère enrichie en oxygène. Plus généralement, lorsque le flux sanguin est altéré et que les vaisseaux perdent leur intégrité fonctionnelle, un mécanisme compensateur de réparation se met en place, avec la formation de nouveaux capillaires à partir des vaisseaux préexistants. Ce phénomène est appelé néovascularisation. Ces nouveaux capillaires sont souvent perméables et se développent de façon anarchique. Ils ne peuvent alors plus assurer correctement le transport du sang et aggravent de ce fait les dommages causés à la rétine. C’est le cas de nombreuses maladies comme la forme humide de dégénérescence maculaire liée à l’âge, première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans et la rétinopathie diabétique, première cause de cécité acquise dans les pays occidentaux chez l’adulte entre l’âge de 25 et 74 ans. Ce projet s’inscrit donc avec ce modèle de rétinopathie, développé dans les années 1950, dans un cadre plus large que la seule rétinopathie du prématuré. Il est largement utilisé depuis pour l’étude de l’angiogenèse et de la néovascularisation pathologique au niveau de la rétine. Il permet de ce fait de tester l’efficacité de thérapies luttant contre la grande famille des rétinopathies vasculaires. Sur la durée du projet, 10 études par espèce sont prévues en plus des études de formation du personnel aux bons gestes techniques, avec à chaque fois au moins un nouveau traitement ou une nouvelle formulation à tester. Chaque étude nécessite un nombre d’animaux minimum afin de pouvoir comparer les différentes conditions expérimentales et évaluer de l’efficacité du traitement.
Bénéfices attendus
Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l’identification et la sélection de nouveaux traitements pouvant améliorer la prise en charge de la rétinopathie du prématuré bien sûr mais aussi toutes les maladies incluant une composante vasculaire telles que dégénérescence maculaire liée à l’âge ou rétinopathie diabétique par exemple.
Procédures
Dès la naissance (rats) ou 7 jours après (souris), les animaux seront placés dans des chambres permettant le contrôle du taux d’oxygène durant une durée définie (14 jours pour les rats, 5 jours pour les souris). La durée des traitements variera en fonction de la formulation et du mode d’administration. Les administrations de gouttes se font généralement quotidiennement à raison de 2 à 3 administrations par jour, tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 17 ou 20 jours après le début de l’étude suivant l’espèce. Pour les administrations systémiques, le schéma d’administration est proche de celui de l’administration de gouttes. Généralement, le nombre d’administrations quotidiennes est un peu plus faible avec 1 ou 2 injections par jour tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 17 ou 20 jours après le début de l’étude suivant l’espèce. Pour les autres voies d’administration qui nécessitent une anesthésie de l’animal, les traitements ne sont plus quotidiens mais hebdomadaires avec seulement 1 à 2 injections par semaine pendant les 17 ou 20 jours de l’étude. La manipulation des animaux durant ces administrations ne durera que quelques secondes. Les examens (observation à la lampe à fente, angiographie, tomographie…) seront généralement hebdomadaires et de dureront pas plus de 5 minutes. Des anesthésies seront pratiquées autant que nécessaire afin de permettre si besoin l’administration ou l’examen des animaux. Tous les examens réalisés ces procédures sont des examens pratiqués chez l’homme en ambulatoire, en cabinet d’ophtalmologie ou chez l'animal en clinique vétérinaire. Chez l’homme, toutes les procédures qui ont nécessité une anesthésie générale, se font la plupart du temps sous anesthésie locale. Les autres examens (lampe à fente…) sont totalement indolores ou sous anesthésie locale et ne durent que cinq minutes tout au plus. Chez l’animal, l’anesthésie générale est réalisée afin d’immobiliser l’animal, de faciliter la procédure et de réduire un stress éventuel.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel liés aux conditions expérimentales d’hébergement, à leur manipulation et à l’administration des produits. La pathologie recherchée - néovascularisation et perméabilité vasculaire rétinienne - n'induit pas de douleur chez l'animal. La croissance des nouveau-nés et des mères exposés à l'hyperoxie (ou alternance de cycles hypoxie/normoxie) n’est que faiblement impactée. Les travaux publiés ne montrent pas d'effet de la modification du taux d'oxygène sur le comportement des animaux. La manipulation des nourrissons peut introduire du stress chez les petits comme chez la mère. Les risques sont qu'un animal soit rejeté de la portée par la mère, ne soit plus alimenté ou mangé par la mère. Pour ne pas induire de stress chez les mères déclenchant ces comportements, les manipulations des animaux seront donc limitées au maximum et seront réalisées par un personnel formé. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de nécroses, de saignements au site d'injection. Les animaux présentant les symptômes, ou exclus volontairement par la mère avec un risque pour leur survie, et si une adoption par une autre femelle n’est pas possible, ils seront sortis de l’étude.
Devenir
A l'issue de chaque étude, les animaux qui auront participé à l’ensemble de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de permettre l'analyse des tissus. Pour les études concernant l'évaluation de l’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure, à savoir les mères gestantes pourront être réutilisées dans d’autres procédures expérimentales compatibles après l’avis du vétérinaire si nécessaire.
Remplacement
L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Dans le cadre de notre projet, nous avons besoin d’un œil perfusé en cours de développement. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement et du nombre de naissances par portée. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Les animaux, une femelle par cage avec ses nourrissons, sont maintenus dans un environnement enrichi, (bouts de bois, coton pour le nid sur toute la période de l’étude) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des portées tout comme le suivi sanitaire quotidien pour minimiser au maximum le stress de la mère afin qu'elle subvienne aux besoins de ses nourrissons. Les examens qui nécessitent un immobilisme complet de l'animal pour la prise de photo, sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. Il en ira de même pour les procédures plus invasives afin de supprimer la douleur provoquée pendant et après l’intervention. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Le modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques, depuis les années cinquantes pour étudier le développement de la vascularisation de la rétine et ses pathologies. Les espèces choisies sont le rat et la souris. Ce sont les espèces références pour ce modèle. Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Le principe du modèle est d'agir sur le développement vasculaire de la rétine de nouveau-nés. Les animaux seront donc inclus dans l'étude quelques jours après leur naissance, avec leur mère pour subvenir à leurs besoins.
Etude de la dysfonction d’organes observée au cours d’un traumatisme sévère chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
720 rats vont être utilisés, anesthésiés sans réveil puis tués, dans des procédures menées sous anesthésie générale. Ils subissent la pose de cathéters veineux et artériels, une spoliation sanguine contrôlée de 90 minutes et une injection intramusculaire provoquant une lésion, pour reproduire un traumatisme sévère associant hémorragie et destruction musculaire. Le porteur cherche à comprendre la défaillance rénale qui suit ce type de traumatisme et affirme n'attendre aucun effet indésirable puisque les rats ne reprennent pas conscience. Il juge l'expérimentation animale "indispensable", estimant les connaissances actuelles insuffisantes pour une modélisation qui remplacerait l'animal.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de comprendre pourquoi les patients ayant subi un traumatisme sévère, associant blessure musculaire et perte sanguine massive, pris en charge à l’hôpital, présentent une dysfonction d’organes majeure, principalement au niveau rénal. Nous cherchons à déterminer, en mimant ce type de lésions sur un modèle animal (rat), quels mécanismes sont impliqués dans cette dysfonction et de quelle façon nous pouvons intervenir pour éviter leur activation.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes conduisant à une défaillance multiviscérale, notamment rénale, chez les traumatisés sévères aidera à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou le développement d’outils pour une amélioration de la prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux du projet (60 groupes) seront soumis à une anesthésie générale gazeuse sans réveil, avec analgésie, avec phase d'induction de très courte durée (5min/animal). Toutes les interventions sont réalisées après l'induction de l'anesthésie. Les interventions réalisées sont les suivantes et détaillées par ordre chronologique : Pour l'ensemble des animaux : - rasage et épilation (6 minutes) - ponction de la vessie sous contrôle échographique (1-5 minutes) - pose du cathéter veineux dans la veine caudale (1-5 minutes) - pose du cathérer artériel dans la carotide gauche (10-20 minutes) selon leur groupe d'appartenance : - spoliation sanguine (prélèvement de sang) contrôlée via le cathéter carotidien (90 minutes) - injection intramusculaire pour induire une lésion musculaire (1-2 minutes) - spoliation sanguine contrôlée via le cathéter carotidien (90 minutes) associée à l'injection intramusculaire pour induire une lésion musculaire (1-2 minutes) - remplissage vasculaire via le cathéter caudal (60 minutes)
Impact sur les animaux
Stress de courte durée dû à la contention et au placement de l'animal dans une cage d'induction nécessaire pour l’anesthésie gazeuse. Pas d'effets indésirables attendus pour les animaux qui subiront les procédures.
Devenir
Euthanasie pour analyses sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Compte tenu des contraintes des études cliniques et de notre incapacité à simuler une rhabdomyolyse et un état de choc hémorragique, des expérimentations animales sont indispensables pour accélérer une amélioration de la prise en charge des patients. De plus, nos connaissances sur les mécanismes de régulation de la pression artérielle systémique ainsi que sur la physiologie rénale ne sont pas suffisantes pour envisager une modélisation suffisamment robuste pour remplacer l’animal.
Réduction
Nous visons à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé en faisant le maximum de mesures par animal tout en nous assurant une analyse statistique fiable et complète de nos travaux. Nous planifierons nos epérimentations de façon à limiter le nombre d'animaux nécessaires pour le stockage et traitement du sang.
Raffinement
Un soin constant sera porté pour assurer l’analgésie par injection de fentanyl, et l’anesthésie par inhalation d'un gaz anesthésiant. Les animaux anesthésiés seront placés sur un matelas chauffant thermorégulé pour maintenir l'homéothermie.
Choix des espèces
En ce qui concerne le modèle, nous mettons en place celui le plus pertinent pour notre projet, à savoir l'association du choc hémorragique et la rhabdomyolyse, afin de pouvoir mimer la pathologie de trauma sévère chez l’Homme. En ce qui concerne l'espèce, nous avons choisi le rat pour permettre la comparaison et la discussion de nos résultats expérimentaux, au vu de la littérature existante sur les modèles de trauma. Les rats utilisés seront des mâles et des femelles adultes de 250 à 350g. Le choix de ce stade de développement est calqué sur celui le plus fréquemment utilisé dans les études publiées ce qui permettra de comparer nos résultats.
Impact du xénon sur la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique aux agents thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont exposés au xénon dans une boîte d'inhalation pendant quatre heures et porteurs d'une pompe implantée chirurgicalement dans le dos pour délivrer un médicament, afin de tester si le xénon aide les traitements à franchir la barrière hémato-encéphalique. Le porteur indique que l'implantation de la pompe peut provoquer une infection et une réaction inflammatoire locales. Il reconnaît qu'une partie du projet repose sur des cultures cellulaires in vitro, mais affirme que la complexité anatomique impose un recours aux "systèmes intégrés", les rats étant tués pour prélever leurs organes.
Objectifs
La barrière hématoencéphalique (BHE) est une interface essentielle qui sépare le sang du système nerveux central (SNC), empêchant ainsi les substances indésirables d'atteindre le cerveau. Cette barrière constitue un obstacle majeur pour l'acheminement de médicaments ciblant le cerveau. Dans le cadre de ce projet, nous explorons l'utilisation du xénon pour moduler la perméabilité de la BHE, permettant ainsi l'entrée de médicaments dans le cerveau. Le xénon présente de nombreuses propriétés intéressantes pour diverses applications : 1) il est chimiquement inerte et soluble dans la plupart des fluides biologiques ; 2) in vitro, il peut être facilement introduit et retiré des échantillons cellulaires ; 3) in vivo, il est actuellement utilisé comme agent anesthésiant à l'hôpital. Les protéines membranaires ABC (ATP Binding Cassette), jouent un rôle clé dans les phénomènes généraux de pharmacocinétique et de pharmacologie clinique, qui concernent de nombreux médicaments, grâce à leur capacité de reconnaissance multi-spécifique. La BHE présente une perméabilité restreinte et sélective en raison de l'expression de ces protéines ABC et de la présence de jonctions serrées dans les espaces inter-endothéliaux, permettant ainsi de contrôler la composition du milieu interstitiel cérébral. Bien que nous sachions maintenant que le xénon franchit rapidement la BHE, il est intéressant d'évaluer la possibilité d'utiliser sa dynamique aide au passage des médicaments dans le cerveau. Si tel est le cas, obtenir des informations sur la perméabilité de la BHE serait utile pour de nombreuses applications médicales, telles que la détermination de doses pour l'administration de médicaments au cerveau.
Bénéfices attendus
L'étude vise à étudier la capacité du Xénon à favoriser le passage de composés à travers la BHE. Les résultats de cette étude sont porteurs d'applications pharmaceutiques potentielles, qui bénéficieront en fin de compte aux patients. La démonstration d'une augmentation des concentrations cérébrales de médicaments tels que des agents anticancéreux (vérapamil), des antiépileptiques (acide valproïque, clobazam, stiripentol, bumétadine) et/ou des agents anti-infectieux (tenofovir, zidovudine, lamivudine, lopinavir) grâce à l'utilisation du xénon pourrait ouvrir la voie à son utilisation chez l'homme. Cela est d'autant plus prometteur que le xénon est déjà utilisé en clinique humaine. Les bénéfices attendus de cette étude comprennent : 1- Amélioration de la délivrance de médicaments au cerveau : En évaluant l'impact du xénon sur la barrière hémato-encéphalique (BHE), l'étude cherche à déterminer la meilleure combinaison de xénon et d'oxygène-Air qui favorise le passage des composés à travers la BHE. Cela pourrait conduire à une meilleure diffusion des médicaments thérapeutiques dans le cerveau potentialisant ainsi les traitements actuels. 2- Potentiel d'optimisation des traitements existants : Si l'utilisation du xénon permet d'augmenter les concentrations cérébrales des médicaments mentionnés (anticancéreux, antiépileptiques, anti-infectieux), cela pourrait améliorer l'efficacité de ces traitements chez les patients atteints de ces affections. 3- Utilisation potentielle du xénon chez l'homme : Si les résultats expérimentaux démontrent l'effet bénéfique du xénon sur la perméabilité de la BHE et l'augmentation des concentrations cérébrales des médicaments, cela pourrait justifier l'utilisation du xénon chez les patients humains. Étant donné que le xénon est déjà utilisé en clinique humaine, cela faciliterait son adoption et son application dans le contexte médical. En résumé, l'étude vise à démontrer les avantages potentiels de l'utilisation du xénon pour améliorer la délivrance de médicaments au cerveau, ce qui pourrait conduire à des traitements plus efficaces pour les patients atteints de cancer, d'épilepsie et d'infections par exemple. Ces résultats ouvriraient également la voie à l'utilisation clinique du xénon chez les humains, en capitalisant sur sa sécurité et son utilisation déjà établies dans le domaine médical.
Procédures
Les rats seront placés dans une boite d’inhalation permettant l’exposition au xénon. Les médicaments seront administrés au moyen d’une pompe Alzet placée au dos de l’animal. L’animal sera libre de ses mouvements dans la cage d’inhalation. La durée de traitement est de 4h. A la fin de chaque traitement les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes.
Impact sur les animaux
Ces considérations seront prises en compte lors de l'étude : Stress lié à la manipulation des animaux et au placement dans la cage : 1- Problème d'infection suite à la chirurgie 2- Réaction inflammatoire : L'implantation des pompes peut provoquer une réaction inflammatoire locale.
Devenir
Les rats seront euthanasiés à la fin de chaque expérimentation pour des prélèvements d’organes.
Remplacement
Le projet que nous souhaitons mener repose sur diverses approches expérimentales complémentaires. La validation de l’utilisation du xénon comme marqueur de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique sera réalisée à l’aide de modèles in vitro de cellules en culture. Ces modèles in vitro constituent un axe important du projet et leur étude apporteront des éléments précieux qui permettront de réduire au maximum l’utilisation d’animaux. Toutefois, l’un des objectifs importants du projet est de tester si l’administration du xénon par inhalation permet une meilleure biodisponibilité cérébrale des molécules thérapeutiques. La complexité anatomique des voies de communication entre le compartiment systémique et le cerveau est telle qu’elles ne sont pas modélisable in vitro. Nous devrons donc avoir recours à des systèmes intégrés afin de tester et valider nos hypothèses.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux (180 au total) nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.
Raffinement
• Les animaux sont hébergés en groupe, dans un environnement enrichi. • L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) tout au long de l’expérience • Stress des animaux liés à leur mise en cage :Les animaux seront progressivement familiarisés avec la boîte d'inhalation en étant exposés à celle-ci pendant des sessions d'entraînement quotidienne sur une période de 15 jours avant le début des expérimentations. Au cours de ces sessions d'entraînement, les rats seront placés dans la boîte d'inhalation pendant des périodes croissantes, commençant par des durées plus courtes et augmentant progressivement jusqu'à atteindre la durée maximale de 4 heures prévue pour l'expérience. Cette approche graduelle visera à réduire l'anxiété et le stress liés à l'exposition à la boîte d'inhalation et aux manipulations associées. • Infection/inflammation du fait de la chirurgie pour l’implantation des pompes : Les animaux seront suivis quotidiennement suite à l’implantation des pompes t. En cas de signe d’infection/inflammation, le vétérinaire sera contacté pour savoir quelles mesures prendre.
Choix des espèces
L’étude de l’efficacité du xénon pour moduler la perméabilité de la BHE nécessite un modèle élaboré comme le rat couramment utilisé en pharmacologie. De plus celui-ci est préféré à la souris car sa plus grande taille rend les expérience plus sensible (la quantité de signal étant plus grande). Cette espèce sera aussi utilisée dans les études futures de toxicologie. Les rats adultes seront utilisés dans ce protocole. Cette première étude adresse les agents thérapeutiques pour une application dans un premier temps chez l’adulte. En conséquence, Il est nécessaire d’utiliser des animaux bien matures sur le plan du développement neuronal. En fonction des résultats nous envisagerons les animaux juvéniles.
Évaluation de la Sécurité préclinique des candidats médicaments chez les rongeurs génétiquement modifiés ou non (rats et souris) et les non rongeurs (chiens, mini-porcs et primates non humains)
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 4800
Chiens : 540
Cochons : 540
Macaques à longue queue : 1250
13 530 animaux non-humains vont être utilisés, en très grande majorité tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 6 400 souris, 4 800 rats, 1 250 macaques à longue queue, 540 chiens et 540 cochons. Ils reçoivent des administrations répétées de candidats médicaments, des prélèvements de sang, de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal et, pour les non-rongeurs, la pose chirurgicale d'implants de télémétrie, dans des études de toxicité réglementaire. Le porteur indique qu'une analyse terminale des organes est le plus souvent nécessaire, seuls 10 à 15 % des non-rongeurs pouvant être réutilisés et certains proposés à l'adoption. Il justifie l'emploi de deux espèces, dont un non-rongeur, par les lignes directrices internationales et l'extrapolation à l'humain, aucune méthode ne remplaçant selon lui l'"organisme entier".
Objectifs
Un médicament n’est mis sur le marché pour les patients qu’après plusieurs années de Recherche et Développement. Les études précliniques, en amont des essais chez l’Homme, sont indispensables à l’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un candidat médicament. Celles visant à qualifier la sécurité du candidat médicament sont réalisées en accord avec la réglementation qui impose cette évaluation sur deux espèces mammifères, un rongeur (rats ou souris) et un non rongeur (chiens, mini-porcs ou primates non humains) (sauf cas particulier, par exemple pour les anticorps si une seule espèce est pertinente). L’objectif de ce projet est de réaliser des études de sécurité préclinique afin d’évaluer les potentiels effets indésirables des candidats médicaments. Pour cela, les procédures mises en œuvre concernent le suivi clinique et biologique des animaux suite à l’administration unique ou répétée du candidat testé, par des voies, la plupart du temps, identiques à celles prévues chez l’Homme, avec des prélèvements de fluides biologiques (par exemple : sang, urines) permettant de mieux caractériser les effets observés. Cela permettra d’avoir des informations essentielles (choix de dose et index thérapeutique) avant la première administration chez l’Homme ou bien de stopper le développement d’un candidat ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité. Ce projet fait partie des prérequis indispensables à la mise sur le marché de nouveaux médicaments et de nouvelles stratégies thérapeutiques pour l’Homme, efficaces, plus sûrs et mieux tolérés et participe aux progrès scientifiques et biomédicaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’apporter les éléments d’information nécessaires aux prérequis toxicologiques en évaluant la sécurité et les effets indésirables des candidats médicaments chez l’animal vivant. Les avantages attendus sont la protection de l’Homme, d’une part en stoppant le développement de composés pour lesquels la toxicité est rédhibitoire et/ou innocuité insuffisante et d’autre part en fournissant les informations essentielles avant les administrations en clinique (par exemple calcul des index thérapeutiques, caractérisations des effets secondaires attendus, biomarqueurs).
Procédures
Les animaux vigiles seront concernés par l’administration unique ou répétée (quotidienne ou hebdomadaire) du candidat médicament, possibles par différentes voies (le plus souvent intra-veineuse ou orale), au cours de l’étude sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de sang ou autres fluides biologiques, associés à une contrainte légère de quelques minutes, seront nécessaires pour évaluer différents paramètres (par exemple hématologie, biochimie, immunologie) ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs (par exemple moëlle osseuse, liquide cérébrospinal). Des mesures comme par exemple, la température corporelle (avec puce électronique), le poids (2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. Plus rarement, une procédure chirurgicale pourra être pratiquée chez les non-rongeurs afin de mettre en place un implant vasculaire ou de télémétrie pour mesurer par exemple les ECG et la pression artérielle (durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie d’environ 2 heures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables seront limités à une contrainte modérée. L’administration du composé lui-même peut provoquer une baisse d’activité, une perte de poids, des modifications de la température corporelle par exemple. Les nuisances liées à la procédure (contention, administration, prélèvements de fluides ou tissus biologiques, etc.) se traduisent par un stress, une douleur de courte durée. La mise en place d’implants vasculaires par chirurgie provoquera une contrainte de courte durée (douleur légère, baisse d’appétit par exemple).
Devenir
Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.
Remplacement
Le projet est réalisé sur animal vivant car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci. Il n’existe pas de méthode substitutive pour remplacer l’ensemble des études menées pour l’évaluation des risques en sécurité préclinique. Cependant, l’utilisation de méthodes in silico (modélisation informatique) et in vitro (par exemple organ-on-chip) mimant la structure et la fonction d’un organe (par exemple : foie, cœur, rein) permet un premier criblage des futurs candidats ou de mieux caractériser l’atteinte de telle ou telle fonction.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (données bibliographiques et historiques, lignes directrices internationales et internes), et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les éventuels effets adverses. Les tests statistiques utilisables sont dépendants des paramètres étudiés, et peuvent être par exemple, une analyse de variance, un test de tendance. La mise en place d’études combinant l’acquisition et l’analyse de paramètres de sécurité, pharmacodynamie et pharmacocinétique permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, l’utilisation d’animaux contrôles n’est pas systématique et est soumis à réflexion en fonction des objectifs de l’étude. Enfin, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le Vétérinaire clinicien, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Pour certains gestes techniques, une phase de désensibilisation/habituation est faite en amont de l’étude pour diminuer le stress de l’animal. L’administration est associée à une récompense physique (caresses, félicitations avec la voix) et/ou alimentaire. Les interventions chirurgicales sont réalisées en condition maximale d’asepsie et avec l’utilisation d’une analgésie multimodale. Le suivi clinique, au moins quotidien des animaux, permet la détection précoce de toute douleur, inconfort ou détresse et la mise en application de critères d’arrêt anticipés supervisée par le Directeur d’étude, le Vétérinaire clinicien et la Structure en charge du Bien-Etre Animal, afin que les animaux ne subissent pas plus qu’une contrainte modérée.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par : -les lignes directrices internationales (ICH) définissant que les études de Toxicologie Générale doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rat, souris, génétiquement modifiés ou non) et chez le non rongeur (chien, mini-porc ou primate non humain) -les données scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le véhicule envisagé et les données disponibles (pharmacocinétique, métabolisme et de toxicologie). L’espèce utilisée doit être pertinente et est essentiellement fonction de la similitude du profil métabolique et des effets biologiques attendus chez l’Homme, afin de permettre l’extrapolation des données acquises à l’espèce humaine. Le choix de l’espèce non rongeur peut dépendre également de la modalité thérapeutique (par exemple, les primates non humains pour les biologiques). Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes, pour répondre aux exigences de la réglementation internationale et aux spécificités découlant des différents programmes de recherche.
Effets de candidats médicaments dans des modèles rénaux d’ischémie reperfusion chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 3105
6 750 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 2 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 4 500 un niveau modéré. Ils subissent des chirurgies d'ischémie rénale et de néphrectomie, des traitements répétés sur trois mois, des séjours de 24 heures en cage à métabolisme et des prélèvements sanguins terminaux, pour tester des candidats médicaments que le porteur évalue pour des clients. Il reconnaît ignorer la nature et les effets secondaires des molécules, et que les chirurgies provoquent les mêmes troubles rénaux que chez l'humain. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie et que le recours à l'animal est "incontournable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments dans des modèles rénaux d’ischémie reperfusion avec différents paramètres. Nous pensons réaliser 3 études par an par procédure et par espèce (soit 90 études au total).
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour améliorer la fonction rénale et prévenir les dommages tissulaires dans les phases aigues de l’ischémie reperfusion.
Procédures
Les animaux vont recevoir des traitements pharmacologiques (fréquence dépendante de chaque protocole expérimental pouvant aller de quelques jours à 3 mois selon les procédures) donc vont être manipulés régulièrement. Chaque administration classique durera 30 sec – 1 min en moyenne. Ils vont également subir des chirurgies (ischémie et/ou néphrectomie). Les ischémies durent environ 1 heure maximum (car 45 min max d’ischémie) et une néphrectomie dure environ 20 min. Les animaux iront dans des cages à métabolisme pour la collecte d’urine où ils seront en cage individuelle pendant 24H. Selon le protocole expérimental, plusieurs sessions de cages à métabolisme pourront être réalisées mais pas plus de deux par semaine sur une période de 3 mois maximum. Pour la mesure d’un paramètre expérimental, les animaux seront anesthésiés afin de scotcher un capteur. Cette anesthésie rapide durera environ 10 min. Des prélèvements sanguins sur animal vigile pourront être réalisés à la queue ou à la veine saphène (1 prélèvement maximum par semaine sur un suivi total de 3 mois d’expérimentation). Sur animal anesthésié, des prélèvements terminaux par voie rétro-orbitale (chez la souris), sub-linguale (chez le rat), intracardiaque ou à la veine abdominale pourront être réalisés. La fréquence des prélèvements est dépendante de chaque protocole expérimental. Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront rapides (5 min max).
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, certains clients nous précisent certains effets secondaires possibles quand ces derniers sont connus. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur. Les animaux auront des chirurgies pour réaliser les ischémies pour induire des troubles rénaux, par conséquent, les animaux auront les mêmes symptômes cliniques que chez l’homme. De plus, toute chirurgie peut provoquer des douleurs, des saignements, un certain mal-être. Lors des prélèvements d’urine, les animaux seront placés dans des cages à métabolisme individuelle pendant 24 heures. Même si les animaux peuvent se voir et communiquer entre eux, l’isolement des animaux avec leurs congénères peut leur provoquer un certain stress.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la perte de fonction et dommages rénaux. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres. Pour mesurer certains paramètres, nous utilisons des méthodes non invasives telles que des cages métaboliques, la mesure du débit de filtration glomérulaire. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ces modèles sont très bien établis dans notre laboratoire et nous les réalisons en routine. De par notre expérience et en accord avec la littérature, un nombre de 10 et 12 animaux chez le rat et la souris, respectivement par groupes expérimentaux est le minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats statistiquement différents et interprétables (avec risque α=0.05 et risque β=0.8). Des t-tests seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux groupes et des tests ANOVA pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes).
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes tels que prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure avant d’atteindre des points limites… En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Des antalgiques seront administrés lors des chirurgies afin de limiter la douleur des animaux. Si un animal présentait des symptômes pouvant aller jusqu’à l’atteinte d’un point limite, il serait hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière, isolé et soigné si besoin selon les symptômes. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h ou si un point limite était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux lors des contentions.
Choix des espèces
Les modèles d’ischémie/reperfusion sont très bien décrits dans la littérature et sont réalisés aussi bien chez la souris que le rat selon la cible scientifique souhaitée. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines. Cependant, nos protocoles expérimentaux étant dépendants de nos clients, des animaux avec un âge différent pourront être utilisés.
Douleur et proteases liees au stress chez le rat EU2/3
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des distensions colorectales par ballonnet répétées et, dans cet établissement, des séances d'imagerie IRMf pour mesurer la réponse cérébrale à la distension, dans un modèle de stress reproduisant l'hypersensibilité viscérale du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur signale que la distension peut provoquer une diarrhée et parfois une perforation du colon. Il conclut, après des essais sur organoïdes humains, que le recours à l'animal reste "incontournable" au motif que la nociception mobiliserait l'"organisme entier".
Objectifs
La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients SII (atteints de syndrome de l’intestin irritable). Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients SII. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale. Un modèle rat est choisi dans cette étude car c’est le modèle animal de référence pour étudier le stress psychologique et ses effets, notamment sur la douleur viscérale. Ce projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouvelles molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques contre la douleur viscérale
Procédures
Dans l'EU 1/3 et 3/3: Un minimum de 3-4 séries de distensions colorectales sera réalisé (2-3 séries de distensions «basales» et 1 série post traitement) par animal et espacées de minimum 3 jours pour les basales. Si les séries de distensions colorectales «basales» (sans traitement) présentent une variabilité importante, nous pourrons décider d’augmenter leur nombre. Nous pourrons aussi décider d’évaluer la reproductibilité des séries de distensions colorectales au cours du temps (sans traitement) sur le même animal ainsi que l’effet de la distension sur les paramètres protéolytiques (mesurés dans les lavages coliques et selles). Ainsi, au maximum, nous pourrons faire jusqu’à 6 séries de distensions colorectales par animal (la durée d'une série de distensions est de 1h15 et inclue 30 min d'habituation au ballon, c'est à dire que le ballon n'est pas gonflé). Des administrations de molécules pourront être effectuées (par voie intrapéritonéale, intra colique, orale, sous cutanée) avant la dernière série de distensions colorectales. Administrations intrapéritonéales et intra coliques de molécules (2 par animaux). Lavages colique (maximum 3 par rat). Dans l'EU 2/3: Nous pourrons évaluer la réponse du système nerveux central (cerveau) en réponse à la distension colorectale par imagerie IRMf (30 min-1h par animal)
Impact sur les animaux
Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale, ainsi qu’une diarrhée dès 15 min post traitement. La motilité et la perméabilité intestinales sont modifiées dès 15 min, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h post-traitement. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés
Remplacement
La douleur chronique intestinale, dont souffrent les patients atteints de syndrome de l'intestin irritable (SII), peut affecter fortement leur condition de vie. Cependant, les causes de cette douleur chronique sont encore mal comprises, notamment si c'est la perception de la douleur en centrale qui est altérée, et/ou bien si c'est la sensibilisation des neurones en périphérique et/ou en central qui est perturbée. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception est ainsi indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive chronique. In vitro, il est possible d’étudier des échantillons coliques provenant de patients SII (biopsies, selles, organoïdes en culture...), nous avons par exemple montré dans des études préliminaires que le traitement d’organoïdes intestinaux par des hormones de stress modifiait la balance protéolytique. Suite à la preuve de concept in vitro d’un effet des hormones de stress sur les médiateurs d’intérêt au niveau de l’intestin (techniques de culture d’organoïdes intestinaux), l'expérimentation animale est nécessaire pour valider ces résultats, c’est a dire pour évaluer la conséquence de l’altération de ces facteurs sur la douleur viscérale (en condition de stimulation nociceptive c'est à dire par exemple en réponse à la distension colorectale). L’étude des mécanismes de nociception requiert une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.
Réduction
La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (par opposition à d’autres méthodes d’évaluation de la douleur viscérale comme par exemple l’implantation d’électrodes au niveau des muscles abdominaux par chirurgie) permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, les résultats de distension obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: série de distensions avant traitement versus série de distensions après traitement). Cependant, il existe de la variabilité de la réponse à la distension au sein du même animal au cours du temps et entre les animaux entre eux. Cette variabilité peut être associée notamment au stress dû à la distension, ainsi, pour réduire cette variabilité au maximum, nous habituons les animaux avant la première série de distensions et nous reproduisons les distensions au sein du même animal plusieurs fois afin de réduire le stress et donc la variabilité intra et inter-individus et en conséquence le nombre d’animaux requis pour une étude. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h durant les 3 jours précédant la première série de distensions (habituation au manipulateur et habituation aux tubes de contention) afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet et expérimentateurs ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; et en particulier aux techniques spécifiquement utilisées ici (distension colorectale, injections intra coliques). L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Transport de moins de 50 km. Nous nous assurerons que les animaux sont protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil, des températures extrêmes (climatisation du véhicule 19-21 degrés), conduite souple, limitation au bruit
Choix des espèces
Le rat est un modèle communément utilisé dans les études de stress psychologique et de mesure de douleur viscérale, il a ete choisi par rapport a une publication de reference du modele cortagine Les rats seront ages d'au moins 7 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 200g.
Douleur et proteases liees au stress chez le rat EU1/3
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent jusqu'à six séries de distensions colorectales par ballonnet, des administrations de molécules et des lavages coliques, dans un modèle de stress destiné à provoquer une hypersensibilité viscérale imitant le syndrome de l'intestin irritable. Le porteur indique que la distension peut entraîner une diarrhée et, comme effet indésirable, une perforation du colon repérée au sang sur le ballonnet. Après une preuve de concept sur organoïdes intestinaux humains, il conclut que le recours à l'animal reste "incontournable" parce que la nociception exigerait une réaction de l'"organisme entier".
Objectifs
La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients SII (atteints de syndrome de l’intestin irritable). Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients SII. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale. Un modèle rat est choisi dans cette étude car c’est le modèle animal de référence pour étudier le stress psychologique et ses effets, notamment sur la douleur viscérale. Ce projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouvelles molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques contre la douleur viscérale
Procédures
Dans l'EU 1/3 et 3/3: Un minimum de 3-4 séries de distensions colorectales sera réalisé (2-3 séries de distensions «basales» et 1 série post traitement) par animal et espacées de minimum 3 jours pour les basales. Si les séries de distensions colorectales «basales» (sans traitement) présentent une variabilité importante, nous pourrons décider d’augmenter leur nombre. Nous pourrons aussi décider d’évaluer la reproductibilité des séries de distensions colorectales au cours du temps (sans traitement) sur le même animal ainsi que l’effet de la distension sur les paramètres protéolytiques (mesurés dans les lavages coliques et selles). Ainsi, au maximum, nous pourrons faire jusqu’à 6 séries de distensions colorectales par animal (la durée d'une série de distensions est de 1h15 et inclue 30 min d'habituation au ballon, c'est à dire que le ballon n'est pas gonflé). Des administrations de molécules pourront être effectuées (par voie intrapéritonéale, intra colique, orale, sous cutanée) avant la dernière série de distensions colorectales. Administrations intrapéritonéales et intra coliques de molécules (2 par animaux). Lavages colique (maximum 3 par rat). Dans l'EU 2/3: Nous pourrons évaluer la réponse du système nerveux central (cerveau) en réponse à la distension colorectale par imagerie IRMf (30 min-1h par animal)
Impact sur les animaux
Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale, ainsi qu’une diarrhée dès 15 min post traitement. La motilité et la perméabilité intestinales sont modifiées dès 15 min, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h post-traitement. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés
Remplacement
La douleur chronique intestinale, dont souffrent les patients atteints de syndrome de l'intestin irritable (SII), peut affecter fortement leur condition de vie. Cependant, les causes de cette douleur chronique sont encore mal comprises, notamment si c'est la perception de la douleur en centrale qui est altérée, et/ou bien si c'est la sensibilisation des neurones en périphérique et/ou en central qui est perturbée. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception est ainsi indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive chronique. In vitro, il est possible d’étudier des échantillons coliques provenant de patients SII (biopsies, selles, organoïdes en culture...), nous avons par exemple montré dans des études préliminaires que le traitement d’organoïdes intestinaux par des hormones de stress modifiait la balance protéolytique. Suite à la preuve de concept in vitro d’un effet des hormones de stress sur les médiateurs d’intérêt au niveau de l’intestin (techniques de culture d’organoïdes intestinaux), l'expérimentation animale est nécessaire pour valider ces résultats, c’est a dire pour évaluer la conséquence de l’altération de ces facteurs sur la douleur viscérale (en condition de stimulation nociceptive c'est à dire par exemple en réponse à la distension colorectale). L’étude des mécanismes de nociception requiert une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.
Réduction
La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (par opposition à d’autres méthodes d’évaluation de la douleur viscérale comme par exemple l’implantation d’électrodes au niveau des muscles abdominaux par chirurgie) permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, les résultats de distension obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: série de distensions avant traitement versus série de distensions après traitement). Cependant, il existe de la variabilité de la réponse à la distension au sein du même animal au cours du temps et entre les animaux entre eux. Cette variabilité peut être associée notamment au stress dû à la distension, ainsi, pour réduire cette variabilité au maximum, nous habituons les animaux avant la première série de distensions et nous reproduisons les distensions au sein du même animal plusieurs fois afin de réduire le stress et donc la variabilité intra et inter-individus et en conséquence le nombre d’animaux requis pour une étude. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h durant les 3 jours précédant la première série de distensions (habituation au manipulateur et habituation aux tubes de contention) afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet et expérimentateurs ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; et en particulier aux techniques spécifiquement utilisées ici (distension colorectale, injections intra coliques). L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Transport de moins de 50 km. Nous nous assurerons que les animaux sont protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil, des températures extrêmes (climatisation du véhicule 19-21 degrés), conduite souple, limitation au bruit
Choix des espèces
Le rat est un modèle communément utilisé dans les études de stress psychologique et de mesure de douleur viscérale, il a ete choisi par rapport a une publication de reference du modele cortagine Les rats seront ages d'au moins 7 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 200g.
Formation et entrainement aux gestes techniques chez le rongeur de laboratoire (souris et rats)
- Formation professionnelle
Rats : 400
2 500 souris et 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce sont des animaux de surplus d'élevage, déjà destinés à la mise à mort, sur lesquels des personnes en apprentissage s'entraînent aux injections, aux prélèvements sanguins et aux perfusions, chaque animal subissant jusqu'à deux administrations et un prélèvement. Le porteur admet que des gestes encore mal maîtrisés peuvent rendre la contention plus longue et le geste plus douloureux. Il affirme que les réactions de l'animal vigile restent "indispensables" et ne peuvent être reproduites par des méthodes de remplacement, et présente le projet comme une réduction puisqu'il utilise des animaux voués à la mort.
Objectifs
L'utilisation d'animaux dans la recherche est parfois nécessaire, la recherche sur les cellules ou les modèles informatiques ne suffisent pas et il est parfois nécessaire de travailler sur organisme entier notamment en raison des nombreuses intéractions qui existent entre les différents organes. Ainsi l'utilisation des animaux de laboratoire permettent l'amélioration des connaissances de maladies complexes et la mise au point de traitement. L'espèce la plus utilisée étant la souris pour plusieurs raisons. La souris partage 90% de ses gènes avec l'Homme, peut souffrir des mêmes maladies (obésité, diabète, cancer...), supporte bien la consanguinité (lots d'animaux homogènes d'un point de vue génétique) et peut être modifiée ganétiquement (OGM avec par exemple invalidation d'un gène d'intérêt), peut aussi être modifiée au niveau de son microbiote (souris axéniques) et il existe de nombreux outils d'analyse (anticoprps par exemple). L'avantage aussi est la petite taille, elles est facile à héberger sous statut sanitaire défini, à élever et à manipuler. Il est important de savoir manipuler l'espèce dont on a besoin dans son projet scientifique, la réglementation demande à ce que le personnel soit formé et compétent. Les établissements utilisateurs accueillent le personnel des équipes de recherche qui va être amené à travailler sur les espèces souris et/ou rats dans le cadre de leurs projets de recherche. Le personnel de l'établissement utilisateur a pour rôle d'accompagner les utilisateurs et certains utilisateurs ont besoin d'être formés aux gestes techniques sur les animaux. Hormis la formation réglementaire (applicateur et concepteur), les utilisateurs ont parfois besoin de se former et s'entrainer en interne en fonction des besoins de leurs projets. Le personnel de l'établissement est formé, compétent et titulaire des formations réglementaires (concepteur ou applicateur et chirurgie expérimentale) et également à jour pour la formation continue. Le programme de ces formations en interne et la validation des gestes est assuré par le responsale du suivi des compétences de l'établissement. Le présent projet a pour but de lister certains gestes techniques réalisés sur des animaux de réforme dans le cadre d'apprentissage ou de training. Le projet global va utiliser au maximum 2300 animaux mâles et femelles de tout âge ne présentant pas de gène d'intérêt, n'ayant pas de phénotype dommageable et dont l'état de santé a été jugé satisfaisant.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de former les nouveaux entrants (zootechniciens nouvèlement recrutés ou personnels d'équipes de recherche utilisateurs du service de zootechnie) et de s’assurer qu’ils maîtrisent parfaitement les gestes d’administration de composés et de prélèvements sanguins avant de les laisser travailler en autonomie. La formation permet aussi d'éviter les biais et les erreurs, si la personne ne maitrise pas totalement les gestes, lors de la réalisation des projets scientifiques.
Procédures
Les gestes enseignés et/ou pratiqués seront diverses injections (intra-péritonéale, sous-cutanée, intraveineuse...), des prélèvements sanguins sous anesthésie et des perfusions. Des tests d'anesthésie pourront également être faits lors de la mise en place d'un projet incluant de la chirurgie ou dans le cadre du raffinement des procédures d'anesthésie. Chaque animal pourra faire l'objet au maximum 2 administrations (gavage ou injection) et d'un prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
Ce projet est réalisé pour valider ou former aux gestes techniques d’administration de substances et de prélèvements sanguins des personnes pouvant être novices, il est donc possible que certains gestes techniques encore mal maitrisés produisent une légère nuisance aux animaux (contention un peu longue par rapport à une personne plus habituée, stress de l’expérimentateur ressenti par l’animal, geste un peu plus douloureux car en apprentissage…).
Devenir
Après utilisation de ces animaux, ils seront mis à mort, comme cela était intialement prévu puisqu'il s'agit d'animaux non-utilisés (surplus d'élevage).
Remplacement
Pour l'apprentissage de l'approche de l'animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l'animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente et pour permettre aux participants d'aborder les animaux dans les conditions les plus proches de leur réalité quotidienne.
Réduction
Afin de réduire le nombre total d'animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus d'élevage, qu'il est prévu de mettre à mort dans la semaine. Nous réduisons également au maximum le nombre d'animaux utilisés pour chaque personne. Néanmoins, afin de limiter le nombre de gestes appliqués à chaque animal 3 animaux par participant sont nécessaires.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages de portoir ventilé, en groupe, avec de l'eau et de la nourriture ad libitum et de l'enrichissement (une maison + de quoi faire un nid). Les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel compétent qui vérifie l'état des animaux, le niveau du biberon et de la mangeoire. En cas de signes cliniques détectés, l'information est remontée et des points limites adaptés sont appliqués.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les animaux de laboratoire utilisés dans le service de zootechnie Les animaux seront utilisés en fonction de leur disponibilité. Le critère d'âge n'est pas restrictif sur l'utilisation de ces animaux.
Effet de la consommation de sucre sur l’anxiété et les capacités mnésiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
228 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils sont soumis à six ou dix semaines de consommation d'eau sucrée puis à seize séances de tests d'anxiété et de mémoire, dont un test reposant sur une stimulation douloureuse brève, pour chercher un lien entre sucre et troubles cognitifs. Le porteur euthanasie ensuite les rats pour analyser leur cerveau. Il affirme qu'aucune alternative n'existe et que l'expérimentation animale offre un environnement "débarrassé du maximum de facteurs confondants", un contrôle qu'il oppose aux études chez l'humain.
Objectifs
Dans les pays développés, la consommation alimentaire peut être motivée autant, voire davantage, par le plaisir que par le besoin de se nourrir. De ce fait, des dérives sont observées dans les comportements alimentaires, comme une consommation excessive de sucres rapides. Des études émettent l’hypothèse qu’une consommation excessive chronique de sucres rapides dès l'adolescence peut être à l'origine de conséquences néfastes sur l'humeur et sur les capacités cognitives des individus. Notre projet vise à tester cette hypothèse, soit pendant soit après une phase prolongée de consommation de sucre, et ce dans le cadre de l’expérimentation animale qui permet l’élaboration d'un environnement contrôlé et débarrassé du maximum de facteurs confondants.
Bénéfices attendus
La consommation chronique de sucres rapides est connue pour induire des dysfonctionnements métaboliques et certains troubles du fonctionnement cérébral, en particulier ceux liés à l'état émotionnel du sujet. Cependant, les troubles cognitifs et mnésiques ne commencent qu'à être décrits chez l'Homme et il est encore difficile de déterminer les liens de causalité entre consommation de sucre et troubles cognitifs. Les expériences que nous proposons de mener chez le rongeur, forcément davantage contrôlées, permettront de participer à l'éclaircissement du lien de causalité potentiel entre le comportement alimentaire et les capacités mnésiques. Par ailleurs, les analyses biochimiques que nous mènerons sur le cerveau des animaux permettront de mettre en évidence des liens potentiels entre le comportement de consommation de sucre et une plasticité cérébrale qui pourrait participer à l’altération des processus cognitifs ou émotionnels.
Procédures
Les animaux seront soumis à une phase de consommation d’eau sucrée, pendant 6 ou 10 semaines (séances de 2h tous les 2 ou 3 jours). Certains seront soumis (ensuite ou pendant la phase de consommation) à des tests comportementaux qui permettront d’évaluer le niveau d'anxiété et les capacités mnésiques des animaux. Chacun de ces tests comportementauc s'étale sur 1 à 4 séances, à raison (selon les procédures) de 1 séance / jour ou 1 séance / 2 jours. Chaque animal sera soumis, au total, à 16 séances, chacune durant environ 5 min. Aucune intervention invasive n’est programmée dans ce projet.
Impact sur les animaux
Des troubles de l'humeur et/ou cognitifs sont envisageables chez les animaux consommateurs de boisson sucrée (le but de l'étude est de les mettre en évidence). Un stress léger peut être généré chez les animaux par la passation des tests d’anxiété et de mémoire (succession des tests sur 18 ou 29 jours, selon les procédures, et, parfois, exposition à une situation aversive). Un seul test est basé sur l'application dunique et courte d'une stimulation douloureuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Le prélèvement de tissus (en particulier le cerveau) permettra l'analyse, à un niveau biochimique, des conséquences éventuelles de la consommation chronique de sucre.
Remplacement
L'utilisation d'animaux vivants et vigiles est forcément obligatoire pour mesurer la consommation orale d'une solution sucrée et ses conséquences éventuelles sur les capacités mnésiques et le niveau d'anxiété. Il n'y a actuellement pas d'alternative pour répondre aux questions abordées par le projet.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé au plus juste en fonction des prérequis statistiques et de notre expertise en matière de comportement, soit 12 animaux/condition pour les expériences de comportement et 10/condition pour les approches moléculaires. Des tests statistiques seront effectués sur les données et les expériences seront terminées dès que ces tests auront confirmé ou infirmé l'hypothèse que nous avons formulée.
Raffinement
Notre protocole expérimental impose que les rats, placés par paires dans des cages standard qui n'entravent pas la communication sonore et olfactive et où ils disposent de morceaux de bois à ronger, soient examinés (pesée, aspect externe) tous les deux jours. L'habituation à la personne et à la manipulation est donc assurée. Leur consommation d'eau, de nourriture et d'eau sucrée est mesurée à la même fréquence. L'isolement de chaque animal n'est réalisé que lorsqu'il est placé en situation de test (consommation de sucre sur 2h, tests de mémoire ou d'anxiété, activité locomotrice de 24h). L'enchaînement des rests comportementaux est élaboré pour qu'il soit compatible avec les règles du bien-être animal. Aucune chirurgie n'est programmée. la mise en place et le respect des points limites est assurée par la surveillance d'éventuels signes de détresse physique ou de changements de comportements majeurs des animaux ainsi que par l'évaluation de leur état général.
Choix des espèces
Le Rat représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires et l’addiction. Sur un plan évolutif, les rongeurs appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Le choix du Rat s’impose par l’existence de très nombreuses données anatomiques, électrophysiologiques et comportementales solides sur la cognition, mémoire, mais aussi l’anxiété et la dépression Les bases neurobiologiques de la mémoire, de l’anxiété ou de la dépression étudiées chez le rongeur, et notamment chez le Rat, ont permis de grandes avancées dans la compréhension de ces phénomènes physiologiques et pathologiques chez l’homme. Par ailleurs, le rat possède des capacités cognitives élaborées et un répertoire comportemental complexe. Animal social, il s’adapte bien à la vie au laboratoire et coopère facilement dans les tâches comportementales. Les tests comportementaux débutent à l'âge de 6 semaines, chez le rat adolescent. L'adolescence est une période critique dans le développement de comportement de recherche et de consommation de drogues ou de récompenses naturelles comme le sucre. La plasticité cérébrale, très importante à cet âge-là, est une source de vulnérabilité en termes de contrôle du comportement et de conséquences à la consommation excessive de sucre.