Rats
Evaluation des modifications vasculaires cérébrales par microscopie de localisation ultrasonore (ULM) sur un modèle de la dépression chez le rat.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
99 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 67 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 32 en souffrance modérée. Issus d'une lignée sélectionnée pour un caractère "dépressif", ils reçoivent des injections d'antidépresseur, une neurostimulation par ultrasons cinq jours de suite, une craniotomie sous anesthésie, puis une imagerie cérébrale avant d'être tués par décapitation sans réveil. Le projet cherche à mesurer la vascularisation du cerveau dans ce modèle de dépression. Le porteur affirme n'avoir "pas d'autre alternative" pour la microvascularisation cérébrale ni pour modéliser la dépression.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’évaluer, par microscopie de localisation ultrasonore (ULM), la vascularisation cérébrale dans un modèle animal de dépression. Les animaux dépressifs proviennent d’une lignée consanguine de rat exprimant spontanément un caractère dépressif à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est d’améliorer la compréhension des mécanismes neurovasculaires liés à la dépression et de proposer des paramètres quantifiables (volume sanguin, vitesse des flux, nombre de vaisseaux, etc.) pour discriminer les animaux atteints et sains, ainsi qu’évaluer l’efficacité des traitements de la dépression.
Procédures
Interventions sur les animaux : - 3 injections intra-péritonéale d'un antidépresseur en 24h - Neurostimulation par ultrason (US) : 1 fois par jour pendant 5 jours ; durée journalière : 10 minutes. - Anesthésie gazeuse pendant l’imagerie par microscopie de localisation ulrasonore (ULM) et le neurostimulation (5x10 minutes neurostimulation + 1x15minutes ULM) - Craniotomie (1 fois, 15 minutes) - Euthanasie par décapitation sans réveil.
Impact sur les animaux
La contention nécessaire à l'induction de l'anesthésie rajoute un stress supplémentaire. Une douleur au point d'injection en intraveineuse de l'agent de contraste et au point d'injection en intra-péritonéale peut être ressentie et peut générer un hématome. Lors de la neurostimulation, il peut être observer un inconfort lié à l'utilisation d'un cadre stéréotaxique.
Devenir
Nous prélèverons les cerveaux pour des analyses histologiques. De ce fait, tous les animaux seront mis à mort à l’issu des manipulations d’imagerie cérébrale.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la vascularisation cérébrale. Au préalable de ce projet, des tests ont été pratiqués sur des dispositifs tubulaires mimants les petits vaisseaux. A ce stade de notre projet, nous n’avons pas d’autre alternative pour tester la microvascularisation cérébrale. De même, il n’existe pas d’alternative pour modéliser la dépression.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, lors de phase de mise au point, chaque animal pourra subir plusieurs fois l’étape d’imagerie de contraste. Ceci permettra de tester plusieurs concentrations (du moins concentré au plus concentré) d’agent de contraste et paramètres d’imagerie sans avoir recours à d’autres animaux et sans reprise de conscience de l’animal. Pour cette phase du projet, nous pensons que l’utilisation de 35 animaux est jugée suffisante pour atteindre l’objectif de cette procédure. De plus, nous ne jugeons pas utile de faire ces mises au point sur les deux sexes. Nous utiliserons donc que des rats mâles. Pour la 2ème étape du projet, nous souhaitons appréhender les différences de vascularisation entre des rats sains et des rats dépressifs. Nous pensons que l’utilisation de 64 animaux est suffisante pour atteindre cet objectif. Des tests stastitiques appropriés seront utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les rats seront hébergés par groupe social, de 2 à 4 par cage, en présence d'enrichissements comprenant un tunnel et/ou une cabane en carton ainsi qu'un bâton à ronger, papier absorbant. Toutes les stratégies d'analgésie et d'anesthésie et de soins seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être observés lors de leur hébergement avant la procèdure d’imagerie.
Choix des espèces
Le rat semble l’espèce la plus adaptée pour cette étude. La taille de la boite cranienne est suffisante pour procéder à l’amincissement de crâne. De plus, il existe un modèle de rats dépressif utilisable pour ce projet . La dépression est souvent une pathologie de l’adulte. Nous aurons donc recours à des rats adultes de 8 semaines.
Effet de l’inhibition de CCL2 et de YAP sur le développement et la progression de la polyarthrite rhumatoïde chez le rat Lewis
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
168 rates Lewis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une arthrite est déclenchée par adjuvant, puis des composés sont injectés chaque jour sous la peau, dans le péritoine et directement dans l'articulation, l'arthrite provoquant un gonflement des chevilles, une douleur des pattes arrière et une immobilité des deux à trois derniers jours. Le porteur prévoit une prise en charge de la douleur et une mise à mort au-delà d'un score seuil, seuil qui déclenche l'euthanasie des animaux les plus atteints. Il justifie le recours au rat plutôt qu'à la souris par sa "plus grande taille" et affirme qu'une étude sur un "organisme entier" est nécessaire.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de déterminer si l’inhibition combinée de deux protéines impliquées dans la polyarthrite rhumatoïde prévient le développement de cette maladie dans le modèle d'arthrite induite par adjuvant. L’objectif secondaire est de comparer plusieurs modes d'administration afin d’établir la combinaison thérapeutique la plus efficace pour prévenir le développement de l’arthrite.
Bénéfices attendus
Si les objectifs sont atteints, la combinaison thérapeutique la plus efficace pourra être ensuite testée en clinique chez l'Homme dans le but d'améliorer la prise en charge des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde.
Procédures
Trois types d'injections sont prévues : une injection sous-cutanée (durée : 30 secondes), une injection intrapéritonéale (durée : 30 secondes) par jour pendant 14 jours, et une injection intra-articulaire (durée : 30 secondes) par jour pendant 4 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux développent l'arthrite pendant une période de 7 jours. Le développement de l’arthrite est caractérisé par un gonflement et un érythème au niveau des chevilles, engendrant une douleur au niveau des pattes arrière et diminuant ainsi la mobilité des animaux. Une immobilité des pattes arrière est généralement observée durant les 2 à 3 derniers jours. Les animaux étant en croissance, un gain de poids reste présent durant le protocole, mais de façon moins importante que chez des rats sains. En revanche, le développement de l'arthrite n'impacte pas le comportement social des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires sur les différents tissus et organes.
Remplacement
Des études in vitro ont permis d’identifier les deux protéines ciblées. Mais une étude in vivo est nécessaire afin d’observer l’effet de l’inhibition de ces deux molécules sur un organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été choisi en accord avec le pourcentage des variations observées dans les mesures des paramètres biologiques, et pour réaliser une étude statistique solide. Le nombre d'animaux à utiliser est dépendant des résultats qui seront obtenus à la suite des différents protocoles décrits. Le nombre minimum d'animaux à utiliser est de 72, et le nombre maximal est de 168.
Raffinement
L’arthrite étant invalidante pour l’animal, les moyens d’accès à la nourriture et à l’eau ont été adaptés. La nourriture est directement déposée dans la cage et les tétines sont plus longues pour faciliter l'accès à l'eau. La douleur sera prise en charge par une administration de néfopam dans l'eau de boisson. La dose de nefopam administrée sera adaptée en fonction du score de douleur de l'animal. Un contrôle de la douleur sera réalisé en fonction de la grille de cotation détaillée en annexe. L'atteinte d’un score supérieur à 8 engendrera une mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle d’arthrite par adjuvant chez le rat est un modèle robuste. Le rat est préféré à la souris en raison de sa plus grande taille, qui permet de visualiser le gonflement articulaire, des volumes injectables et percevables supérieurs. Le modèle d’arthrite induite par adjuvant nécessite l’utilisation de rats femelles d’environ 100g. Ces animaux auront 5-6 semaines et seront donc sevrés.
Effet de la crise de migraine induite par des donneurs de monoxyde d’azote sur la dépression corticale envahissante chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Ils reçoivent des injections de donneurs de monoxyde d'azote censés reproduire la migraine, subissent un test comportemental de sensibilité faciale au filament de von Frey, puis des enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie profonde sans réveil après application de chlorure de potassium. Le porteur indique comme seul effet attendu une allodynie faciale et reconnaît que le modèle ne reproduit pas tous les aspects de la migraine. Il affirme qu'un "animal entier avec un système nerveux intégré" est un préalable et juge les méthodes in silico "trop primaires".
Objectifs
L’isosorbide dinitrate (ISDN) et la nitroglycérine (NTG), sont des donneurs de monoxyde d’azote (NO). Ils sont utilisés comme modèles de migraine chez les rongeurs en raison de leur capacité à induire des céphalées chez les humains. Cependant, il est important de noter que ces modèles ne reproduisent pas tous les aspects de la migraine, notamment la manifestation d'aura ? De plus, leur utilisation doit être combinée à d'autres modèles pour obtenir une compréhension complète de la pathologie de la migraine. Le chlorure de potassium (KCl) est utilisé comme modèle pré-clinique de dépression corticale envahissante (CSD) dans la migraine avec aura car il est capable de déclencher une décharge électrique similaire à celle qui se produit dans le cerveau lors d'une crise de migraine. En utilisant ce modèle, en combinaison avec l’ISDN ou le NTG, nous pourrons étudier les mécanismes sous-jacents de la CSD et de la migraine, ainsi que tester de nouveaux traitements potentiels. L'objectif est d'évaluer la faculté de deux donneurs de NO à altérer le seuil de déclenchement et le nombre des épisodes de CSD provoqués par application de concentrations croissantes de KCl au niveau cortical chez le rat anesthésié. La CSD est caractéristique des évènements survenant lors du déclenchement des crises de migraine et constitue dans la littérature un outil pour étudier la migraine avec aura.
Bénéfices attendus
A moyen terme, en combinant deux modèles de migraine chez les rongeurs (Isosorbide dinitrate+chlorure de potassium et Nitroglycérine+chlorure de potassium), ce projet a pour but d’améliorer les outils existants dans la recherche pré-clinique pour étudier la physiopathologie de la migraine avec aura. Si nous arrivons à identifier de nouveaux acteurs ainsi que leurs rôles, cela nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, ces études peuvent aider à développer de nouveaux traitements pour soulager les patients souffrant de migraine avec aura.
Procédures
Les interventions dans ce projet sont prévues sur une durée maximale de 2 semaines. 1/ Injections (intra péritonéales i.p.) sur des animaux vigiles (Maximum 4). Chaque animal reçoit au maximum 1 injection i.p. par jour (durée d’intervention : 1min). 2/ Réalisation des enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie générale profonde au 5ième jour (protocole ISDN), ou 8ième jour (protocole NTG). 3/ La sensibilité mécanique est mesurée par un test de von Frey qui consiste à appliquer sur la face du rat (zone périorbitaire) une gamme de filaments de von Frey, calibrés pour exercer une force (exprimée en grammes) constante. Les rats sont habitués à ce test durant les 5 jours. Ces mesures sont peu douloureuses (durée de stimulation 3 sec) puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement. Tous les jours, les rats seront soumis au test comportemental de von Frey et la force exercée qui entraine le retrait de la tête sera mesurée sur chaque rat, avant et après l’administration de saline, ISDN ou NTG.
Impact sur les animaux
Selon la littérature et notre expérience avec le modèle Isosorbide dinitrate et Nitroglycérine ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux autre que le développement d'une allodynie, surtout à niveau facial. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels comme manger et boire. Aucune nuisance ou effet indésirable est attendu après l’administration de chlorure de potassium car elle aura lieu chez l’animal anesthésié (procédure sans réveil).
Devenir
Impossibilité de récupérer les animaux du fait de la procédure effectuée et des risques irreversibles (infectieux traumatiques) en cas de réveil.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il n'existe pas dans la littérature aucune méthode alternative (in vitro ou in silico) pouvant répondre à l'efficacité d'un produit à potentiel thérapeutique antimigraineux. Un animal entier avec un système nerveux intégré, même sous anesthésie, est un préalable à une étude pertinente dans le domaine de la douleur. Une méthode in vitro ne pourrait rendre compte de la douleur car elle supprimerait de nombreux paramètres (régulations...) et rendrait le résultat réducteur voir inadapté. Des études électrophysiologiques chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence le déclenchement d'évènements de dépression corticale envahissante après l'application de chlorure de potassium. Les études in silico constituent dans le domaine de la migraine encore une étape encore trop primaire aujourd'hui.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum (n=10/groupe/sexe). Un seul groupe témoin sera utilisé (5 injections de saline). Le nombre d'animaux par groupe est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets (http://www.quantativeskills.com/sisa). D’après les données du laboratoire nous prévoyons une perte maximum de 20 % de rats (qui pourront être écartés de l'étude), en raison de l'instabilité ou de la perte en cours de manipulation in vivo des enregistrements électrophysiologiques (baisse très importante de la pression artérielle témoin d'un problème homéostasique, ou perte du signal de courants corticaux).
Raffinement
L’expérience des travaux précédents (Dallel et al., 2017) montre que suite aux injections uniques ou répétées d'ISDN le rat ne présente aucun trouble moteur ou postural affectant ses capacités à se déplacer, à satisfaire ses besoins physiologiques (alimentation hydratation...). L'allodynie ne se traduit pas par une fuite ou une agressivité lors de la manipulation pendant et en dehors des sessions de test de sensibilité mécanique. La prise de poids reste normale. Néanmoins, si au cours de l’expérimentation, nous observons que les animaux ont de grosses difficultés à se mouvoir, se toiletter, se relever pour se nourrir, ou un mauvais état de leur pelage, ils seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital (150 mg/kg). Pour l'enregistrement électrophysiologique, les expériences peuvent être interrompues par une mise à mort par overdose de pentobarbital iv, si les conditions physiologiques d'enregistrement ne sont plus assurées, suite à une altération durable et irréversible des paramètres cardiorespiratoires.
Choix des espèces
La souche Sprague Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires . C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 8-12 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire. Les différents études sur la migraine sont réalisées sur des animaux adultes. Cette pathologie est majoritaire chez les personnes adultes. Chez l'enfant, ses caractéristiques sont un peu différentes de l'adulte.
Etude des effets thérapeutiques lors du traitement par radiothérapie interne via l’utilisation de nanoparticules chargées au Rhénium-188 et d’un bio-implant dans le cas du glioblastome chez le rat (2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intracérébrale de cellules tumorales, la pose d'un implant biodégradable et selon les groupes une radiothérapie, avec un suivi IRM hebdomadaire et un transport de 95 kilomètres pour l'irradiation externe. Le porteur décrit fatigue, perte de poids et prostration possibles, et fait tuer tous les animaux pour éviter la souffrance liée à la croissance du glioblastome. Il juge le recours à deux modèles de rats "indispensable" pour obtenir des données transférables à la clinique.
Objectifs
Le développement de ce projet chez le rat permettra d'évaluer si l'attraction de cellules cancéreuses résiduelles dans un implant biodégradable en zone confinée (la cavité d'ablation de la tumeur dans le cerveau) apporte un bénéfice préclinique en synergie d'une radiothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements du fait de l'inclusion d'un acte de radiothérapie externe à distance du site principal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavité d'éxérèse dans le glioblastome en synergie d'irradiation pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) - la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h) - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h30) - l'association ou non à des radiothérapies (durée d'environ 30 minutes fractionnée en 2 ou 3 fois selon le type de radiothérapie). En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 3. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire. L'un des actes (radiothérapie externe) inclue un transport aller-retour d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.
Remplacement
La thématique de recherche de notre équipe concerne le développement d’approches thérapeutiques pour le traitement du glioblastome et l’étude des modalités de mise en place posant à la fois des questions fondamentales et des questions de biotechnologies pour la santé. Le projet ici proposé a pour but l’étude du piégeage tumoral au travers de bio-implants polymères pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes de piégeage (au travers d’un leurre environnemental) et celle d’élimination (au travers de l’application d’une procédure de radiothérapie interne vectorisée). L’utilisation de deux modèles pour valider ces procédures et obtenir des données interprétables par la suite valorisables par la publication et transférables à la clinique est indispensable pour répondre aux questions et livrables scientifiques indiqués dans le résumé non technique.
Réduction
En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur des cellules dissociées ainsi que des sphéroïdes ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Un groupe référence incluant la radiothérapie externe est introduit, toutefois sans modifier le nombre initial d'animaux prévus pour l'étude, tout en devant générer des données statistiquement interprétables.
Raffinement
Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Ce projet sera développé chez le rat, permettant des gradients d’infusion de chimio-attractant et des migrations cellulaires sur des volumes et distances plus importants que chez la souris. La possibilité d’utiliser deux types cellulaires dans deux types de rats est envisagée afin d’investiguer les réponses dans un cadre de xénogreffe d’une part et dans un cadre syngénique d’autre part (permettant d’étudier le rôle de l’immunité). En effet, nous avons validé des cellules humaines modifiées (de niveau sécuritaire 1) sur-exprimant le récepteur CXCR4, jouant un rôle dans les réponses aux radiations, et une protéine de fluorescence ; ce modèle sera utilisé chez le rat nude. Par ailleurs la lignée cellulaire F98 (modèle de GB de rat) sera utilisée chez le rat Fischer pour les études syngéniques. Les rats seront utilisés à 8 semaines car ils seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.
Méthode d’identification et de caractérisation génétique chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 1000
75 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est contenu quelques secondes pour un tatouage et une biopsie d'oreille destinée au génotypage, sous isoflurane au-delà de quatorze jours. Le porteur réutilise environ 1 100 animaux pour d'autres projets ou pour la formation, et fait tuer les autres, notamment les génotypes non souhaités et les animaux d'élevage trop âgés. Il caractérise génétiquement quatre-vingts lignées de son animalerie et affirme qu'identifier les individus est "nécessaire" à leur utilisation scientifique.
Objectifs
L'objectif est de caractériser génétiquement les 80 lignées de notre animalerie pour gérer nos élevages et être utilisés dans des projets scientifiques (ex: identifier des biomarqueurs de l'hypoxie, étudier des gènes de l'infertilité, étude de l'arthrite, étude de cancérologie pour trouver et mettre au point des traitements, ...).
Bénéfices attendus
Notre établissement utilise en routine pour l'élevage des lignées génétiquement altérées: l'identification par tatouage des phalanges et la biopsie d'oreille pour le génotypage. Ce projet permettra de caractériser génétiquement les 80 lignées de notre élevage de souris et rats génétiquement altérées nécessaires à différents projets de recherche.
Procédures
L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Impact sur les animaux
La contention pouvant engendrer un stress et des douleurs légères au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d'oreille), nous serons vigilant à effectuer cette méthode d 'identification de façon rapide et avec précision. L’anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux agés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés. Le geste sera réalisé par du personnel dûment formé ayant suivi un tutorat relatif à ce geste technique.
Devenir
Mise à mort des animaux pour les génotypes non souhaités, les animaux d'élevage trop âgés, les animaux au cours de leur élevage fin d'éviter des situations de souffrance. Gardés en vie pour une utilisation continue pour l'élevage ou vers les projets prévus pour ces animaux et réutilisation vers les projets non prévues pour ces animaux pour la formation.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs à des fins scientifiques nécessite de pouvoir identifier les individus et de les caractériser d’un point de vue génétique le cas échéant. L’identification permet de repérer un animal parmi ses congénères et de le suivre tout au long de sa vie expérimentale. En plus de cette identification, une caractérisation génétique moléculaire est nécessaire lorsque l’on utilise des lignées de rongeurs génétiquement modifiées afin de s’assurer de la présence ou de l’absence d’une mutation d’intérêt dans leur génome ou pour suivre une sélection sur marqueurs génétiques par exemple. De plus ,il n'est pas possible dans le cadre de l'expérimentation des chercheurs de la plateforme de remplacer le modèle animal par un autre (in vitro, in silico,..)
Réduction
Une caractérisation génétique moléculaire est nécessaire lorsque l’on utilise des lignées de rongeurs génétiquement modifiées afin de s’assurer de la présence ou de l’absence d’une mutation d’intérêt dans leur génome ou pour suivre une sélection sur marqueurs génétiques par exemple. Seuls les animaux ayant besoin d'etre génotypés subiront une biopsie d 'oreille , les autres seront identifiés uniquement par technique du tatouage aux phalanges. La gestion des élevages se fait de façon raisonnée afin d'éviter au maximum la génération d'animaux surnéméraires non utilisés par la suite dans les expérimentations.
Raffinement
Le geste technique sera réalisé rapidement à l'extrémité de l'oreille ,afin de réduire supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse nous pratiquerons une anesthésie gazeuse par inhalation d'isoflurane lors du tatouage et de la biopsie de tissu pour les animaux agés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de produire et d'identifier des lignées de souris et rats génétiquement modifiées par croisement et ceci afin de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche des instituts comme par exemple en oncologie, sur les maladies neurodégénératives , sur des pathologies de la grossesse ou sur des modèles de différentes pathologies touchant les organes. Les animaux seront identifiés à partir du 5ème jours jusqu'au 14ème jour, au dela la biopsie et l'identification par tatouage pourra se faire uniquement sous anesthésie volatile à l'isoflurane.
Enregistrement de neurones spinaux pour le criblage de candidats médicaments antalgiques contre la migraine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent cinq injections d'un produit déclencheur de migraine, puis leurs neurones spinaux sont enregistrés sous anesthésie profonde, ce qui ne permet pas de les garder en vie. Le porteur décrit ces injections comme "brèves et indolores" et l'allodynie comme modérée, tout en classant la procédure en sévère du fait de la répétition des injections. Il cherche à cribler des candidats médicaments antalgiques contre la migraine.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en place, valider, et utiliser un modèle de migraine expérimentale chez le rat pour tester des candidats médicaments anti-migraineux. Ce modèle est basé sur la mesure électrophysiologique de l’activité des neurones innervant la face et impliqués dans la génération de la sensation douloureuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester l’efficacité de candidats médicaments anti-migraineux sur des bases électrophysiologiques. Ainsi, il permettra de préciser le mode d’action des candidats médicaments, et d’avoir une meilleure évaluation de leur efficacité comparée à celle apportée par les tests comportementaux habituellement utilisés.
Procédures
Les animaux vigiles reçoivent 5 injections (1 jour sur 2) contenant un produit qui est connu pour pouvoir générer des migraines chez l’homme jusqu'au jour précédant la mesure électrophysiologiques. Les injections sont brèves et indolores.
Impact sur les animaux
L’injection i.p. du produit qui est connu pour pouvoir générer des migraines chez l’homme induit un stress très bref 1) due à la contention de l’animale et 2) une douleur très brève et modérée due à la pénétration de l’aiguille. En pratique, une injection correctement exécutée n’induit aucun reflexe défensif chez l’animal. L’état d’allodynie est modéré car d’après la littérature, les animaux traités ne présentent aucun signe comportemental de douleur spontanée. Cependant, la répétition des injections justifient une classification sévère.
Devenir
Les mesures électrophysiologiques sont invasives (elles se pratiquent sous anesthésie profonde) et ne permettent pas de garder les animaux en vie à la suite de l’expérience.
Remplacement
L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité d’analgésiques/antalgiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes physiopathologiques comme les mécanismes d'action des candidats-médicaments sont des processus complexe impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit par 3 actions conjointes : 1) le soin apporté à chaque expérience, conjugué à plus de 10 ans de pratique dans le domaine (une spécialisation extrême est indispensable à l’obtention d’un taux de succès élevé); 2) le ciblage d’une population de neurone bien définie (neurones spinoparabrachiaux soit de la couche I, soit des couches III-V), qui permet de réduire les variations expérimentales liées aux caractéristiques individuelles des neurones enregistrés; 3) une approche par étape, avec des lectures intermédiaires des résultats, afin d’arrêter rapidement les plans d’expériences improductifs.
Raffinement
Les approches physiologiques chez l’animal anesthésié permettent un certain nombre de raffinements. Premièrement, la mesure de l'activité des neurones spinaux se fait chez l'animal anesthésié et permet de pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments sur la réponse à des stimuli très nociceptifs sans aucune souffrance pour l'animal (impossible chez un animal vigile). Deuxièmement, plusieurs doses de candidat médicaments peuvent être testées chez un même animal dans la même expérience, et il est possible de faire des prélèvements sanguins au cours de l’expérience (chez le rat) pour corréler l’exposition plasmatique aux effets observés. Troisièmement, le nombre d'animaux utilisés est réduit par le fait que chaque animal est son propre contrôle (principe des mesures répétées). Enfin, la mesure concomitante des paramètres cardiovasculaires apportent des renseignements connexes essentiels sur les caractéristiques du candidats médicaments.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce, ici le rat, dépend des données déjà acquises sur le candidat médicament à tester, et sur le développement de la recherche dans le domaine de la migraine. L’ensemble des mesures électrophysiologiques dans ce domaine s’est fait chez le rat.
Evaluation in vivo des propriétés d’anti-adhérences postopératoires de polymères à visée thérapeutique chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
548 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque rat subit sous anesthésie une section du nerf sciatique ou du tendon d'Achille suivie d'une réparation, opération qui limite la mobilité de la patte. Le porteur indique que des automutilations et des abrasions du talon sont attendues et liées au modèle. Il teste des polymères anti-adhérences post-opératoires et affirme que les modèles ex vivo ne reproduisent pas les propriétés des "organes entiers".
Objectifs
La surface des tissus internes et des organes est naturellement structurée de façon à ce que les tissus n’adhèrent pas les uns aux autres. Lors d’une chirurgie ou d’une blessure, le traumatisme généré aux tissus va induire une réaction inflammatoire qui peut causer la formation d’adhérences anormales. Ces adhérences post-opératoires sont très fréquentes et sont observées dans plusieurs types de chirurgies : abdominales (90 pour cent de patients concernés), gynécologiques (60-90 pour cent), du tendon (30-40 pour cent), cardiaques (20 pour cent). Elles ont des conséquences délétères sur la qualité de vie du patient à court et long terme : elles limitent la mobilité des tissus concernés, peuvent engendrer de la douleur, voire des paralysies et des anomalies fonctionnelles (obstructions, occlusions, infertilité…). Bien que les techniques de chirurgie aient beaucoup évolué pour rendre la procédure moins traumatisante pour les tissus, les adhérences post-opératoires concernent globalement 1 patient sur 3. Le traitement des adhérences post-opératoires est lourd puisqu’il nécessite une nouvelle intervention chirurgicale ce qui, en plus de l’impact direct sur le patient, entraine des coûts importants pour les systèmes de santé et la société en raison des hospitalisations répétées et de la prise en charge des complications. Prévenir les adhérences post-opératoires est donc un véritable enjeu de santé publique et répond à un réel besoin clinique exprimé par les chirurgiens. Notre objectif est de développer des systèmes de réparation atraumatiques, sans sutures ni agrafes, qui pourront être utilisés dans la réparation de tissus. Des dispositifs sous forme d’implants et de colles chirurgicales sont développés pour différentes applications de la réparation des nerfs périphériques aux hernies abdominales. Les formulations d’adhésifs et d’implants développées à ce jour ont démontré une efficacité pour restaurer la fonction de certains tissus avec une bonne biocompatibilité. L’objectif de la présente étude est maintenant de déterminer si nos systèmes de réparation peuvent également être efficaces dans la prévention des adhérences post-opératoires. Nous nous focaliserons sur des modèles, de réparation du tendon et du nerf sciatique.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de démontrer dans deux modèles précliniques différents un impact positif de nos systèmes de réparation sur la survenue des adhérences post-opératoires. Nos produits pourront ainsi fournir une solution aux chirurgiens dans la prévention de ces adhérences combinée à une réparation atraumatique et efficace des tissus déjà démontrée.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie unique d’une durée de 30 minutes environ de lésion/réparation du nerf sciatique ou du tendon d’Achille effectuée sous anesthésie générale et locale ainsi qu’une prise en charge de la douleur pré et postopératoire. A la fin de la période de maintien prévue, ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Les procédures nécessitent un geste chirurgical réalisé sous anesthésie générale. L’anesthésie est associée à un risque d’hypothermie et d’assèchement de la cornée. La procédure va engendrer une léthargie et une douleur transitoires pouvant être à l’origine d’une perte de poids post-opératoire. Les modèles vont nécessiter une transection du nerf sciatique ou du tendon d’Achille ce qui va limiter la mobilité des animaux au niveau de la patte opérée. Des automutilations et des abrasions du talon sont attendues et sont liées aux modèles.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure pour des analyses post-mortem destinées à évaluer les adhérences post-opératoires.
Remplacement
De nombreux tests ont été réalisés ex vivo et in vitro pour obtenir un maximum de données préliminaires et sélectionner les systèmes les plus prometteurs pour une utilisation in vivo. Malheureusement, ces études ne peuvent pas suffire car ces modèles ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Le présent projet in vivo consiste à caractériser l’impact de nos systèmes de réparation sur la survenue d’adhérences post-opératoires ou suite à une blessure. Il s’agit d’un mécanisme complexe faisant intervenir différents systèmes biologiques et qui nécessite de travailler sur un organisme intégré et autonome.
Réduction
Au maximum, 548 rats seront intégrés dans l’étude. Nos systèmes de réparation ont subi une batterie de tests préalables. Seuls les systèmes les plus prometteurs ont été sélectionnés pour un passage sur l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. La taille des groupes expérimentaux a été définie à l’aide d’un test statistique de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en utilisant le moins d’animaux possible (n=10 animaux exploitables par groupe). Une étape préliminaire de formation des opérateurs au geste chirurgical est prévue dans l’étude sur un nombre limité d’animaux (n=20). Les résultats seront également analysés par un test statistique.
Raffinement
Les rats seront hébergés en cages individuellement ventilées, à raison de 2 rats par cage, en milieu enrichi par des tunnels et des balles en bois. La température et l’hygrométrie seront contrôlées. Les rongeurs disposeront à volonté d’eau et d’aliments. Une période de stabulation réglementaire minimale d’une semaine sera respectée entre l’arrivée des animaux et le début de la procédure pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement et ainsi de limiter leur stress. Une étape de socialisation sera mise en place pour habituer les rats à la préhension et réduire leur stress avant la procédure. La totalité des gestes expérimentaux sera pratiquée par du personnel qualifié. Tous les actes techniques seront réalisés avec une anesthésie et/ou une analgésie adaptée à la nature et à la durée du geste. Une pesée des animaux sera réalisée 1 fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour évaluer la récupération de l’animal. Si nécessaire, un complément gélifié et/ou des granules humidifiées seront déposés directement dans le fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire (1 pot/cage). Des graines de tournesol seront également ajoutées à l’alimentation usuelle pour diversifier l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement et pesés 1 fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie puis 1 fois par semaine. Une grille de score va nous permettre d’évaluer de façon objective l’état de l’animal et de prendre les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance par la mise en place de points limites.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour des protocoles de chirurgie. De plus, la taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison avec d’autres espèces mammifères telles que porc ou brebis. De plus, leur taille, comparée à celle de la souris, permet plus aisément de pratiquer un acte chirurgical fin. Enfin, la composition de la matrice extracellulaire des humains et des rongeurs est très similaire. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude (une période minimale d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations). Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. De plus, les animaux seront jeunes et auront donc une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement.
Formation aux procédures expérimentales
- Formation professionnelle
Rats : 300
Hamsters dorés : 75
Lapins : 30
Poissons zèbres : 210
4 715 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance de sans réveil à modéré. Environ 4 100 souris, 300 rats, 210 poissons zèbres, 75 hamsters dorés et 30 lapins servent à entraîner des expérimentateurs aux prélèvements, injections, gavages et actes chirurgicaux. Le porteur précise que les animaux sont tués pour apprendre aussi la mise à mort et le prélèvement d'organes. Il mobilise des animaux surnuméraires ou réutilisés, commence l'apprentissage sur des peluches et des cadavres, et qualifie le recours aux animaux vivants de "nécessaire" et "essentiel".
Objectifs
Les personnes souhaitant pratiquer des actes techniques ou de chirurgie sur les animaux de laboratoire doivent suivre une formation réglementaire selon l’arrêté du 1 er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques. Cette formation comprend différents modules imposés par la réglementation. Le nombre d’heures de pratique dans les formations réglementaires est insuffisant pour la bonne maitrise de ces gestes. La mise en place des formations continues et de travaux pratiques (TP) in vivo pour les expérimentateurs a pour but de bien les former afin qu’ils maitrisent les actes qu’ils vont appliquer dans leurs projets et de répondre aux exigences de la législation française qui impose de : Tenir à jour un tableau de suivi permettant de s’assurer que le personnel dispose d’un niveau d’études, de compétences et d’une formation continue adéquats et vérifier que l’adéquation entre les compétences et les missions est effective lors de la prise de poste afin de définir, le cas échéant, un programme de formation adaptée à la personne et à la fonction exercée. La personne nominativement désignée pour cette tâche par le responsable de l’établissement tient à la disposition des agents de contrôle habilités tous les éléments permettant de vérifier que les compétences des personnels correspondent à la fonction exercée. Notre projet est donc éducatif. Il s’agit d’accompagner et de suivre les expérimentateurs pour des actes techniques et chirurgicaux : - préhension, contention, et manipulation, adaptées aux différentes procédures de routine ; - marquage individuel ; - administration et prélèvements de routine ; - anesthésie fixe et gazeuse ; - asepsie ; - mise à mort ; - actes chirurgicaux : sutures, vagotomie, prélèvement d’organes (thyroïdectomie, splénectomie…), ischémie rénale, cathéterisation…sur des animaux anesthésiés.
Bénéfices attendus
La mise en place des formations continues et de travaux pratiques (TP) in vivo pour les expérimentateurs a pour but de bien les former afin qu’ils maitrisent les actes qu’ils vont appliquer et le suivi des animaux dans leurs projets et de répondre aux exigences de la législation française. En matière de 3R, le bon apprentissage de ces techniques permettra de réduire les échecs des futurs expérimentateurs dans leurs projets et par conséquent le nombre d’animaux utilisés. Il permettra également l’amélioration de raffinement pour les différents gestes appliqués sur les animaux.
Procédures
Prise de sang sur animaux vigiles ou anesthésiés, quelques secondes, une fois. Administrations : intra-péritonéales, intra-musculaire, sous-cutanée, intra-dermique sur animaux vigiles ou anesthésiés, quelques secondes, une fois. Administrations : intra-veineuse sur animaux anesthésiés (rétro-orbitaire) ou vigiles (veine caudale), quelques secondes. Administrations : nasales, intra-trachéales, intrathécales, interosseuses sur animaux anesthésiés, quelques secondes, une fois. Gavage sur animaux vigiles, quelques secondes, une fois. Acte chirurgical, 30 à 60 min selon le geste, une fois
Impact sur les animaux
Ce projet inclut des actes chirurgicaux occasionnant des douleurs et un inconfort modéré. Ces actes seront réalisés sous anesthésie gazeuse/injectable et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en post-opératoire par le vétérinaire formateur afin d’éviter/minimiser la douleur et l’inconfort. Les différents actes d’administrations et de prélèvements n’occasionnent qu’une douleur, une souffrance ou une angoisse légère de courte durée ainsi que celles sans incidence significative sur le bien-être ou l'état général des animaux. Une partie de ces gestes sont réalisés sur des animaux anesthésiés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont utilisés pour la formation à la mise à mort et à la réalisation de prélèvement d'organes.
Remplacement
Dans ce projet l’utilisation d’animaux est nécessaire pour permettre aux expérimentateurs le bon apprentissage des techniques appliquées sur les animaux en conditions réelles. Cela permet d’éviter par la suite de nombreuses erreurs qui peuvent se faire parfois au détriment du bien-être animal. Il est donc essentiel que la formation à cette méthode implique des animaux vivants en plus des autres méthodes alternatives. L’apprentissage commence par l’utilisation des peluches et des cadavres.
Réduction
Ce projet utilisera des animaux surnuméraires d'une activité d'élevage ou des animaux réutilisés d’autres projets. Le nombre d’animaux utilisés est minimisé par la possibilité d’appliquer deux ou 3 gestes légers sur le même animal. Le nombre d’animaux a été déterminé selon le nombre de personnes à former. Plusieurs sessions de travaux pratiques sur souris, rats, poisson zèbres, hamsters et lapins seront organisées par an, chaque session accueille en moyenne 5-10 participants En général, 1 animal est prévu pour la démonstration et 4 souris, 2 rats, 4 poissons zèbres, 1 hamster et 1 lapin par participant sont prévus pour chaque session.
Raffinement
La procédure expérimentale modérée de ce projet implique une anesthésie, une analgésie, un suivi quotidien des animaux, et des points limites précoces et spécifiques liés à l’acte chirurgical ainsi que les actions à mettre en place pour chaque point limite.
Choix des espèces
L’utilisation de souris s’impose pour former à la pratique de procédures expérimentales sur souris qui est l'espèce la plus utilisée dans l'établissement utilisateur. Certaines procédures ne sont applicables que sur les rats, hamsters, lapins et poissons zèbres d’où la nécessité d’utiliser ces espèces. Souriceaux et adultes pour les souris et adultes pour les autres espèces correspondant aux animaux utilisés classiquement lors des procédures expérimentales
Validation biologique chez le rat d’une sonde intracérébrale de détection radioactive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Quinze d'entre eux sont opérés puis tués sans reprise de conscience, les trente autres sont réveillés puis reçoivent des injections de produits radioactifs et des acquisitions répétées. Chaque implantation de sonde intracérébrale dure jusqu'à deux heures, et le porteur indique qu'elle peut provoquer une hémorragie cérébrale, une hypothermie et une douleur, les rats réveillés étant isolés à cause du dispositif fixé sur leur tête. Il cherche à valider une nouvelle sonde de détection radioactive et qualifie le passage in vivo de "nécessaire" après des essais sur des crânes imprimés en 3D.
Objectifs
En neurosciences, la Tomographie par Émissions de Positons (TEP) est une modalité d’imagerie majeure pour étudier les processus cérébraux in vivo, comme les mécanismes de communication des neurones ou l'occupation des récepteurs, grâce aux émissions produites par un produit radioactif injecté au préalable. Par son caractère non invasif, elle permet de réaliser des études longitudinales chez l’animal dans différentes conditions et à différents temps. Cependant, les acquisitions TEP nécessitent une anesthésie ou une contention importante pour maintenir le rongeur dans une position fixe afin d’assurer une bonne qualité d’image. Ainsi, il n’est pas envisageable de combiner cette technique d’imagerie avec des études comportementales sur animaux éveillés. Les sondes intracérébrales apparaissent alors comme un outil complémentaire pour explorer la distribution des produits radioactifs injectés. Elles peuvent être implantées dans des régions cérébrales cibles et permettre l'enregistrement local de cinétiques radioactives. Une fois la sonde implantée, il est alors possible d’étudier l’animal éveillé et de répéter des mesures, sur plusieurs jours, en les associant à des tâches comportementales. Les premiers modèles de sondes étaient très simplifiés, ce qui limitait la qualité de l’information spatiale fournie, et très fins, ce qui les rendait fragiles et difficiles à manipuler. Fort de ces observations, ce nouveau projet a pour objectif de développer, de produire et de tester, in vivo chez le rat, de nouvelles sondes biocompatibles, plus résolues spatialement et plus robustes. Grâce à une liaison sans fil entre la sonde et le dispositif d’enregistrement, les animaux auront une liberté totale de mouvement et donc un stress moindre. L’objectif de ce projet est donc de valider biologiquement cette nouvelle sonde radiosensible avec différents produits radioactifs et cela en deux phases : une phase aiguë en réalisant des enregistrements comparés et simultanés sonde/TEP chez le rat anesthésié et une phase chronique chez le rat éveillé.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de valider une nouvelle sonde intracérébrale radiosensible dédiée à l’imagerie chez le rat. Cet outil de détection permettra des mesures locales de la concentration de molécules radiomarquées chez l’animal éveillé et libre de ses mouvements. Cette technique permettra de coupler des acquisitions de cinétiques radioactives chez l’animal vigile avec des études comportementales ou de répéter des acquisitions dans des conditions expérimentales différentes. Comparée à la TEP, cette sonde offrira une meilleure résolution spatiale (en fournissant des données locales dans la zone cérébrale cible implantée) et une plus haute résolution temporelle.
Procédures
Tous les animaux du projet (45 rats) seront soumis à une chirurgie ayant pour but l'implantation de sondes de détection radioactive dans des régions cibles du cerveau (opération d'une durée de 1h30 à 2h s'il y a réalisation d'un chapeau de protection des cartes électroniques reliées aux sondes, étape nécessaire quand il y a réveil de l'animal). Une partie des animaux (15 rats), aura, dans la foulée, un examen d'imagerie comprenant une acquisition couplée sonde/TEP d'une durée de 1h10 à 1h40 selon le produit radioactif injecté. L'autre partie des animaux (30 rats) sera réveillée à l'issue de la chirurgie et recevra, une semaine plus tard minimum, une injection de produit radioactif en vue d'acquérir des cinétiques et cela en condition vigile (durée : 1h10 à 1h40 selon le produit injecté). Cette acquisition sera répétée une semaine plus tard exactement dans les mêmes conditions.
Impact sur les animaux
Stress physique / thermique : Pour les chirurgies intracérébrales, les nuisances peuvent être l’apparition d’hémorragie intra-cérébrale ou d’une hypothermie. Douleur : À la suite de la chirurgie, les animaux peuvent présenter une douleur, une inflammation ou une mauvaise cicatrisation. Faim : Pour les acquisitions avec le glucose radioactif, les animaux devront être mis à jeun 4h avant l’injection, afin de minimiser les variations de métabolisme glucidique non spécifiques. Isolement : Pour la procédure chez l'animal vigile, un chapeau (poids du dispositif : 2 grammes) sera réalisé sur la tête de l’animal pour protéger les sondes implantées. La présence de ce chapeau, après le réveil de l’animal, représente également des nuisances, non seulement par l’encombrement sur la tête, mais aussi par le fait que cela nous oblige à isoler les rats afin d’éviter qu’ils se détruisent leur chapeau mutuellement. La cicatrisation peut également entraîner des grattages au niveau du scalp. Lors des acquisitions vigiles, les rats porteront un gilet où sera fixé le dispositif d’enregistrement et qui sera relié aux câbles de la sonde.
Devenir
A l’issue des expérimentations, les animaux seront mis à mort par injection d’euthanasiant après anesthésie gazeuse.
Remplacement
Plusieurs étapes préliminaires de validation de la sonde ont été effectuées avant le passage à l’animal. Pour contrôler la sonde, des tests électroniques et l’acquisition de cinétiques dans des solutions contenant de la radioactivité ont été faits en laboratoire. Parallèlement, afin de s’exercer à la chirurgie, des simulations d’implantations stéréotaxiques ont été faites avec des sondes fictives et sur des crânes de rat imprimés en 3D. Maintenant, l’étape suivante est le passage in vivo. Cette étape est nécessaire pour vérifier différents points. Tout d’abord, il faut s’assurer de la biocompatibilité des sondes lorsqu’elles sont implantées dans le tissu cérébral et tester leur résistance quand elles sont fixées et placées dans le chapeau sur la tête d’un rat qui va se déplacer dans sa cage ou lors de tests comportementaux. De plus, ces sondes permettent d’acquérir des cinétiques radioactives, c’est-à-dire la distribution tissulaire du radiotraceur dans l’organisme et nécessite donc une circulation sanguine ainsi que des processus actifs pour avoir une barrière hématoencéphalique active.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. Cependant, ce protocole est très exploratoire et il est donc difficile de définir un nombre d’animaux à partir de tests statistiques. Concernant les premières expérimentations, les acquisitions de cinétiques et de déplacement du produit radioactif i jecté seront réalisées chez le même animal, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Pour les expérimentations chez l’animal vigile, qui ne seront faites que si les cinétiques obtenues lors des premières expérimentations sont satisfaisantes, le nombre d’animaux a été fixé à 10 maximum, ce qui représente un nombre classique d’animaux pour des études d’imagerie.
Raffinement
En amont des chirurgies stéréotaxiques, les animaux recevront une unjection d'analgésique et / ou d'anti inflammatoire selon si l’animal est réveillé ou non en fin de chirurgie ainsi qu'une injection d'anesthésique local avant l’incision du scalp. Durant la chirurgie, les rats seront placés sur un tapis chauffant. Pour les expérimentations vigiles, les animaux seront opérés en début de semaine afin de mettre en place une observation étroite et quotidienne lors du réveil et les jours suivants, jusqu’à complète récupération (utilisation d’une grille de score). Des doses supplémentaires d'analgésique et d'anti inflammatoire seront pratiquées en fin de chirurgie et le lendemain matin. Afin d’éviter tout grattage de la cicatrice, les griffes seront coupées lors de l’anesthésie. La présence du chapeau fixé sur la tête (implant nécessaire pour protéger les cartes électroniques), nécessitera l’isolement des rats. Lors de cette période, l’enrichissement dans les cages sera renforcé et les cages placées côte à côte afin que les animaux gardent un contact (visuel, olfactif…) avec leurs congénères. Les animaux seront stabulés dans des cages à couvercle plat afin d’éviter qu’ils se heurtent ou s’accrochent avec leur chapeau.
Choix des espèces
Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies du système nerveux central et de nombreuses données précliniques existent pour cette espèce. Les animaux utilisés seront des animaux jeunes adultes, pesant au moins 250 grammes afin que la taille du cerveau soit compatible avec la résolution de la caméra micro-TEP préclinique (1,5 mm) et assez importante pour permettre l’implantation des sondes.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un inhibiteur des myosines rapides dans la dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme sévère de dystrophie musculaire de Duchenne, ils reçoivent par voie orale un inhibiteur des myosines rapides, subissent des prises de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie et des tests d'agrippement, avant d'être tués pour analyses des muscles. Le porteur affirme tester un modèle qui "mime fidèlement" la maladie de l'enfant et renvoie le bénéfice thérapeutique au "long terme". Il conclut que la question ne peut être obtenue que chez "l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire. En l'absence de la protéine dystrophine, les fibres musculaires sont affaiblies et fragiles, au point de rompre lors d’une contraction musculaire qui agit comme un stress mécanique. Cela conduit à des cycles répétitifs de régénération et de dégénérescence des fibres, accompagnés d'une inflammation chronique douloureuse et d’une perte permanente des fibres musculaires par épuisement de la capacité de réparation du muscle. L'objectif de notre étude est de stopper la progression de la maladie à l'aide de nouvelles molécules qui réduisent la mort des fibres musculaires. L'efficacité d’un composé similaire a déjà été démontrée sur un modèle de souris DMD, cependant moins sévères que notre modèle de rat. Ce projet permettra de valider chez le rat l'efficacité de trois nouveaux composés dans une situation qui ressemble beaucoup à celles des enfants atteints de DMD.
Bénéfices attendus
Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la DMD pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Nous proposons ici de tester des composés innovants qui via un mécanisme protecteur de la membrane des fibres musculaires, améliore la survie de l'ensemble des muscles et réduisent la douleur de l'inflammation causée par la disparition massive des fibres. Ces composés permettront sur le long terme d'accélérer la récupération motrice. Nous projetons ainsi d'identifier une piste innovante qui pourrait devenir un traitement utilisable chez l’enfant en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Procédures
Le traitement sera administré une seule fois par voie orale afin de maîtriser la dose administrée. Le geste dure 15 secondes. Le sang des animaux (1,7 ml au total) sera prélevé en deux fois au sinus rétro-orbitaire, sous anesthésie générale légère et locale. Le prélèvement dure 30 secondes, l'anesthésie complète environ 20 minutes. La durée d'une séquence de grip test est de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Il a été montré que les produits administrés ne sont pas toxiques jusqu’à une inhibition de 50% de l’activité des fibres musculaires rapides (qui confère leur protection contre la mort). Le dosage utilisé, inférieur, sera limité à 15% d’inhibition, ce qui garantit l‘absence de toxicité. La procédure de ce projet inclut des animaux de 4-5 semaines chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont très limitées et ne gênent l'exécution d'aucune de leurs tâches quotidiennes. Ils se déplacent, mangent, boivent, se toilettent et jouent comme leurs frères de portée non atteints par la maladie. L'administration du traitement par gavage utilisera une sonde plastique souple à bout arrondi qui supprime les perforations possibles de l'oesophage avec l'usage d'anciennes sondes métalliques. La contention pour ce geste, les prises de sang et le test d'agrippement est réalisée délicatement, ce qui élimine la réponse de stress de l'animal. Un effet indésirable du test d'agrippement est la cassure d'une griffe trop longue lors du saisissement de la barre, raison pour laquelle nous vérifions avant le test leur longueur et les raccourcissons si besoin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.
Remplacement
Ce qui a pu être testé de l'efficacité des composés sans l'usage d'animaux a été réalisé en amont de ce projet. Les composés que nous allons administrer engage leur cible biologique et réduisent la contraction des fibres musculaires rapides. Leur innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l'éventuelle toxicité du produit administré, mais aussi de tous les composés issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé testé permet-elle dans le modèle sévère de la maladie (le rat que nous utiliserons) de protéger suffisamment les muscles pour que cela confère un bénéfice fonctionnel quantifiable à l’échelle des muscles squelettiques, associée à une diminution également quantifiable des lésions musculaires délétère à l’échelle histologique.
Réduction
Notre laboratoire a cumulé de nombreuses données sur ce modèle de rats DMD. Les calculs de puissance statistique nous recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce que nous avons validé avec d'autres projets terminés. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Puis, nous utilisons une analyse statistique adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible ici de ne pas inclure d'animaux WT, sans perte d'information biologique de référence. Les molécules ont par ailleurs déjà été testées sur des rats sauvages.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage respecte l'alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les outils récents d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle de chien DMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Nous utiliserons des animaux à l'âge de 4 à 5 semaines. Notre étude de caractérisation ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 4-5 semaines permettra d’évaluer la capacité des composé testé à réduire l’endommagement musculaire et par conséquent, à différer l’installation progressive de la fibrose et ses conséquences fonctionnelles sur la musculature striée.
Toxicité d’aérosols de type « mélanges gaz/particules » d’intérêt défense : cas des résidus de combustions issus de propergols solides composites
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
782 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils sont exposés par inhalation "nez seul" pendant quatre heures à du chlorure d'hydrogène et des particules d'alumine, subissent aspirations oropharyngées, instillations intratrachéales, gavages, jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang, des tests d'anxiété et de mémoire, une trachéotomie puis une perfusion intracardiaque. Le projet vise à définir des valeurs limites d'exposition pour les personnels du Ministère des Armées et du secteur aérospatial soumis aux résidus de combustion des missiles. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives" et que les études in vivo sont "indispensables", ne retenant que des mâles au motif qu'aucune donnée féminine n'est disponible.
Objectifs
Avec l’émergence de nouveaux systèmes d’armes, le cumul des expositions des personnels du Ministère des Armées devient de plus en plus complexe, et ces derniers peuvent de fait être exposés à des mélanges de polluants au cours de leur carrière. C’est notamment le cas lors de l’utilisation de propulseurs tels que les propergols solides composites nécessaires à la mise à feu rapide de missiles où les personnels peuvent être exposés simultanément à du chlorure d’hydrogène et des particules d’alumines par inhalation. Seule une étude sur les effets de ce type d’exposition a montré des phénomènes d’inflammation pulmonaires et systémiques précoces. L’objectif de ce projet est de poursuivre cette évaluation, en déterminant notamment si l’inflammation observée à court terme est persistante et si ces expositions impliquent d’autres types d’effets. Les résultats de ce projet devraient permettre de contribuer à définir des valeurs seuils chez les travailleurs du Ministère des Armées et du secteur aérospatial (valeurs limites d’exposition professionnelles) susceptibles d’être exposés à ce type de substances dans leur environnement professionnel, d’établir de nouvelles recommandations et d’identifier des biomarqueurs à analyser pour un meilleur suivi médical (examens pulmonaires, prises de sang, tests cognitifs, etc.).
Bénéfices attendus
Les études réalisées dans le cadre de ce projet permettront : - De déterminer les effets à long terme de l’exposition aiguë et subaiguë à des mélanges de chlorure d’hydrogène et de particules d’alumine (fibrose pulmonaire, atteintes cognitives, pathologies neurodégénératives, génotoxicité, etc.) ; - D’obtenir des informations sur les mécanismes d’action toxiques induits par ce type d’exposition ; - De comparer les données in et ex vivo obtenues à des données d’études in vitro réalisées en parallèle, et de définir si les modèles in vitro testés permettent une bonne prédictivité de la toxicité de ces substances/mélanges ; - De fournir des données contribuant à l’établissement de valeurs limites d’exposition professionnelles et de préconisations pour le suivi des personnels du Ministère des Armées par la médecine de prévention.
Procédures
Identification (moins de 5 min) : 1 fois ; anesthésie, perçage d’une oreille à l’aide d’une pince et tatouage en utilisant une encre dédiée (animaux stabulés plus d’un 1 mois). Observations cliniques et pesées (moins de 5 min) : au moins 2 fois/semaine, au maximum tous les jours. Aspiration oropharyngée (moins de 10 min/exposition) : 5 aspirations (jour 1, 2, 3, 6 et 7) ; anesthésie, manipulations pour exposition et exposition à la solution d’essai par aspiration oropharyngée. Instillation intratrachéale (moins de 10 min/exposition) : 5 instillations (jour 1, 2, 3, 6 et 7) ; anesthésie, manipulations pour exposition et exposition à la solution d’essai par instillation intratrachéale. Exposition par inhalation en mode "nez seul" : 1, 4 (1 exposition/jour/4 jours consécutifs) ou entre 16 et 24 expositions (1 exposition/semaine/4 à 6 mois) ; habituation à la contention des tubes d’exposition (stabulation dans les tubes jusqu’à 30 min/jour/3 jours consécutifs), exposition aux substances/mélanges d’essai (4h/exposition). Gavage (moins de 3 min/administration) : 1 à 3 gavages (jour 1, jour 1+24h et jour 1+45h) ; contention manuelle des animaux vigiles, gavage avec la solution d’essai. Prélèvements de sang (moins de 5 min/prélèvement) : 1 à 25 prélèvements (2 prélèvements/semaine/12 mois) ; contention manuelle des animaux vigiles, manipulations et prélèvement d’une goutte de sang. Comportement (15 min à 1h15/évaluation suivant les tests) : 3 ou 4 fois (1, 3, 6 et pour certains animaux 12 mois après la dernière exposition) ; placement des animaux vigiles dans des dispositifs de mesure de l’activité, de l’anxiété et des capacités de mémorisation, et enregistrement de leurs déplacements. Pléthysmographie (moins de 1h15/évaluation) : 2 à 48 fois (1 évaluation/semaine ou par mois/2 semaines à 12 mois) ; placement des animaux vigiles dans des enceintes de pléthysmographie corps entier et enregistrement de paramètres respiratoires. Mécanique pulmonaire (moins de 45 min) : 1 fois préalablement à la fin de l’étude ; administration d’un antalgique, anesthésie, acte chirurgical (trachéotomie), administration d’un myorelaxant et mesure de la mécanique pulmonaire. Perfusion intracardiaque/exsanguination (moins de 45 min) : 1 fois en fin d’étude ; administration d’un antalgique, anesthésie, actes chirurgicaux (laparotomie et thoracotomie) et perfusion avec du tampon phosphate salin.
Impact sur les animaux
Tatouage : stress lié à l’anesthésie ; Aspiration o.p. : stress lié à l’anesthésie ; Instillation i.t. : stress lié à l’anesthésie ; Exposition par inhalation en mode "nez seul" : stress lié à la manipulation et à la contention du placement dans les tubes, à l'immobilisation, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; Gavage : stress lié au gavage et à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser ; Prélèvements de sang : stress lié à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser ; Analyse comportementale/pléthysmographie : Stress lié à la manipulation et au placement dans les dispositifs de test, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront notamment les expositions/administrations des substances/mélanges d’essai. Les expositions/administrations de substances/mélanges d’essai pourront également induire des effets locaux et systémiques susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, les muqueuses et la physiologie, pourront être observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort aux temps de fin d'étude définis en fonction des analyses ex vivo prévues selon une méthode autorisée chez le rat.
Remplacement
Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives à l’expérimentation animale qui permettent seules de déterminer la toxicité aiguë et subaiguë de l’exposition par inhalation à du chlorure d’hydrogène et des particules d’alumines, seuls et en mélange, notamment des effets cliniques, pulmonaires, cognitifs et systémiques immédiats, et à court et à long terme. Les études in vivo sont pour cette évaluation indispensables. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’étude des effets respiratoires d’utilisation du rat, de souche couramment utilisée en laboratoire, au stade jeune adulte au moment de l’exposition aux substances/mélanges d’essai et de mâles. L’âge et le sexe des animaux utilisé a été défini comme étant représentatifs de la population humaine cible de ce projet. Seuls des mâles seront utilisés car il n’est pas attendu de variations significatives entre les deux sexes concernant les paramètres qui seront analysés, que le sexe n’est pas un facteur d’intérêt dans ce projet et que des données étant actuellement uniquement disponibles chez des mâles, seule l’étude de ce sexe sera pertinente pour la confrontation des données.
Réduction
Le nombre d’animaux qui sera utilisé a été déterminé sur la base de l’effectif minimum nécessaire pour mettre au point et valider un protocole de développement de fibrose pulmonaire, un protocole d’induction de génotoxicité et évaluer la toxicité de l’exposition aux substances/mélanges d’essai chez le rat. Il a été établi à partir des données bibliographiques disponibles sur l’induction de ces modèles pathologiques et par rapport aux paramètres in vivo (fonctions respiratoires, mécanique pulmonaire, fonctions cognitives) et ex vivo (biodistribution de l’alumine, marqueurs histologiques et biochimiques de toxicité et de génotoxicité) qui seront étudiés pour permettre une analyse statistique robuste et une extrapolation inter-espèces pertinente des résultats. Des tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution seront utilisés pour les comparer et ainsi évaluer les effets de l’exposition aux substances/mélanges d’essai. De plus, plusieurs paramètres seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront adaptées aux rats et enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés à plusieurs par groupe expérimental (2 ou 3 animaux par cage) pour leur socialisation. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Pour les animaux exposés par inhalation « nez seul », des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour leur permettre de se familiariser avec ces objets et de se cacher. Préalablement à la 1ère exposition, ces animaux seront habitués à la contention imposée par le placement dans les tubes en y étant stabulés jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Les tubes seront tapissés de matériaux absorbants pour assurer le confort des animaux. Après chaque phase d’habituation, de la nourriture sera déposée dans leurs cages d’hébergement en guise de récompense. Des critères de raffinement des gestes techniques qui seront pratiqués (manipulation précautionneuse, surveillance continue, posologie adaptée, etc.), des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur (perte de poids, lésion, comportement anormal, etc.) et des actions correctives visant à soulager les animaux (surveillance accrue, traitements médicamenteux, etc.) ont été définis en adéquation avec les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être.
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées chez le rat car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets toxicologiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’étude des effets respiratoires, d’utilisation du rat et de souche couramment utilisée en laboratoire. Des animaux jeunes adultes (âgés de 6 semaines au moment de la 1ère exposition) seront utilisés. L’âge des animaux au cours de l’étude (jeunes adultes/adultes étudiés durant au maximum 12 mois) sera ainsi représentatif des scénarios d’exposition réalistes étudiés.
Evaluation in vivo de polymères à visée thérapeutique dans la prévention et le traitement de névrome chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
746 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit la section puis la réparation d'un nerf sous anesthésie et des mesures de conduction nerveuse par stimulation électrique, pour tester des colles et implants censés prévenir les névromes après amputation. Le porteur indique que la section nerveuse affecte la mobilité de la patte opérée et provoque léthargie, douleur et perte de poids. Il affirme qu'un modèle mammifère est "essentiel" et que ces études ne peuvent se faire ni ex vivo ni in vitro, faute de reproduire un "organe entier".
Objectifs
La réparation tissulaire conventionnelle par chirurgie implique l’utilisation de sutures, d’agrafes ou autres techniques utilisant des points d’ancrage qui induisent un traumatisme supplémentaire au tissu. Ces techniques peuvent engendrer une inflammation et de la fibrose à l’origine d’effets délétères sur la réparation des tissus et sur la qualité de vie du patient. Ces techniques constituent pourtant, faute d’alternatives satisfaisantes, les méthodes de référence pour la réparation chirurgicale des tissus. Notre objectif est de développer des systèmes de réparation atraumatiques sans sutures qui pourront être utilisés dans la réparation de tissus. Des dispositifs sous forme d’implants et de colles chirurgicales ont été développés pour différentes applications dont la réparation des nerfs périphériques et ont démontré une nette efficacité lors de précédentes études. Le but de ce présent projet est d’élargir l’indication de ces systèmes de réparation à des scénarios cliniques très spécifiques comme le traitement et la prévention de névrome notamment dans le cadre d’amputations. L’amputation concerne plus d’un million de patient par an à l’échelle mondiale, qu’elle soit liée à des traumatismes ou à des maladies chroniques comme le diabète ou le cancer. Après une amputation, il est fréquent que les nerfs sectionnés soient à l’origine : 1) du phénomène de douleur du membre fantôme qui correspond à des douleurs ressenties dans la partie du corps amputée. Ce phénomène affecte 95 pour cent des patients en postopératoire immédiat avec une persistance au long cours chez la moitié d’entre eux. 2) de la formation d’un névrome (48,7 pour cent des patients). Il s’agit d’une tumeur bégnine formée par des fibres nerveuses qui se sont développées de façon anarchique. Un névrome s’accompagne de douleurs fulgurantes et peut nécessiter une nouvelle intervention chirurgicale pour le retirer. En clinique, les chirurgiens utilisent la réinnervation musculaire ciblée pour traiter les nerfs lors d’une amputation pour prévenir l’apparition de névromes. Le but de ce projet est de valider in vivo l’efficacité de nos systèmes de réparation sur les nerfs dans un modèle de réinnervation musculaire ciblée chez le rat.
Bénéfices attendus
Si la régénération nerveuse est confirmée avec nos systèmes de réparation, une solution atraumatique pourra être proposée aux chirurgiens pour éviter l’apparition de névromes post-amputation sans créer de traumatismes supplémentaires aux tissus.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie unique d’une durée de 30 minutes environ de transection puis réparation du nerf, effectuée sous anesthésie générale gazeuse et locale associée à une prise en charge de la douleur pré et postopératoire. Nous évaluerons à trois reprises (avant, pendant et après la chirurgie) la conduction nerveuse par électrophysiologie (stimulation électrique des nerfs) sous anesthésie générale pour une durée de 20 à 40 minutes. A la fin de la période de maintien prévu, ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Les procédures nécessitent un geste chirurgical réalisé sous anesthésie générale. L’anesthésie est associée à un risque d’hypothermie et d’assèchement de la cornée. La procédure va engendrer une léthargie et une douleur transitoires pouvant être à l’origine d’une perte de poids post-opératoire. Au cours de la chirurgie, des nerfs vont être sectionnés ce qui va impacter la mobilité de l’animal au niveau de la patte opérée. Le muscle n’étant que partiellement dénervé au cours de la chirurgie, l’impact sur la mobilité sera limité.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure pour des analyses post-mortem destinées à évaluer l’efficacité de nos systèmes de réparation sur la régénération nerveuse.
Remplacement
De nombreux tests ont été réalisés ex vivo et in vitro pour obtenir un maximum de données préliminaires et sélectionner les polymères et les designs les plus prometteurs pour une utilisation in vivo. Malheureusement, ces études ne peuvent pas suffire car ces modèles ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Le présent projet doit nous permettre d’évaluer une régénération nerveuse ce qui ne peut être fait que dans un individu intégré et autonome.
Réduction
Au maximum, 746 rats seront intégrés dans l’étude. Nos dispositifs ont subi une batterie de tests préalables. Seuls les implants et colles les plus prometteurs ont été sélectionnés pour un passage sur l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Au cours de l’étude les résultats intermédiaires seront analysés et pourront permettre d’écarter d’autres designs ou des temps de suivi tardifs. La taille des groupes expérimentaux a été définie à l’aide d’un test statistique de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en utilisant le moins d’animaux possible (n=10 animaux par groupe). Les résultats seront également analysés par un test statistique.
Raffinement
Les rats seront hébergés en cages individuellement ventilées (2 rats/cage), en milieu enrichi par des tunnels et des balles en bois et aliments à volonté. La température et l’hygrométrie seront contrôlées. Une période de stabulation réglementaire minimale d’une semaine sera respectée entre l’arrivée des animaux et le début de la procédure pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement et ainsi de limiter leur stress. Une étape de socialisation sera mise en place pour habituer les rats à la préhension et réduire leur stress avant la procédure. Les gestes expérimentaux seront pratiqués par du personnel qualifié avec une anesthésie et une analgésie adaptée à la nature et à la durée du geste. Une pesée des animaux sera réalisée avant la chirurgie puis 1 fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour évaluer la récupération de l’animal puis 1 fois/semaine. Si nécessaire, un complément gélifié et/ou des granules humidifiées seront déposés directement dans le fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire (1 pot par cage). Des graines de tournesol seront également ajoutées à l’alimentation usuelle pour diversifier l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Une grille de score va nous permettre d’évaluer de façon objective l’état de l’animal et de prendre les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance par la mise en place de points limites. Le scoring sera effectué 1 fois par semaine et servira de support au suivi quotidien des animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour des protocoles de chirurgie. De plus, la taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison avec d’autres espèces mammifères telles que porc ou brebis. De plus, leur taille, comparée à celle de la souris, permet plus aisément de pratiquer un acte chirurgical fin, d’autant plus que nous travaillerons sur des nerfs. Enfin, la composition de la matrice extracellulaire des humains et des rongeurs est très similaire. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude (une période d’acclimatation minimale de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations). Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. De plus, les animaux seront jeunes et auront donc une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement ce qui est très important pour les temps de suivi tardifs de notre étude.