Rats
Etude des polyphénols alimentaires sur l’hémostase et le risque hémorragique sous anti-coagulants chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tués sous anesthésie, sans réveil, après des prélèvements et des mesures d'hémostase, 80 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Pendant cinq semaines, ils reçoivent chaque jour sous contention un anticoagulant par la bouche et subissent une prise de sang, pour mesurer l'effet d'une supplémentation alimentaire en polyphénols sur leur coagulation et leur risque de saignement. Le porteur les héberge seuls, pour éviter que des comportements agressifs ne provoquent blessures et saignements sous anticoagulant et pour recueillir leurs urines de 24 heures, avec pour enrichissement un tunnel et des balles en acier. Il annonce aussi que le projet contribuera à la "mise en place d'un modèle animal" destiné à tester d'autres facteurs nutritionnels ou agents pharmacologiques présentant "un bénéfice ou un risque hémorragique".
Objectifs
Le saignement sous anti-coagulants représente une des premières causes iatrogènes d’hospitalisation d’urgence en France. Une marge thérapeutique étroite et des effets indésirables potentiellement graves des anti-coagulants conduisent les praticiens à prendre en considération les interactions possibles entre anti-coagulants et alimentation du patient. L’objectif du projet est l’évaluation des effets d’une supplémentation nutritionnelle en polyphénols sur les paramètres de l’hémostase et le risque d’hémorragie chez le rat sous anti-coagulant. En effet, de nombreuses études montrent que les polyphénols agiraient favorablement sur certains facteurs de risque cardiovasculaires dont l’amélioration de la fonction endothéliale . Bien qu’encore peu documenté au niveau clinique, les flavonoïdes, une famille de polyphénols, auraient également un impact direct sur l’hémostase (ensemble des phénomènes qui permettent l’arrêt d’une hémorragie). Elle est divisée en deux temps successifs : l’hémostase primaire correspondant à la formation du « clou plaquettaire » et l’hémostase secondaire, dite « cascade de coagulation ». Murphy et al. ont mis en évidence un impact des flavonoïdes sur l’hémostase primaire en exerçant une action antiplaquettaire. Plus récemment, des études ont mis en évidence une réduction de la coagulation plasmatique par les flavonoïdes qui exercent des activités anti-facteur IIa ou anti- facteur Xa. De plus, notre équipe a montré un impact des flavonoïdes sur la structure du caillot de fibrine formé lors de l’hémostase secondaire, résultant en un caillot moins dense et plus perméable. L’ensemble de ces résultats sont en faveur d’une diminution des évènements thrombotiques et d’un allongement de l’hémostase primaire , qui pourrait constituer un facteur de risque de saignement, notamment chez les sujets sous anti-coagulants. Ainsi, il apparaît pertinent de porter une attention particulière au risque hémorragique en cas de supplémentation nutritionnelle riche en polyphénols.
Bénéfices attendus
Les bénéfices qui découleront de ce projet sont la contribution à la compréhension de l’impact des polyphénols de notre alimentation sur l’hémostase, le risque hémorragique, et la réactivité vasculaire. Le projet contribuera également à la mise en place d’un modèle animal permettant de tester d’autres facteurs nutritionnels ou agents pharmacologiques présentant un bénéfice ou un risque hémorragique (anticoagulants ou anti-agrégants plaquettaires…).
Procédures
Les animaux, sous contention (d'une durée d'environ 30s) recevront une administration quotidienne d'anticoagulant par voie orale pendant 5 semaines. Une prise de sang unique sera réalisée pour s'assurer du taux plasmatique d'anticoagulant au cours du traitement (durée du geste = moins de 2 minutes). En fin d'études, les animaux seront anesthésiés (5 minutes) pour la réalisation de prélèvements et des mesures d'hémostase avant sacrifice sans réveil préalable pour la collecte des tissus.
Impact sur les animaux
La mise sous anti-coagulants ainsi que la supplémentation nutritionnelle en polyphénols (à des doses équivalentes à celles des aliments sources) ne sont pas suspectées d’induire d’effets indésirables. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés lors de l’administration par voie oral des traitements anti-coagulants afin de s’assurer de l’absence d’effet secondaire (hémorragie spontanée, …). Par ailleurs, l''hébergement en cage individuelle transparente n'est connu pour induire de baisse de l'ingéré. Par précaution, la masse corporelle ainsi que leur consommation alimentaire seront contrôlées de façon bi-hebdomadaire dans le cadre de se projet.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de collecter le plasma et les tissus vasculaires nécessaires à l'exploration des fonctions tissulaires impliquées dans l'hémostase et la réactivité vasculaire.
Remplacement
Les méthodes d’étude de l’hémostase in vitro, sur des restes de tubes de plasma humain par exemple, ne permettent pas la prise en compte du métabolisme des flavonoïdes. En effet, les flavonoïdes de notre alimentation sont soumis à différentes modifications de structure par les enzymes digestives et métaboliques, résultant en la génération de formes nommées métabolites dans la circulation sanguine. De plus, les approches in vitro ne prennent pas en compte les effets des métabolites des flavonoïdes sur les paramètres cellulaires régulant l’hémostase (ex : facteurs endothéliaux …). De plus ces méthodes permettent d’estimer de façon indirecte le risque d’hémorragie. Par conséquent, à ce jour, aucune méthode de remplacement n’est envisageable pour répondre aux objectifs scientifiques de notre projet.
Réduction
Le nombre d’animaux dans l’étude proposée a été déterminé sur la base des données de la littérature ayant mis en évidence une modification significative du temps de saignement chez le rat anti-coagulé à l’aide d’une procédure similaire. Par ailleurs, des critères secondaires d’analyses tels que l’évaluation de l’hémostase primaire et secondaire ainsi que l’évaluation de la réactivité vasculaire ont été inclus dans l’étude afin de ne pas répéter cette expérimentation à ces fins.
Raffinement
Les animaux seront hébergés individuellement afin d’éviter tout comportement agressif pouvant engendrer des blessures et saignement notamment lors des traitements sous anti-coagulants. De plus, l’individualisation des animaux est nécessaire pour le suivi de la prise alimentaire et le recueil des urines 24h. Cet hébergement se fera dans les conditions standards et réglementaires. Toutefois, ces animaux bénéficieront d’attention particulière notamment en termes d’offre d’objets d’enrichissement (tunnel et balles en acier) avec des alternances hebdomadaires. Un suivi quotidien des animaux, imposé par ailleurs par le déroulé du protocole, permettra de compléter la surveillance de leur bien-être.
Choix des espèces
Les rats « Sprague-Dawley » ont été largement étudiés avec des similitudes physiologiques avec l’homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Ces animaux sont également utilisés dans les études publiées sur le temps de saignement ce qui facilite la comparaison des données issues des diverses expérimentations réalisées. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux agés de 8 semaines (poids < 200gr) de façon similaire aux études précédentes publiées.
Enseignements pratiques de physiologie animale et de pharmacologie : apprentissage des savoir-faire en expérimentation animale
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 70
282 souris et rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Les rats reçoivent la pose de cathéters et un prélèvement à la carotide, les souris des injections et une ischémie du rein gauche par clamp, gestes réalisés par des étudiants de licence pour apprendre les techniques de base de l'expérimentation animale. Le porteur reconnaît qu'un réveil prématuré ou une surdose d'anesthésique peut survenir et qu'il arrive qu'un animal meure pendant la séance. Il indique que les étudiants s'exercent d'abord sur des rats en plastique, la plupart se destinant à la recherche sur le vivant.
Objectifs
L’objectif est principalement d’inculquer aux étudiants des notions d’expérimentation animale requises dès la troisième année de licence de biologie et d’autre part d’illustrer les cours théoriques de physiologie animale et de pharmacologie par des applications techniques concrètes réalisées sur le rat et la souris.
Bénéfices attendus
Acquisition des techniques de base d’expérimentation animale sur animal vigil (préhension, contention et techniques d’injections les plus courantes) et sur animal anesthésié (pose de cathéters, prélèvement carotidien).
Procédures
Les séances avec contention et injections sur animal vigil impliquent un stress chez l’animal qui est minimisé par l’acclimatation des animaux à leur environnement une semaine avant les séances de travaux pratiques et par un apprentissage des étudiants sur un modèle inerte de rat plastique. Après une analgésie préopératoire de buprénorphine, les rats seront anesthésiés à l’isoflurane dès leur entrée dans la salle de TP, puis pose de cathéters, injection et prélèvement unique de sang (1-2 mL) par le cathéter carotidien. Chez les souris après analgésie/anesthesie, initiation aux techniques d’injections intrapéritonéale et sous-cutanée et induction d’une ischémie du rein gauche en appliquant un clamp sur l'artère rénale et la veine pendant 20 minutes. La nuisance principale est un réveil prématuré de l’animal lors de la séance d’expérimentation ou au contraire une surcharge anesthésique induisant un arrêt cardio-respiratoire de l’animal. Selon les cas, l’enseignant réajuste la dose d’anesthésique et le cas échéant, opère une réanimation.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n’est attendue sur les animaux. Le stress à la contention est minimisé par l'apprentissage de la réglementation et de l'éthique lors d'une séance de présentation en cours magistral et d'une démonstration préalable par l'enseignant. Un apprentissage sur un modèle d'imitation (animal inerte conçu avec un matériau qui confère la sensibilité spécifique d'un animal vivant) permet d'acquérir les compétences nécessaires pour manipuler et réaliser les gestes de routine d'expérimentation (injection et pose de catheter), sans la nécessité d'utiliser un animal vivant. Cet entrainement dans une séance qui précède la séance d'expérimentation sur l'animale vivant permet de réduire à la fois le stress de l'étudiant et chez l'animal. L'effet indésirable, bien que rare, est l'arrêt cardio-respiratoire de l'animal sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Une réanimation est donc réalisée par l'enseignant avec un contrôle du débit d'anesthésiant, mais il arrive qu'un animal meurt pendant une séance d'expérimentation.
Devenir
Procédures sans réveil, compte tenu des manipulations expérimentales et des injections réalisées par les étudiants, les animaux ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure par l’enseignant.
Remplacement
Afin d’acquérir les compétences techniques d’expérimentation animale, les étudiants s’entraineront tout d’abord sur des modèles de rats en plastique. Cette initiation leur permettra de se familiariser avec les structures anatomiques et les gestes techniques (contention et techniques chirurgicales) avant de pratiquer sur les rats véritables dans une expérimentation réalisée dans la demi-journée qui suit.
Réduction
Le nombre d'animaux choisi est le nombre minimal permettant d'acquérir les techniques de bases en expérimentation animale afin de sensibiliser et former nos étudiants, qui pour la majorité d’entre eux sont destinés à poursuivre leur carrière dans le domaine de la recherche en laboratoire sur le vivant.
Raffinement
Aucune souffrance n’est causée aux animaux. Pour l’ensemble des procédures, les animaux sont anesthésiés afin d’empêcher toute douleur ou souffrance de l’animal en fonction des gestes réalisés et jusqu’à leur mise à mort à la fin de l’expérimentation. Un enseignement spécifique de la réglementation et des principes éthiques relatifs à l’expérimentation animale est réalisé avant les séances de travaux pratiques. Au début de chaque séance d'expérimentation, les étudiants sont sensibilisés au respect des animaux et à la réalisation des gestes dans les meilleures conditions possibles avec une démonstration réalisée par l’enseignant. Pour la première séance d’expérimentation sur le rat, l’initiation au préalable sur des modèles plastiques permet de préparer au mieux les étudiants avant l’utilisation d’animaux anesthésiés/analgésiés.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les modèles animaux les plus utilisés en recherche et le choix d’animaux jeunes adultes permet une manipulation plus aisée et un meilleur contrôle de l’anesthésie.
Formation de microchirurgie expert
- Formation professionnelle
240 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal subit une intervention unique de quatre heures maximum, sutures de la carotide, de la jugulaire, pontage ou transplantation rénale, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des chirurgiens déjà confirmés à un diplôme de microchirurgie "Expert". Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des vaisseaux au sang circulant et que l'entraînement sur matériel inerte, des "nouilles chinoises", ne suffit pas pour gérer anesthésie et complications. Quatre rats sont utilisés par stagiaire.
Objectifs
La microchirurgie est une discipline chirurgicale qui permet de réparer, de remplacer, de greffer des nerfs ou des vaisseaux, et qui permet de disséquer des tumeurs cérébrales et de réaliser une hémostase rigoureuse et délicate dans un cerveau ou une moelle épinière. Son exercice n’est accessible qu’à un chirurgien rompu aux différentes techniques microchirurgicales, et dont la pratique est quotidienne. Tous les chirurgiens des centres "SOS mains" notamment en France exercent cette spécialité. Tous les Neurochirurgiens sont formés à la microchirurgie, comme la plupart des chirurgiens qualifiés en chirurgie plastique et reconstructrice. Cette compétence s’acquiert par le diplôme universitaire de microchirurgie dans le cadre de la formation initiale du chirurgien. Toutefois ce diplôme ne permet qu’une formation de base. La réalisation de procédure plus complexe et notamment réimplantation digitale ou lambeaux libres ne peut être réalisé dans le cadre de ce DU car ne concerne que peu d’étudiants et nécessite également une expérience pratique au-delà de cette formation initiale. Le diplôme Universitaire de microchirurgie « Expert » s'adresse à des chirurgiens confirmés et permet à ceux-ci développer leur technique, leur compétence dans des procédures plus complexes. Le diplôme nécessaire pour pratiquer la chirurgie réparatrice des micro-vaisseaux. Pour acquérir ces gestes, il est indispensable de travailler sur des vaisseaux avec du sang circulant pour pouvoir apprendre à réparer ces veines et artères de manière que celles-ci soient à nouveau opérationnelles sans hémorragie et sans thrombose.
Bénéfices attendus
Le diplôme Universitaire de microchirurgie « Expert » s'adresse à des chirurgiens confirmés et permet à ceux-ci développer leur technique, leur compétence dans des procédures plus complexes. Le diplôme est nécessaire pour pratiquer la chirurgie réparatrice des micro-vaisseaux. Pour acquérir ces gestes, il est indispensable de travailler sur des vaisseaux avec du sang circulant pour pouvoir apprendre à réparer ces veines et artères de manière que celles-ci soient à nouveau opérationnelles sans hémorragie et sans thrombose.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles. L'ensemble des animaux subiront une unique intervention chirurgicale de 4 heures maximum chacun sous anesthésie générale sans réveil. Ces interventions viseront l'apprentissage microchirurgical de sutures complexes: suture artère carotide, veine jugulaire, pontage carotidien, transplantation rénale.
Impact sur les animaux
L'ensemble des procédures seront sans réveil sur animaux anesthésiés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures entièrement réalisées sous anesthésie générale, la complexité des opérations subies rendant leur réveil impossible.
Remplacement
La partie purement technique peut être travaillée sur du matériel inerte et c’est le cas puisque l’apprentissage des gestes se fait systématiquement sur un modèle de nouilles chinoises. Les gestes sont validés par un chirurgien confirmé au début de l’ensemble des séances avant de passer sur l’animal. En dehors de l’aspect technique, les stagiaires doivent être capables de gérer une situation globale d’anesthésie générale ainsi que les complications chirurgicales (hémorragies, thromboses…) auxquelles ils seront confrontés en clinique humaine ou vétérinaire et qui peuvent difficilement être reproduites dans leur intégralité sur des modèles inertes. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable.
Réduction
Les séances seront organisées de façon à pouvoir effectuer plusieurs gestes sur le même animal permettant d'en réduire le nombre. 4 rats seront utilisés par stagiaire ce qui nous semble nécessaire mais suffisant pour atteindre le niveau d'expertise visé.
Raffinement
La formation débute par une séance en centre de simulation. Une présentation de l’anatomie du rat est réalisée sur la table d’anatomie au laboratoire de Simulation. Les vidéos des procédures sont présentées aux étudiants en détaillant les voies d’abord et les points techniques importants. Les étudiants peuvent simuler les différentes voies d’abord qui seront utilisées au cours des travaux pratiques sur la table d’anatomie. Les séances pratiques débuterons systématiquement par du travail sur matériel inerte (nouille chinoise) et le geste devra être validé par un responsable chirurgien expérimenté avant de débuter le protocole sur l'animal. L'ensemble des procédures se feront sur animal anesthésié et seront sans réveil. L'ensemble des animaux est hébergé en cages enrichies (cabanes, frisotis) par lots de 5 ou 6 d'âge et de sexe identiques dans une pièce à atmosphère contrôlée et observés quotidiennement. L'eau et la nourriture sont disponibles à volonté. Les cages sont définies 1 semaine minimum avant l'entrée des animaux dans le protocole.
Choix des espèces
L'espèce choisie (Rats) a des vaissaux d'un diamètre correspondant à ceux rencontrés en microchirurgie humaine ou vétérinaire. Le rat est donc parfaitement adapté à l'apprentissage de ces techniques.
Evaluation de la biodisponibilité de la curcumine et de ses métabolites à partir de différentes formulations chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage une dose unique de curcumine sous différentes formulations, puis subissent cinq prélèvements sanguins en six heures sous anesthésie, avant le prélèvement de leurs organes. L'objectif déclaré est de sélectionner la formulation la plus efficace pour un complément alimentaire, dans un projet lié à un partenaire industriel et couvert par une "clause de confidentialité". Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier la biodisponibilité et fixe les groupes à trois rats.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’évaluer à partir de diverses formulations (procédés et compositions soumises à une clause de confidentialité), la biodisponibilité en molécules d’intérêts à savoir la curcumine et ses métabolites. Ces évaluations, selon les diverses formes galéniques, permettront de déterminer la meilleure formulation pour une supplémentation alimentaire en curcumine avant le passage en phase de test clinique.
Bénéfices attendus
L’évaluation de la biodisponibilité en curcumine et de ses métabolites suite au traitement oral de différentes formulations, permettra de déterminer la formulation qui pourrait être la plus efficace afin de rendre la curcumine et/ou ses métabolites biodisponibles. Cette sélection permettra ensuite à travers une étude pré-clinique puis une phase clinique d’évaluer les effets physiologiques et cellulaires de la supplémentation en curcumine.
Procédures
Dans le cadre de cette procédure aigue, les rats recevront un traitement par voie orale (gavage) une dose unique des différentes formulations de curcumine ou de l’eau à l’aide d’une aiguille de gavage métallique spécifique. Un prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale sera effectué à T = 0 minutes (avant le traitement oral) puis à 30 minutes, 1 heure, 2 heures et 6 heures après le traitement oral. Afin de limiter le stress des animaux, les prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse courte (≈ 5 minutes). Les prélèvement sont effectués à l’aide d’un cathéter placé de manière au niveau de la veine caudale. Au cours de cette procédure, la température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant . A la fin de chaque prélèvement, le cathéter est retiré et un point de compression est réalisé afin de stopper l’écoulement sanguin, puis les animaux seront replacés dans une cage individuel entre chaque prélèvement et seront surveillés.
Impact sur les animaux
Le traitement oral peuvent être à l’origine de douleurs modérées ou de stress pour l’animal. Les prélèvements de sang répétés sur une période de 6 heures peuvent également être une source de stress et douleurs modérées. Néanmoins, toutes ces procédures seront réalisées par des personnels expérimentés. Les animaux seront surveillés tout au long de la procédure pour s’assurer de leur bien-être. Par ailleurs, les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie légère à l’Isoflurane complété par une anesthésie locale à la lidocaine (crème) du site de prélèvement.
Devenir
Tous les animaux (n=24) seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d'organes cibles.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro permettant l’étude de la biodisponibilité de différentes formulations d’un même composé. En effet, les mécanismes de digestion, d’absorption et de métabolisation sont complexes et aucune méthode ne permet de les remplacer de manière exhaustive. Il convient donc d’étudier in vivo la biodisponibilité de la curcumine et de ses métabolites à partir de différentes formulations.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe (3) a été défini en accord avec le partenaire industriel comme le nombre minimum afin d’évaluer la biodisponibilité tout en s’assurant de la répétabilité des résultats et de mettre en évidence des différences statistiques significatives sur les paramètres étudiés.
Raffinement
Le protocole a été conçu pour limiter au maximum le stress subit par les animaux. Les animaux seront acclimatés 10 jours après leur arrivé et avant toute procédure. Les rats sont hébergés en cage de 3 individus afin de maintenir le caractère social de l’espèce. Les cages seront enrichies avec des tubes, coton et bâtons à ronger. Ils seront hébergés en animalerie dans des conditions standards d'animalerie avec un accès ad libitum à de la nourriture standard et à de l’eau. Les rats seront également suivis quotidiennement par un personnel formé contrôlant le bien-être des animaux. Au cours de la procédure expérimentale, le bien-être des animaux sera évalué par un personnel formé à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites. Au cours de l’’anesthésie, la température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant.
Choix des espèces
Le rat est un modèle pertinent afin d’étudier les mécanismes de digestion/absorption et métabolisation de molécules car sa son système digestion et sa physiologie présentent de grandes similitudes comparées à ceux de l’Homme. De plus, les prélèvements sanguins permettent d’obtenir des volumes suffisants afin de réaliser les dosages des différentes molécules d’intérêts (curcumine et métabolites) et sont facilement réalisable chez le rat.
Evaluation des effets de traitements par plasmas froids sur la cicatrisation de plaies cutanées ischémiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie cutanée chronique est provoquée sur leur dos par arrêt de l'irrigation sanguine lors de deux chirurgies, puis traitée par plasmas froids trois fois par semaine jusqu'à cicatrisation, chaque rat étant isolé en cage individuelle pour l'empêcher d'arracher ses sutures. Le porteur reconnaît que cet isolement peut être source de stress et qu'un excès de traitement pourrait nécroser les tissus. L'objectif déclaré est de tester ces plasmas froids en vue d'une future thérapie des plaies chroniques chez l'humain, sain ou diabétique.
Objectifs
Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. Les plasmasfroids produisent des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote qui ont une capacité pro-cicatrisante et antibactérienne. L'utilisation des plasmas froids se différencie par le fait qu’elle est non invasive, c’est-à-dire sans contact, et sans douleur. Les objectifs de cette première étude menée dans le cadre d’un nouveau projet sont d’évaluer les effets de plasmas froids générés par une nouvelle technologie sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques induites chez le rat. Les effets seront comparés à ceux observés sur des plaies cutanées chroniques non traitées. Les traitements par plasmas froids seront effectués sous anesthésie 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète. A l’issue de l’étude, des dosages seront effectués sur un prélèvement de sang après placement des animaux sous anesthésie générale, suivi après leur euthanasie du prélèvement d’organes pour la réalisation d’analyses.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette seconde étude menée dans le cadre d’un projet global va permettre d’évaluer les effets de traitements par plasmas froids sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat et de les comparer ces effets avec des plaies cutanées chroniques non traitées, en utilisant un gaz rare différent de celui utilisé lors d’une précédente étude, ainsi qu’un nouveau dispositif médical breveté permettant la diffusion des plasmas froids générés. Les données des analyses effectuées sur les prélèvements de sang, de peau de la région cicatrisée et des organes prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets des traitements effectués sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat. Cela permettra de poursuivre les études sur l’animal dans le cadre de ce projet, et notamment d’étudier les effets d’une combinaison traitements par plasmas froids et pansement actif, et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettra à terme de proposer une nouvelle thérapie innovante pour le traitement de plaies cutanées chroniques chez le sujet sain ou diabétique.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée chronique avec arrêt de l’irrigation sanguine sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale sur 2 jours consécutifs. Un traitement analgésique sera administré chaque jour avant la chirurgie et 6 heures après la fin de celle-ci le 2ème jour. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ le 1er jour et en 10 minutes environ le 2ème jour. Les plaies cutanées seront traitées 3 fois par semaine et seront protégées par un morceau de gaze stérile et 2 bandes de sparadrap pour le maintien de celle-ci. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps, et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation.
Impact sur les animaux
L’induction d’une plaie cutanée chronique réalisée sur 2 jours successifs peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements et les changes de gaze et de sparadraps, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. Une toxicité éventuelle des traitements par plasmas froids pourrait se traduire par exemple par une nécrose avancée des tissus traités en raison d'un excès d'espéces réactives de l'oxygène, pouvant alors constituer un point limite. L’hébergement en cage individuelle des rats sera nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps au cours de la période de traitement. Cela permet également d’éviter toute interférence avec le processus de cicatrisation qui est un processus long passant par différentes phases successives. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 20 rats seront euthanasiés lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, après réalisation d’un prélèvement de sang pour la réalisation d’analyses sanguines. Les rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de la peau au niveau de la région ou la plaie cutanée a été induite, ainsi que des organes pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes successifs. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études menées sur le modèle expérimental de plaie cutanée chronique et sur un autre modèle expérimental chez le rat, et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour les 2 groupes de traitement envisagés. Nous utiliserons donc à nouveau 2 groupes expérimentaux de 10 rats.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie préopératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celleci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque traitement et/ou change de gaze et de sparadrap et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids importante est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière. L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.
Choix des espèces
Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet car il présente une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme, avec une durée de cicatrisation suffisamment longue (plusieurs semaines). Les animaux seront de jeunes rats âgées de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour la réalisation des expérimentations. Les rats auront ainsi une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme.
Recherche d’un agoniste 5HT permettant de moduler la pression artérielle d’un rat (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
31 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue. Dix subissent une lésion haute de la moelle épinière qui les laisse partiellement paralysés, incapables de vider leur vessie seuls et sujets à des troubles cardiovasculaires pendant trente jours, tandis que les vingt et un autres sont opérés sous anesthésie sans jamais se réveiller. Le porteur décrit la procédure comme "lourde, handicapante et sévère" et écarte pour cette raison toute adoption. L'objectif déclaré est de trouver une molécule proche de la sérotonine, déjà utilisée chez l'humain, pour relever la pression artérielle après une lésion de la moelle épinière.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière (SCI) sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52,5 cas par million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Outre les déficits sensorimoteurs bien connus, les sujets présentent une altération majeure du contrôle du système nerveux autonome (SNA). Les symptômes cliniques comprennent entre autres des troubles cardiovasculaires ou une thermorégulation dysfonctionnelle. Les conséquences sur la qualité et l’espérance de vie sont extrêmement préjudiciables. Chez les rats SCI, l'administration chronique de molécules proches d’un des neurotransmetteurs du SNA favorise la récupération fonctionnelle. Outre ce rôle démontré dans le contrôle moteur, ce neurotransmetteur joue également un rôle ubiquitaire dans le système cardiovasculaire puisqu'il module entre autre, le tonus des vaisseaux sanguins, la rythmicité cardiaque. Cela nous a conduit à développer un protocole expérimental basé sur l'utilisation de ces molécules. Ainsi, des animaux présentant une SCI ont été traités de façon chronique pendant 28 jrs avec des molécules tests (données non publiées) et les résultats ont mis en évidence une amélioration importante des fonctions cardiovasculaires. Dans ce cadre et en collaboration avec une équipe médicale en rééducation fonctionnelle d’un CHU, nous souhaiterions approfondir nos connaissances sur les mécanismes et potentiellement mettre en place une étude clinique. De plus, un précédent projet a soulevé des interrogations quant au développement d’une tachycardie post-lésionnelle (les patients étant bradycardes). Nous avançons l’hypothèse qu’elle serait due à la persistance de certaines connexions nerveuses entre le SNA et le cœur. Nous souhaitons tester cette hypothèse.
Bénéfices attendus
Les lésions hautes de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Outre les déficits sensori-moteurs, des troubles cardio-vasculaires importants sont présents chez ces individus. Certains troubles comme les dysreflexies autonomes (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive) peuvent mettre en jeu le pronostic vital du patient. Afin de pouvoir plus rapidement lancer une étude clinique, nous recherchons ici, une molécule pharmacologiquement similaire mais déjà utilisée en routine chez l'humain dans d'autres domaines. Le bénéfice à court terme, nous l'espérons, est l'amélioration des conditions des patients atteints de lésions de la moelle épinière (diminution du nombre de dysreflexie autonome, augmentation de la pression artérielle et augmentation de la fréquence cardiaque).
Procédures
10 animaux subiront une première chirurgie d'environ 40 minutes sous anesthésie gazeuse puis une deuxième de 1h à 1h15 maximum. 21 animaux subiront une chirurgie sans réveil où l'ensemble des procédures seront faites sous analgésie et pour éviter tout stress et douleur. Ces animaux ne se réveilleront pas de leur opération. Le temps de cette expérimentation sera de 3h maximum.
Impact sur les animaux
10 animaux subiront une lésion haute de la moelle épinière provoquant une mobilité réduite, une impossibilité de vidanger leurs vessies, seuls, des troubles cardiovasculaires, des risques infectieux liés à l'impossibilité de vidanger la vessie et des risques d'obstruction stomacale lié à la réduction de la motilité intestinale (capacité de l'intestin à faire avancer les aliments dans le tractus intestinal). Le risque infectieux est surtout présent pendant les 10 jours post-opératoire et le risque d'obstruction stomacale dure entre 4 et 5 jours post-opératoire. Les autres conséquences de la lésion médullaire dure sur l'ensemble du temps du projet, soit 30 jours. Les autre animaux (n=21) seront hébergés sans effets indésirables quelconques et ne se réveilleront pas de leur chirurgie.
Devenir
La procédure subie par les animaux est lourde, handicapante et sévère. Il n'est pas possible de les faire adopter en l'état (n=10 animaux). Pour les 21 autres animaux, la même raison nous oblige à ne pas les faire se réveiller alors que le risque de mortalité et de souffrance est important (21 à 36% de mortalité chez les humains - étude épidémiologique sur la Finlande sur une période de 30 ans).
Remplacement
Le système serotoninergique est complexe avec une quinzaine de types ou sous-types de récepteurs différents et se retrouve à plusieurs niveaux tant centraux que périphérique. Il n'existe pas de modèle de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets des molécules que nous souhaitons passer au crible dans ce projet.
Réduction
Grâce à la télémétrie les injections pourront être faites sur le même lot d'animaux. Des analyses statistiques seront faites en suivants sur les résultats.
Raffinement
Afin de prévenir tous les problèmes liés à l'absence de rétrocontrôle sympathique, plusieurs points sont raffinées (alimentation liquide pour pallier au ralentissement de la vidange gastrique), ajout de paraffine dans celle-ci(pour pallier au ralentissement de la motricité intestinale), cage sur tapis chauffant (pour pallier aux problèmes de thermorégulation), vidange de la vessie plusieurs fois par jour par des expérimentateurs expérimentés, adaptation de l’environnement du rat pour sa paralysie du train-arrière. Le protocole analgésique a été validé par 2 vétérinaires.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain.Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies (pose de capteur télémétrique et SCI). De plus il existe de nombreux points commun entre le rat etl'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Les animaux seront implantés à 225-275gr soit à 7/8 semaines d'âge environ. Les individus subissant des lésions de la moelle sont souvent de jeunes adultes (cf description du projet) d'où le choix de la tranche d'âge. Nous avons aussi une contrainte de limite de poids (200gr) pour la pose du capteur de télémétrie.
Évaluation, dans un modèle de rat et chez le macaque, de l’efficacité et de la toxicité d’une stratégie de thérapie génique pour traiter la maladie de Stargardt.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Macaques à longue queue : 6
170 rats et 6 macaques vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les uns et les autres reçoivent une injection de vecteurs de thérapie génique sous la rétine des deux yeux, puis subissent des séries d'imageries et de tests rétiniens sous anesthésie, répétés jusqu'à quinze fois chez les macaques, ainsi que des prélèvements sanguins. L'objectif déclaré est de tester l'efficacité d'un traitement de la maladie de Stargardt chez les rats et sa toxicité chez les macaques, que le porteur juge indétectable chez les rongeurs. Il présente la rétine comme non reconstituable in vitro et retient le macaque pour son œil proche de celui de l'humain.
Objectifs
La maladie de Stargardt est une maladie génétique liée à des mutations sur le gène ABCA4. Elle a une prévalence de 1 pour 8000 à 10000 personnes, et se traduit par une dégénérescence rétinienne avec une cécite diurne, qui impacte à la fois les hommes et les femmes à partir de l’adolescence. La protéine ABCA4 est un transporteur essentiel pour le métabolisme des photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. En absence d’ABCA4, on observe une accumulation de déchets métaboliques dans les photorécepteurs, qui finissent par dégénérer. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace pour cette maladie. La thérapie génique, qui consisterait à venir ramener une copie fonctionnelle du gène ABCA4 dans les cellules rétiennes, est une approche prometteuse. Mais une limite de cette approche est que le gène ABCA4 est trop grand pour être intégré dans les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), vecteurs de choix pour transférer un gène dans la rétine. Une approche alternative consiste à délivrer deux vecteurs rAAVs, chacun porteur d’une moitié du gène ABCA4, associé à des structures spécifiques appelées ‘intéines’. Les deux moitiés de la protéine ABCA4 sont produites dans les cellules transduites, et une ligation s’effectue grâce aux intéines pour reconstruire une protéine ABCA4 entière. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité et la potentielle toxicité d’un traitement de thérapie génique basé sur l’utilisation de vecteurs recombinants «AAV-ABCA4-intéine» pour la maladie de Stargardt. L’évaluation de l’efficacité de ces vecteurs sera réalisée après injection sous-rétinienne chez le rat ABCA4-/-, modèle de la maladie de Stargardt dans lequel le gène ABCA4 est non fonctionnel. L’objectif sera de réduire le taux de déchets métaboliques dans la rétine, après expression de la protéine complète d’ABCA4, tout en vérifiant qu’une structure correcte de la rétine est maintenue. En parallèle de cette étude d’efficacité chez ce modèle de rat, nous évaluerons le risque de toxicité des «AAV-ABCA4-intéine» chez le macaque sain. En effet, les intéines étant des éléments protéiques exogènes, étrangers au système immunitaire, elles pourraient induire une toxicité immunitaire. Une telle toxicité ne pouvant pas être mise en évidence chez les rongeurs (connus pour tolérer un certain nombre de protéines exogènes, après transfert avec un vecteur AAV), il est donc nécessaire de passer au modèle macaque pour répondre à cette question.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est d’évaluer l’effet thérapeutique des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine» après injection sous rétinienne chez des rats pour lesquels le gène ABCA4 n’est pas fonctionnel et de valider l’absence de toxicité de cette approche thérapeutique chez le macaque. L’évaluation in vivo des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. De plus, si cette approche est validée pour le gène ABCA4, elle pourra potentiellement être transposée pour soigner d’autres maladies génétiques ayant un gène trop grand pour être inséré dans un seul vecteur AAV.
Procédures
(i) Injection sous-rétinienne des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » dans les 2 yeux : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 2h maximum pour les macaques. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 4 fois le premier mois puis maximum deux fois par mois, soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats et 1h pour les macaques. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 2 fois le premier mois puis maximum une fois par mois, soit un maximum de 8 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 1h30 pour les macaques. (iv) Injection intramusculaire d'un traitement immunosuppresseur: Geste réalisé sur animaux vigiles (sous contention dans leur cage), pour les macaques une fois avant l'injection du vecteur, puis une fois par semaine pendant les 5 semaines suivant l'injection du vecteur. (v) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois avant l’injection des vecteurs puis une fois par mois post-injection, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Pour les macaques lors des mêmes anesthésies que les imageries rétiniennes soit un maximum de 10 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée du geste 10 minutes maximum pour les deux espèces.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide après les chirurgies car les animaux seront sous anesthésie gazeuse.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.
Remplacement
La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. D’autre part, la pathologie de Stargardt est induite par une toxicité liée au métabolisme de la vitamine A présent dans l’œil à la naissance et supplémenté via la circulation choroidale. Cet effet systémique de la vitamine A ne peut pas être reproduit in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Ce nombre basé sur celui de nos précédentes études, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles, que ce soit avec le modèle de rat ABCA4-/- ou le macaque sain. Pour les rats ABCA4-/-, nous nous laissons la possibilité d’inclure entre 1 et 3 animaux supplémentaires par groupe, en cas d’échec des injections sous-rétiniennes. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses quantitatives et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes non injectés ou injectés avec un tampon, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes. Le suivi longitudinal non invasif par imagerie de la rétine permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour les analyses chez le macaque le nombre d'animaux utilisés est réduit à son strict minimum (n= 2 animaux par groupe, avec injections bilatérales). Malgré tout, nous savons que ce nombre permettra d'apporter les réponses aux questions posées dans cette étude. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression du gène ABCA4, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre ABCA4 et une analyse statistique sur les amplitudes des résultats d’électrorétinogrammes (analyse de la réponse électrique de la rétine). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales.
Raffinement
Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats, et dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés pour les macaques. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts et un suivi des animaux à l’aide de grilles de score, d’un arbre décisionnel nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés voire de décider d'une mise à mort prématurés.
Choix des espèces
Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large pour permettre une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt. Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. Mais les études menées chez les rongeurs ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’œil comparable à celle de l’homme, comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système visuel, une dimension et une structure du globe oculaire mais également de la rétine, avec la présence d’une macula (absente chez les rongeurs) ainsi qu’un système immunitaire comparable à ceux de l’homme.
Traitements des lésions coliques radio-induites par médecine régénérative combinée à la thérapie cellulaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 036 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent trois irradiations de l'abdomen sous anesthésie, des coloscopies pour l'administration d'un patch ou d'un gel, puis un prélèvement sanguin terminal, l'irradiation pouvant toucher l'intestin grêle et provoquer un amaigrissement et un gonflement abdominal irréversibles. L'objectif déclaré est de tester des traitements régénératifs contre les lésions du côlon provoquées par la radiothérapie chez des patients atteints de cancer pelvien. Le porteur affirme qu'évaluer un tel traitement exige un modèle animal intégré et que les organoïdes ne sont pas techniquement possibles ici.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer les bénéfices thérapeutiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ainsi que des molécules anti-inflammatoires et antifibrotiques lorsqu'elles sont intégrées dans un dispositif médical innovant auto-enroulé ou dans une solution liquide gélifiante à 37°C. L'objectif principal est de traiter de manière ciblée et locale les lésions colorectales radio-induites, en favorisant la régénération tissulaire et en réduisant l'inflammation et la fibrose associées à ces lésions. Par conséquent, ce projet vise à améliorer la qualité de vie des hommes et des femmes atteints de radioproctopathie.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche scientifique vise à apporter plusieurs bénéfices dans le domaine de la prévention et du traitement des lésions radio-induites dans le côlon, notamment : - Meilleure compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites : Le projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux lésions radio-induites dans le côlon. Cela inclut l'identification des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement initial des lésions, ainsi que l'évolution de ces lésions au fil du temps. Cela permettra une détection précoce plus précise et une intervention thérapeutique plus efficace. - Développement d'un traitement préventif : Le projet vise à développer des approches thérapeutiques préventives pour réduire le risque de lésions radio-induites dans le côlon. Cela pourrait inclure l'utilisation de molécules spécifiques, de dispositifs de libération locale ou d'autres stratégies novatrices visant à protéger les tissus normaux contre les effets néfastes de la radiothérapie. Un tel traitement préventif pourrait contribuer à améliorer la qualité de vie des patients en limitant les lésions radio-induites. - Développement d'un traitement curatif de la radioproctopathie : la radioproctopathie désigne les lésions radio-induites spécifiquement localisées dans le colon descendant-rectum. Le projet vise à développer des traitements curatifs ciblant cette condition. Cela pourrait impliquer l'utilisation de molécules thérapeutiques spécifiques, de dispositifs de libération locale ou d'autres approches novatrices pour promouvoir la guérison des lésions, réduire l'inflammation, restaurer la fonction normale du colon et éviter la fibrose. Cette approche curative pourrait améliorer la qualité de vie des patients et réduire les complications à long terme. En somme, les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Il comprend une meilleure compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites dans le colon, ainsi que le développement de traitements préventifs et curatifs pour la radioproctopathie. Ces avancées contribueront à améliorer les résultats cliniques, à réduire les effets indésirables de la radiothérapie et à améliorer la qualité de vie des hommes et femmes atteints de cancer pelvien.
Procédures
- Irradiations locales au niveau de l'abdomen sous anesthésie gazeuse (maximum 6 minutes), 3 fois avec un intervalle de 48 heures entre chaque séance. - Coloscopie sous anesthésie gazeuse, d'environ 10 minutes, une ou deux fois selon le groupe pour l’administration du traitement (patch ou gel). - Prélèvement de 10 ml de sang à partir de l'artère mésentérique avant l'euthanasie, d'environ 2 minutes, sous analgésique et anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Les deux modèles d’irradiation localisée du colon, chez le rat, utilisés dans ce projet sont déjà utilisés dans le laboratoire. Ce modèle d’irradiation du côlon peut toucher une petite zone de l’intestin grêle, qui est mobile, entraînant des signes cliniques spécifiques irréversibles : amaigrissement de l’animal accompagné d’un gonflement au niveau de l’abdomen. La mise en place du système enroulé se fait sous coloscopie avec anesthésie, de même pour le liquide gélifiant qui sera administré par voie rectale sous anesthésie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de valider in vivo sur un modèle de pathologie radio-induite cliniquement relevant l’efficacité de traitements locaux combinés. Pour évaluer l’efficacité thérapeutique d’un traitement, il est nécessaire d’utiliser un modèle intégré in vivo. De plus l’effet de ces traitements, pour qu’ils soient pertinents, nécessitent leur interaction avec les différents compartiments du côlon, condition retrouvée chez le modèle animal intégré. D'autre part, l'utilisation des organoïdes pour la réalisation de ce projet n'est actuellement pas techniquement possible, car il est nécessaire d'obtenir une monocouche orientée de cellules.
Réduction
Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes sont classiquement constitués de 10 à 20 individus selon le paramètre utilisé. Une analyse sera réalisée afin de comparer tous les groupes entre eux.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (aspect du poil, prise alimentaire, présence de fèces dans la cage, perte de mobilité…). De plus, des dispositifs d'enrichissement seront mis en place dans les cages pour créer un environnement stimulant pour les animaux. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et euthanasié si son état est jugé irréversible.
Choix des espèces
Le rat est un modèle clé en recherche préclinique, en particulier dans la recherche pharmacologique et toxicologique, en raison de sa similitude avec l'être humain dans l'élimination des toxicités. Le protocole d’irradiation proposé a été mis au point au laboratoire chez le rat. La taille du rat permet aisément la réalisation d’irradiations fractionnées. En outre, nous utiliserons des animaux de 275 g à 300 g pour les différentes études citées ci-dessus (rats à l’âge adulte). Pour la mise en culture des CSM (hors du champ d’application), nous utiliserons des rats GFP mâles ou femelles d6 semaines provenant de notre élevage interne. La multi-potentialité des CSM et leur capacité réparatrice est réduite avec l’âge, nous isolerons donc les CSM à partir de rats juvéniles.
Neuroprotection dans le cadre de l’hypoxieischémie néonatale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
650 rats, des nouveau-nés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une ligature de la carotide suivie d'une hypoxie leur provoque des lésions cérébrales que le porteur reconnaît irréversibles, avant l'administration de lactate, des examens d'IRM sous anesthésie et des tests de réflexes, de mémoire et de dépression avec restriction alimentaire. L'objectif déclaré est d'évaluer des stratégies de neuroprotection contre l'hypoxie-ischémie du nouveau-né humain, dont un complément alimentaire pour la femme enceinte. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne remplace le cerveau "dans son intégrité" et renvoie au long terme l'application clinique.
Objectifs
L’hypoxie-ischémie néonatale est un problème de santé publique majeur tant par son occurrence (1-6 cas pour 1000 naissances) que par sa létalité et par les troubles cognitifs et/ou infirmités motrices qu’elle engendre. Elle est caractérisée par une diminution du flux sanguin cérébral au niveau du cerveau du nouveau-né. La seule thérapie actuellement appliquée est l'hypothermie thérapeutique modérée (diminution de la température corporelle de quelques degrés pendant 3 jours maximum), mais environ la moitié des nouveau-nés n’y répondent pas favorablement. Les objectifs de ce projet sont de développer des stratégies de neuroprotection dans le contexte de l'hypoxie-ischémie néonatale, sur un modèle de ratons. Pour répondre aux objectifs, les effets neuroprotecteurs du lactate (substrat énergétique neuronal, administré par voie intrapéritonéale) et de polyphénols (administrés dans l'eau de boisson de la mère) seront évalués.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont : - le développement d’un complément alimentaire, riche en polyphénols, destiné à la femme enceinte pour prévenir les dommages induits par une hypoxie-ischéime néonatale - les résultats préliminaires de l'injection de lactate chez le rongeur permettront la mise en place d’une étude préclinique chez le porc, dont la physiologie est plus proche de l'humain. A long terme, cette neuroprotection de l’administration de lactate pourra être testée en clinique.
Procédures
Pour l'induction de l'hypoxie-ischémie, les animaux subiront une chirurgie puis une hypoxie. L'hypoxie-ischémie ser suivie par une hypothermie. Les animaux subiront une procédure chirurgicale (ligature de l'artère carotide commune ; réalisée une fois d'une durée inférieure à 10 minutes). Une hypothermie modérée sera mise en place à la sortie du caisson d'hypoxie-ischémie (1 fois, durée : 2 h). Une injection intra-péritonéale sera rélisée afin d'administrer le lactate (réalisée juste après l'hypoxie-ischémie et sur les deux jours suivant, durée : 2 s). Les animaux effectueront des examens par résonance magnétique nucléaire de diffusion sous anesthésie gazeuse ; technique non-invasive pour les animaux (durée : 30 - 45 min). Ils effectueront aussi des examens par résonance magnétique nucléiare fonctionnelle sous anesthésie administrée en intra-veineux (1 fois, à 45 jours d'âge, durée : 2 h). La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements de réflexes précoces (durée : 5 min) et de mémoire (durée 10 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (durée : test échelonné sur 3 jours ; durée du test : 10 min).
Impact sur les animaux
Lors de précédents projets, il a été noté une perte de poids chez un faible nombre de ratons, dans les 48-72 h suivant l’hypoxie-ischémie. Dans le caisson d'hypoxie-ischémie, tout comme lors de l'hypothermie, des difficultés respiratoires pourraient subvenir. L'administraton de lactate par injection intrapéritonéale pourrait engendrer une légère douleur due à l'insertion de l'aiguille. La réponse à l'hypoxie-ischémie est variable d'un individu à l'autre : dans de rares cas, des lésions cérébrales importantes pourraient subvenir. Elles représenteront un point limite. Un stress lié à l'anesthésie durant l'IRM, une perturbation du rythme cardio respiratoire entraîneront un arrêt de la séance d'imagerie. Les tests comportementaux pourraient être vecteurs de stress pour les ratons. La restriction alimentaire associée à la mesure d'un état dépressif pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 130). L'induction de lésions cérébrales par hypoxie-ischémie ne permettra pas d'utiliser les animaux pour un autre projet.
Remplacement
Des modèles d’hypoxie cellulaires existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de l’hypothermie et de pouvoir envisager une application rapide chez l’Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par (i) le fait que la compétence dans le modèle d’hypoxie-ischémie chez le rat est maîtrisée au laboratoire (pas de mise au point nécessaire), (ii) nous disposons de nombreux contrôles antérieurs (moins de contrôles à refaire), (iii) l'imagerie par résonance magnétique de diffusion ou fonctionnelle est une technique d’investigation non invasive et permet donc une suivi dans le temps des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux, (iv) l'utilisation d'outils statistiques.
Raffinement
La chirurgie sera réalisée sous anesthésie ; une injection d'analgésique locale sera réalisée avant l’incision et avant la suture. Les pertes de poids seront surveillées et à partir d'un certain point seront considérées comme atteignant un point limite. Des difficultés respiratoires post-opératoires entraîneront l'arrêt de la procédure. Les examens d'IRM seront réalisés sous anesthésie générale. Une modification du rythme cardiaque ou du rythme respiratoire entraînera l'arrêt de l'expérimentation. L'utilisation de gel ophtalmique durant les examens d'IRM préviendra le risque de sécheresse oculaire. L'IRM permet la quantification des volumes lésionnels.Le volume des lésions sera calculé, et au delà d'un certain pourcentage l'animal sera considéré comme atteignant un point limite. Une surveillance particulièrement accrue sera mise en place pour les 5 jours post-opératoires (couleur de la peau, estomac plein, mouvements, interactions avec la mère et les autres membres de la portée). Tous les tests de comportement seront réalisés par un unique expérimentateur, et dans une salle unique dédiée, permettant une habituation des animaux aux manipulations et à l’individu lui-même. Pour le test de dépression, nécessitant une privation de nourriture ponctuelle, la prostration de l’animal représentera un point limite. Au niveau de l’hébergement, les animaux seront élevés en cage collective, sur une litière de peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. Lors de ces observations quotidiennes, la capacité de l'animal à s'alimenter, le comportement et sa vivacité, la couleur de la peau ou l'état du pelage seront vérifiés.
Choix des espèces
Le rat Wistar est utilisé depuis plusieurs années dans ce modèle d'hypoxie-ischémie, ainsi de nombreux groupes témoins dans la littérature permettent de faire des comparaisons et limitent le nombre de témoins. Nous souhaitons suivre les animaux par IRM à 4 stades de développement: - sur des ratosns âgés de 7, 9 et 30 jours, par IRM de diffusion afin d'évaluer l'effet neuroprotecteur précoce des traitements administrés en phase aigüe de la pathologie (3 h et 48 h) et à 30 jours afin d’évaluer les effets neuroprotecteurs à long terme ; l’IRM fonctionnelle permettra, chez les ratons âgés de 50 jours d’évaluer les effets de la neuroprotection sur le remodelage des circuits neuronaux et la récupération fonctionnelle.
Validation in vivo d’un nouveau dispositif de mesure de l’élasticité des tissus mous : étude expérimentale sur modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 14
14 rats et 7 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats reçoivent une plaie cutanée au bistouri sur le dos et une injection intradermique, les souris une injection de médicament anticancéreux destinée à provoquer une nécrose de la peau, pour tester un nouvel appareil de mesure de l'élasticité des tissus comparé à deux dispositifs du commerce. Le porteur annonce des douleurs localisées, une perte de poids modérée et un stress lors des manipulations. Il présente l'outil comme plus simple et moins coûteux et renvoie au conditionnel son application clinique chez l'humain.
Objectifs
La caractérisation des propriétés mécaniques des tissus mous, à l’instar de l’élasticité cutanée, présente un intérêt majeur pour de nombreuses spécialités médicales et chirurgicales. Sur une peau cicatricielle (séquelles de brûlures, cicatrices post-opératoires ou post-traumatiques, cicatrices chéloïdes, greffes de peau, etc.) sa mesure répétée au cours du suivi objective l’efficacité d’un traitement et conforte l’examen clinique. Les technologies actuelles sont cependant imprécises, coûteuses et complexes à manipuler et il n’y a pas de protocole fiable utilisé en pratique clinique pour effectuer cette mesure. L’objectif du projet est de valider un nouveau dispositif de mesure de l’élasticité des tissus mous, indolore et non invasif. Une étude mécanique préalable a été réalisée sur des échantillons inertes mimant des tissus biologiques (Agar Agar de différentes concentrations). Les résultats ont montré une très bonne reproductibilité avec une erreur inférieure à 5% sur tous les échantillons, et de meilleures performances qu'avec les technologiques utilisées actuellement. L'objectif de ce nouveau protocole est de valider ce dispositif sur des tissus biologiques in vivo (modèles murins : la souris et le rat) en le comparant au Cutomètre® et au Myoton®, deux outils permettant la mesure de l’élasticité cutanée et des tissus mous. L’ensemble de ces expérimentations animales permettra d’assurer la cohérence en vue d’un futur essai clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus après analyses statistiques seront en premier lieu de confirmer l’applicabilité de notre dispositif à l’étude de l’élasticité des tissus mous in vivo sur un modèle murin, ainsi que la simplicité de cette mesure. Nous souhaitons démontrer la précision et la fiabilité de cet outil par comparaison au Cutomètre® et au Myoton®, pour un coût et une complexité de mise en oeuvre moindres. Ces résultats positifs permettront à court terme de développer une étude chez l’homme en pratique clinique usuelle. Notre outil pourrait permettre d’évaluer instantanément et in vivo l’élasticité d’un tissu mou biologique. Il pourra aisément s’intégrer au diagnostic et au suivi thérapeutique de l’ensemble des pathologies nécessitant une évaluation objective de ces propriétés mécaniques, et permettre un gain majeur en qualité de vie pour les patients cibles. Il s’agit d’un dispositif très simple puisqu’il se compose d’une masse équipée d’un ou plusieurs capteurs de force, et est ainsi peu coûteux en comparaison aux technologies déjà présentes sur le marché. A terme, son utilisation pourra s’étendre à d’autres domaines tels que la médecine régénérative, la cosmétologie ou la chirurgie carcinologique, par exemple via la délimitation en temps réel des marges tumorales lorsque celles-ci sont incertaines à l’inspection et à la palpation.
Procédures
Dans le premier protocole, il est effectué sur le dos des rats une perte de substance cutanée rectangulaire (plaie mécanique au bistouri). Elle est réalisée sous sédation chimique, après rasage à la crème dépilatoire et désinfection cutanée. Elle est ensuite recouverte de vaseline et bandée pour faciliter la cicatrisation. Il est également réalisé une injection intradermique ventrale d'un produit volumateur. Dans le second protocole, il est effectué sur le dos des souris une injection intradermique d'un médicament anticancéreux afin d'induire une zone de nécrose cutanée.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus et prévisibles, et cibles des stratégies de raffinement sont : - Douleurs localisées au niveau des zones étudiées (perte de substance cervico-thoracique droite et point d'injection ventral droit chez le rat, zone de nécrose dorsale droite chez la souris) - Perte de poids modérée - Stress majoré lors des manipulations initiales et lors des mesures régulières en cours d'étude.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'étude : 14 rats et 7 souris, au terme des 2 mois de l'étude.
Remplacement
Les alternatives non animales pour notre étude ont été exploitées lors de la phase initiale du projet, lors de l'étude mécanique préliminaire in vitro réalisée sur des échantillons d'Agar Agar de différentes concentrations mimant des tissus biologiques. Les résultats ont montré une très bonne reproductibilité avec une erreur inférieure à 5% sur toutes les concentrations en Agar et de meilleures performances qu'avec les méthodes élastométriques. L'objectif est désormais de valider notre outil sur le modèle animal, afin de le valider in vivo au cours d'un processus de cicatrisation complet. Ces résultats, s'ils sont positifs, permettront à terme de développer une étude chez l'homme en pratique clinique usuelle.
Réduction
Le nombre d'animaux requis pour notre étude a été calculé afin d'obtenir des analyses statistiques significatives en ce qui concerne la précision de nos mesures. Il est cohérent avec les protocoles suivis dans les études animales comparables. La durée totale d'étude de 2 mois a été retenue pour permettre un recul suffisant après cicatrisation, et ne pas prolonger inutilement le protocole. Elle est cohérente avec les délais des études comparables compris entre 1 mois 1/2 et 3 mois.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation des animaux avec des conditions de lumière et de température standardisées sera respectée en début d'étude, afin de limiter le stress animal. Une sédation sera réalisée avant chaque geste invasif, adaptée à la douleur. Concernant la perte de substance réalisée pour le protocole n°1, elle sera couverte de vaseline et bandée pour faciliter la cicatrisation à la phase initiale. Passé le délai de 14 jours, et puisque les mesures seront alors plus espacées, un pansement hydrocolloïde transparent sera appliqué entre chaque mesure. En cas de douleur postopératoire, un antalgique sera administré à l'animal selon les bonnes pratiques usuelles. La réaction locale aux points d'injection sera étudiée à chaque temps et des photographies seront réalisées. Le choix d'une perte de substance dorsale a été fait pour éviter le risque de grattage de la lésion par le rongeur. Les cages comporteront des tiges de coton pour nidifier et des maisonnettes en carton.
Choix des espèces
Les modèles murins (souris et rats) sont très adaptés au suivi cicatriciel et permettent des manipulations aisées. Il s'agit des modèles principalement utilisés dans les études comparables de la littérature. Les rats et les souris seront à l'âge adulte. Il n'est pas nécessaire d'utiliser des animaux plus jeunes, et leur surface corporelle ainsi que leurs capacités de cicatrisation seront optimales à ce stade de développement.
Enseignement pratique de la microchirurgie sur le modèle rat
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
750 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil, pour former des internes à la microchirurgie sous microscope. Chaque animal, ancien reproducteur destiné à l'euthanasie, sert à s'exercer aux sutures de microvaisseaux et de nerfs pendant environ trois heures. Le porteur applique le principe "Jamais la première fois sur l'animal" après entraînement sur substituts inertes et animaux morts. L'établissement déclare avoir utilisé 831 animaux là où 3000 étaient prévus, et en demande désormais 750.
Objectifs
Les formations sur animal vivant anesthésié visent à former les internes de chirurgie à la microchirurgie sous microscope opératoire. Elles complètent l’enseignement traditionnel par le compagnonnage et permettent de mettre les internes en situation réelle et en autonomie sans impliquer la vie d’un patient humain. L’enseignement pratique est complété par des cours théoriques dans différentes disciplines nécessitant la microchirurgie. La microchirurgie est une discipline exigeante, difficile et sa mauvaise réalisation peut compromettre la récupération du patient. Les internes ne peuvent être formés directement sur le patient. Le déroulé de l’enseignement est composé de différentes étapes dont la difficulté de réalisation est progressive. L’enseignement commence par 5 sessions de 3 h soit 15 h d’enseignement sur supports inertes et sur animaux morts pour former les participants au maniement des instruments de microchirurgie et au travail sous microscope. L’enseignement sur animaux morts permet de former les participants aux différentes voies d’abords chirurgicales et aux sutures qui seront ensuite réalisées sur l’animal vivant anesthésié. Durant ces TP, le travail du participant est évalué afin de déterminer s’il est apte à travailler sur l’animal vivant. Après cette validation des gestes techniques, il y a 11 sessions de 3 h chacune (10 sessions de formation et 1 session d’examen) sur animaux vivants. Durant ces sessions, différents types de gestes techniques seront abordés et représentent les spécificités techniques de chaque spécialité. En complément de l’utilisation d’animaux vivants, 3 sessions de 3 h sont réalisées sur corps humains issus des dons du corps à la science. Ces sessions permettent de réaliser des gestes techniques qui ne sont pas réalisables sur l’animal. Les gestes chirurgicaux portent sur la chirurgie des microvaisseaux (artère & veine) et des nerfs.
Bénéfices attendus
Les objectifs pédagogiques sont de former les internes en fin d’internat (5ème et 6ème semestre) avant qu'ils soient laissés en autonomie totale au bloc opératoire. Pour placer les participants dans les conditions de chirurgie, l’installation des animaux est semblable à celle du bloc opératoire (anesthésie, analgésie, asepsie et champage, même instrumentation).
Procédures
Sur animaux vigiles, une injections sous cutanée : environs 1 minute. Les gestes chirurgicaux sont éffectués sur animaux anesthésiés et analgésié sans réveil. En moyenne cet enseignement dure 3H.
Impact sur les animaux
L’étape de réception peut provoquer des blessures de bagarre au moment de la constitution du lot. Durant la phase d’acclimatation et malgré l’enrichissement, le risque de bagarre, la perte de poids quoiqu’exceptionnelle ne peuvent être exclus. Concernant les chirurgies, ce sont des procédures sans réveil. Les animaux sont sous anesthésie générale avec analgésie, complétée par une anesthésie locale après ouverture de la peau. Durant toute la procédure chirurgicale, le maintien de la narcose et de l'analgésie sont surveillés et les doses sont adaptées afin d’exclure tout réveil ou douleur de l’animal. Sans les traitements adaptés, les incisions du plan cutané et du péritoine peuvent générées de la douleur. Lors de la chirurgie au niveau de la cavité abdominale, un refroidissement et un dessèchement des viscères sont attendus.
Devenir
Les animaux sont utilisés dans le cadre de la formation à la chirurgie des internes. Du fait de la complexité des gestes techniques, il ne serait pas éthique, ni favorable de maintenir l’animal en vie après la formation. De ce fait, tous les animaux sont mis à mort sans réveil de l’animal.
Remplacement
Le développement de substitut inerte ou organique permet de plus en plus de remplacer l’animal, et dès que cela est possible, leur utilisation est privilégiée si elle permet de répondre aux objectifs de formation. Avant d’utiliser un animal vivant, les participants sont formés sur des substituts inertes, des animaux décédés et sur les corps humains (don du corps à la science). Malgré tout, la microchirurgie est complexe, impliquant plusieurs organes, nécessitent un support vivant, avec des tissus mobiles et vascularisés. Reprenant la doctrine chirurgicale qui tend à imposer le principe «Jamais la première fois sur le patient», nous appliquons «Jamais la première fois sur l’animal».
Réduction
Sur la précédent demande d’autorisation, l’évaluation prospective des besoins portait sur 3000 animaux sur 5 ans. Le développement de la simulation ex vivo et le recours systématique aux substituts ou corps humains, nous a permis de n’utiliser réellement que 831 animaux. De plus, après le COVID et pour des contraintes sanitaires, le nombre d’étudiant par promotion a été réduit de 40% passant de 20 étudiants à 12 étudiants. Cela a permis d’améliorer les conditions d’enseignement en apportant un environnement plus calme, une meilleure disponibilité du professeur. L’utilisation d’animaux morts issus d’autres TP a permis de réduire le nombre d’animaux vivants utilisés. Pour cette nouvelle demande, cela porte sur 750 animaux sur 5 ans afin de couvrir l’ensemble des formations existantes et nouvelles (suite à la supression du numérus clausus).
Raffinement
L’animal aura 1 semaine minimum en acclimatation. Ils sont hébergés en groupe de poids harmonieux. Pour cela, chaque animal est pesé le jour de la réception et ils sont regroupés par lot de 2 à 3 individus de poids proches. Leur environnement est enrichi avec des rouleaux, bâtons à ronger, coton. L’enrichissement est diversifié à chaque change hebdomadaire. Le change est fait le jour de sortie des animaux pour le TP afin de limiter le stress des animaux restants. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un hypnotique couplé à un analgésique pour réduire toutes sensations à la douleur. L’animal sera disposé sur un système chauffant (37-39°C) pour maintenir la température corporelle. Une anesthésie cutanée et intra-abdominale sera mise en place. Pour limiter le dessèchement des viscères, une technique de voie d’abord a été développée permettant de maintenir les viscères dans la cavité abdominale. Elles sont repoussées de part et d’autre de l'incision médiale et maintenues avec des compresses humides et chaudes sous la paroi abdominale. Ce raffinement améliore le maintien de la température corporelle et limite le dessèchement des viscèresde l'animal.
Choix des espèces
Le rat adulte (animal de réforme) présente un calibre des vaisseaux sanguins (carotide, aorte abdominale, artère fémorale) très proche des micro-vaisseaux sanguins et nerfs humains. La taille des animaux d’un poids moyen 600-750 g est très adaptée à l’apprentissage de la microchirurgie. Les rats utilisés sont adultes afin de présenter une taille de vaisseaux et de nerfs appropriée. Les animaux sont des individus de réforme (anciens reproducteurs) destinés à l’euthanasie.
Impact des polluants organiques persistants et de la signalisation AHR sur la fonction cardiaque dans un modèle prédisposé aux cardiomyopathies
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
224 rats prédisposés au syndrome métabolique vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage de la dioxine TCDD, un polluant reconnu cancérigène, sont soumis à un test d'effort sur tapis roulant avec choc électrique et à des imageries, avant une intervention cardiaque terminale qui les tue tous. L'objectif est de voir si une exposition chronique à faible dose aggrave le dysfonctionnement cardiaque. Le porteur affirme que les cultures et modèles ex vivo sont "inadéquats" et que les procédures ont un "caractère de stricte nécessité".
Objectifs
L'exposition aux polluants organiques persistants (POP) est un problème majeur de santé publique (OMS 2019), notamment en tant que facteur de risque de maladies cardiovasculaires. Les dioxines, et en particulier la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) sont parmi les POP les plus toxiques et persistants qui sont rejetés dans les écosystèmes en tant que sous-produits de divers processus de combustion et industriels. Malgré des politiques restrictives de réduction des émissions de POP les populations humaines continuent d'être chroniquement exposées aux dioxines car elles persistent des centaines d'années dans les sols et les sédiments, contaminant ainsi la chaîne alimentaire. Les dioxines sont lipophiles, s'accumulent dans les tissus adipeux et persistent pendant de nombreuses années dans l'organisme. L'exposition aux POP a été associée à un risque accru de développer une hypertension, une obésité, une résistance à l'insuline et un diabète de type 2, et donc un risque accru de maladies cardiaques et de décès. Concernant la TCDD, il a été démontré que l'exposition subchronique à une forte concentration de TCDD induit une légère hypertrophie cardiaque et une hypertension. Cependant, il est encore inconnu si l'exposition chronique et à faible dose de TCDD exacerbe le dysfonctionnement cardiaque chez l'Homme et les modèles animaux prédisposés aux cardiomyopathies, ainsi que les mécanismes sous-jacent à la cardiotoxicité induite par la TCDD. Ainsi, les objectifs de notre projet sont : 1) de déterminer si la toxicité cardiovasculaire d'une exposition chronique et une faible dose de TCDD est exacerbée dans un modèle murin prédisposé aux cardiomyopathies, 2) d'identifier les voies moléculaires affectées par l'exposition chronique à la TCDD, avec un accent particulier sur Aryl Hydrocarbon Receptor, dont l’activité est modulée par le TCDD et 3) de tester les effets d’antagonistes synthétiques de l'AHR sur les effets cardiotoxiques de la TCDD.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons à ce que les résultats de ce travail permettent de démontrer puis de déterminer le rôle du récepteur AHR dans les dysfonctions cardiaques et vasculaires et endothéliale lors d’une intoxication par la dioxine. Ceci permettra ainsi de nouvelles opportunités pour le développement d’approches thérapeutiques ciblées.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 manipulations interventionnelles de classe légère non invasives : - exposition par gavage à la TCDD et à l'antagoniste des récepteurs AHR pour une durée d'environ une minute par animal par semaine - echocardiographie environ 20 minutes par animal - IRM environ 45 minutes par animal - mesure de pression à la queue environ 10 minutes par animal. Les animaux seront soumis à 2 manipulations expérimentales de classe modérée : la capacité d'exercice environ 15 minutes par animal, et l'évaluation de la fonction rénale environ 3h par animal. Enfin les animaux seront soumis à une manipulatiob expérimentale de classe sans réveil d'une durée d'environ 20 minutes par animal. Les prélèvements (coeur, reins et aorte) se feront après la mise à mort de l'animal.
Impact sur les animaux
Concernant la TCDD, il a été démontré que l'exposition à une très forte concentration de TCDD a des effets cancérigènes notamment au niveau hépatique après plusieurs semaines d'exposition. Nous nous attendons également à retrouver un effet délétère au niveau cardiovasculaire après plusieurs semaines d'exposition. Pour la MANIP 1, qui correspond à l'administration de la TCDD par gavage, aucun effet indésirable ou nuisance ne sont attendus. Pour les MANIP 2, 3 et 4 (echocardiographie, IRM et mesure de pression à la queue), la température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à une table chauffante. Les animaux retrouveront conscience sur la plaque chauffante et seront ensuite replacés dans leurs cages. Pour la MANIP 5 (évaluation de la capacité d'exercice), lorsque le degré de fatigue est atteint et/ou que l'animal a des difficultés à rester sur le tapis roulant (indépendamment de la délivrance du choc électrique), l'animal sera retiré du tapis de course et le temps de course sera enregistré à la seconde près. Les rats seront habitués à cette mesure en la subissant une fois par jour pendant 3 jours consécutifs avant les mesures d’effort de base.
Devenir
Tous les animaux resteront en vie à l'issue de chaque manipulations expérimentales, excépté pour l'évaluation de l'hémodynamique intracardiaque qui sera une intervention terminale entrainant la mise à mort de tous les animaux à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées pour la bonne réussite de ce projet. En effet, ce projet se propose d’étudier, dans le contexte pathologique du syndrome métabolique, les effets cardiovasculaires et rénaux d’une exposition à la dioxine et/ou de l’antagoniste du récepteur AHR dans des conditions de physiopathologies intégrées, autrement dit, chez des rats représentant les caractéristiques observées chez l’Homme : une hypertension artérielle, une insuffisance rénale et un diabète. L’utilisation de cellules ou de modèles expérimentaux ex vivo est par conséquent inadéquate pour répondre de façon pertinente aux questions posées dans le cadre de ce travail. Ainsi, les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Sur la base des données historiques depuis 30 ans obtenues avec des agents pharmacologiques chez des rats atteints d'insuffisance cardiaque chronique sur le remodelage cardiaque et l'hémodynamique, nous avons effectué une simulation satistique pour chaque paramètre obtenu chez les animaux non traités. Sur ces bases nous estimons que le nombre d’animaux nécessaire est de 224 rats.
Raffinement
Après leur arrivée dans l’animalerie, les rats resteront une semaine en période d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Les rats seront hébergés pour groupe de 3 par cage afin de permettre des interactions avec leurs congénères. Le milieu de la cage sera également enrichi de carton pour leur permettre de réaliser des nids. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Différents paramètres seront évalués incluant le comportement (mobilité, activité normales et toilettage) ainsi que l’état physique (état de la peau, de la fourrure et des yeux, vitesse et profondeur de la respiration). Leur prise de poids sera également notée régulièrement. En présence de signes de souffrance légère une administration de buprénorphine 0,03 mg/kg par voie sous cutanée pourra être réalisée. En présence de signes de souffrance sévère ou de détresse constituant un point limite (perte de poids > 10%, paupières fermées, léthargie, comportement de retrait, vocalisations, température corporelle diminuée > 5ᵒC), l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
L'exposition aux TCDD a été associée à un risque accru de développer une hypertension, une obésité, une résistance à l'insuline et un diabète de type 2, et donc un risque accru de maladies cardiaques. Les rats Zucker fa/fa seront donc un modèle idéal pour évaluer les effets de la TCDD sur des individus prédisposés aux cardiomyopathies. Les rats Zucker fa/fa ou Lean (contrôle) utilisés seront des rats matures de 12 semaines ayant au moment de l'inclusion dans l’étude un syndrome métabolique. Ils auront 24 semaines au moment de leur mise à mort. La durée du protocole impliquera soit 3 soit 12 semaines d’exposition à la TCDD avec ou sans antagoniste du récepteur AHR pour pouvoir observer l’impact de la TCDD sur le système cardiovasculaire. Le choix du rat et son âge se justifie par l’expérience du laboratoire obtenue avec les différents modèles de syndrome métabolique au cours des derniers 15 années, utilisés pour évaluer les effets cardiovasculaires des nouveaux traitements pharmacologiques en collaborations avec des industries pharmaceutiques.