Rats
Evaluation comportementale des effets de nouvelles entités pharmacologiques dans trois modèles de mémoire chez le rongeur: le test du labyrinthe de Barnes, le test du labyrinthe en Y et le test de reconnaissance de nouvel objet
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1440
6 240 rongeurs, 4 800 souris et 1 440 rats, vont être utilisés, et la déclaration en compte 3 520 en souffrance légère et 2 720 en souffrance modérée. Selon les groupes, ils passent sous candidats médicaments un labyrinthe de Barnes, un labyrinthe en Y, dont une version impose huit jours de restriction alimentaire, ou un test de reconnaissance d'objet nouveau, et l'un des protocoles les expose à une lumière et un bruit forts pour les pousser à chercher un refuge. Les souris des lignées présentées comme reproduisant la trisomie 21 et le syndrome de l'X fragile passent les trois tests. Ces molécules viennent du centre de recherche du porteur, qui les trie selon leur effet sur la mémoire et renvoie les retombées pour les patients à "plus long terme", où le projet "pourrait permettre" de fournir des données qu'il dit "indispensables". Les souris de ces lignées et les rongeurs traités par des composés qui risqueraient d'interférer avec d'autres expériences sont tués, et les témoins pourront être réutilisés dans d'autres projets, 960 souris et 360 rats selon la déclaration.
Objectifs
Il existe de multiples formes de mémoire chez l’humain, avec notamment la mémoire déclarative (ou explicite, que l’on peut verbaliser), qui est perturbée dans de nombreuses pathologies telles que la maladie d’Alzheimer, la schizophrénie, l’autisme, ou encore des maladies génétiques telles que la trisomie 21, le syndrome de l’X Fragile… Afin de chercher des pistes thérapeutiques à ces pathologies, il est nécessaire de passer par des tests chez l’animal, et donc de pouvoir évaluer leur mémoire déclarative de manière objective, car ils ne peuvent pas la verbaliser. Différents types de tests comportementaux ont été mis au point dans ce but, en utilisant des stratégies distinctes. Un première stratégie vise à approcher la mémoire déclarative humaine chez l’animal en mettant en jeu un sous-type de cette forme de mémoire, la reconnaissance/familiarité, qui peut être évaluée chez le rongeur. Le test le plus utilisé est celui de reconnaissance de nouvel objet, que nous utiliserons dans ce projet. Une seconde stratégie utilisée pour évaluer la mémoire chez l’animal repose sur un parallèle existant entre mémoire déclarative humaine et mémoire spatiale animale, qui reposent toutes les deux sur les mêmes structures cérébrales et qui partagent des mécanismes. Divers dispositifs ont été validés dans la littérature afin d’étudier cette mémoire spatiale chez la souris et le rat, et nous en utiliserons deux dans ce projet : le labyrinthe de Barnes et le labyrinthe en Y. Grâce à ces trois tests comportementaux évaluant des types de mémoire différents, nous avons pour objectif de tester l’effet sur la mémoire de nouveaux candidats médicaments développées dans notre centre de recherche (dont la majorité ont pour cible des récepteurs du système nerveux central). C’est pourquoi nous travaillerons tout d’abord sur des animaux standards dans un contexte physiologique afin de tester l’effet sur la mémoire des composés en conditions basales. Nous prévoyons aussi d’utiliser des modèles murins de pathologies génétiques (Trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile) afin d’étudier l’effet bénéfique potentiel de nos composés pour réduire les déficits cognitifs présents dans ces modèles.
Bénéfices attendus
A court terme, et à l’échelle du laboratoire dans le développement préclinique de nouveaux candidats médicaments, ce projet permettra de caractériser leur effet sur différents types de mémoire (reconnaissance d’objet, reconnaissance spatiale, mémoire à court ou long terme). En travaillant tout d’abord chez des animaux standard en condition physiologique, on pourra ainsi sélectionner des candidats médicaments présentant des effets promnésiques (c'est à dire favorisant la mémoire) intéressants pour des applications dans des pathologies comportant des déficits de mémoire (exemples : maladie d’Alzheimer, schizophrénie, autisme…). Ou à l’inverse, nous pourrons par exemple exclure du développement préclinique des molécules ayant un effet néfaste sur la mémoire. D’autre part, ce projet inclus deux modèles murins de maladies génétiques (trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile), qui permettront de tester l’effet de nos nouveaux candidats médicaments sur les déficits cognitifs présents dans ces pathologies. Ainsi, à plus long terme et à l’échelle du développement clinique chez l’humain, ce projet pourrait permettre de fournir des données scientifiques précliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments pour traiter des déficits de mémoire dans différentes pathologies.
Procédures
Ce projet comporte 3 protocoles différents et indépendants. Dans le cas d’utilisation de souris et de rats standards, des groupes distincts seront soumis à ces 3 protocoles. En revanche, dans le cas de l’utilisation des 2 modèles souris de la trisomie 21 et du syndrome de l’X Fragile, les mêmes souris seront soumises aux 3 protocoles car ces souris sont disponibles en quantités limitées. Le premier protocole est le test du labyrinthe de Barnes. Ce protocole sera déoulera sur plusieurs jours (une à deux semaines), et pour chaque journée chaque animal ne sera testé dans le labyrinthe qu'une à trois fois pour une durée de 3 minutes maximum chacune. Le second protocole est le test du labyrinthe en Y, qui pourra se décliner en 3 versions différentes. La première version se fera en un seul essai de 8 minutes; la seconde version impliquera une restricton alimentaire légère (pour motiver la recherche de récompenses alimentaires) et se déroulera sur 8 jours avec au maximum 3 essais par jour de quelques minutes; la troisième version aura lieu sur 1 à 2 jours avec 2 essais de 5 min séparés de 1h à 24h. Le troisième protocole de ce projet est le test de reconnaissance de nouvel objet. Ce test a lieu sur 2 jours, avec trois phases de 5 à 10 minutes chacune au sein du dispositif et séparées de 4-5h à 24h. Pour chacun des 3 protocoles de ce projet, des candidats médicaments seront administrés aux rongeurs à différentes phases du protocole (avant l’entraînement, avant le test de mémoire…) selon l’effet recherché.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, dans le cadre d'un protocole spécifique, les rongeurs pourront être soumis à une courte période de restriction alimentaire. Pour un autre protocole, la lumière et le bruit ambiant seront forts pour motiver la recherche d'un refuge dans un labyrinthe, et seront donc source de stress chez les animaux. Enfin, toutes nos procédures impliquent une manipulation des animaux pour les introduire dans les différents dispositifs, ce qui est source de stress, mais qui sera atténué par une habituation préalable et par le transport dès que possible via des tunnels ou sur le bras de l'expérimentateur pour éviter le soulèvement par la queue.
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort, tout comme les souris modèles de pathologies génétiques qui ne peuvent pas être réutilisées dans d'autres projets. Cependant, les animaux contrôles standards pourront être réutilisés dans d’autre projets selon les objectifs de recherche. La décision sera prise par le responsable projet (ou par une personne compétente désignée par lui) ou par le vétérinaire.
Remplacement
Ce projet ayant pour but de tester l’action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire normale et pathologique, il est nécessaire de passer par des modèles animaux avant toute administration à l’homme. En effet, l’évaluation d’un processus aussi complexe et intégré que la mémoire, mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée in vitro ou in silico.
Réduction
Un effectif minimum de 16 souris/12 rats par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours après l’arrivée des animaux est prévue avant le début des expérimentations. Tout au long des études, les animaux sont hébergés e, groupe dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, igloo, appareil de nidification…), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi du bien-être par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Chaque animal est manipulé et pesé quotidiennement en phase active de protocole afin de diminuer le stress induit par la manipulation. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration de produits afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont très classiquement utilisés dans la littérature au sein de tests comportementaux évaluant la mémoire, et les protocoles sont bien établis pour ces deux espèces, en particulier pour les trois tests utilisés dans ce projet. De plus, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire telle qu’elle est testée chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire humaine, avec même des tests mnésiques réalisés chez la souris qui peuvent être transposés de manière très fidèle chez l’humain. D’autre part, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour lesquelles les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. En effet les tests de mémoire sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitive et d’attention fonctionnelles.
Pré-conditionnement des cellules stromales mésenchymateuses ex vivo avec alpha-tocophérol : accélération de la régénération osseuse ?
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
133 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 28 mis à mort sans réveil comme donneurs de cellules et 105 opérés du crâne sous anesthésie en souffrance modérée. Un défaut osseux est créé chirurgicalement dans la calotte crânienne puis comblé par un biomatériau, les rats étant hébergés deux à huit semaines avant mise à mort pour analyser la régénération osseuse. Le porteur décrit une douleur post-opératoire prise en charge par analgésie et des points limites déclenchant l'euthanasie. Il affirme que ces études de reconstruction osseuse "ne peuvent être menées que sur des animaux".
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle le traitement, pré-implantation, de cellules souches autologues avec une molécule nommée l’alpha-tocophérol (AT) peut améliorer leur participation au phénomène de réparation osseuse. Cette hypothèse est établie sur la base des résultats montrant que l’AT favorise la formation de cellules productrices de tissu osseux à partir de cellules souches mésenchymateuses. Ces effets sont obtenus sans effet toxique de l’AT.
Bénéfices attendus
Les précédentes expériences effectuées in vitro suggèrent que les CStroM traitées avec l’AT pourraient avoir une meilleure capacité de régénération osseuse se traduisant par une résolution des défauts plus rapide et de meilleure qualité. Dans ce cas, nous allons tester, sur un modèle animal, la preuve de principe d’une procédure thérapeutique (accélération de la régénération osseuse) innovante. La mise au point d’un essai préclinique sur grand animal est la perspective directe de ces expériences, utilisant les réactifs et consommables de grade clinique, compatibles avec une procédure ex vivo de médicament de thérapie innovante (MTI). Dans la même perspective, nous préparerons ces cellules pour le développement d’un MTI et d’un essai clinique de grade 1/2 en médecine humaine. De même, ces résultats peuvent orienter la recherche sur l’effet de l’AT ex vivo sur les cellules souches isolées à partir d’autres tissus, ce qui pourrait, à son tour, ouvrir des perspectives vers le développement d’autres MTI.
Procédures
Les animaux (rats) prévus pour ce projet seront soumis à une seule procédure chirurgicale (procédure 1, durée environ 30 minutes, 105 rats), à l'exception des rats donneurs de cellules qui seront euthanasiés pour obtenir des cellules souches mésenchymateuses (28 rats).
Impact sur les animaux
Durant ce projet, uniquement une douleur post chirurgie est attendue pour les animaux. Comme indiqué dans la suite du formulaire, l’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur et/ou par le personnel de l’animalerie. Cette estimation sera ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements [voir annexe 2 et 3]. Les critères utilisés seront ceux de Lloyd.
Devenir
Les animaux (105 rats) ayant subi l'unique procédure 1 seront hébergés entre 2 et 8 semaines puis sacrifiés pour prélever les implants et réaliser les différentes analyses ayant pour but de quantifier la régénération osseuse induites par les matériaux implantés.
Remplacement
Le processus de développement et de validation des biomatériaux utilisés pour la reconstruction osseuse nécessite des études précliniques qui ne peuvent être menées que sur des animaux et, dans le cas de ce projet, sur des rongeurs. Les études faisabilité, de fonctionnalité et de régénération osseuse chez l’animal sont indispensables pour le développement des biomatériaux. Ces tests menés chez le rongeur sont une étape nécessaire pour permetre la suite de notre projet dirigé vers la clinique. Le principe général est de créer chirurgicalement un défaut osseux dans la calvaria puis de mettre en place un biomatériau de comblement permettant de stimuler la reconstruction osseuse. Les procédures d’évaluation comprennent un suivi clinique (inflammation, douleur), ainsi qu’un suivi histologique et radiologique par microscanner, après euthanasie des animaux.
Réduction
Afin d'utiliser le moins d'animaux possibles mais également afin d’avoir un nombre suffisant d’échantillons à la fin de l’étude, tout en prenant en compte le risque de perte d’animaux, une approche statistique nous a permis d'établir que notre projet comprendra des groupes de 5 rats pour l'expérience préliminaire puis de 8 rats pour chaque condition dans les expériences suivantes. Pour l’analyse statistique, nous comparerons les résultats obtenus avec les différents échantillons.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et dans des cages avec de l'enrichissement adapté afin de leur offrir un cadre d'hébergement optimal: litière en copeaux de peupliers et des jouets. Après la chirurgie, chaque animal se réveillera dans une cage séparée pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, l’animal reviendra dans sa cage d’origine. L'anesthésie des animaux sera réalisée au masque (anesthésie gazeuse) par de l’isoflurane (4,5% pour l’induction, puis 2.5% pour le maintien). L'analgésie sera réalisée en pré oépratoire par une par une injection sous-cutanée d’un anesthésique local (lidocaïne) et par une injection sous-cutanée de buprénorphine, 30 minutes avant l'intervention, ainsi qu'une injection en post-opératoire. L'estimation de la souffrance animale sera constamment mesurée: 1/ Tout au long de l’intervention chirurgicale, les signes avant-coureurs du réveil seront surveillés et, si un de ces signes apparait, une augmentation temporaire du taux d'isoflurane à 4,5% sera réalisée. Si les signes persistent, l'animal, qui sera toujours sous anesthésie sera euthanasié par dislocation cervicale. 2/ L’estimation de la souffrance sera mesurée dans les 5 premiers jours post chirurgie concernant leurs activités et comportements. Les critères utilisés seront ceux de Lloyd et al. : le score limite est de 14 et au-delà, l’animal sera euthanasié. Toute souffrance plus modérée sera traitée par l’administration quotidienne, par voie intra-péritonéale, de buprénorphine pendant 3 jours. La persistance de douleurs entraînera l’euthanasie de l’animal. Les critères suivants seront prépondérants dans la détermination du point limite : apparence de l’animal, prise d’eau et de nourriture, signes cliniques (rythme cardiaque et respiratoire), comportement naturel et provoqué. En cas de blessures corporelles suite à un combat, l’animal sera isolé et soigné avant de retourner dans sa cage pour être surveillé en continu. En cas de problème de cicatrisation des plaies, les soins nécessaires seront effectués. Selon la gravité, la plaie sera ré-ouverte pour enlever pus ou hématomes, et un traitement antibiotique. Les animaux ayant atteint les points limites seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le défaut de calvaria chez le rongeur est un modèle largement utilisé dans notre recherche, validé dans la littérature. C'est un modèle de choix pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Pour ce projet, nous devons nous placer dans des conditions expérimentales in vivo qui miment l’allogreffe. Nous travaillerons ainsi avec une souche allogénique de rats couramment utilisé pour ce type d’expérimentation : des rats Sprague Dawley. Nous utiliserons un modèle de rat plutôt qu'un modèle plus petit (comme la souris) car ce modèle est mieux adapté aux types de matériaux (nature et taille) et car nous avons déjà une bonne expertise de la culture des CStroM de rats qui rend ce projet réalisable sans mise au point.. Les animaux seront commandés et hébergés environ 2 semaines avant l’intervention pour permettre leur acclimatation. Nous utiliserons des animaux adultes (10 à 12 semaines pour les rats). Cela permettra d’éviter que la croissance osseuse des animaux vienne interférer avec les processus de régénération.
Développement d’un nouveau biomatériau naturel poreux pour une médecine régénérative en vue de traiter les communications bucco-sinusiennes EU 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une communication bucco-sinusienne est créée chirurgicalement au palais sous anesthésie, puis comblée par un biomatériau à base de collagène, avec un suivi par scanner pendant trois semaines avant mise à mort au 21e jour pour analyse histologique. Le porteur décrit des douleurs post-opératoires, des difficultés d'alimentation, des infections et un risque de mortalité estimé inférieur à 5 pour cent. Il affirme qu'il n'est "pas possible de se passer d'animaux" pour vérifier l'efficacité du biomatériau avant un essai chez l'humain.
Objectifs
Les communications buco-naso-sinusiennes (CBS) sont fréquentes en cancérologie, d'origine iatrogène de la tête et du cou et peuvent être causées par la chirurgie et/ou la chimiothérapie. Elles se manifestent sous forme de fistules entre la cavité orale et les sinus maxillaires ainsi que les fosses nasales. Ces communications peuvent entraîner des symptômes tels que des infections récurrentes des sinus, une obstruction nasale, des douleurs faciales et des écoulements nasaux persistants. Les traitements actuels sont souvent invasifs et présentent un risque élevé d'échec. Pour résoudre ce problème, nous proposons un nouveau biomatériau sec, poreux et bioactif fabriqué à partir de collagène de types I et de lysat plaquettaire. Ce biomatériau a pour objectif de fermer complètement les CBS tout en libérant des molécules bioactives qui favorisent la réparation tissulaire (facteurs de croissance, des cytokines...). Le but de ces travaux est d'évaluer l'efficacité de ce biomatériau sur des animaux dans le cadre du traitement des CBS. Il vise à offrir une solution thérapeutique supplémentaire aux CBS de petite ou moyenne taille, en particulier celles qui sont récidivantes et réfractaires au traitement par lambeaux. L'utilisation de ce biomatériau plutôt que d'un lambeau permettrait d'éviter la morbidité associée (séquelles du site donneur) et de raccourcir la durée de l'opération. Cela améliorerait la qualité de vie des patients, en particulier ceux qui doivent porter des plaques palatines obturatrices à vie en raison de CBS persistantes. Les approches utilisant des biomatériaux bioactifs d'origine naturelle, comme celle que nous proposons, représentent une alternative de choix pour combler ce vide thérapeutique. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs situés dans un même bâtiment (un établissement pour l'expérimentation y compris la chirurgie et l'hébergement, le second pour l'imagerie).
Bénéfices attendus
- Prouver l’efficacité des biomatériaux pour la régénération tissulaire in vivo - Perfectionner le modèle animal de CBS chez le rongeur
Procédures
L'induction de la communication bucco-sinusienne et la mise en place des biomatériaux seront réalisées sur l'ensemble des rats (60) sous anesthésie générale, avec une durée estimée de 60 minutes (EU1/2). Chaque rat sera placé allongé sur le dos sur un tapis chauffant, avec la bouche maintenue ouverte à l'aide d'un élastique placé sur les incisives maxillaires. La procédure consistera en la création d'une perte de substance palatine, conformément à la méthode décrite dans la littérature. Cette perte de substance sera ensuite comblée avec nos biomatériaux sélectionnés, soit l'aérogel de collagène et de lysat plaquettaire, soit l'aérogel de collagène seul, à l'exception du groupe contrôle. Lors de l'application des aérogels, une pression douce sera exercée avec une compresse jusqu'à obtention de l'hémostase. Un suivi de 3 semaines sera effectué, avec une observation hebdomadaire par scanner (TDM) sous anesthésie générale, pour une durée estimée inférieure à 15 minutes. Ceci permettra d'évaluer la régénération tissulaire induite par nos biomatériaux dans les groupes traités et de la comparer à la régénération spontanée du groupe contrôle (EU 2/2). Enfin, après une anesthésie générale, tous les rats seront euthanasiés au 21e jour ce qui prendra quelques secondes, pour être disséqués et des analyses histologiques seront réalisées sur les échantillons (EU 1/2).
Impact sur les animaux
Douleurs : Il est possible que des signes de douleur post-opératoire apparaissent en raison des incisions chirurgicales, de la manipulation tissulaire et des lésions tissulaires pendant la chirurgie. Ces douleurs peuvent avoir des effets négatifs sur le bien-être général des animaux, tels que des problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité. Difficultés alimentaires : Des difficultés à s'alimenter peuvent survenir en raison de douleurs ou d'inconfort buccal, des modifications anatomiques de la cavité buccale et des sinus qui affectent la fonction de mastication et rendent l'ingestion des aliments moins efficace./Infection : Il est possible que des infections se développent au site de la communication bucco-sinusienne ou de la réparation subséquente avec l'aérogel./ Mauvaise cicatrisation : Il est possible que la réparation avec l'aérogel ne soit pas efficace et que la communication bucco-sinusienne persiste ou se reforme. /Effets secondaires systémiques : L'utilisation de l'aérogel pour la réparation de communications bucco-sinusiennes chez les rats peut entraîner des effets secondaires systémiques, tels que des modifications du poids corporel, du métabolisme ou d'autres paramètres physiologiques. Réaction immunitaire : Il est possible que certains animaux développent une réaction allergique à l'aérogel, ce qui pourrait entraîner des symptômes tels que de l'inflammation, des rougeurs, des démangeaisons ou une nécrose tissulaire. /Mortalité : Il est possible que des animaux décèdent en raison de complications liées à la procédure de réparation avec l'aérogel, telles que des infections, des complications chirurgicales ou des réactions inattendues (risque estimé inférieur à 5%).
Devenir
Mise à mort nécessaire pour examen histologique (évaluation biointégration, biodégradation, formation osseuse).
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal. Une seule formulation de mousse composée de collagène et de lysat plaquettaire parmi 3 formulations de départ sera évaluée, car l’évaluation in vitro (culture cellulaire 3D) a montré son fort potentiel.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le critère de jugement principal est le taux de rats présentant un succès. Un succès est défini comme une régénération de plus de 50% de la surface.
Raffinement
La totalité des procédures effectuées sera réalisée par un personnel qualifié composé de concepteurs de projet et d’applicateurs de procédures expérimentales ainsi de chirurgiens ORL. Un entrainement sur des cadavres de rats sera effectué afin de permettre aux opérateurs de se familiariser et raffiner la procédure chirurgicale. Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur (buprenorphine). Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages utilisées et le nombre d’animaux par cage sont conformes à la règlementation en vigueur. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et la structure possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie. Le transfert des cages se fera sur chariot (moins de 20 minutes de transfert entre deux services situés dans un même bâtiment, au même étage). Le biberon est retiré des cages pour la durée du transfert pour éviter tout déversement de liquide dans la litière. Les animaux gardent accès à la nourriture.
Choix des espèces
Bien que les modèles animaux ne puissent reproduire précisément la physiologie ou l'anatomie humaine, le rat se distingue en tant que modèle animal particulièrement avantageux pour notre étude. Il présente une combinaison d'atouts significatifs, tels que son coût abordable, sa robustesse et sa facilité d'entretien. Notre sélection s'est orientée vers la race Wistar Han, avec des mâles âgés d'environ 7 à 9 semaines, pesant entre 251 et 275 grammes. Toutes les expérimentations animales seront rigoureusement conduites au sein d'une installation de Zootechnie agréée. Cette décision repose sur des études préalables similaires à notre approche de recherche, qui ont été précédemment publiées.
Activité physique et neurogénèse comme facteur protecteur des effets délétères de la surconsommation de sucre à l’adolescence sur le cerveau et le comportement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
346 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie cérébrale d'une heure, un isolement en cage individuelle et une surconsommation forcée de sucre à l'adolescence, avant des analyses post-mortem. Le porteur cherche à montrer que l'activité physique protège le cerveau des effets du sucre, en présentant les retombées comme des arguments pour de futures campagnes de prévention. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier un tel comportement.
Objectifs
Dans le présent projet, nous souhaitons tester l’hypothèse selon laquelle une activité physique qui favorise la production de nouveaux neurones, pourrait avoir des effets protecteurs et/ou thérapeutiques sur les effets délétères du sucre consommé en excès à l’adolescence et d’en demontrer le rôle de cause a effets par des manipulations neurobiologiques de cette neurogénèse.
Bénéfices attendus
La surconsommation de sucre au cours d’une période vulnérable de développement du cerveau qu’est l’adolescence, induit des effets délétères à l'âge adulte (dépression, perte de motivation, anxiété...). Ce projet combine approches environnementale (activité physique) et neurobiologique (cibler des populations de nouveaux neurones spécifiques) pouvant potentiellement remédier à ces pathologies. D'une part, la démonstration qu’une surconsommation de sucre à l’adolescence entraîne un déficit de nouveaux neurones, spécifiquement créés pendant cette periode, serait une donnée essentielle pour alimenter les campagnes luttant contre les mauvaises habitudes alimentaires chez les jeunes. D’autre part, la démonstration que l'augmentation de production ou d'activité de ces nouveaux neurones puisse remedier à ces déficits comportementaux à l’âge adulte, permettrait également de proposer des approches thérapeutiques et de remédiation naturelle. Une démonstration causale entre activité physique, stimulation de nouveaux neurones créés pendant l’adolescence et remédiation des déficits, serait une avancée majeure pour les neurosciences.
Procédures
Dans ce projet, 262 rats subiront une intervention chirurgicale pendant 1 heure. 134 rats recevront également un entraînement comportemental pendant 30 minutes pour toute la durée de l'apprentissage et le test (entre 20 et 40 jours). 20 rats vont passer pour les test GTT et ITT deux fois ; chaque fois, on va faire 7 prélèvements avec a chaque fois d’une goutte du sang prelevée pendant 1 seconde a fin de mesurer la glycémie. Tous les rats (346) seront isolés 16 jours pendant la surexposition au sucrose et 4 semaines pendant l’exercice physique (256). Tous les rats seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir un stress du à l'isolement en cage individuelle ou en roue d'activité, ceci sur des périodes courtes allant de 16 jours à 4 semaines. Les étapes de chirurgie peuvent entraîner quant à elles des douleurs, et dans de rares cas des infections. Les prélévements du sang peuvent entraîner de douleur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
De plus en plus d’études utilisent le modèle animal pour modéliser certaines pathologies chez l’homme. Les nombreuses similitudes entre les humains et les animaux en termes de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que certaines caractéristiques neuronales et hormonales permettent de justifier l’utilisation du modèle animal comme outil dans de nombreuses études. En effet, il est impossible de retrouver ces pathologies, ces caractéristiques ou la realisation d'activité physique chez un modèle in vitro ou informatique. Le modèle animal est pour cela le modèle le plus adapté.
Réduction
Dans le but de diminuer le nombre d’animaux, les expériences seront conduites uniquement chez des mâles. Un effectif maximum de 10 animaux par groupe est nécessaire pour nos analyses statistiques afin de s'abstenir de la variabilité interindividuelle. Un même groupe contrôle est utilisé pour 2 thématiques dès que cela est possible.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages collectives (2 rats par cage maximum) dans un milieu enrichi (litière cellulose, papier ouaté, bâton à ronger, nid compact) (sauf pendant les périodes d’accès aux roues, les roues étant en elle-même un enrichissement). La surveillance des animaux est réalisée de façon quotidienne. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites ci-dessous : - perte de poids de 15% sur trois jours - automutilation - développement de plaies ou d'infections - poil mal entretenu ou aspect général anormal - changement de comportement (particulièrement la prostration) - activité cardiorespiratoire ralentie ou accélérée En cas de blessure, les plaies seront nettoyées et désinfectées. En cas de perte de poids, l'animal peut être réhydraté si besoin par injection sous-cutanée de saline ou saline-glucose. On peut également déposer des miettes humides issues de la nourriture habituelle directement dans la cage. En cas de douleur évidente, une injection d'analgesic est réalisée et peut être renouvelée 1 fois par jour pendant 3 jours maximum. En cas de non amélioration de l'état général de l'animal, le responsable du projet sera averti et prendra la décision de la nécessité de mise à mort de l'animal. En post-opératoire, les animaux sont gardés sur tapis chauffant jusqu’à leur réveil avant de retourner dans leur pièce de stabulation. Ils reçoivent une injection d'analgesic toutes les jours pendant 3 jours. Les sutures sont désinfectées et surveillées. Pour éviter la douleur pendant le prélèvement, un anesthésique local va être administrée avant le procédure.
Choix des espèces
Notre projet de recherche implique une expérimentation chez le rat, qui constitue pour les neurobiologistes un support indispensable à l'étude de l'organisation et du fonctionnement du système nerveux central en situation normale mais également, et surtout, en situations expérimentales ou pathologiques. L'ensemble de nos travaux considère l'animal in vivo, et met à profit différents protocoles comportementaux développés et codifiés depuis de nombreuses années chez ces espèces, et irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau des rongeurs est proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus dans ces conditions permettent de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre de surconsommation de récompenses. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 28 jours, ce qui correspond à l'entrée dans la phase d'adolescence.
Effets de composés pharmacologiques sur les effets addictifs de l’héroïne chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
660 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des composés de l'industrie pharmaceutique censés réduire les rechutes à l'héroïne. Les animaux subissent des chirurgies de pose de cathéter intraveineux, de minipompe sous-cutanée ou d'électrodes intracrâniennes, suivies de tests comportementaux et de prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique qu'une partie des rats est tuée pour prélever des échantillons, les autres étant maintenus vivants entre deux procédures enchaînées. Il affirme que seul l'animal permet d'étudier ces mécanismes et justifie le recours au rat par un "continuum" des processus de récompense avec l'humain.
Objectifs
La dépendance aux opiacés est un problème majeur de santé publique. Des recherches sont entreprises pour identifier des traitements capables d’aider à l’arrêt durable de la consommation, notamment en réduisant les effets du sevrage et les risques de rechute. L’objectif de ce projet est d’évaluer de nouveaux composés issus de l’industrie pharmaceutique pour leurs capacités thérapeutiques dans ces deux domaines. L’étude se fait au moyen de modèles validés chez le rat. L’avantage en est le contrôle strict de la consommation préalable de drogue et des conditions d’application du composé.
Bénéfices attendus
La dépendance aux opiacés est un enjeu de santé publique mondial. Ces expériences permettent d'étudier les bénéfices de nouveaux traitements dans la dépendance physique et psychologique aux opiacés.
Procédures
Des animaux (n = 36 à 180) seront soumis à une chirurgie intaveineuse pour l'implantation d'un cathéter intraveineux. Ce type de chirurgie est effectué sous anesthésie, en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 30 min. Des animaux (n= 48 à 240) seront soumis à l'implantation sous-cutanée d'une minipompe. Ce type de chirurgie est effectué sous anesthésie, en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 5 min. Des animaux (n = 48 à 240) seront soumis à une chirurgie stéréotaxique pour l'implantation d'électrodes, pour enregistrements électroencéphalographiques (durée 45 min à 1h30), puis 7 jours plus tard à l'implantation d'une minipompe sous-cutanée (durée: 5min). Ces chirurgies sont effectuées sous anesthésie, en conditions aseptiques, sur couverture chauffante.
Impact sur les animaux
Les animaux sont soumis à des chirurgies et tests comportementaux successifs dont le degré de gravité va de léger à modéré pour des procédures qui sont globalement de gravité modérée. Les nuisances attendues sont celles associées à une chirurgie vasculaire, d'implantation et retrait d'une minipompe sous-cutanée, ou stéréotaxique, dans des conditions où toutes les mesures sont prises pour réduire douleur et risque d’infections (aseptie, anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, suivi post-opératoire).
Devenir
Mise à mort des animaux dans le cas de trois des procédures pour prélever des échantillons. Les animaux des autres procédures sont gardés vivants car elles sont suivies d’une autre procédure.
Remplacement
Seul le modèle animal permet d’interroger les mécanismes neurobiologiques difficilement accessibles chez l’homme. De plus, l’étude du comportement addictif ne peut se réduire à la simple étude de l’effet de la drogue. Ce comportement met en jeu des mécanismes psychopharmacologiques complexes qui ne peuvent pas être appréhendés par des modèles ex vivo.
Réduction
Nous procédons à des analyses statistiques afin de déterminer le nombre minimum de sujets nécessaire pour obtenir un résultat fiable.
Raffinement
Le confort de l’animal est pris en compte tout au long de sa vie au moyen d’une grille d’évaluation et la définition de points limites et critères d’arrêt. Un soin particulier est porté à la formation des expérimentateurs pour qu'ils sachent détecter tout signe de mal-être et ne soient pas eux-mêmes source de mal- être par une manipulation inadaptée. Les soignants qui s’occupent de nos animaux sont encadrés par, ou sont eux-mêmes, des personnels diplômés soigneurs animaliers. Les expériences se déroulent quand les animaux sont actifs (phase nocturnes) et leur sommeil est ainsi respecté. Les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur (sauf week-ends où ils sont observés). L’anesthésie et la douleur post-opératoire sont gérées avec des molécules adaptées. Les chirurgies sont pratiquées sur couverture chauffante puis la récupération post-opératoire se fait en chambre post-opératoire chauffée. Pour enrichir l’environnement, des nids végétaux sont placés dans chaque cage et renouvelés systématiquement lors du change.
Choix des espèces
Compte tenu des questions que nous posons, il est nécessaire d’utiliser une espèce mammifère dont le développement des réseaux neuronaux permet l’expression d’un comportement aussi complexe que la prise de drogue. Or il a été montré un continuum entre les mécanismes psychologiques et biologiques des processus de récompense entre le rat et l’homme, et ces processus sont à la base de la dépendance, étudiée dans ce projet. Nous utilisons des rats adultes âgés de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire (250-275g). Dans la mesure où nous procédons à une période d'habituation de 18 jours, les animaux doivent être suffisamment jeunes à leur arrivée au laboratoire, ce qui justifie notre choix.
Caractérisation d’un nouveau modèle de rat pour la Dystrophie Musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
163 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 68 d'entre eux et sévère pour 95. Porteurs d'une dystrophie musculaire proche de la maladie de Duchenne, ils subissent un prélèvement sanguin au niveau de l'œil, des mesures de force musculaire par contraction, un test d'agrippement et un conditionnement de peur de cinq minutes par jour pendant cinq jours. Le porteur reconnaît que la mesure de force peut être douloureuse et que le conditionnement repose sur un stimulus stressant. Il affirme que les questions posées ne peuvent être obtenues que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie du cœur et des muscles squelettiques. Au fur et à mesure que la maladie progresse, la faiblesse musculaire peut entraîner des difficultés fonctionnelles, telles que des difficultés à monter les escaliers ou à se lever d'une chaise. La maladie évolue lentement et tous les patients atteints deviennent dépendants d'un fauteuil roulant. Chez les patients en fauteuil, la faiblesse des muscles intercostaux et du diaphragme entraîne une insuffisance respiratoire. Les anomalies cardiaques se traduisent par une hypertrophie des cavités cardiaques entraînant une cardiomyopathie dilatée, qui conduit au décès des patients vers l'âge de 30 ans. La DMD est causée par des mutations d'un gène situé sur le chromosome X, qui entraînent des anomalies dans l'expression de la protéine appelée dystrophine, dont la fonction est de protéger la membrane des cellules musculaires lors de la contraction. La dystrophine est également exprimée dans le cerveau. À ce jour, le rôle des différentes formes de dystrophine dans le cerveau n'a pas été suffisamment décrit. Les objectifs de ce projet sont d'une part de caractériser l'évolution de la maladie chez un modèle génétique animal de la DMD que nous venons de créer, d'autre part de le comparer à des modèles proches mais génétiquement disctincts, en vue de préciser le rôle de chacune des formes de dystrophine dans le fonctionnement cérébral.
Bénéfices attendus
Une fois bien décrit, notre souhait est de pouvoir utiliser ce modèle pour développer des traitements efficaces. En outre, ce modèle nous aidera à comprendre la fonction spécifique d'une des formes de la protéine Dystrophine dans le développement et le fonctionnement du cerveau. Cette connaissance précise permettra d'éclairer les décisions à venir sur le choix des futures stratégies thérapeutiques à évaluer pour traiter certes les muscles des patients, mais aussi les déficits mentaux dont certains patients sont atteints.
Procédures
Les animaux seront prélevés une fois au sinus rétro-orbitaire avant la mise à mort, sous a'anesthésie générale qui requiert une injection sous-cutanée qui dure 5 secondes. Le prélèvement sanguin dure moins de 30 secondes. La durée d'un enregistrement de l'activité électrique cardiaque est de 15 minutes. La durée d'un enregistrement de l'activité ventilatoire est de 30 minutes. La durée d'une séquence de test d'agrippement est de 20 minutes. La durée d'un enregistrement de force est de 90 minutes, anesthésie comprise. La durée du conditionnement de peur est de 5 minutes par jour, pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire. Nos analyses sur un modèle proche ont révélé que jusqu'à l'âge de 10 mois, les anomalies fonctionnelles des rats DMD ne causent pas de problème majeur pour la vie quotidienne des animaux (rythme circadien, toilettage, alimentation, sommeil, état général). Au-delà de 10 mois d'âge, la force musculaire des rats diminue, leur muscles masticatoires sont moins efficaces et ils ont tendance à moins s'alimenter, ce qui justifie une vigilance accrue pour prévenir une baisse de masse pondérale. Nous appliquerons toutes les méthodes qui ont prouvé leur efficacité pour maintenir les animaux qui vieilliront dans un état de bien-être, jusqu'à l'atteinte d'une combinaison de points limites qui déclenchera la mise à mort compassionnelle. Lors de la caractérisation neurologique qui accompagne l'évolution de la maladie, les animaux seront soumis à un stimulus stressant inconfortable mais léger, destiné à évaluer leur capacité de mémorisation associative. La mesure de force provoque une contraction musculaire qui pourrait être douloureuse. Nos animaux seront donc sédatés, anesthésiés et toute douleur, même légère, sera prévenue par une prémédication adaptée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Nous souhaitons avec ce projet répondre à des questions qui ne peuvent être obtenues que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante. Par exemple, nous allons évaluer l'influence d'une forme particulière de la protéine appelée Dystrophine sur le développement et l'architecture de l'encéphale des animaux, ainsi que sa contribution sur des fonctions cognitives et comportements complexes qui requièrent une coordination fonctionnelle entre plusieurs régions de l'encéphale. Lorsque nous pourrons répondre à des questions avec des cellules ou des dispositifs de pseudo-organes nourris et connectés entre eux par un réseau microfluidique, nous le ferons pour éviter tout recours non justifié à l'animal vivant.
Réduction
Notre laboratoire a cumulé de nombreuses données sur ce modèle de rats DMD. Les calculs de puissance statistique nous recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce que nous avons validé avec d'autres projets terminés. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Puis, nous utilisons une analyse statistique adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. Par ailleurs, en raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible de réduire les cohortes d'animaux sans perte d'information biologique robuste.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage respecte l'alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Additionnellement, les analyses prévues ont toutes été optimisées afin de minimiser le nombre d’anesthésie/injection/stress et dérangement subis par les animaux. Tous les tests pouvant être réalisés lors de la même anesthésie ont été regroupés et les tests réalisés sur animaux réveillés sont également rassemblés afin de limiter le stress et la fatigue induite par le dérangement des animaux pendant leur période de repos.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris mdx, mondialement utilisé, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin de DMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Pour la caractérisation phénotypique et l'étude de la survie, nous allons utiliser des animaux de l'âge de 3, 6 et 12 mois afin de suivre les animaux à chacune des étapes décisives de la trajectoire de la maladie : initiation de la maladie avec mort précoce des muscles et perte de gain pondéral quotidien, plateau de la maladie installée avec perte de capacité de réparation musculaire par sénescence précoce des cellules souches et enfin, dégradation clinique et évaluation post-mortem de l'ensemble des biomarqueurs pour créer un jeu de données de référence utilisable dans les futurs essais précliniques.
Modèle de valvulopathies associées à la Filamine A chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
9 700 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 200 d'entre eux et modéré pour 7 500. Ils subissent des séances d'imagerie sous anesthésie dès le deuxième jour après la naissance et jusqu'à douze mois, des injections répétées ou un gavage pendant douze semaines et une biopsie de la queue pour le génotypage, pour étudier une valvulopathie cardiaque liée à une mutation. Le porteur signale des risques d'infection, de perte de poids et une douleur légère liée à la biopsie. Il affirme qu'une approche de "physiologie intégrée" est nécessaire et que la maladie ne peut être modélisée in vitro ou in silico.
Objectifs
Le prolapsus valvulaire mitral (PVM) est l’une des pathologies cardiovasculaires les plus fréquentes, et est associé à un haut taux de morbidité et de mortalité. A l’heure actuelle, aucun traitement pharmacologique n’est disponible pour les patients porteurs d’un PVM, la seule option étant la chirurgie valvulaire mitrale, une approche thérapeutique très invasive. Notre projet a pour objectif d'analyser et d’identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la survenue du PVM, mais aussi de la cardiomyopathie associée à cette maladie valvulaire que nous avons récemment décrite chez les patients. Par l’analyse génétique d’une grande famille vendéenne, notre équipe a identifié la première mutation associée au PVM : la mutation P637Q sur le gène FLNA (chromosome X). Un modèle de rat présentant cette mutation a ensuite été généré par l’équipe. Notre projet s’appuie donc sur l’étude de ce modèle unique de rat. Nos premiers résultats nous ont permis d’identifier les voies de signalisation majeures impliquées dans le processus physiopathologique lié au développement de la pathologie valvulaire. L’inflammation et la réponse immunitaire sont apparues comme l’un des acteurs majeurs de ce processus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement et la progression du PVM, ainsi que l’identification de potentielles cibles thérapeutiques pour traiter les patients.
Procédures
Des approches d’imagerie (échocardiographie et IRM) ainsi que des électrocardiogrammes de surface sont réalisés. Ces approches non invasives sont réalisées, sous anesthésie, dès le jour 2 après la naissance jusqu’à 12 mois (nombre maximal par animal = 8). Des injections répétées (journalièrement ou hebdomadairement) en intra péritonéal ou un gavage chez les rats sont réalisées, sur une durée maximale de 12 semaines, selon les protocoles établis. Une biopsie de queue est réalisée pour le génotypage des animaux.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effet secondaire n’est attendu lors de la réalisation de l’Axe 1. L’utilisation de traitement (Axe 2 & 3) peut être associée à des effets indésirables de type infection, perte de poids, réduction de la mobilité ou changement de comportement des animaux, même si les données de la littérature sont très rassurantes. Le prélèvement d'une biopsie de queue peut entrainer une douleur légère de courte durée. Ces potentiels effets indésirables seront suivis quotidiennement, et les animaux présentant des point limites seront sacrifiés et le protocole adapté au besoin.
Devenir
Après chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de caractériser l’atteinte valvulaire, par différentes approches expémentales complémentaires.
Remplacement
La modélisation in vitro ou in silico de la pathologie valvulaire cardiaque est limitée. En effet, les valves subissent à chaque cycle cardiaque des stress mécaniques multiples (tension, pression, flux) et répétitifs, qu’il est impossible de modéliser. De plus, le retentissement sur le myocarde de la pathologie, ne peut lui non plus être modélisé in vitro ou in silico. Une approche de physiologie et pathophysiologie intégrée est donc nécessaire pour répondre aux questions auxquelles nous faisons face. La culture primaire de cellules permet de s’affranchir des problématiques liées à la surexpression et sous expression de protéines in vitro, qui dans tous les cas ne permettront pas de modéliser l’effet d’une mutation ponctuelle telle que celle que nous étudions.
Réduction
Des analyses intermédiaires seront réalisées et permettront selon les résultats obtenus de réduire le nombre d’animaux par conditions. De plus, selon l’avancé des expérimentations in vitro et les premiers résultats obtenus en termes de quantité de cellules disponibles, nous pourrons réduire le nombre d’animaux traités chaque semaine, ainsi que le nombre de semaine d’expérimentation.
Raffinement
Les rats sont hébergés en cages ventilées enrichies en tunnel et frisottis, avec un accès à l’eau et la nourriture en continue. Les approches d’imagerie proposées sont non invasives et permettent de suivre un même animal longitudinalement. Elles sont réalisées sous anesthésies à l’isoflurane. Pour ce qui est des protocoles faisant intervenir un traitement, un suivi quotidien durant la phase de traitement sera effectué afin de répertorier l’apparition de points limites. Cette approche permettra de modifier/raffiner le protocole expérimental.
Choix des espèces
De nombreux processus et systèmes biologiques inter-régulés et intégrés sont décrits dans le PVM. Il est donc impossible de substituer ou modéliser par des approches in vitro ou in silico l’ensemble de ces processus. Le recours au modèle animal est donc primordial. L’utilisation d’un modèle KI permet quant à lui d’étudier une protéine mutée endogène, ce qui est primordial au regard de l’activité ubiquitaire et intervenant dans différentes voies de signalisation de la Filamine A (les modèles KO pour ce gène ne permettent pas ce type d’étude). La souche choisie pour générer le modèle est une souche non consanguine de rat Sprague Dawley, qui nous permet donc de mimer au mieux la pathologie humaine (mutation ponctuelle dans un environnement génétique hétérogène). De plus, les potentielles cibles thérapeutiques pourront être testées sur le rat FlnA-P637Q qui récapitule la complexité des processus physiopathologiques en jeu. Rappelons que le modèle de rat est particulièrement bien adapté à l’exploration des valves, qui sont des tissus très petits et difficiles à imager sur les souris. Nos données préliminaires suggèrent la présence de la pathologie valvulaire dès 7 jours post naissance. Nous devons déterminer le stade précis où la pathologie est présente afin d’étudier les mécanismes initiateurs. De plus, l’évolution de la pathologie a un intérêt thérapeutique. Nous allons donc utiliser les rats entre la naissance (J0) et l’âge de 12 mois.
Évaluation des effets d’une thérapie peptidique sur la régénération musculaire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une lésion du muscle par injection de chlorure de baryum et deux prélèvements sanguins au niveau de l'œil, une partie étant des rats porteurs d'une dystrophie musculaire proche de la maladie de Duchenne qui se dégrade jusqu'à la mise à mort. Le porteur indique administrer des analgésiques et présente la thérapie peptidique testée comme dépourvue de toxicité. Il renvoie les bénéfices pour les enfants malades au long terme et affirme que la validation à l'échelle de l'"organisme entier" ne peut se faire in vitro.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare qui est causée par différentes mutations qui peuvent survenir tout au long du gène de la dystrophine porté par le chromosome X. La myopathie est rapidement invalidante.notamment avec la perte de la marche à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles respiratoires et du muscle cardiaque entraine une insuffisance cardiorespiratoire fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune thérapie curative. Cependant, le traitement par les glucocorticoïdes, largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte de la marche et le décès d'environ 2 à 8 ans, avec le désavantage de provoquer un grand nombre d’effets secondaires qui dégradent la qualité de vie des patients. L'absence de dystrophine dans les cellules cardiaques et les fibres des muscles squelettiques induit une dysfonction et une fragilité puis une rupture des membranes cellulaires, soumises à des forces d'étirement lors des cycles de contraction/relâchement. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique et la fibrose (remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux non contractile). Cette combinaison d’évènements empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice du traitement avec un peptide candidat sur les capacités régénératives du muscle compromises dans le modèle original du rat DMD. Ce peptide est un nouvel acteur dans la gestion de la progression de la DMD grâce à son nouveau mécanisme d'action. Il permet de rééquilibrer la balance vers la regénération aux dépens de l’inflammation dans les muscles atteints par la maladie. Plus particulièrement, il devrait améliorer la contribution des cellules souches du muscle à la réparation musculaire. Ce traitement devrait donc permettre de bénéficier simultanément de différentes propriétés thérapeutiques sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. En cas de bénéfice évident chez les rats, les données précliniques produites seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. A long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. La diminution de la dégénérescence musculaire, aussi bien au niveau des muscles squelettiques qu’au niveau du coeur, retarderait la progression de la maladie et pourrait même prévenir la perte de la marche et l'insuffisance respiratoire ou cardiaque fatale. Cette thérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant ou en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires. Nous prévoyons également une étude comparative avec les glucocorticoides seuls ou en combinaison avec le peptide étudié afin de vérifier ses effets et de voir un potentiel effet conjugué des deux traitements. Le but est également de permettre d’obtenir un terrain favorable aux thérapies curatives ultérieures.
Procédures
Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbital 2 fois. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus un traitement anti-douleur injectable. La procédure d’induction de la blessure du muscle tibial antérieur sera réalisée sous anesthésie générale et induite par l'injection intramusculaire d'un produit chimique après un traitement anti-douleur local. Cet acte nécessitera moins de 5 minutes. Les animaux seront ensuite réveillés et traités avec un anti-douleur injectable toutes les 8h pendant 2 jours au minimum et jusqu’à la mise à mort en cas de signe de douleur après ces deux jours. Il n'y a pas de chirurgie prévue.
Impact sur les animaux
La lésion musculaire induite par le chlorure de baryum provoque la mort des cellules musculaires qui entraine une sensibilité excessive d'origine inflammatoire. Nous connnaissons bien les conséquences de ce processus temporaire et avons anticipé toute forme de ressenti de la douleur par les injections de buprénorphine, très efficace par expérience sur ce type de procédure. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Ces défaillances combinées conduisent à la nécessité d'une mise à mort compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie ce qui garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Les procédures de ce projet n’incluent que des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers. En ce qui concerne le traitement, il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection du peptide étudié. En effet, il est reconnu que la thérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité. Pour ce qui est du traitement avec le Déflazacort (anti-inflammatoire), sur la durée de traitement envisagée, nous n’attendons pas d’effet indésirable majeur mais nous serons particulièrement attentifs à la possible perte de poids observée précédemment avec d'autres molécules de la même famille.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.
Remplacement
Le peptide extracellulaire utilisé a été identifié comme une protéine cible de médicaments dans de nombreuses maladies, en particulier dans les troubles associés à l'inflammation. Le tests in vitro ont démontré son efficacité sur la prolifération cellulaire cependant la validation à l'echelle de l'organe ou de l'organisme entier ne peuvent être reproduit in vitro. Le traitement avec une forme ameliorée de cette protéine lors d’une lésion musculaire chez la souris, favorise la guérison du tissu en induisant la prolifération des cellules souches musculaires et en mobilisant les macrophages sans accentuer dramatiquement l'inflammation. Sur la base de ces résultats préliminaires, nous souhaitons avec ce projet valider les effets d’un traitement avec ce peptide chez le rat DMD qui représente une modèle plus robuste de la dystrophie musculaire de Duchenne que le modèle souris mdx couramment utilisé.
Réduction
Le modèle de rats DMD est maintenant bien caractérisé et reproduit de façon très similaire le développement de la pathologie humaine. Les calculs de puissance statistique recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce qui a été validé avec d'autres projets terminés utilisants des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). La correction des données avant analyse statistique a été optimisée et adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wild type, WT) et DMD traités avec un placebo ou le diluant du produit à tester, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible ici de ne pas inclure d'animaux WT, sans perte d'information biologique de référence.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de l'homme constitue un modèle apprécié. Les outils récents d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin. Pour la procédure de lésion musculaire induite, nous utiliserons des rats sauvages de 10 semaines puisqu'il s'agit ici de tester l'effet du composé sur la régénération musculaire dans un modèle de lésion induite bien calibré dans notre laboratoire. Pours les procédures de traitement avec les corticoides seuls ou en combinaison avec le composé à tester, nous utiliserons des animaux DMD à l'âge de 10 semaines. Notre étude de caractérisation du modèle rat DMD ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire (remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux) est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 10 semaines permettra d’évaluer la capacité du composé testé à réduire l’endommagement musculaire et par conséquent, à différer l’installation progressive de la fibrose et ses conséquences fonctionnelles sur les muscles.
Effet d’un extrait végétal standardisé dans la prévention des dérèglements métaboliques et inflammatoires associés à l’obésité chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
40 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans une intervention unique de prélèvement sanguin puis d'euthanasie. Leurs organes, notamment des segments d'intestin, sont prélevés pour tester ex vivo un extrait végétal censé agir sur les troubles liés à l'obésité. Le porteur indique n'attendre aucune nuisance et présente les rats comme une étape avant l'espèce cible, le chien, pour prélever des organes qu'il dit non prélevables chez ce dernier. Il affirme que le remplacement des rats n'est pas possible pour compléter les études in vitro et in vivo du projet.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de réaliser des expérimentations ex vivo innovantes pour explorer l'action d'un extrait végétal standardisé, notamment au travers d'un challenge sur des organes d'intérêt (comme les segments d'intestins). En effet de nombreuses études ont révélé le rôle central de la dysbiose intestinale dans l'initiation et l'entretien du syndrome métabolique. L'extrait végétal standardisé étudié pourrait avoir une action prébiotique et être utilisé comme substrats par les micro-organismes de l'Hôte de manière bénéfique. Le premier sous-objectif de ce projet est d'étudier l'impact d'un extrait standardisé sur des dérèglements induits ex vivo mimant ceux observés dans l'obésité. Le second sous-objectif est de comparer cet effet ex vivo entre l'extrait standardisé et plusieurs de ses composants majeurs connus pour leur action bénéfique sur les paramètres étudiés.
Bénéfices attendus
Notre hypothèse principale est que l'action synergique des composants majeurs de l'extrait végétal standardisé réduisent les effets délétères du challenge mimant les désordres métaboliques de l'obésité. Par ailleurs l'éffet totum de la plante devrait être supérieur à celui de ses composants majeurs. Ainsi ce projet pourrait explorer de nouveaux effets non ou peu connus de cet extrait végétal standardisé et proposer une nouvelle approche pour lutter contre les troubles de l'obésité.
Procédures
Une intervention pour tous les animaux (40 rats) : anesthésie, prélèvement sanguin et euthanasie.
Impact sur les animaux
Les animaux ne recevront pas de traitements invasifs et seront euthanasiés. Une seule contention sera réalisée pour l'injection intra-péritonéale. Pas de nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux.
Devenir
Avant le prélèvement des organes les rats seront euthanasiés.
Remplacement
Le remplacement des rats n'est pas possible pour répondre aux questions de l'étude et compléter les études in vivo et in vitro associées au projet. Les rats sont utilisés afin de valider les effets de l'extrait végétal standardisé étudié avant de mettre en oeuvre les protocoles dans l'espèce cible : le chien ; pour limiter le nombre d'expérimentations sur celui-ci. L'utilisation du rat nous permet aussi d'étudier des organes, non prélevables chez le chien.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum afin de pouvoir effectuer une analyse statistique dont la puissance est suffisante pour pouvoir montrer un effet et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement et de paramètres testés étant répété sur chaque rat, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera surveillé tout au long du protocole par leur observation quotidienne de l’état général et du comportement. Les conditions d'hébergement et les méthodes expérimentales utilisées seront les plus adaptées pour réduire toute souffrance et tout dommage que pourraient ressentir les animaux. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Les animaux sont deux par cages avec eau et nourriture à volonté.
Choix des espèces
Nous utilisons le rat en prémice de l'espèce cible (chien) afin de compléter notre étude pour valider les effets de notre extrait végétal standardisé tout en poussant les analyses sur des organes spécifiques afin d'approfondir notre exploration (comme l'étude de la perméabilité et la réactivité intestinale qui requiert l'analyse de l'intestin en chambre de Ussing et en chambres d'organes isolés), non prélevables chez le chien. Les rats sont acclimatés à l'âge de 6 semaines avant de commencer l'étude à 8 semaines (cycle de 12h jour/nuit). Cela permet d'éviter des résultats faussés par le stress induit lors du changement d'environnement.
Etude de capacités cognitives et apprentissage de gestes techniques chez le rat
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour un enseignement et l'entraînement de doctorants et de personnels. Ils sont d'abord soumis à des tests cognitifs de détection de la nouveauté et de localisation, puis utilisés pour l'apprentissage par tutorat d'injections et de chirurgies stéréotaxiques du crâne. Le porteur indique que la chirurgie stéréotaxique peut provoquer douleur et hébergement en cage individuelle, avant la mise à mort pour prélèvement du cerveau. Il affirme que l'acquisition de ces gestes techniques est "nécessaire" et ne peut se faire que sur des rats.
Objectifs
Ce projet constitue la partie pratique d’un enseignement portant sur les méthodes d’études de capacités cognitives cher le rat. Ces capacités sont illustrées dans deux tâches comportementales, une tâche de détection de la nouveauté et une tâche de localisation d’un lieu. Ces animaux pourront ensuite être utilisés pour la formation par tutorat de doctorants, post-doctorants et personnels statutaires ayant suivi les formations réglementaires, conformément à l’arrêté du 1er février 2013, afin d’acquérir les gestes techniques requis pour la réalisation des procédures expérimentales des projets de recherche dans lesquels ils seront impliqués. Cette formation par tutorat pourra porter sur la pratique d'injections périphériques et d'interventions chirurgicales stéréotaxiques. Elle sera assurée par des personnels experts de ces domaines au sein du laboratoire et validée par la responsable du suivi des compétences.
Bénéfices attendus
En permettant aux étudiants d’assister à la passation de tests comportementaux dans les conditions réelles d’un laboratoire, ce projet contribue de manière essentielle à leur formation et à leur sensibilisation aux bonnes pratiques en matière d’utilisation des animaux à des fins scientifiques. La formation par tutorat est nécessaire à l’acquisition des gestes et au maintien des compétences requises pour la réalisation des procédures expérimentales.
Procédures
Les animaux qui seront utilisés pour la formation par tutorat seront soumis au maximum à une injection pendant cinq jours consécutifs, une intervention chirurgicale et une injection pour leur mise à mort.
Impact sur les animaux
La chirurgie stéréotaxique peut induire de la douleur et une altération de l’état de santé des animaux. Elle peut également nécessiter un hébergement temporaire en cage individuelle.
Devenir
La mise à mort des animaux de la procédure est nécessaire au prélèvement de leur cerveau.
Remplacement
Les objectifs du projet ne peuvent être atteints qu’en utilisant des animaux (évaluation de fonctions cognitives ; acquisition de gestes techniques ou maintien de compétence sur le modèle rat).
Réduction
Le nombre d’animaux (24 par an) a été déterminé de manière à permettre d'assurer cet enseignement pour 12 binômes/trinômes d'étudiants par an.
Raffinement
A leur arrivée au laboratoire, l’état général des animaux est rapidement évalué au sortir de la boîte de transport, ils sont pesés puis placés en binômes dans des cages enrichies avec deux bâtonnets de bois à ronger. Après deux semaines d’acclimatation, ils sont pesés régulièrement et familiarisés à la manipulation par les porteurs du projet. La diffusion d’un bruit de fond dans l’animalerie (station musicale pendant la phase lumineuse) permet de diminuer leur réactivité aux bruits soudains auxquels ils sont sensibles et qui peuvent accompagner par exemple le changement des cages. La visite quotidienne permet de détecter rapidement des signes de mal-être et une prise en charge adaptée (alerte au responsable de projet et à la Structure Bien-Etre Animal et sollicitation du vétérinaire désigné si nécessaire). Des points limites adaptés à chaque étape du projet ont été définis. La chirurgie stéréotaxique est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique systémique et locale. Pendant la semaine qui suit la chirurgie, le suivi quotidien est renforcé.
Choix des espèces
Le rat est l’une des espèces les plus utilisées en neurosciences comportementales et l'une des espèces utilisées au laboratoire. Les animaux, peu réactifs vis-à-vis de l’homme, se familiarisent très rapidement aux manipulations nécessaires à la passation d’un test comportemental. Leur coopération, associée à la richesse de leur répertoire comportemental, en fait des sujets particulièrement adaptés à l’enseignement. A leur arrivée au laboratoire, les rats sont âgés de 4-5 semaines, un âge auquel notre expérience montre que les binômes constitués cohabitent très bien à l’âge adulte. Les tests comportementaux sont réalisés lorsqu’ils sont âgés de 10-12 semaines, ce qui correspond à un âge auquel leur système nerveux est complètement développé. Les animaux sont mis à mort au plus tard à l’âge de 6 mois, un âge auquel ils ne présentent qu’exceptionnellement des pathologies
Sauvetage pharmacologique des symptômes sensoriels, émotionnels et cognitifs de rats exposés à la séparation maternelle néonatale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
864 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 432 dans des procédures classées sévères. Séparés de leur mère dès les premiers jours de vie pour reproduire les effets de la prématurité, ils reçoivent des injections répétées, une chirurgie sous anesthésie profonde et des tests de nociception, d'anxiété et de cognition. Le porteur indique que ce modèle induit anxiété et douleur, et que les mères, rendues anxieuses par la séparation, sont tuées après le sevrage. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne peut restaurer les réseaux neuronaux impliqués et retient le rat comme modèle de la prématurité humaine.
Objectifs
Les données cliniques suggèrent que la prématurité impacte le développement du système nerveux, modifiant plusieurs paramètres neurologiques à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) chez le rongeur est un modèle de stress reflétant la prématurité humaine et induisant des altérations nociceptives, une anxiété accrue, ainsi que des troubles des comportements sociaux. Ces altérations sont associées aux dysfonctionnements du ocytocinergique (OT), qui joue un rôle dans les réponses au stress et à la douleur. La douleur a déjà été étudiée dans le modèle de SMN au niveau sensoriel et émotionnel, mais les potentielles altérations cognitives de la SMN sont encore méconnues chez l’animal, alors que la cognition est une des composantes principales de la douleur chez l’Homme. Elles ont été examinées dans les structures de l’émotion chez l’Homme. Plusieurs études ont démontré une hausse de molécules pro-inflammatoires dans le cerveau de rats SMN sans ces structures. Dans ce contexte, la première étape du projet vise à préciser le comportement des animaux SMN en étudiant leurs potentielles altérations cognitives à l’âge adulte. Par la suite, le but du projet est aussi d’expliquer ces altérations comportementales : différentes hypothèses cellulaires et moléculaires seront confirmées ou infirmées grâce à l’injection de différentes molécules durant la période de séparation ou à l’âge adulte. Ainsi, le mode d’action moléculaire de l’ocytocine dans le cas de séparation précoce pourra être précisé.
Bénéfices attendus
Le modèle de SMN a permis de décrypter nombre des mécanismes d’altération du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, l’étude permettra de mieux comprendre l’impact d’un stress néonatal non douloureux (i.e. une séparation précoce avec la mère) sur les processus cognitifs à l’âge adulte, ainsi que les mécanismes et structures mises en jeu lors de ce stress. Ce projet vise aussi à caractériser l’action potentiellement bénéfique de l’ocytocine et de molécules du système ocytocinergique sur le phénotype altéré des animaux SMN et donc à envisager l’utilisation de ces molécules en clinique comme moyen thérapeutique. En plus, l’effet de molécules inhibitrices des cellules gliales sera étudié pour comprendre le rôle de la neuroinflammation observée chez les rats séparés. En effet, d’après la littérature, les marqueurs de l'inflammation sont directement associés à des déficits de la fonction cognitive, qui sera aussi étudiée dans notre étude. Comprendre le lien entre les deux pourrait fournir des informations pour prévenir le déclin cognitif après un stress précoce.
Procédures
La moitié des animaux recevra un total de 10 injections (1 injection quotidienne de 10 sec pendant 10 jour). L'autre moitié des animaux recevra un total de 3 injections durant 5 min sous anesthésie générale 2 heures avant chaque test comportemental. Une chirurgie sous anesthésie générale profonde d'une durée de 45 min sera réalisée 1 semaine avant la 1ère injection. Les tests comportementaux pour évaluer la nociception, l'anxiété et la cognition des animaux (5 à 40min/animal) seront réalisés 1 seule fois chacun entre le 30ème et le 60ème jour postnatal, avec un délai de 24h minimum entre chaque test.
Impact sur les animaux
Le modèle de séparation maternelle néonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. La SMN induit également au niveau comportemental une anxiété accrue chez la mère. Une attention particulière est accordée à la surveillance du site d’injection pour repérer un potentielle infection ou plaie. Cette surveillance est aussi appliquée post-chirurgie, les animaux étant douloureux pendant quelques jours après la chirurgie, et pour repérer une potentielle infection ou inflammation de la plaie, auquel cas des soins seront apportés à l’animal. Un stress mineur sera causé aux animaux lors du maintien de ceux-ci par contention pour les injections ainsi que lors des tests comportementaux.
Devenir
Toutes les mères de cette étude seront mises à mort après sevrage de leurs petits (P21) puisque la SMN leur cause potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. En fin d’expériences, tous les animaux seront également mis à mort après une anesthésie préalable et des prélèvements seront effectués.
Remplacement
Les comportements d’anxiété, la cognition et la douleur étant des processus intégrés, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature. De plus, l’étude vise à caractériser les propriétés et le mode d’action de molécules d’intérêt dans notre modèle, et il est donc impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable de restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux du projet, la solution controle injecté aux animaux sera commune à toutes les molécules utilisées au cours de l’étude. Ce nombre d’animaux a été calculé pour obtenir des résultats fiables et robustes. L’intégralité des animaux de chaque portée sera analysée à chaque fois, permettant également de préciser les différences mâles-femelles si elles sont observées.
Raffinement
A leur arrivée, les femelles gestantes sont laissées 1 semaine dans l'animalerie pour acclimatation. Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Les animaux sont hébergés en cages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Dans ce cas, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Les chirurgies se feront sous anesthésie avec une analgésie pré- et post-opératoire, et les animaux seront observés quotidiennement en respectant les points limites fixés avant de la chirurgie et en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental de animaux.
Choix des espèces
Le rat est un standart en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de SMN a déjà été bien caractérisé chez cette espèce, permettant de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus, ce modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3ème trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3ème trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3ème trimestre de gestation chez l’Homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie postnatales chez le rat; ainsi, les animaux sont utilisés à partir du 2ème jour post-natal.
Altérations métaboliques dans la prise compulsive d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 81 tués pour prélèvement du cerveau et 15 proposés pour servir à des formations à l'expérimentation animale. Ils sont isolés et soumis pendant 21 semaines à une alcoolisation volontaire, à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie et à des sessions où la prise d'alcool est associée à un événement aversif. Le porteur indique que l'isolement et ce modèle augmentent l'anxiété des rats, et reconnaît que 15 d'entre eux ne développeront pas l'appétence pour l'alcool attendue. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne permet d'évaluer un comportement d'addiction à l'alcool.
Objectifs
Le métabolisme cérébral est profondément altéré suite à une prise excessive et répétée d'alcool. L'objectif ici est donc de démontrer qu'en corrigeant le métabolisme cérébral en changeant certains apports alimentaires chez le rat, l'on peut modifier des comportements associés à l'addiction à l'alcool.
Bénéfices attendus
Comprendre les altérations métaboliques en lien avec l'addiction à l’alcool et les façons d'intervenir de manière efficace pour les corriger pourraient permettre à terme le développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces contre cette maladie psychiatrique.
Procédures
Les animaux suivront une procédure comportementale avec alcoolisation volontaire sur une période de 21 semaines maximum. Au cours de celle-ci, ils auront de manière espacée (deux semaines d'écart minimum), 4 prélèvements sanguins à la queue sous anesthésie générale (durée inférieure à 15 minutes) ; deux fois, espacé de deux semaines, 6 sessions de comportement de 30 minutes/jour avec prise d'alcool associée à un événement aversif modéré (pour reproduire le symptôme pilier de l'addiction qui est de persister dans la recherche et la prise de la drogue en dépit des conséquences négatives) ; ainsi qu'un régime alimentaire modifié et contrôlé pendant un mois. A l’issue de l'étude, les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés pour des analyses biochimiques ultérieures.
Impact sur les animaux
L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’isolement des animaux nécessaire pour cette expérimentation ont un impact d’ordre modéré sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont également attendues lors des sessions comportementales associées à un événement aversif. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections sous-cutanées des traitements antalgiques potentiels. Nous n'anticipons pas d'effets indésirables des régimes alimentaires modifiés, sur la base des protocoles et des produits publiés qui vont être utilisés.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des procédures auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses biochimiques. Cependant, il est estimé sur la base de protocoles comportementaux similaires que 15 animaux sur le total ne satisferont pas au critère comportemental d'appétence pour l'alcool nécessaire à la poursuite de l'étude. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire référent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Etre des Animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement caractéristique de l'addiction à l'alcool.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base de procédures similaires réalisées auparavant. Le suivi longitudinal des animaux pendant plusieurs mois permettra également de renforcer l'analyse statistique, et donc de réduire le nombre d'animaux par condition.
Raffinement
Les animaux seront herbergés dans les conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Nous serons cependant obligés de les isoler par rapport à l'étude pour suivre leur consommation individuelle d'alcool, mais avec des cages avec grilles en portoirs ouverts, proches les unes des autres, permettant ainsi le maintien d’un certain nombre d’interactions sociales entre les animaux, ce qui limitera toute nuisance associée à un isolement plus strict. Ils seront hebergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils seront manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux contentions et aux manipulations. Pour les prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésique gazeux. Le suivi et les pesées au quotidien des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Un antalgique pourra également être injecté en utilisant des aiguilles courtes et fines.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, ainsi qu'au niveau du métabolisme. Les registres comportementaux explorés (associés à l'alcool) sont également facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 10 à 12 semaines, de 220 à 280 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, tout au long de l'étude qui prendra plusieurs mois.