Rats

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie abdominale de quarante minutes qui dérive le canal lymphatique, puis un gavage d'une formule riche en oméga-3 et une collecte de lymphe pendant six heures en cage individuelle. La dérivation étant irréversible, tous sont tués en fin de protocole, leurs organes servant aussi à d'autres analyses. Le porteur relie ce travail à des recommandations nutritionnelles et à la "valorisation" de matrices alimentaires pour les consommateurs.

Objectifs

Une meilleure compréhension de la biodisponibilité des nutriments permet de fixer des recommandations nutritionnelles appropriées pour un effet santé. Les données scientifiques relatives à l'amélioration de la biodisponibilité des oméga-3 sont éparses. Ce projet vise à déterminer l'ensemble des facteurs susceptibles d'améliorer l'absorption intestinale et la biodisponibilité des oméga-3 pour des effets santé avérés. Il s'agit d'un sujet de fond qui permettra d'acquérir des données scientifiques originales utiles à la valorisation des nutriments lipidiques dans des matrices alimentaires innovantes ciblant la santé et le bien-être des consommateurs.

Bénéfices attendus

Ce sujet permettra d'acquérir des données scientifiques pour valoriser des nutriments lipidiques d'interet tels que les omega-3 pour des bienfaits santé et le bien-être des consommateurs. Egalement ces données permettront d'acquérir des arguments scientifiques pour appuyer les recommendations et besoins nutritionnels chez l'Homme. C'est un sujet de santé publique en lien avec les recommendations nutrtionelles.

Procédures

La technique chirurgicale de dérivation du canal lymphatique est réalisée sur les animaux et dure environ 40 minutes sous anesthésie générale. Les animaux reçoivent une seule intubation gastrique de l'une des formules lipidiques riches en oméga 3. Cette manipulation ne dure pas plus de 30 secondes , sous la réalisation de personnel qualifié. Les animaux sont ensuite placés en cage individuelle où ils disposent à volonté d'eau tout au long de l'expérimentation. La lymphe s'écoule et recueillie au travers de la canule placée a demeure vers un tube entreposé dans la glace sur les 6 heures suivantes.

Impact sur les animaux

La technique de micro chirurgie implique une incision large de l'abdomen. Après la pose d'une sonde à demeure, l’animal est suturé. Au reveil cela peut induire une douleur à l’animal, ce qui est anticipé par l’injection en amont et après la chirurgie d’un anti douleur ( analgésique). En outre, le recueil de la lymphe, nécessite une immobilisation de l'animal dans une cage individuelle, le temps de l'expérimentation (6 heures post prandial). Pour éviter tout stress, les animaux sont isolés au calme sous une température de 24°C. Enfin, l’administration des formules lipidiques, par gavage gastrique peut induire un stress chez l’animal. Ces volumes sont calculés de sorte à ne pas dépasser 1mL par animal pour limiter le temps de manipulation. En outre, la manipulation de gavage est réalisée par les techniciens de laboratoire, formés, habilités à le faire et qui en l’occurrence maitrisent parfaite le geste technique pour limiter tout stress à l’animal.

Devenir

L'intervention permet de dériver le canal lymphatique. Or après dérivation il n'est pas possible de replacer le canal lymphatique dans le circuit général, et sans quoi les animaux ne peuvent pas vivre "naturellement". Ceci implique l'euthanasie de l'ensemble des animaux en fin de protocole expérimental.En outre les organes sont également recueillis en vue d'autres études et pour limiter le nombre d'animaux en rechercher expérimentale pour du prélevement d'organes.

Remplacement

L'absorption intestinale et le métabolisme des lipides ne peuvent être directement estimés chez l'Homme. Le rat est le modèle de choix dans ce type d'étude car il les systèmes digestif et intestinal sont semblables à ceux observés chez l'Homme. Les méthodes alternatives type cultures cellulaires ne peuvent être envisagées car elles ne présentent pas à ce jour les mêmes caractéristiques que celles observées chez le rat et l'Homme. Notamment les cellules intestinales utilisées en recherche sont issues de cellules cancéreuses et ne présentent pas les caractéristiques impliqués dans l'absorption intestinale des lipides chez l'Homme et le rat.

Réduction

La taille de la population cible est calculée à partir de données avec une marge d’erreur, acceptable de 5% et un niveau de confiance : 95% . Cette ta taille l’échantillon est calculée via un logicile qui prend en compte les données. En conséquence, une taille d'échantillon totale de 8 rats par groupe a été obtenue.

Raffinement

Pour éviter toute douleur liée à l'intervention, les animaux recoivent un analgésique pour prévenir de la douleur juste avant l'intervention. Une grille de suivi et d'évaluation de la douleur est mise en place pour chaque animal en post chirurgie. Selon le score obtenu dans cette grille, de nouvelles injections d'analgésique peuvent être réalisées afin de limiter la douleur aux animaux. Les animaux sont placés dans des cages individuelles jusqu'au réveil où ils disposent d'eau à volonté, dans une pièce d'isolement au calme, dont la température est maintenue à 24°C pour leur éviter tout stress.

Choix des espèces

Le modèle rat est le modèle le plus utilisé dans les études d'absorption et de métabolisme des lipides dans l'organisme, en vue d'une extrapolation chez l'Homme. Ce modèle a l'avantage de possèder les mêmes systèmes digestif et enzymatiques que ceux observés chez l'Homme. D'autre part depuis près de 30 ans nous avons cumulés des données obtenues à partir de ce modèle, ce qui nous permet de poursuivre nos investigations sur la base de précédentes études mais aussi de mettre en régard nos données à celles d'autres travaux de recherche à l'internationnal. Les animaux sont reçus à 8 semaines au stade de jeunes adultes. Nos études reflètent l'absorption de lipides d'interet chez les adultes ( pour la population saine adulte en général) et nos animaux sont des jeunes mâles adultes. Les animaux sont acclimatés 1 semaine avant de rentrer dans le protocole expérimental.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie du crâne d'environ une heure trente pour l'implantation de capteurs intracérébraux, puis deux tests comportementaux et un régime cétogène, afin de suivre le glucose et le lactate du cerveau chez l'animal éveillé. Le porteur choisit le rat plutôt que la souris pour sa taille, seule capable de porter le dispositif miniature fixé sur la tête. Il présente les effets neuroprotecteurs du régime au-delà de l'épilepsie comme des hypothèses, l'apport immédiat restant la mise au point d'un système de mesure sans fil.

Objectifs

Le jeûne induit des adaptations métaboliques qui produisent des effets bénéfiques sur la santé, notamment mentale. Au fil des jours de jeûne, l’organisme puise son énergie dans les réserves de graisses du tissu adipeux et les corps cétoniques issus de leur dégradation, remplacent en partie le glucose dans le sang et le cerveau. Cet état métabolique, appelé cétose, peut-être reproduit par un régime dit cétogène, riche en graisse et dépourvu de sucres. Certains effets neuroprotecteurs du jeûne sont reproduits par le régime cétogène, notamment l’effet anti-épileptique, d’autres sont encore à l’état d’hypothèse, comme des effets anti-neurodégénératifs et protecteurs vis-à-vis de la maladie d’Alzheimer ou de Parkinson. Cependant, les effets de ce régime sur le métabolisme cérébral sont encore mal connus. Malgré l’absence de sucres dans la nourriture ingérée sous régime cétogène, le foie reste capable de produire du glucose. Cependant l’évolution des concentration intracérébrales de glucose au cours d’une diète cétogène reste inconnue, tout comme celle du lactate. Or le glucose et le lactate sont les principaux métabolites énergétiques du cerveau et la compréhension des effets du régime cétogène sur le métabolisme cérébral commence par une connaissance de ses effets du le glucose et le lactate cérébraux. Le but de ce projet est de monitorer les concentrations interstitielles de glucose et de lactate dans le cerveau au cours des premiers jours d’un régime cétogène grâce à des biocapteurs électrochimiques. Ce projet est aussi un défi technologique car la détection du glucose et du lactate repose sur des capteurs dont la durée de vie in vivo n’excède par 12h. Un nouveau procédé de fabrication qui permet d’obtenir une sensibilité stable pendant 5 à 7 jours a été mis au point. Ce projet permettra aussi de valider le concept d’un monitorage de plusieurs jours chez l’animal vigil, grâce à ces nouvelles microélectrodes.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet permettra d’évaluer comment la diète cétogène affecte le métabolisme cérébral. D’un point de vue méthodologique, ce projet permettra de mettre au point un système sans fil innovant, embarqué sur la tête de l’animal et qui rendra possible les études du métabolisme cérébral chez l’animal vigil. Sachant que l’anesthésie générale perturbe largement le métabolisme et notamment la régulation du glucose et du lactate intracérébral, cette innovation permettra une meilleure compréhension des mécanismes régulant le métabolisme cérébral. L’effet du régime cétogène sur le métabolisme cérébral une thématique importante du laboratoire pour laquelle un autres financement a déjà été obtenu de la FRC, la possibilité d’étudier ces effets chez l’animal vigil sans anesthésie représente un progrès considérable.

Procédures

Une chirurgie initiale durant environ 1h30 avec implantation de capteurs intracérébraux Deux tests comportementaux chez l'animal vigil et modification de l’alimentation. Les animaux seront hébergés individuellement pour pouvoir suivre leur prise alimentaire.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du crâne qui peut occasionner des douleurs qui seront traitées par l’administration de buprénorphine pendant les premières 24h, puis de carprofène pendant 12h supplémentaires. Ensuite, l’animal sera soumis à des protocoles des stimulations sensorielles très peu invasives. Le régime cétogène présente aussi peu d’effets secondaires, ceux-ci incluent une constipation ou des diarrhées peu fréquentes. Sur l’ensemble du projet la nuisance principale représente le réveil après la chirurgie du crâne, ce qui justifie un niveau de gravité modéré.

Devenir

La survie des animaux impliquerait une deuxième chirurgie pour la désimplantation des électrodes et probablement des souffrances consécutives à l'intervention

Remplacement

Le régime cétogène induit des adaptations lentes du métabolisme dès le changement de régime alimentaire. Ces adaptations impliquent l’ensemble de l’organisme : intestins, foies, pancreas, circulation sanguine, reins, cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir recours à l’animal vivant pour étudier ce phénomène. Le remplacement par des approches in vitro n’est pas possible actuellement.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre des analyses statistiques fiables. Au cours de ce projet, les analyses statistiques consisteront à comparer les données obtenues pendant la phase de diète standard 36h-48h après chirurgie, à celles obtenues après 3 jours de diète cétogène. Des tests de t de Student appariés seront appliqués après une analyse de normalité par le test de shapiro-Wilk. Dans le cas d’échantillons de données non normales, des tests de Mann-Whitney seront pratiqués. Les effectifs sont calculés sur la base de 10 animaux par groupe. Des mâles et des femelles seront inclus à part égale dans l’étude et nous disposerons de 5 comparaisons pour pouvoir détecter d’éventuelles différences liées au sexe. Les analyses statistiques seront pratiquées dès que six animaux auront été enregistrés. S’ils sont significatifs ou si des calculs de taille d’échantillon par des test beta révèlent qu’aucune différence claire n’apparaît, les expériences seront interrompues sans utiliser l’effectif annoncé au départ, ce qui peut réduire l’effectif.

Raffinement

Tout au long de ce projet, les animaux seront hébergés par paire dans des cages enrichies avec des matériaux de nidification et des baguettes de bois à ronger, afin d’améliorer leur bien-être général. Pendant la phase de réveil après chirurgie, le bien-être de l’animal sera évalué par une grille de score et la douleur sera traitée par des analgésiques. Tout au long du projet, des interactions régulières avec la cellule bien-être et la vétérinaire référente permettront éventuellement d’intégrer des mesures supplémentaires permettant d’améliorer le confort des animaux (par exemple un allongement de la période d’administration des analgésiques au-delà des premières 36h).

Choix des espèces

La plupart des études sur les effets du régime cétogène ont été effectuées chez le rongeur, qui représente le modèle animal de prédilection dans ce domaine, ce qui permet de s'appuyer sur un corpus bibliographique conséquent. Par rapport à la souris, le rat présente une taille et une masse musculaire plus importantes. Seul cet animal pourra porter le poids du potentiostat miniature évalué à moins de 10 g. Rats adultes de 10 semaines (environ 330g chez les mâles et 240g chez les femelles). L'étude concerne des animaux adultes

86 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intracérébrale de vecteurs viraux pour surproduire la neuromélanine, puis jusqu'à cinq séances d'imagerie sous anesthésie et un essai de traitement par ultrasons, avant mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur indique que l'injection peut provoquer douleur et perte de poids, et qu'un syndrome parkinsonien progressif peut mener à l'apathie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du cerveau nécessaire à l'étude de la maladie de Parkinson.

Objectifs

La neuromélanine, qui joue un rôle dans le développement de la maladie de Parkinson, est principalement contenue dans une structure cérébrale appelée substance noire qui est fortement impactée dans la maladie. L’imagerie par résonance magnétique permet de mesurer in vivo le volume de certaines structures cérébrales, incluant la substance noire, ainsi que de mesurer la présence de neuromélanine. L’objectif du projet est de mesurer le niveau de neuromélanine par imagerie par résonance magnétique dans un modèle rat de la maladie de Parkinson afin de mieux comprendre le lien entre cette molécule et le développement de la maladie. Un essai thérapeutique par stimulation mécanique des tissus par ultrasons focalisés transcrâniens sera également réalisé dans l’objectif de réduire la concentration intracellulaire de neuromélanine et de ralentir le processus dégénératif.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à la recherche contre la maladie de Parkinson avec de nombreux bénéfices à court et long-terme. Dans un premier temps, les résultats de la première étude permettront de mieux comprendre le développement de maladie de Parkinson en étudiant la corrélation entre les niveaux de neuromélanine dans la substance noire, les symptômes moteurs et les caractéristiques histopathologiques des neurones dopaminergiques. Selon notre hypothèse, un seuil de neuromélanine pathologique sera établi à la suite de cette étude. Dans un second temps, notre projet permettra le développement et l’évaluation in vivo du traitement par ultrasons transcrâniens focalisés sur un modèle pertinent. Nous attendons de ce traitement qu’il ralentisse l’apparition du syndrome parkinsonsien chez les rats. Nos données présentant plusieurs fenêtres thérapeutiques seront alors une base solide pour la conception d’un essai clinique. En supplément de ces bénéfices directs, le projet permettra une meilleure caractérisation du modèle rat utilisé. Ces résultats, qui pourront être valorisés à travers des publications dans des revues scientifiques, seront utiles à toute la communauté scientifique travaillant sur ces problématiques. Par ailleurs, les images acquises en imagerie par résonance magnétique et les échantillons cérébraux issus de rats modèles de la maladie de Parkinson à différents âges, pourront par la suite être réutilisés dans de futurs projets.

Procédures

Le projet inclut les interventions suivantes : - Injection intracérébrale de vecteur viraux induisant la surproduction de neuromélanine : 86 rats (tous les animaux). Sera pratiqué une seule fois par animal, sous anesthésie générale avec prise en charge analgésique pour une durée de 30 min. - Imagerie par résonance magnétique sensible à la neuromélanine : Sera pratiqué sur 86 rats entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sous anesthésie générale pour une durée de 2h30. - Test comportemental (observation du rat dans une cage propre) : Sera pratiqué entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sur animaux vigiles pour une durée de 5 min. - Traitement par ultrasons focalisés : Pratiqué sous anesthésie générale en même temps qu'une session d'imagerie de 30 min sur 30 rats 1 fois par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Les rats recevront une injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la tyrosinase humaine. Suite à cet acte, les rats sont susceptibles de montrer des signes de douleur et une perte de poids qui devrait durer une semaine maximum. Les sessions d’imagerie et de traitement ne nécessitent pas de chirurgie et aucune nuisance n’est attendue après réveil. Enfin, les tests comportementaux prévus (observation d’un rat dans une cage propre pendant 5 min) seront réalisés sur des rats vigiles. Ces tests pourraient générer un léger stress qui devrait s’estomper rapidement après retour du rat dans sa cage d’hébergement. Le phénotype des rats exprimant la tyrosinase humaine n’est pas considéré comme dommageable dans la limite d’âge attendue. Le développement du syndrome Parkinsonien chez les rats exprimant la tyrosinase humaine, très progressif, pourrait cependant mener à terme à une perte de poids due à une apathie et inactivité des rats.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leurs tissus cérébraux et d’analyser les neurones dopaminergiques de la substance noire. Ces données nous permettront de mieux comprendre les liens entre le niveau de neuromélanine, les troubles moteurs, et la dégénérescence neuronale dans ce modèle de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun moyen de modéliser in vitro ou in silico la complexité du cerveau nécessaire à l’étude des mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson.

Réduction

Un calcul de puissance statistique d’après nos précédents résultats a montré un nombre minimal de 8 rats nécessaires dans chaque groupe expérimental pour pouvoir répondre à la question scientifique posée. Afin de garantir que la perte d’un animal pour une quelconque raison ne puisse pas compromettre les analyses statistiques de l’étude, ce nombre a été porté à 10 rats par temps d’observation (5 temps x 10 rats = 50 rats). La conception de l'étude permet de réduire le nombre d’animaux utilisés en effectuant un suivi longitudinal plutôt que l’établissement d’une nouvelle cohorte pour chaque âge étudié. De plus, afin de garantir le bon déroulement de l’étude principale , celle-ci sera précédée d’une étude préliminaire permettant d’optimiser les protocoles d’injection et d’imagerie. Un nombre de 6 rats est prévu dans cette procédure pour pouvoir ajuster notre protocole avant le lancement de l’étude comportant un nombre important d’animaux, dans le cas où le protocole initial ne serait pas satisfaisant pour répondre à la question scientifique. De plus, cette étude principale permettra d’identifier la fenêtre temporelle la plus pertinente pour l’évaluation d’une thérapie. Cela permet de réduire le nombre d’animaux qui auraient dû être utilisés pour tester le traitement à différents temps post injection. Au total un nombre de 86 rats sont donc inclus dans les procédues expérimentales.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 2 en portoir ventilé, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire sera fourni aux animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant toute manipulation des animaux lors de leur arrivée. Les animaux seront ensuite examinés quotidiennement par le responsable du projet. Une surveillance et une fréquence de pesée accrues seront mises en place en cas d’approche d’un point limite, en particulier en cas de perte de poids corporel constatée lors du suivi hebdomadaire. Lors des injections intracérébrales, les rats âgés de deux mois seront anesthésiés et recevront une analgésie 20 minutes avant l’injection intracérébrale. La température corporelle des animaux sera maintenue avec un tapis d’eau chaude circulante thermo-régulée. De l’ocrygel sera placé sur les yeux pour éviter tout dessèchement. Une crème analgésique locale sera également appliquée au niveau des points de contact du cadre stéréotaxique. Suite aux actes chirurgicaux, une prise en charge analgésique sera réalisée pour la prise en charge aigüe, puis des analgésiques seront mélangés à la boisson pendant 24h. Le suivi hebdomadaire du poids corporel des rats nous permettra d’instaurer un point limite de nuisance au bien-être des animaux. Suite aux actes chirurgicaux, ou en cas de perte de poids des animaux, une surveillance accrue sera mise en place avec un suivi renforcé à trois fois par semaine. La plaie sera surveillée. En cas d’infection, la plaie sera nettoyée et une pommade cicatrisante sera appliquée quotidiennement. L’utilisation d’ultrasons transcraniens est une mesure de raffinement en elle-même puisqu’elle permet une approche thérapeutique sans ouverture crânienne. Lors des examens d'imagerie, les rats seront anesthésiés et fixés par un cadre stéréotaxique au lit de l’appareil d'imagerie. Une analgésie locale sera appliquée par gel au niveau des oreilles pour minimiser la douleur induite par le cadre stéréotaxique.

Choix des espèces

Les rats sont de bons modèles pour l’étude du cerveau par imagerie par résonance magnétique, car leur taille permet de les examiner dans des imageurs à résonance magnétique à haute performance, avec de nombreux modèles pathologiques disponibles. De plus, de nombreux tests comportementaux permettent d’évaluer les altérations cognitives et motrices dans ces modèles. En particulier, le modèle utilisé permet de reproduire de nombreux aspects de la maladie de Parkinson. Les animaux seront utilisés à l’âge de deux mois, au début de l’âge adulte, idéal pour l’injection des vecteurs viraux et passage à l’imagerie par résonance magnétique.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections intramusculaires et jusqu'à sept prélèvements de sang, avant mise à mort pour prélever les muscles injectés. Le porteur affirme n'attendre aucun signe clinique et présente ce contrôle d'immunogénicité comme "nécessaire" à son dossier réglementaire avant des essais cliniques sur un candidat myorelaxant. Sur le remplacement, il indique que la pertinence des modèles cellulaires reste débattue et que le système immunitaire ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

Après avoir démontré le bénéfice d’efficacité de notre produit (FTP-501) face aux produits de référence utilisés en clinique lors de projets précédents, ce projet expérimental s’intéresse au potentiel immunogène (développement de réaction pro-inflammatoire) de ces candidats. Cette étude a pour objectif de confirmer la non-présence d’Anticorps Anti-Drug (ADA) (anticorps dirigé contre notre propre molécule) suite aux injections de notre composé. Cette molécule pourrait a priori provoquer une réaction immunitaire suite aux injections, diminuant ainsi l’efficacité du traitement et sa tolérance. Il est donc important de vérifier qu’une telle réaction est limitée ou inexistante. De plus ce test est nécessaire pour l’évaluation de notre dossier règlementaire en vu des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé nos 2 premiers Lead (FTP-501 et FTP-101) quasiment au terme de leur développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Ainsi, ce projet permettra de vérifier qu’aucune réaction immunitaire ne se manifeste suite aux injections du composé FTP-501 et que par conséquent notre produits est très bien toléré après des injections répétées.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 6 injections, durée 30 secondes/injection/animal = 3 min - Pesée des animaux = 10 pesées / animal => 30 secondes / pesée = 5 min / animal - Prélèvements de sang = 7 maximum par animal, durée 2 minutes = 14 minutes / animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans nos études précédentes et la littérature. En effet lors de nos précédents projets, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à une seule injection n’a été observé. Nous n’attendons pas ici de réactions suite aux multiples injections. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection, une douleur liée aux injections i.m. et les multiples prélèvements de sang (7 maximum).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure sont concernés En effet, les muscles injectés seront prélevés pour analyse histologie.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). De plus, nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe (impossible à reproduire dans sa globalité in vitro) et nécessite des expérimentations in vivo.

Réduction

Pour la réduction, la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis) a été déterminé avec le logiciel G-Power. Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 20 animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages en plastique transparent de 1800cm2 au sol et comportant une plateforme. Les cages seront ventilées individuellement, placés dans une pièce sous air conditionné, avec un cycle jour/nuit de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Ils seront maintenus en groupe de 2 ou 3 rats par cage. Ils disposeront de matériel de nidification (litière en chips de cellulose) puis d’enrichissement : les rats ont un tunnel rouge ainsi qu’un bâton de bois à ronger. Les animaux seront surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur entraîné, et via une approche limitant le stress et la douleur, tout en ne dépassant pas les limites de volume prélevables chez un rat.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes interne. Nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe et nécessite des expérimentations in vivo. De plus, nous avons choisi le rat d’une part, par continuité avec nos études précédentes et notre expérience sur ce modèle et d’autre part, car il s’agit d’un modèle de choix pour des études de toxicité de composé. Nous utiliserons des rats Sprague Dawley âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 30 semaines maximum en fin d’expérimentation. Des jeunes adultes sont choisis ici pour le bon fonctionnement de leur système immunitaire

Pour reproduire l'amblyopie, un trouble de la vision qui se constitue dans la petite enfance, 144 ratons Long Evans vont être utilisés entre leur 12e et leur 22e jour de vie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Sous anesthésie profonde, l'équipe coud une paupière aux ratons opérés, en quatre points, avant l'ouverture des yeux, puis rend chacun à sa mère. Le porteur affirme, en s'appuyant sur la littérature, que ces gestes sont "non douloureux en période post-opératoire" et que la suture est "bien tolérée", et dit avoir choisi ces rats pour leur acuité visuelle, supérieure à celle des rats Wistar. En cas de problème lié à la suture, une infection par exemple, le raton est "écarté du lot" et mis à mort aussitôt.

Objectifs

Notre équipe a le projet de décrypter les mécanismes de plasticité neuronale mis en jeu dans l’amblyopie, une pathologie dont la conséquence première est une vision anormale. Elle est l’une des principales causes de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Ce n’est pas une maladie de l’œil, le récepteur visuel étant normal mais du système nerveux intégrateur. L’acuité visuelle à la naissance est faible à cause de l’immaturité du système nerveux visuel. Pendant une période de forte plasticité neuronale chez le petit enfant, des différences de réfraction, d’alignement entre les deux yeux ou une opacité d’un œil amènent à un défaut d’intégration des signaux neuronaux provenant de l’œil faible. Le traitement, seulement possible avant 6-7 ans, se fait d'abord en corrigeant le défaut visuel, puis en rééduquant l’œil amblyope par pénalisation de l’œil dominant. Ce projet propose de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires de la plasticité cérébrale au cours du développement des neurones du corps genouillé lateral dorsal (dLGN), premiers relais thalamiques de la stimulation visuelle en mimant l’amblyopie sur le rat Long Evans par suture d’une paupière avant l’ouverture des yeux.

Bénéfices attendus

L’amblyopie est un déficit visuel fonctionnel chez l’humain qui, s’il n’est pas traité dans une période de temps limité avant 6-7 ans, est irréversible. C’est la principale cause de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Le but de ce travail est d’identifier les mécanismes neuronaux à l’origine de la perte de réponse du cortex cérébral aux stimuli visuels dans l’objectif d’allonger la fenêtre thérapeutique au-delà de l’enfance.

Procédures

Suture de la paupière (4 points de sutures) sur un matelas chauffant sous anesthésie profonde associée à une analgésie locale oculaire. Après le réveil les ratons sont remis à la mère . Durée totale de l’intervention : 10 minutes. Dans la littérature ces gestes chirurgicaux sont non douloureux en période post-opératoire, la suture est bien tolérée par l’animal (pas de signe de grattage, automutilation, ni réaction négative de la part de la mère). On réalise ensuite une surveillance journalière de la tolérance des sutures de paupières.

Impact sur les animaux

Suite à la procédure de privation visuelle monoculaire par suture palpébrale, l’apparition d’effets indésirables sera contrôlée quotidiennement, en particulier : - risque d’infection au niveau des points de suture - risque d’arrachement des points de suture.

Devenir

Euthanasie préalable au prélèvement du tissu cérébral sur lequel seront réalisées les expérimentations.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est indispensable dans le cadre de ce projet dans la mesure où il est nécessaire de priver le système nerveux d’entrées sensorielles au cours du développement. L’utilisation de culture de neurones est donc naturellement exclue.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux sera faite -Grâce à l’utilisation de rat des 2 sexes. - En multipliant le nombre d’expérimentateurs qui travaillent en parallèle sur le cerveau d’un rat sacrifié pour les mesures des phénomènes électriques des neurones, leur durée de survie étant limitée. -En miniaturisant le matériel cellulaire à prélever pour les analyses biochimiques grâce à l’utilisation de technologies de dernière génération de grande sensibilité. -En maintenant une formation régulière du personnel sur les techniques de sutures de paupières par les praticiens hospitaliers de notre laboratoire

Raffinement

Suture de la paupière (4 points de sutures) sur un matelas chauffant sous anesthésie profonde associée à une analgésie locale oculaire. Après le réveil les ratons sont remis à la mère en vérifiant que celle-ci les reprend bien en charge. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement par un personnel expérimenté. En cas de problème lié à la suture (par exemple infection) l’animal sera écarté du lot et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le rat est le modèle animal le plus utilisé actuellement dans la littérature pour l’étude des mécanismes neuronaux de plasticité du système visuel. Notre laboratoire a acquis depuis quelques années une grande expertise dans le domaine de l’électrophysiologie neuronale, en particulier chez le rat. Nous avons choisi de mener notre étude sur des rats Long Evans dont l’acuité visuelle est supérieure à celle des rats Wistar habituellement utilisés au laboratoire. Les animaux seront utilisés entre J12 et J22, période critique de développement de la fonction visuelle.

18 rats porteurs d'un modèle de la dystrophie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des enregistrements cardiaques et respiratoires, un test de préhension et une mesure de force musculaire sous anesthésie, puis un prélèvement de sang, avant mise à mort pour analyse des organes. Le porteur teste deux composés combinés censés réguler la dynamique calcique et retarder la maladie, mais renvoie les bénéfices pour les patients au conditionnel et au long terme, après d'éventuels essais sur des animaux plus grands. Sur le remplacement, il affirme que seule la réponse de l'animal vivant avec ses organes en interrelation permet de conclure, et décrit le rat comme un modèle plus fidèle que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très mauvais et les jeunes patients meurent prématurément. L’absence de la protéine dystrophine entraîne un stress oxydatif pour les cellules, avec une anomalie de la dynamique du calcium qui engendre des défauts fonctionnels pour les fibres musculaires. Nous proposons ici de tester l’efficacité thérapeutique de deux composés chimiques innovants, identifiés comme régulateurs de cette dynamique calcique. Ces deux composés sont ici combinés en un seul produit qui a récemment prouvé son efficacité chez le poisson et la souris, modèle partiel de la DMD. Le but de ce projet est d'évaluer l'effet de ce produit dans le modèle pertinent du rat DMD, dont il a été prouvé qu’il récapitule beaucoup plus fidèlement la progression très sévère et fatale de la maladie chez l'humain. Par sa plus grande hétérogénéité génétique, le rat permet de plus d’évaluer la réponse individuelle au traitement, prémices d’une médecine de précision. En cas de succès, ce produit poursuivra son développement vers des essais précliniques chez des animaux de plus grande taille et encore plus hétérogènes au plan génétique avant, en cas de succès, d’entrer en phase d’essai clinique chez les enfants atteints de DMD.

Bénéfices attendus

Nous espérons que les résultats obtenus dans le cadre de cette étude contribueront au développement d'un traitement pharmacologique de la dystrophie musculaire de Duchenne. D'une manière générale, nos résultats permettront d'avancer dans la connaissance plus précise des mécanismes anormaux à l'oeuvre dans cette maladie. La thérapie basée sur le produit testé ici est de nature protectrice et nous espérons que ce traitement retardera l'évolution de cette maladie. Ce produit peut être administré en combinaison avec d'autres thérapies existantes ou en développement. Le produit a déjà démontré son efficacité et sa sécurité lors d'études préliminaires sur des cellules musculaires et cardiaques humaines, ainsi que sur des poissons et des souris. Il est donc attendu un bénéfice sur l'état général des animaux testés ici, ainsi qu'une absence de toxicité.

Procédures

La durée d'un enregistrement ECG, indolore, est de 15 minutes. La durée d'un enregistrement pléthysmographie, indolore, est de 30 minutes. La durée d'une séquence de grip test, indolore, est de 20 minutes. La durée d'un enregistrement de la force musculaire est de 90 minutes jusqu'au réveil, anesthésie comprise (une injection sous cutanée avec une aiguille hypodermique très fine). Les animaux seront également prélevés une fois pour récupérer un millilitre de sang, en vue de quantifier des biomarqueurs de la maladie. Ce prélèvement dure moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

L'absence de toxicité du produit a été démontrée in vitro et in vivo. Aucun effet indésirable supplémentaires à ceux causés par la maladie développée spontanément par les animaux modèles n'a été observé chez les souris traitées avec les composés du produit, sur une durée de 6 mois à la dose de 60 mg/kg/jour. Ici, le traitement sera administré par voie orale dans l'eau de boisson car il s'agit de la forme d'administration la plus pratique et la moins contraignante pour l'animal. Elle a montré une bonne biodisponibilité dans les tissus cibles (muscle, cœur et cerveau) de la souris et du rat.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires à l'évaluation complète du produit testé.

Remplacement

L'efficacité du composé testé a déjà été confirmée in vitro et sur des modèles de souris. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé testé permet-elle de protéger suffisamment les muscles pour que cela confère un bénéfice quantifiable au cœur et aux muscles squelettiques, à l’échelle de leur microstructure et de leur fonction.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats (2 muscles traités indépendamment par rat) permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Pour réaliser cette estimation, nous utilisons des tests statistiques en prenant en compte des paramètres tels que la différence à mettre en évidence entre les différents lots, la puissance et le risque du test. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des logiciels qui permettent de comparer deux groupes ou plusieurs groupes entre eux.

Raffinement

Le phénotype dommageable des animaux consiste en une faiblesse progressive de leur musculature, sans effet indésirable jusqu'à l'âge de 6 mois, au-delà de l'âge atteint par les rats en fin de cette procédure. Les animaux seront donc considérés comme des animaux capables d'une vie normale en espace confiné et seront stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées, monitorées et conformes à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrières. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 6 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 300g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux par l'utilisation d'agents anesthésiques et analgésiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la même classe que l'être humain. À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD dont la valeur demeure inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Nous utiliserons des animaux à l'âge d’un à 4 mois (3 à 15 semaines). Notre étude de caractérisation ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 3 semaines permettra d’évaluer la capacité du composé testé à différer l’installation progressive de la fibrose (traitement préventif) et ses conséquences fonctionnelles sur la musculature striée. Le bon état général des animaux à l'âge maximal de 4 mois justifie notre suggestion de classer cette procédure en procédure modérée.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus diabétiques, ils reçoivent des injections quotidiennes d'une molécule tenue secrète, la "myokine X", subissent des prises de sang répétées à la queue, un test de mémoire en piscine de Morris et une exposition au froid à 4 °C pendant 24 heures, avant d'être tués pour analyse des organes. Le porteur attend une perte de poids, des désordres intestinaux et une détérioration de la queue liés aux prélèvements. Il compare sa molécule, en cours de brevet, au liraglutide déjà utilisé chez les patients et affirme "indispensable" le recours à l'animal.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (diabète de type 1, DT1), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit (diabète de type 2, DT2). Ainsi, dans les 2 cas, il y a un trouble de l’utilisation et du stockage du glucose apporté lors des repas, entrainant une hyperglycémie. Cette dernière peut au fil du temps provoquer des maladies cardiovasculaires, des néphropathies, des altérations cognitives (perte de mémoire) … La régulation de la fonction sécrétoire des cellules à insuline et leur survie jouent un rôle central dans la progression du diabète. Le muscle squelettique constitue l’organe le plus sensible à l’insuline de l’organisme et joue donc un rôle majeur dans l'équilibre glycémique de l'organisme puisqu’il constitue le site majoritaire de stockage du glucose sous l'action de l'insuline. Nous avons mis en évidence l’existence d’une communication croisée entre le muscle squelettique et les cellules à insuline par le biais de facteurs appelés myokines. Nous avons montré in vitro (îlots pancréatiques de Rat et Humain) et in vivo, dans un modèle de transplantation d’îlots chez le rat DT1, qu’une myokine, appelée myokine X, permettait d'améliorer la survie, la fonction des îlots pancréatiques et l’équilibre glycémique des animaux diabétiques transplantés. Par ailleurs, dans une autre étude in vivo réalisée récemment, nous avons montré qu’une injection quotidienne de notre Myokine X chez un modèle de rat DT2, permettait de prévenir l’apparition de cette pathologie. En particulier, les premiers résultats montrent un impact intéressant de la myokine X sur le tissu adipeux brun. Ce dernier représente un intérêt important de par sa capacité thermogénique qui améliore l’homéostasie glucidique grâce à une importante consommation des substrats dont le glucose. Le nom de cette myokine, représentant un intérêt thérapeutique important pour le patient diabétique, reste anonyme car un brevet est en cours de dépôt. Désormais, le premier objectif de cette demande est de déterminer si notre Myokine X pouvait également avoir un effet curatif sur un modèle de Rat DT2 ainsi que sur les complications citées précédemment. Le second objectif de cette étude est de comparer les effets de notre Myokine X avec les effets du Liraglutide, qui est aujourd’hui un antidiabétique largement utilisé chez l’Homme mais qui peut présenter certains effets secondaires.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est d’obtenir un effet curatif du DT2 par la Myokine X. De plus, cette étude permettra de comparer les effets de notre molécule avec ceux du Liraglutide, qui est très largement utilisé chez le patient diabétique. Néanmoins, le Liraglutide peut présenter un certain nombre d’effets indésirables tels que des désordres intestinaux qui peuvent amener le patient à vouloir arrêter son traitement. Par ailleurs, nos études précédentes in vivo menées chez le rat diabétique n’ont pas montré de tels désordres. Ainsi, notre traitement pourrait constituer une biothérapie innovante pour le DT2.

Procédures

Afin d’évaluer l’évolution du diabète, différents tests seront effectués sur l’ensemble des animaux pour suivre la glycémie. Tout d’abord, celle-ci sera mesurée quotidiennement et l’acte ne durera que quelques secondes. Par ailleurs, nous complèterons ce suivi par une prise de sang hebdomadaire afin de mesurer des marqueurs en liens avec la glycémie. La durée de la contention pour la prise de sang est de moins de 2 minutes. Pour évaluer le fonctionnement de l’ensemble des organes impliqués dans la régulation de la glycémie, un test de sensibilité à l’insuline sera réalisé la moitié des animaux et sur l’autre moitié un test de tolérance au glucose sera effectué. Ces deux tests dureront chacun 2h et avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l’eau ad libitum). De plus, nous évaluerons les effets de notre traitement sur les altérations cognitives pouvant être induites par le diabète à l’aide du test de la piscine de Morris. Ce test durera 2 min et sera réalisé 3 fois de suite pendant 3 jours au cours de 3 sessions réparties au cours des 15 semaines de l’étude sur 64 animaux. Enfin, nous étudierons sur 40 animaux l’effet de notre traitement sur l’activation du tissu adipeux en réponse au froid. Pour cela, les animaux seront exposés au froid (4°C) pendant 24h.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de Myokine X et de Liraglutide. - Désordres intestinaux liés au Liraglutide. - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Hypoglycémie. - Hypothermie post test comportemental. - Hypothermie au cours de la mise au froid 4°C–8°C. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie liée au prélèvement sanguin. – Inflammation au point d’injection due aux injections répétées.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Le diabète est une pathologie complexe où de nombreux organes sont impliqués (pancréas, muscles, tissu adipeux…) et communiquent entre eux, ce qui ne peut être modélisé in vitro. De plus, l’impact de la Myokine X a déjà été évalué in vitro sur des ilots pancréatiques. Il est maintenant primordial d’évaluer ses effets dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostaie glucidique sont présents. Pour cela, le recours à une étude in vivo est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux qui sera utilisé par groupe est déterminé selon une étude récente qui a démontré que seulement 75% des rats ZDSD devenait diabétique. Ainsi, pour pallier à ce pourcentage d'obtention de rats diabétiques, à ces variations glycémiques et afin d'obtenir des données statistiquement analysables, nous utiliserons 15 rats par groupe. Par ailleurs, ce nombre est basé sur notre longue expérience obtenu au cours des nombreuses études métaboliques réalisées au laboratoire. Cette étude nécessitera donc 120 rats. De plus, la stratégie d’expérimentation est établie tenant en compte la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d’animaux et le stress que pourrait engendrer l’ensemble des procédures sur chaque animal, une attention particulière est portée sur le fait que tous les animaux ne seront pas utilisés pour l’ensemble des procédures. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque procédure a été défini d’après notre expérience dans le domaine du diabète ainsi que d’après la littérature.

Raffinement

Le raffinement a principalement lieu au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. Ainsi, les animaux développant un diabète après alimentation enrichie en gras seront traités par insulinothérapie. Un suivi quotidien sera réalisé afin de mesurer la glycémie afin d’ajuster les doses d’insuline à injecter. Si les animaux présentent des signes de douleur, des antalgiques seront administrés en fonction du degré déterminé.

Choix des espèces

Le modèle de rat diabétique utilisé est celui qui mimique le mieux le syndrome métabolique, le diabète de type 2 et l'obésité trouvé chez l’Homme. Les autres modèles de rongeurs actuellement disponibles pour le diabète et le syndrome métabolique manquent de translationnalité à la condition humaine. Ainsi, nous utiliserons ce modèle de rat. L’utilisation en parallèle de rats sains servira de contrôle afin d’évaluer l’impact de notre molécule en situation non pathologique. Ceci nous permettra de comprendre les mécanismes d’action physiologique impliqué notamment dans la régulation de la glycémie de notre Myokine X, encore à élucider à ce jour. Nous utiliserons des rats âgés de 16 semaines au commencement du protocole (Arrivée dans notre animalerie à 14 semaines donc 2 semaines d’habituation). En effet, le DT2 apparaitra à partir de 16 semaines de vie chez les rats de ce modèle. Ainsi, comme le projet consiste à étudier l'effet curatif de notre Myokine X sur le DT2, il faut que les animaux aient au moins 16 semaine de vie avec un statut diabétique établi avant le commencement des traitements.