Rats

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent chaque jour pendant 14 jours une injection sous-cutanée d'isoprénaline pour provoquer un stress cardiaque, une partie recevant en fin de protocole une injection d'un inhibiteur, avant prélèvement du cœur. Le porteur indique que le traitement augmente la fréquence et le débit cardiaques et que l'inhibiteur peut provoquer une hypertension. Sur le remplacement, il conclut qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier le remodelage cardiaque et qualifie le recours aux animaux d'"indispensable".

Objectifs

Le stress adrénergique cardiaque peut entraîner un remodelage physiologique du cœur, comme on l'observe en réponse à l'entraînement physique. Cependant, lorsque ce stress est chronique, il conduit à un remodelage cardiaque défavorable qui est associé à un dysfonctionnement. À ce jour, le principal traitement efficace pour limiter le remodelage myocardique consiste à réduire la surcharge de pression. Par conséquent, il est impératif de mieux comprendre les voies de signalisation qui sous-tendent les (mauvaises) adaptations cardiaques dépendantes du stress adrénergique afin de fournir des pistes pour le développement de nouvelles thérapies. En réponse à la stimulation des recepteurs β-adrénergiques, le myocarde produit des quantités accrues d'oxyde nitrique (NO). Jusqu'à récemment, on considérait que la signalisation du NO impliquait principalement l'activation des voies de la protéine kinase dépendante de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) (GMPc-PKG). Cependant, le NO peut également se fixer directement de manière covalente aux résidus thiol de cystéines, un processus appelé Snitrosylation (SNO). Ce second mécanisme a été moins étudié et fait l'objet du présent projet. La SNO est une modification post-traductionnelle réversible majeure impliquée dans la régulation de l'activité des protéines ; il permet également de protéger les protéines contre l'oxydation irréversible des fragments thiols. Ce processus a été bien décrit dans les mitochondries où il est associé à une production réduite d’espèces réactives de l’oxygène. Les myofilaments cardiaques sont également rapportés comme étant sensibles à l'oxydoréduction et, par conséquent, potentiellement affectés par la signalisation du NO. La question est de tenter de mieux comprendre comment la SNO des protéines myofilamentaires est impliquée dans la régulation de la machinerie contractile cardiaque. L’objectif du projet NitrosoCard est de tester l'hypothèse selon laquelle, en réponse au stress adrénergique, la eNOS (enzyme responsable de la synthèse de NO) peut se relocaliser vers les mitochondries pour moduler la SNO de protéines clés dans la régulation de la réponse du cœur à une situation de stress.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux identifier les voies de signalisation impliquées dans la réponse du coeur à un stress adrénergique. En effet, il est bien connu qu'un stress adrénergique transitoire peut aboutir à une adaptation bénéfique du coeur alors qu'un stress chronique peut conduire à un remodelage cardiaque défavorable. Néanmoins, à ce jour, les mécanismes cellulaires permettant d'expliquer qu'un même stimulus puisse aboutir à des réponses adaptatives différentes n'ont jamais été identifié

Procédures

Les animaux seront traités quotidiennement, pendant 14 jours, avec un agoniste des récepteurs β-adrénergiques, l’isoprénaline, par injection sous-cutanée (une injection sous cutanée tous les jours pendant 14 jours). A la fin des 14 jours, certains animaux (groupe taités avec l'inhibiteur des NOS, L-NAME) reçoivent une dernière injection cette fois en intrapéritonéale.

Impact sur les animaux

Le traitement sub-chronique à l’isoprotérénol peut avoir des conséquences sur l’état de bien-être des animaux (principalement augmentation de la fréquence et du débit cardiaque). Les animaux seront donc surveillés, tout particulièrement dans les heures qui suivent l’injection sous-cutanée d’isoprotérénol, par un personnel habilité et formé pour ce type d'acte expérimental. L'injection de L-NAME peut aussi être à l'origine de stress (hypertension artérielle). Dans ce cas aussi, les animaux seront particulièrement surveillés dans les heures suivant l'injection. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules, des myofilaments isolés et necessiteront l'euthanasies des animaux avant le prélèvement des tissus.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur et ainsi permettre l'isolement primaire de cardiomyocytes, de mitochondries ou des analyses biochimiques.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l’impact du stress adrénergique sur le remodelage myocardique. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.

Réduction

Un grand nombre d'expérimentations sera réalisé sur des cellules ou des mitochondries isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du coeur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser diffrentes évaluations (biochimie, immuno-précipitation, protéomique).

Raffinement

Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Ainsi, en se basant sur cette grille, un score sera attributé à chaque animal afin d'évaluer son état de bien être ou de souffrance. Les résultats de cette observation permettront, en se basant sur un arbre décisionnel, d'opter, si necessaire, soit pour une stratégie d'analgésie soit pour la mise de la mort de l'animal.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique, des prélèvements sanguins répétés, et selon les groupes une pompe implantée chirurgicalement sous la peau ou des injections d'anticorps trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur indique vouloir moduler la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur, afin d'améliorer les traitements de thérapie génique. Il affirme que le rat Sprague-Dawley est le seul petit modèle reproduisant cette réponse et que le modèle animal reste "incontournable".

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAV) constituent des outils de choix. Une seule injection de ces vecteurs permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV. L’initiation ou non de cette réponse immune cellulaire semble être dépendante de nombreux facteurs (voie d'administration, dose injectée, tissu cible, transgène thérapeutique...) et son impact sur l’efficacité du transfert de gène reste à ce jour difficile à prédire. Nous avons récemment développé un modèle animal dans lequel nous observons une réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Ce modèle semble reproduire la réponse immune observée chez l’humain. La génération de ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de rats, 2 stratégies pour moduler la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. La première stratégie consistera à utiliser une molécule (l’interleukine 34 (IL-34)) pour favoriser l’émergence de cellules immunitaires (macrophages et lymphocytes T) régulatrices impliquées naturellement dans la modulation des réponses immunitaires. La seconde stratégie repose sur le constat que les cellules effectrices humaines expriment fortement un marqueur de surface (le CD45RC) à l’inverse des cellules aux propriétés régulatrices Un anticorps ciblant ce marqueur spécifique sera utilisé pour moduler l’action des cellules immunitaires effectrices. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de développer une stratégie pour moduler la réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une méthode pour prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.

Procédures

Les rats recevront une injection unique de solution saline ou d’un vecteur viral en Intraveineuse. La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront réalisés régulièrement pendant toute la durée du protocole soit 7 pour les suivis 1 mois et 10 pour les suivis 3 mois. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. Pour les animaux inclus dans la première stratégie d’immunomodulation, des pompes seront placées chirurgicalement sous la peau du dos des rats permettant de diffuser un immunomodulateur sur plusieurs jours. Le temps d’anesthésie, de préparation du champ opératoire et de la chirurgie est d’environ 30 mn. La recharge s’effectuera tous les 15 jours à travers la peau et s’effectue en moins de deux minutes sous anesthésie. Pour les animaux inclus dans la deuxième stratégie d’immunomodulation, les anticorps seront injectés en intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés, le temps de réaliser l’injection soit environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une légère douleur au point du prélèvement sanguins et au point d’injection de l’intraveineuse et de l’intrapéritonéales dû à la pénétration de l’aiguille. La répétition des injections intrapéritonéales peut engendrer un stress pour les animaux. Les animaux ressentiront une douleur modérée dû à l’incision de la peau pour la mise en place de la pompe rechargeable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L’enjeu majeur des protocoles de thérapie géniques développés à l’aide d’AAV consiste à s’affranchir de la réponse immunitaire anti-vecteur observée chez l’humain. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire in vitro un système immunitaire et encore moins de le combiner avec des cellules d’autres organes (également transduits par le vecteur de thérapie génique). Le modèle animal demeure donc incontournable. Pour ce protocole précis, nous avons choisi un modèle de rat Sprague-Dawley, car c’est le seul modèle de petit animal, qui développe une réponse immunitaire anti-AAV similaire à celle observée chez l’humain.

Réduction

Chez l’Homme, l’apparition d’une réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique ainsi que son intensité varient d’un individu à l’autre. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire où environ 60% des animaux injectés développent une réponse immunitaire. De manière à avoir des résultats statistiquement interprétables, le nombre d’animaux par groupe devra être porté à au moins 10 .

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.). En cas d’observation d’un mal être de la part de l’animal, un examen clinique sera réalisé à l’aide d’une grille de score afin d’évaluer le degré de souffrance de l’animal. Selon le score enregistré et l’arbre décisionnel, certaines actions seront mises en place comme l’utilisation d’analgésique, une surveillance accrue, ou une euthanasie.

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation du rat est justifiée à la fois par la preuve de concept de modélisation de la réponse immune anti-AAV ainsi que par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. De plus, des études fonctionnelles réalisées in vivo dans un contexte de transplantation d’organes chez le rat mettent en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’anti-CD45RC et de l’IL34. Le but de cette étude est d’apporter une preuve de concept de l’effet de ces molécules sur la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur dans un contexte de transfert de gène. Les rats seront injectés entre 6 et 10 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature.

Une injection d'analgésique, une anesthésie gazeuse, une incision, puis une aiguille qui dépose dans l'oreille moyenne une solution chimique détruisant les récepteurs de l'équilibre de l'oreille interne, ou une solution saline pour les témoins : la séquence dure 72 minutes pour chacun des 252 rats femelles. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec perte d'équilibre, troubles de la posture, déshydratation et perte de poids attendues chez les rats lésés. Selon les groupes, ils reçoivent ensuite chaque jour, pendant 3 à 10 jours, de la bétahistine, un médicament contre le vertige, un placebo ou des antagonistes de l'histamine, ainsi qu'un marqueur de prolifération cellulaire, et une partie passe des tests comportementaux à six reprises jusqu'à J30, sans que le porteur les nomme. Tous sont mis à mort à J3, J7 ou J30, pour le prélèvement du sang et du cerveau.

Objectifs

Ce projet porte sur le système vestibulaire, responsable de l’équilibre postural et locomoteur, ainsi que de la stabilisation du regard lors de mouvements de la tête. L’information perçue par les récepteurs vestibulaires localisés dans l’oreille interne est transmise via le nerf vestibulaire aux noyaux vestibulaires (situés dans le tronc cérébral). Un dysfonctionnement de ce système peut causer des symptômes tels que des vertiges, des déséquilibres, des chutes ou encore de l’anxiété, qui affectent la vie quotidienne des patients. La thérapie vestibulaire implique une rééducation vestibulaire et un traitement médicamenteux. Toutefois, le manque d’efficacité des médicaments utilisés ou encore la méconnaissance de leurs sites et mécanismes d’action représentent un obstacle de taille. Un médicament couramment utilisé en France dans la pathologie du vertige est la bétahistine. Certains de ses mécanismes d’action sont connus dans le modèle animal de lésion chirurgicale du nerf vestibulaire. Toutefois, ce modèle est comparable, en clinique, à une ablation curative du nerf vestibulaire, pratiquée uniquement dans le cas de schwannomes (tumeurs bénignes du nerf vestibulaire). Les effets et mécanismes d’action de ce médicament ne sont pas connus dans un modèle animal de lésion vestibulaire mimant des pathologies telles que la névrite ou la maladie de Ménière, qui sont plus couramment observées en clinique. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de la bétahistine sur un modèle de lésion vestibulaire induisant une inflammation telle qu’observée dans la névrite en clinique. Nous savons que la bétahistine augmente la concentration d’histamine, un neurotransmetteur qui module l’inflammation, dans le cerveau. De plus, des cellules intervenant dans l’inflammation sont importantes pour la récupération des fonctions vestibulaires. Ainsi, nous supposons que ce traitement va favoriser des mécanismes essentiels à la compensation vestibulaire via des récepteurs à l’histamine dans ce modèle. Enfin, nous supposons que la bétahistine aura un effet anxiolytique dans notre modèle car elle module un neurotransmetteur intervenant dans l’anxiété (sérotonine). Des tests comportementaux, l’utilisation de molécules chimiques bloquants des récepteurs à l’histamine (antagonistes), ainsi que des analyses sur les tissus des animaux nous permettront de réaliser ce projet.

Bénéfices attendus

Les désordres vestibulaires touchent un tiers des adultes de plus de quarante ans aux Etats-Unis. En France, les vertiges constituent un des motifs prépondérants de consultation chez le généraliste, avec plus de 15 millions par an. En Allemagne, la prévalence des troubles vestibulaires est de 6,5% selon une étude épidémiologique. Ainsi, les désordres vestibulaires représentent un enjeu de santé publique majeur et l’étude des désordres vestibulaires ainsi que des traitements pharmacologiques utilisés restent primordiaux. Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont nécessaires afin d’étudier les déficits vestibulaires et leur compensation. Le modèle de lésion utilisé dans ce projet est un modèle se rapprochant de pathologies humaines telles que la vestibulopathie périphérique aiguë (névrite) ou la maladie de Ménière. Il mime des symptômes vestibulaires retrouvés chez l’humain. A court terme, ce modèle animal et ces tests comportementaux vont permettre d’observer l’efficacité de la bétahistine (traitement étudié prescrit en clinique humaine) sur les symptômes posturo-locomoteurs induits par la pathologie et également sur l’anxiété des animaux. D’un point de vue fondamental, nous mettrons en évidence l’impact de ce traitement sur l’inflammation et sur l’anxiété des animaux dans un contexte de pathologie vestibulaire. Nous préciserons également le rôle de l’histamine dans la pathologie vestibulaire. Enfin, ce projet permettra d’élucider la compensation vestibulaire à un niveau plus global que seulement au sein des noyaux vestibulaires. Plus globalement, d’un point de vue clinique, ce projet pourrait amener à des nouveaux mécanismes quant aux fonctionnements d’un composé pharmacologique de référence prescrit en clinique. A plus long terme, les résultats obtenus permettront d’adapter la prise en charge médicamenteuse des patients afin de mieux traiter les pathologies vestibulaires.

Procédures

Ce projet est composé de trois procédures et chaque rat femelle sera utilisé dans une seule procédure. L’administration transtympanique a lieu une fois, chez l’ensemble des animaux de l’étude. Avant administration, les animaux sont soumis à une injection d’analgésique 30 minutes avant d’être placés sous anesthésie gazeuse et un anesthésique local est appliqué 5 minutes avant incision. Dans chaque procédure, un groupe d’animaux est soumis à une injection transtympanique d’une solution chimique détruisant les récepteurs vestibulaires de l’oreille interne et un autre groupe d’animaux est soumis à une injection transtympanique d’une solution saline. Cette administration se fait dans l’oreille moyenne des animaux en utilisant une aiguille. Les gestes décrits ci-dessus durent 72 minutes pour un animal. Dans chaque procédure, l’administration d’un marqueur de la prolifération cellulaire a lieu une seule fois, chez les animaux, au 3ème ou au 7ème jour post-lésionnel. Dans deux procédures, l’administration de la bétahistine ou du placebo a lieu une fois par jour chez de nombreux animaux. Cette procédure s’effectuera pendant les 10 jours qui suivent la lésion pour les animaux soumis aux tests comportementaux ou pendant les 3 ou 7 jours après la lésion pour les animaux non soumis aux tests comportementaux qui sont utilisés afin d’étudier les effets à court terme du traitement. Dans une seule procédure, l’administration des antagonistes aux 2 types de récepteurs à l’histamine a lieu une fois par jour chez tous les animaux. Cette procédure s’effectuera pendant les 10 jours qui suivent la lésion pour les animaux soumis aux tests comportementaux ou pendant les 3 ou 7 jours après la lésion pour les animaux non soumis aux tests comportementaux qui sont utilisés afin d’étudier les effets à court terme du traitement. Dans chaque procédure, les animaux sont soumis à des tests comportementaux. Ils ont une durée de 25 min10 secondes par animal. Ils ont lieu aux délais pré-administration, J2, J3, J7, J15 et J30. Les tests effectués pour un groupe ont une durée correspondant à une matinée.

Impact sur les animaux

Pour tous les animaux de ce projet, l’introduction d’un liquide dans l’oreille moyenne et l’incision cutanée (qui ont lieu lors de l’administration transtympanique) peuvent être source de douleur et d’inconfort. Dans les 3 procédures de ce projet, les mêmes effets indésirables sont prévus sur les animaux lésés. Les animaux soumis à une lésion transtympanique peuvent avoir un déficit d’hydratation dans les 24-48 heures après l’atteinte vestibulaire et une perte de poids est attendue chez ces animaux lésés. Le syndrome vestibulaire conduit à d’autres effets indésirables tels que des problèmes de maintien de posture et de perte d’équilibre. Également, l’anxiété est connue pour être une des composantes du syndrome vestibulaire. L’injection des antagonistes (quotidiennement durant 10 jours), l’injection d’un marqueur de la prolifération cellulaire (une fois, J3 ou J7 post-lésionnel) ainsi que l’injection d’un analgésique (une fois avant l’administration transtympanique et une fois avant la mise à mort de l’animal) peuvent être perçues comme une nuisance par l’animal. L’ensemble du groupe d’animaux testé est délocalisé hors de son environnement (correspondant à la salle d’hébergement de l’animalerie) pendant une matinée aux différents délais des tests comportementaux (délais pré-administration, J2, J3, J7, J15 et J30 post-lésionnels). Cela pourrait être perçu comme une nuisance par l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures et le sang et les tissus seront récupérés pour procéder à des analyses. Il est nécessaire de procéder à des dosages et marquages histologiques spécifiques dans le cerveau des animaux utilisés dans ce projet afin d’élucider les effets de notre médicament dans notre modèle animal. Le sang récupéré permettra de procéder à des dosages de marqueurs spécifiques du stress et de l’anxiété. Ces mises à mort sont nécessaires pour la mise en évidence des effets à court et à long terme du traitement.

Remplacement

Il existe des alternatives n’utilisant pas de modèles animaux telles que la méthode in silico ou encore in vitro. La méthode in silico utilise des modèles informatiques dans le but de prédire ce qui se passerait dans la réalité. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle informatique mimant de manière aussi complexe la physiologie et la physiopathologie du syndrome vestibulaire. Un autre modèle serait le modèle in vitro qui consiste en l’étude d’éléments hors de leur environnement en conditions définies et contrôlées. Puisque nous avons besoin de l’individu dans son ensemble, autant au niveau cérébral qu’au niveau périphérique (informations quant à la posture et concernant l’état d’anxiété des animaux), nous ne pouvons pas substituer le modèle animal par ces modèles.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction, les rats correctement lésés lors de l’apprentissage de la lésion par l’expérimentateur seront inclus dans l’étude pilote. De plus, cette étude sera effectuée dans le but de permettre une mise à mort des animaux à deux délais au lieu de trois délais différents (J3 ou J7 post-lésionnel et J30 post-lésionnel). L’étude de ces deux délais est nécessaire afin d’élucider les effets à court terme du traitement et la prolifération cellulaire (J3 ou J7 post-lésionnel) mais aussi afin de comprendre les effets à long terme du traitement et la survie et différenciation cellulaire (J30 post-lésionnel). De plus, les animaux mis à mort au 30ème jour après la lésion pour les investigations cellulaires sont les animaux soumis aux tests comportementaux. Également, il a été choisi de faire un test qualitatif permettant d’observer l’expression de plusieurs protéines pro- et anti-inflammatoires, pouvant être modulées dans le syndrome vertigineux. Ce test permettra de cibler les protéines à étudier en profondeur en utilisant des tests semi-quantitatifs et ainsi de ne pas multiplier le nombre d’essai et d’animaux. Enfin, les mêmes animaux seront utilisés afin de réaliser l’ensemble des études biochimiques (correspondant aux dosages des protéines et des marqueurs du stress et de l’anxiété). Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour chaque groupe en fonction de l’expérience précédente de l’équipe et avec l’aide d’un statisticien. Enfin, la répartition des animaux dans les groupes sera randomisée et l’expérimentateur travaillera en aveugle. Dans la dernière procédure de ce projet, les groupes qui auront préalablement été faits lors de la procédure précédente ne seront pas répétés afin de limiter le nombre d’animaux.

Raffinement

Notre modèle d’étude est un modèle de lésion vestibulaire, obtenu par une administration transtympanique d’un produit chimique détruisant les récepteurs vestibulaires de l’oreille interne. Avant cette administration transtympanique, les animaux sont mis sous analgésie et anesthésie gazeuse pour éviter tout inconfort ou angoisse. Leur température est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée et une solution est appliquée sur leurs yeux pour assurer une hydratation oculaire. Après l’administration transtympanique, l’animal est observé jusqu'à récupération de l’anesthésie. Avant le réveil, l’animal est hydraté (injection d’un liquide) afin de compenser les pertes liquidiennes associées à la lésion vestibulaire. Les biberons sont équipés d'une pipette allongée pour faciliter l’hydratation et une solution nutritionnelle complète est déposée dans la cage pour assurer une bonne alimentation durant 1 semaine après la lésion. Puisqu’une perte de poids est un effet indésirable connu à la suite d’une lésion vestibulaire, un suivi de poids sera également effectué (1/jour pendant la première semaine après la lésion puis 1/semaine). L’apparence et le comportement des animaux sont évalués 2x/jour durant la première semaine après la lésion, puis 2x/semaine jusqu’aux derniers tests comportementaux. Cette évaluation se fait en utilisant une grille de score du bien-être animal adaptée au modèle utilisé. Tous les animaux sont soumis à une phase d’habituation à l’expérimentateur ainsi qu’à la salle d’expérimentation pendant une voire deux semaines limitant ainsi tout stress ou angoisse potentielle. Une récompense sera attribuée aux animaux à la fin des tests comportementaux (riz soufflé chocolaté) avant de les ramener dans leur salle d’hébergement au sein de l’animalerie. Les co-porteurs du projet sont formés en expérimentation animale (niveau concepteur de projet) et sensibilisés au bien-être animal.

Choix des espèces

La compensation vestibulaire est un processus présent chez les mammifères. Précédemment, notre laboratoire étudiait le modèle félin, espèce la mieux adaptée au comportement d’équilibration. Les tests comportementaux utilisés chez le chat ont ensuite été adaptés chez le rat. Le modèle rongeur présente de nombreux avantages en termes de manipulation et il reproduit le syndrome vestibulaire rencontré chez différentes espèces, dont l’humain. De plus, la durée totale du syndrome vestibulaire est significativement réduite chez le rat (2 à 3 semaines) par rapport à l’humain (90 jours). Ce gain temporel est avantageux pour l’étude de composés anti-vertigineux et pour la compréhension des mécanismes neurobiologiques responsables du syndrome. De plus, à un niveau cellulaire, nous retrouvons les mêmes modifications post-lésionnelles que celles observées chez le chat (production de cellules, modification dans l’inflammation et dans les marqueurs de l’excitabilité neuronale). La présente étude s’intéresse aux processus de compensation post-lésionnelle adultes présents après lésion vestibulaire et à l’effet anxiolytique de la bétahistine. L’étude de ces mécanismes dans les noyaux vestibulaires sera donc réalisée sur des rats adultes (10 à 13 semaines), afin de s'assurer d’être sorti de la période développementale. Pour un rat, la maturation des neurotransmetteurs et la densité synaptique est atteinte à plus de 8 semaines. De plus, en période développementale, un marqueur de l’excitabilité neuronale (co-transporteur membranaire) est moins exprimé qu'à l'âge adulte. Puisque nous étudions cet élément comme étant une des modifications post-lésionnelles, il est nécessaire d'avoir des rats adultes d'au moins 10 semaines pour tester nos différents composés et avoir une maturation complète du système nerveux central.

82 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne et des rats sains reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique, puis des prélèvements sanguins mensuels et un prélèvement terminal, pour tester de nouveaux promoteurs censés cibler le traitement sur les muscles. Le porteur justifie le choix du rat en écartant la souris, au phénotype jugé trop peu marqué, et le chien, jugé trop lourd à manipuler. Les bénéfices annoncés pour les patients, des doses plus faibles et moins de toxicité, sont renvoyés au conditionnel.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD qui code pour une protéine appelée Dystrophine. La Dystrophine est essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité de l'ensemble des muscles de l'organisme (y compris le coeur). L’absence de Dystrophine dans les muscles provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. Aucun traitement n’est disponible à ce jour pour la DMD. La thérapie génique, qui vise à corriger ou remplacer le gène DMD est aujourd’hui une approche prometteuse pour le traitement de cette maladie. Pour réaliser un transfert de gène efficace, il est possibile d'utiliser des vecteurs viraux dérivés des Virus Adéno-Associés (AAV) produits en laboratoire dans des systèmes cellulaires. Ils assurent un transfert de gène thérapeutique sûr et efficace dans différents tissus/organes (oeil, muscle, foie ou cerveau). Les AAV sont des produits thérapeutiques performants mais des essais précliniques et cliniques ont montré des limites à leur utilisation, avec notamment la nécessité d'utiliser de fortes doses, et un transfert de gène dans certains tissus non ciblés (tissus non musculaires), avec un risque de toxicité associé. Une approche pour contrer cet effet secondaire indésirable des vecteurs AAV repose sur l'utilisation, dans ces vecteurs AAV de séquences d'ADN particulières (appelées promoteurs "tissus-spécifiques"), qui vont permettre de restreindre le traitement uniquement dans les tissus ciblés dans la pathologie à traiter, soit, dans le cadre de la Dystrophie Musculaire de Duchenne, dans les muscles squelettiques et le coeur. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité et la spécificité de nouveaux promoteurs "muscle-spécifiques" portés au sein de vecteurs AAV. Cette évaluation se fera chez le rat DMDmdx, modèle animal pertinent de la DMD, mais également chez le rat sain, afin d'évaluer les potentielles différences d'activité de ces promoteurs entre un tissu pathologique et un tissu sain.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra d'identifier un (ou plusieurs) promoteurs "muscle-spécifiques" et de rendre les traitements utilisant les vecteurs de thérapie génique de type AAV beaucoup plus sécuritaires et plus efficaces: plus sécuritaires via le ciblage du traitement uniquement dans des tissus ciblés (ici les muscles), et plus efficaces car permettant d'obtenir un effet théraputique à une plus faible dose de vecteur AAV que celles actuellement utilisées. Une réduction des doses à injecter permettra de réduire la toxicité associée à l'injection de ces fortes doses, et de réduire le coût du traitement. L'identification de tels promoteurs "muscle-spécifiques" aura une application directe pour le traitement des patients atteints de DMD à l'aide de vecteurs AAV. De plus, si ces promoteurs montrent la même efficacité dans les muscles sains et dans les muscles dystrophiques, il pourra alors être envisagé de les utiliser dans des vecteurs AAV thérapeutiques visant à traiter d'autres types de maladies musculaires.

Procédures

(i) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 10min. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine jugulaire le jour de l'injection, puis une fois par mois jusqu'à la mise à mort de l'animal (2 prélèvements pour les animaux suivis 2 mois post-injection, et 4 prélèvements pour les animaux suivis 4 mois post-injection). Prélèvements effectués sous anesthésie, pour un volume correspondant à 7.5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal. Durée de l'intervention: maximum 10min. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

(i) L'injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale se fera sous anesthésie et ne provoquera donc pas de stress ou de douleur aux animaux. Les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Prélèvements sanguins mensuels au niveau d'une veine jugulaire: les animaux pourraient être stressés par les anesthésies, mais celles-ci seront espacées d'au moins 4 semaines, et les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et immunohistologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs). Ce projet, qui vise à évaluer l'efficacité et la spécificité d'éléments géniques régulateurs, à la fois dans un contexte malade (DMD) et un contexte sain, et dans plusieurs tissus différents, ne peut donc être réalisée in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets sur le modèle de rats DMDmdx, lors desquels des résultats d'analyses moléculaires et immunohistologiques cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Pour les rats DMDmdx, nous nous laissons la possibilité d'inclure un animal supplémentaire par groupe (avec un maximum de 10 animaux DMDmdx supplémentaires sur l'ensemble de l'étude), en cas de sacrifice prématuré d'un animal du fait de l'évolution de la maladie chez ces animaux avec phénotype dommageable.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois), un hébergement à deux animaux (par groupe expérimentaux), accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Il existe un modèle de rat possèdant un défaut génétique dans le gène codant pour la protéine Dystrophine, le rat DMDmdx. Dans ce modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD), l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype sévère. Les modèles animaux atteints de cette maladie les plus classiquement utilisés : souris déficientes en dystrophine (souris mdx) et chien Golden Retriver déficient en dystrophine (chien GRMD), présentent des limites pour les projets pré-cliniques : -La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec un phénotype peu marqué. -Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients atteints de la Dystrophie Musculaire de Duchenne et un phénotype sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Afin de comparer les résultats obtenus dans un contexte sain et un contexte dystrophique, des rats sains de type Sprague Dawley (même fond génétique que les rats DMDmdx) seront utilisés. Les animaux seront injectés à l'âge de 1 mois au niveau de la veine caudale. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients DMD pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants ou jeunes adolescents, pré-pubères). Les animaux injectés seront ensuite suivis sur une durée de soit 2 mois, soit 4 mois après injection pour documenter l’efficacité du traitement à 2 temps différents. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette myopathie est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation devient sévère (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation) pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois.

970 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés ensuite dans d'autres projets après avis vétérinaire. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie de 1h30 à 2h, parfois une seconde chirurgie pour une mini-pompe, puis reçoivent des candidats médicaments par diverses voies pendant plusieurs jours, avec des périodes d'isolement et de mise à jeun jusqu'à 20 heures. Le porteur décrit ces atteintes comme un stress modéré et transitoire. Il affirme qu'avant toute administration à l'homme l'animal constitue un "passage obligatoire" et qu'il n'existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets cardiovasculaires.

Objectifs

Chaque étude de ce projet consiste à évaluer les effets cardio-vasculaires de différents candidats médicaments chez le rat éveillé en utilisant un enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (télémétrie). Pour cela, des chirurgies sont prévues afin d'implanter de manière définitive un dispositif d'enregistrement. Les enregistrements se feront en cage de vie et sur des animaux libres de leur mouvements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les procédures de ce projet nécessitent différents types d'interventions. Dans un premier temps, une chirurgie sous anesthésie générale sera pratiquée afin d'implanter un dispositif (émetteur de télémétrie) permettant l'enregistrement automatique des paramètres cardio-vasculaires (durée: 1h30-2h). Les animaux seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Après la chirurgie d’implantation de l’émetteur de télémétrie, 10 à 15 jours de récupération, au minimum, sont prévus avec isolement des animaux pour optimiser la cicatrisation. Pour certains protocoles, une seconde chirurgie pourra être pratiquée après récupération de la première chirurgie (durée: 30-45min). Le but de cette seconde chirurgie est d’implanter une mini-pompe sous la peau pour perfuser le produit à tester de façon continue. Dans ce cas, les soins post-opératoires ne pourront pas être suspendus et leurs durées seront fonction du type de mini-pompe implantée (durée maximale: 1 semaine). Le candidat médicament ou du placebo seront administrés aux animaux par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée (continue ou non), transdermique, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion ou continue) (durée 1-2minutes et non applicable pour les administrations continues via une mini-pompe). Ainsi, leur potentiel effet sur les paramètres cardiovasculaires pourra être évalué. Cette évaluation se fera chez un animal éveillé et libre de ses mouvements dans sa cage d'hébergement pendant plusieurs heures ou jours. Dès que possible, les animaux seront hébergés avec un animal compagnon afin de ne pas être isolé. Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile ou anesthésié (durée des prélèvements: moins de 3min). Pour certains protocoles, des animaux pourront être mis à jeun (durée maximale: 20 heures). En cas de mise à jeun, une période minimale d’une semaine sera respectée entre chaque expérience de télémétrie (à l'inverse de 24h sans mise à jeun).

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. La chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie et la potentielle chirurgie d'implantation d'une mini-pompe peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Post-chirurgie.s, les animaux pourront être isolés: 10/15 jours maximum post chirurgie d'implantation de l'émetteur de télémétrie et éventuellement, 1 semaine supplémentaire maximum post chirurgie d'implantation d'une mini-pompe. Cet isolement engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée (désocialisation). Cependant en contrepartie, l'isolement permettra aussi d'accélérer la récupération post-chirurgicale. Finalement, les animaux pourront être mis à jeun avant l'administration du produit (et de façon exceptionnelle, avant les chirurgies). Cette période de jeun durera maximum 20h. La mise à jeun engendre un stress physiologique et psychologique d'intensité modérée mais de courtes durées.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire (sauf en cas de prélèvements d’organes / fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal).

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la fonction cardiovasculaire. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe (6 à 12) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. L'utilisation de la télémétrie permet de faire des suivis sur de longues périodes. De plus, en général, les mêmes animaux sont utilisés pour les administrations des placebos et des produits (avec un temps de récupération entre les 2). Ainsi, la technique de télémétrie permet de diminuer le nombre d'animaux en ne multipliant pas les animaux pour l'étude de divers temps et groupes expérimentaux. Enfin, une réutilisation des animaux pour plusieurs études, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra aussi de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu par : l'utilisation d'animaux libres de leurs mouvements pendant les enregistrements, la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, la validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, des protocoles chirurgicaux avec une anesthésie et une analgésie adaptées et maitrisées, le suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet de réduire les contraintes potentielles pour l'animal à leur minimum.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces de rongeurs les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur le système cardiovasculaire car il s'agit d'une espèce bien connue et décrite dans les premières étapes de l'évaluation des effets cardiovasculaires des candidats-médicaments. Des animaux adultes seront utilisés. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticorps, par voie intraveineuse sous anesthésie ou trois injections intrapéritonéales par semaine pendant un mois, avec des prélèvements sanguins rétro-orbitaux hebdomadaires sous anesthésie jusqu'à cent jours, pour mesurer la durée d'action d'une immunothérapie anti-CD45RC avant un essai clinique. Le porteur indique que la biosécurité de l'anticorps a déjà été démontrée et qu'aucun effet indésirable n'a été observé, et précise que tous les rats sont euthanasiés pour analyser le sang, la rate, les ganglions et la moelle osseuse. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'ensemble des systèmes biologiques humains et conclut que le rat reste le "meilleur modèle".

Objectifs

L'immunothérapie ciblée constitue un espoir majeur dans le traitement de nombreuses pathologies dont les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes ou encore le rejet de greffe. Contrairement aux médicament immunosuppresseurs couramment utilisés, la thérapie par injection d'anticorps permet d'induire des effets immunomodulateurs spécifiques en agissant uniquement sur les populations cellulaires d'intérêt. Depuis plusieurs années, notre équipe de recherche a démontré l'efficacité de l'immunothérapie par injection d'anticorps dans le contrôle de l'inflammation dans des modèles de transplantation, de maladie du greffon contre l'hôte et de maladie auto-immune. Une nouvelle société pharmaceutique développe actuellement plusieurs versions de cet anticorps. Les résultats obtenus suite à la collaboration entre cette société et notre laboratoire de recherche permettent aujourd'hui d'envisager un essai clinique de phase I courant 2024. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la pharmacodynamique (la durée de l'effet thérapeutique) de l'anticorps in vivo chez le rat en prévision de cet essai clinique.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est de définir à la fois la durée de l'effet d'une injection d'anticorps, et la durée de l'effet d'un cycle de traitment par injection répétées d'anticorps. Ces résultats ont pour objectif final d'orienter le protocole de traitement pour l'essai clinique chez l'Homme.

Procédures

Les animaux auront soit une seule injection d'anticorps en intraveineuse (sous anesthésie) soit un mois de traitement avec 3 injections intrapéritonéales par semaine. Dans les deux cas, un petit volume de sang sera prélevé en rétro-orbital sous anesthésie toutes les semaines à partir de la dernière injection et jusqu'à réapparition des cellules (maximum 100 jours après la dernière injection d'anticorps) pour controler l'efficacité à long terme du traitement.

Impact sur les animaux

La biosécurité de l'anticorps, selon la dose et les protocoles utilisés dans cette étude, a déjà été démontré. Aucune nuisance ou effet indésirable n'a été observé. Les injections intraveineuses ou intrapéritonéales ainsi que les prélèvements sanguins peuvent engendrer une douleur légère de courte durée.

Devenir

L'euthanasie au terme de la procédure ou à l'atteinte du point limite est nécessaire pour permettre l'analyse en parallèle des cellules présentes dans le sang et dans les tissus tels que la rate, les ganglions et la moelle osseuse.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsqu'aucun modèle expérimental in vitro ne permet de le remplacer. Aujourd'hui il n'existe pas de modèle in vitro qui permette de reproduire l'ensemble des systèmes biologiques présents chez l'homme. Ainsi, l'injection d'anticorps chez le rat (anticorps démontré comme étant un bon susbtitut de l'anticorps humain) est le meilleur modèle pour étudier la durée de l'effet du traitement en prévision d'un essai clinique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire chez l'animal. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les symptômes seront évalués selon une grille critériée deux fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batônnet de bois,...).

Choix des espèces

Nous avons déjà démontré l'intérêt des modèles de rats pour étudier les pathologies humaines et notamment pour étudier l'implication de certaines cellules dans leur développement. Ainsi, en plus d'avoir mis en évidence la pertinence de l'utilisation des modèles de rats, nous avons prouver que l'injection de notre anticorps n'induit pas d'effets indésirables ou nuisibles chez le rat adulte.

930 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une ou deux neurochirurgies pour induire un modèle de maladie de Parkinson, des prélèvements sanguins sous anesthésie et une batterie de tests comportementaux moteurs, cognitifs et sensoriels dont le RNT ne précise pas le détail, pour évaluer un implant censé protéger les neurones. Le porteur indique que le modèle induit des symptômes moteurs qui restent légers et que les rats sont mis à mort pour analyse du cerveau. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthodes alternatives" et renvoie les bénéfices pour les patients au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier les effets d’un dispositif ayant des propriétés protectrices contre la mort des neurones impliqués dans la maladie de parkinson sur un modèle de rat parkinsonien. Ce projet a pour but d'évaluer l'effet bénéfique de ce dispositif sur la perte de ces neurones ainsi que les performances des rats dans des tâches comportementales motrices, sensorielle, psychiatrique et d'apprentissage caractéristiques de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet aura pour bénéfice d’apporter les dernières preuves d’efficacité du dispositif sur les mécanismes connus pour déclencher la maladie de Parkinson. Ces résultats permettront de faciliter le passage aux essais cliniques directement chez le patient. La maladie de Parkinson, ainsi que de nombreuses maladies neurodégénératives, n’a à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique autre que le soulagement des symptômes. La finalité de ce projet est que ce dispositif apportera une possibilité de ralentir la progression de la maladie et ainsi, l’évolution des patients vers des stades de plus en plus handicapant pouvant aller jusqu’à la perte d’autonomie, la démence et une forte réduction de la qualité de vie des patients.

Procédures

Les rats subissent des neurochirurgies pour une durée de 30 minutes, anesthésie incluse. Les rats peuvent avoir une ou deux neurochirurgies. Les rats auront 4 prélévements sanguins sous anesthésie générale pour une durée de 10 minutes maximum. Les rats participeront également à des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités motrice, psychiatrique, d'apprentissage et sensorielle impactées par le modèle de la maladie de Parkinson. La durée de ces tests est de 1 à 30 minutes et se feront durant deux semaine, avec un test par jour maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux seront : 1) la neurochirurgie pour induire le modèle de rats parkinsoniens qui implique une anesthésie générale, 2) Le modèle utilisé induit l’apparition progressive des symptômes moteurs et non-moteurs qui restent cependant légers sur la plus grande partie de ce projet 3) Nous effectuerons 4 prélèvements sanguins dans la veine de la queue du rat qui peut induire du stress dû à l'anesthésie et une légère hémorragie. 4) Nous effectuerons un large panel de tests comportementaux afin d’évaluer l’effet de notre modèle de rats parkinsoniens et l’effet bénéfique de notre implant qui peuvent induire un stress dû au déplacement dans la salle d'expérimentation et le passage dans un nouvel environnement.

Devenir

Les rats seront mis à mort pour effectuer des analyses des tissus cérébraux.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent d'évaluer l'impact du modèle de rats parkinsoniens et du dispositif sur les différents marqueurs cellulaires et moléculaires caractéristiques de la maladie de Parkinson et du modèle de rats parkinsoniens et sur le comportement des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique. Les animaux seront testés en deux sessions successives incluant la moitié des rats de chaque groupe. Si les résultats sont suffisant pour mettre en évidence des différences satistiquement significative sur les paramètres décrits précedemment, il ne sera pas nécessaire de faire la deuxième session.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur ayant pour avantage que les déficits moteurs bilatéraux restent modérés tout au long du protocole. Afin de prévenir toute douleur post-opératoire supplémentaire pouvant affecter la récupération de l’animal, une injection d'un analgésique avant la procédure chirurgicale puis toutes les 24 heures après la chirurgie si nécessaire sera effectuée. Ces chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale en maintenant une température constante, les yeux sont protégés du déssechement et un anesthésique local est injecté sur le crâne de l’animal avant incision. Suite à la chirurgie, les rats sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Afin de réduire le plus possible toute douleur ou détresse que les animaux pourraient ressentir, ils seront observés au moins une fois par jour par le personnel compétent impliqué dans la réalisation des expériences et/ou dans le soin des animaux. Une échelle de cotation de douleur sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal. Les animaux seront également hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément.

Choix des espèces

Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau d'un réseau de neurones important pour notre étude car il est connu pour dysfonctionner dans la maladie de Parkinson, ce qui peut être reproduit chez le rat. Les modèles de rats Parkinsoniens seront réalisés sur des rats jeunes adultes (à partir de 10 semaines, environ 300g en début d’expérience) afin de travailler sur des systèmes cérébraux matures et stables qui resteront stables tout au long du projet.