Rats

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées de nitroglycérine, une tous les deux jours pendant neuf jours, pour reproduire une migraine chronique et une hypersensibilité douloureuse au toucher appelée allodynie, avant d'être anesthésiés et mis à mort pour prélever leurs tissus nerveux. Le porteur étudie l'implication des astrocytes et annonce un intérêt "fondamental" doublé d'une possible piste thérapeutique contre la migraine humaine. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace ce protocole car la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux.

Objectifs

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades. L’allodynie correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à une inflammation.En temps normal, les informations tactiles et douloureuses n’aboutissent pas au même niveau de la moelle épinière ou du tronc cérébral, les deux modalités sensorielles (tact et douleur) sont donc normalement séparées. En conditions pathologiques, par exemple lors d’une allodynie, l’information tactile devient capable d’activer des neurones nociceptifs, grâce à un circuit qui implique plusieurs cellules. Le tact va alors devenir douleur (allodynie mécanique). Ce processus va provoquer l'activation de plusieurs populations neuronales et implique également une population spécifique de cellules gliales, les astrocytes. Cependant, peu de choses sont connues sur ces cellules et leur implication dans le déclenchement de l’allodynie .L’objectif de ce projet va consister à étudier l’implication des astrocytes et plus précisément des canaux potassiques astrocytaires dans un modèle de migraine chronique .Ce projet combinera des études comportementales et d’expression protéique. Il présente donc un intérêt fondamental, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les douleurs pathologiques chez l’homme.

Bénéfices attendus

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques.

Procédures

Les injections intra péritonéales (fréquence: 1 injection tous les 2j pendant 9j/ durée: 30s) et les perfusions (fréquence: 1/ durée 30min) seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal.

Impact sur les animaux

Les résultats obtenus des travaux des autres laboratoires avec ce modèle de migraine chronique ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux autre que la développement d'une allodynie. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une quantification protéique ou une analyse immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de Nitroglycérine.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales et moléculaires est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux par groupe: habituation, injection,comportement, prélèvements et préparation des échantillons. C'est un modèle que le laboratoire veut mettre en place, donc, pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05. Les groupes non stimulés (NS) seront réalisés en priorité; si les résultats obtenus sont significatifs, nous ne réaliserons pas les groupes stimulés (St).

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats seront préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, en cas d’injection d’un produit inflammatoire au niveau de la lèvre supérieure droite ou de la patte, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. Lors des enregistrements électrophysiologiques, un contrôle de la température et cardiorespiratoire est réalisé sur l'animal. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie. Si au cours de l’expérimentation, l’animal a de grosses difficultés à se déplacer, se relever pour se nourrir, l’animal sera euthanasié par dose létale de pentobarbital.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 7-10 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.

129 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats reçoivent un implant de céramique dans l'os par chirurgie, les souris un implant sous la peau, avec suivi par micro-scanner. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales au site opératoire. Il affirme qu'aucun modèle de formation osseuse in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la cicatrisation, et vise à tester des céramiques comme alternative à l'autogreffe.

Objectifs

La réparation du squelette après perte de substance osseuse demeure un problème lorsque les défauts sont de grande taille. Si le traitement par autogreffe (prélèvement d’os chez le même patient) reste la référence, il a cependant des inconvénients. Les matériaux à base de céramiques en phosphate de calcium (CaP) sont une bonne alternative à l’autogreffe osseuse car supportent bien la repousse osseuse mais, généralement qu’aux abords des berges osseuses limitant leur efficacité à des défauts de faible volume. Une stratégie prometteuse pour améliorer le potentiel régénératif de ces matériaux est de mieux mimer la composition chimique de l’os (partie minérale), qui contient de nombreux oligo-éléments sous formes d’ions (tels carbonates, fluor, magnésium, manganèse…). L’insertion d’ions dans les céramiques de CaP est une approche de plus en plus étudiée permettant de moduler les propriétés physico-chimiques et microstructurales du matériau, et ainsi ses propriétés biologiques. Parmi les éléments ‘traces’ présents naturellement dans l’os, le silicium (principal élément composant le sable) joue un rôle essentiel dans le développement, la croissance et la calcification du tissu osseux (une alimentation déficiente en silicium engendre un retard de croissance accompagné d’un développement crânien anormal chez le rat alors qu’un régime enrichi en silicium améliore leur croissance squelettique). Le silicium est présent dans le corps sous forme d’ions silicates. Des études in vitro démontrent que les ions silicates favorise la différenciation de cellules qui produisent le tissu osseux et inhibe les cellules osseuses qui résorbent l’os. L’incorporation d’ions silicates dans ces matériaux a été déjà étudiée ces dernières années mais en raison de la faible dégradation des céramiques de CaP in vivo, les ions Silicates (qui pourraient influencer les cellules osseuses) ne sont en fait jamais libérés. L’incorporation d’ions carbonates, (ions naturellement présents dans le tissu osseux à 5-8%) dans les céramiques augmente leur dégradation in vivo. Considérant les avantages de chacun, l’incorporation simultanée d’ions silicates et carbonates dans la structure des céramiques rendrait le matériau dégradable, libérant ainsi les ions Silicates bioactifs pour stimuler les cellules osseuses et promouvoir l’ostéogénèse. L’objectif de ce projet est d’évaluer la dégradation des différentes céramiques (+/- ions) in vivo et leur potentiel à réparer un défaut osseux.

Bénéfices attendus

Plusieurs données de la littérature ont montré le bénéfice de céramiques contenant des ions silicates sur la formation osseuse ; mais une controverse persiste dans la communauté scientifique en raison de la faible/absence de dégradation des céramique in vivo, limitant la libération des ions silicates bioactifs. Le co-insertion d’ions carbonates et silicates a pour objectif d’obtenir des matériaux dégradables et donc plus bioactifs. Ce projet permettra de valider (ou invalider) l’intérêt d’insérer des ions silicates dans une biocéramique pour la réparation osseuse. Le bénéfice attendu à plus long terme est l’optimisation de la synthèse et fabrication d’implants en biocéramique pour le comblement de grands défauts osseux en remplacement de l’autogreffe.

Procédures

Pour les souris : 1-Implantation sous cutanées de matrices ( 1X ; durée ~20 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (max 7X; durée 15 min) Pour les rats : 1- Implantation intraosseuse au niveau du condyle (1X, durée 40 min) ; 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (6X; durée 15 min) 3- Injection d'agent fluochromes (2X ; durée 5 min)

Impact sur les animaux

Nuisances attendues causées durant les actes expérimentaux : stress dû à la contention puis lors de la perte de connaissance par le gaz anesthésiant (souris et rats) ; Injection en sous cutané (souris et rats); Injection en intrapéritonéal (souris et rats); Chirurgie en sous-cutané (sous analgésie et anesthésie) (souris) ; Chirurgie en intra-osseux (sous analgésie et anesthésie) (rats). Nuisances attendues engendrés suite aux expérimentations : douleurs post-chirurgie (niveau du site opératoire) (souris et rats)

Devenir

Mise à mort car fin de protocole ; les explants seront récupérés et traités selon l’étude (analyse expression génique, histologie, analyse au scanner à plus haute résolution, mesure de la masse de la céramique restante).

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire ; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

4 ou 2 implants seront implantés par animal pour diminuer le nombre d’animaux utilisé. L’imagerie non-invasive pour petits animaux (suivi de la formation osseuse par micro-scanner) sera utilisée pour suivre les mêmes animaux dans le temps et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisé. Une analyse statistique en préalable a permis de déterminer qu’il nous fallait 10 animaux par groupe testé pour espérer obtenir une différence statistique entre au moins 2 groupes.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée entre l’arrivée des animaux et la chirurgie. Le manipulateur viendra les voir et manipuler au minimum 3 fois avant la chirurgie. En vue d’éviter le stress, les souris et les rats initialement hébergés ensemble (3 animaux/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La souffrance sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire pendant les 3 premiers jours. Après anesthésie et avant chirurgie, un gel sera est appliqué sur chaque œil pour éviter le dessèchement des yeux. Après chirurgie, les animaux seront surveillés en per-opératoire puis régulièrement jusqu'à la fin de l'expérimentation. Pour chaque analyse par micro-scanner, les souris et rats seront anesthésiées par inhalation d’un gaz anesthésiant dont les effets se dissipent 1 à 2 minutes après l’arrêt du contact direct avec le produit. Les points critiques (plaie, démarche..) seront surveillés, notés et reportés sur une feuille de score permettant de quantifier la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures à prendre pour chaque situation clinique (Perte de poids, Comportement général altéré, Apparence extérieure altérée, Site d’implantation infecté) et si les points limites sont atteints, sont listées sur cette feuille de score. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), dômes (pour souris) et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour les implantations sous-cutanées est la souris immunodéprimée Nude (ayant un système immunitaire adaptatif altéré, mais inné non-altéré) car une procédure implique l’association de céramiques avec des de cellules humaines formatrices de tissu osseux; son poids à 8 semaines (~30 g) permet l’implantation de 4 implants par souris ou 2 chambres de diffusion par souris sans problème. Le modèle animal choisi pour les implantations intra-osseux est le rat Wistar. La taille du rat est plus pertinente que la souris pour évaluer la réparation d’un grand défaut osseux. La souche Wistar est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin.

2 200 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et 275 non greffés réutilisés pour de la formation. Une tumeur leur est induite par injection dans le péritoine, parfois précédée d'une irradiation, puis ils reçoivent des composés à tester par voies multiples, avec prélèvements sanguins et imagerie répétés. Le porteur indique que les prélèvements de sang sont le geste le plus stressant et que les animaux greffés ne peuvent plus servir à autre chose. Il décrit les reconstructions de tumeurs en 3D comme marginales et difficilement transposables à l'Homme.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des cancers de la cavité abdomino-pelvienne ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier, dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, les mécanismes d’évolution des cancers ou de métastases dans la cavité abdomino-pelvienne. Grâce à ces études et dans un environnement adapté (ajout de cellules immunitaires humaines ou dans un système immunocompétent), il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). - Selon les modèles, les animaux seront transportés vers le site où ils seront irradiés (une seule fois, 2 heures). - Selon les modèles, un implant sous cutané sera posé sous anesthésie (une seule fois, 5 minutes) - Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). - Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisants administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention avec ou sans anesthésie générale (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. - Pesée des animaux (moins de 1 minute) - Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). - Recueil d’urine en hébergement individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). - Techniques d’imagerie, potentiellement répétées : sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal : -Identification des animaux : implantation d’un transpondeur, clips d’oreilles ou tatouage (1 minute) -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation (2 heures) -Pose d’un implant Sous Cutané (5 minutes) -Induction tumorale par IP (1 minute) -Radiothérapie (1heure) -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée (1 minute) -Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie, 1 heure) Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique (1 minute) Au début de l’étude, les animaux seront distribués dans des groupes de traitement. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation (30 minutes) Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal (5 minutes).

Devenir

Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée. Tous les animaux greffés et inclus dans les groupes de traitement seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux non greffés et surnuméraires peuvent être réutilisés pour formation.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations interindividuelles. Entre 10 et 20 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle ou d’amplification tumorale) à 15 groupes. Le nombre d’animaux par groupe peut varier généralement entre 3 et 15, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisées dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. Pour les modèles de cancer dont l’induction est réalisée en intrapéritonéale un nombre d’animaux surnuméraire de 5% pourra être utilisé (pour 100 animaux, 105 seront greffés).

Raffinement

De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires en termes d’anesthésie, de volume, fréquence et antalgie. Ces actes seront réalisés sous anesthésie (sauf pour les administrations orales) avec l’analgésie appropriée pour les injections en intramusculaire/intradermique (opiacés). Les traitements par radiothérapie seront faits sous anesthésie générale. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Un groupe contrôle d’animaux non porteur de tumeur sera utilisé pour monitorer la prise de poids moyen naturelle des animaux au cours de l’étude. La croissance tumorale de chaque animal sera suivie par la différence de prise de poids de l’animal de l’étude par rapport à la prise de poids moyenne d’animaux non porteur de tumeur. Un pourcentage de prise de poids supérieur à 10% constituera un point limite.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 6 semaines afin que leur morphologie facilite l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester et le développement de la tumeur.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sous anesthésie une chirurgie d'ischémie du membre inférieur par ligature de l'artère fémorale, suivie de la pose d'un stent, pour évaluer un stent recouvert de vésicules biologiques. Le porteur reconnaît une douleur prise en charge par la buprénorphine et un stress lié aux manipulations. Il annonce un dépôt de brevet et renvoie l'essai chez des patients au long terme, jugeant qu'aucune alternative in vitro ne teste le bénéfice global d'un stent.

Objectifs

L'angioplastie et la pose de stents sont les principales approches thérapeutiques pour permettre la revascularisation des artères bouchées qui sont responsables d’AVC ou d’infarctus du myocarde. Les stents disponibles actuellement peuvent entraîner des complications graves chez certains patients et nécessitent souvent une thérapie médicamenteuse anti-agrégante associée afin de limiter les éventuelles complications. Nous proposons de tester des nouveaux stents bioactifs et recouverts de vésicules biologiques ayant déjà montré des propriétés anti-inflammatoires et cardioprotectrices dans des modèles animaux après injection intraveineuse. L’intérêt sera d’amener directement ces vésicules sur le site/artère bouchée via le stent. L’objectif est donc de tester les bénéfices thérapeutiques de ce type de stent dans un modèle expérimental de maladies cardiovasculaires, sur 40 rats, nombre nécessaire afin de conclure de manière statistique sur le bénéfice.

Bénéfices attendus

Ce projet fera l’objet d’un dépôt de brevet auprès de la SATT avant publication des résultats. Au final, ce projet vise à développer des stents actifs « coatés » avec des CD146-EV afin de diminuer les thromboses de stent et les resténoses intra-stent dues à la composante inflammatoire résiduelle de la paroi vasculaire. A plus long terme, nous envisageons de tester les bénéfices de ces nouveaux stents biologiques actifs dans des cohortes de patients recrutés dans les services de cardiologie interventionnelle.

Procédures

Une procédure chirurgicale par animal d'une durée de 40 minutes sous anesthésie générale gazeuse.

Impact sur les animaux

Les animaux devront subir sous anesthésie générale gazeuse, des injections d’analgésie, une chirurgie d'ischémie du membre inférieur par ligature de l'artère fémorale puis seront implantées dans la foulée avec le stent déposé au niveau de l'artère obstruée, avant réveil. Les expérimentations prévues entraînent une douleur qui sera prise en charge par l’administration de buprenorphine. Les animaux pourront également subir une angoisse générée par les manipulations (pesée, mise en cage d’induction anesthésique).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse des bénéfices du stent biologiquement actif après ischémie.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucune autre alternative à l'utilisation d'un modèle animal pour tester le bénéfice global d'un stent biologiquement actif sur artère obstruée après ischémie, l'évaluation des effets indésirables hors-cibles ne pouvant pas se faire in vitro.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux sera utilisé pour atteindre le seuil statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés au moins par 2 dans des cages contenant de l’enrichissement, type carrés de coton et dômes, et auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Aussi, si les animaux présentant des symptômes type infection visible cliniquement donc essentiellement cutanée (dermatite), ils seront écartés des protocoles. Nous serons attentif à toute souffrance animal lors de l'élevage. En effet, si l'animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait l’analgésie peut être envisagée par administration de carprofène par voie sous-cutanée à 5 mg/kg, 1 injection par jour et si les signes de douleur persistent, l’avis du vétérinaire référent sera demandé.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation d'un modèle animal de pathologie athéroscléreuse tel que ApoE KO qui est très bien décrit et exploré avec le modèle murin ou le rat. Ici, la pose de stent nécessite des vaisseaux les plus larges possibles, donc le choix s'est porté sur le rat ApoE KO. Les animaux seront utilisés au stade adulte à un âge avancé d’environ 20 semaines. En effet, les AVC et les infarctus du myocarde touchent le sujet humain adulte. Il faut donc utiliser le modèle adulte pour ces protocoles. Par ailleurs, il est beaucoup plus aisé de réaliser les protocoles sur des rats de taille adulte et ainsi d’effectuer les bons gestes, ce qui justifie d'utiliser les rats au stade adulte.

128 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'implantation intratissulaire d'un dispositif de mesure sous anesthésie puis deux heures d'acquisitions IRM, et 76 d'entre eux subissent en plus l'induction d'un gliome, pour développer des micro-antennes d'imagerie. Le porteur reconnaît des risques de saignement, d'hémorragie et de troubles neurologiques liés à la tumeur intracérébrale. Il indique valider en amont in vitro et in silico, et présente le rat comme le modèle courant des plateformes d'imagerie précliniques.

Objectifs

Les objectifs du projet de recherche portent sur le développement et la validation de nouveaux dispositifs pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et à la spectroscopie par résonance magnétique (SRM). Ces dispositifs permettront de détecter et d’analyser de façon plus précoce, plus précise et plus sensible l’apparition et le développement de tumeurs. Ils permettront également de mieux évaluer la réponse des tumeurs aux traitements anti-tumoraux appliqués.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la réalisation de ce projet sont la validation de nouveaux dispositifs d’analyse IRM et SRM utilisables pour améliorer la compréhension in vivo de processus physiologiques et pathologiques (dans le cas présent, un modèle de gliome) mais également pour évaluer plus finement et précocement l’effet de thérapies ciblants ces pathologies.

Procédures

Les animaux (128), seront soumis à l’implantation intratissulaire d’un dispositif de mesures pour l’IRM. La procédure d’implantation, d’une durée d’environ 30 minutes, sera réalisée sous anesthésie générale. A la suite de de cette implantation, des acquisitions IRM seront réalisées sur les animaux sous anesthésie générale pendant deux heures. Une partie de ces animaux (76) sera soumise également à l’induction de tumeurs (modèle de gliome) réalisée sous anesthésie générale pour une durée d’environ 30 minutes. Le développement de la tumeur se fera sur une période d’environ 10 jours avant l’implantation intratissulaire d’un dispositif de mesures IRM et l’acquisition IRM comme décrit plus haut.

Impact sur les animaux

Pour les animaux utilisés pour la procédure 1, les effets indésirables et nuisances attendus et possibles sont les suivants. La pose de la canule présente un risque de saignement avec des effets indésirables de douleur post-opératoire et de stress lié à la présence de la canule sur le crâne de l’animal. L’introduction de la micro-antenne présente un risque d’hémorragie. Pour les animaux de la procédure 2, sur lesquels l’induction de la tumeur est réalisée, les nuisances et effets indésirables attendus et possibles sont les suivants. L’implantation des cellules tumorales présente un risque d’effet indésirable liés à la douleur post-opératoire. La croissance tumorale intracérébrale peut être cause de troubles neurologiques pour l’animal. La pose de la canule présente un risque de saignement avec des effets indésirables de douleur post-opératoire et de stress lié à la présence de la canule sur le crâne de l’animal. L’introduction de la micro-antenne présente un risque d’hémorragie. Durant la réalisation des gestes, pour l’ensemble des animaux, existent également des risques de déshydratation et de sécheresse oculaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure. La procédure subie par les animaux ne permettant pas de les maintenir en vie.

Remplacement

En ce qui concerne l’exigence de remplacement, la validation amont des protocoles de recherche sera réalisée dans la mesure du possible in vitro sur des solutions contenant des métabolites à des concentrations similaires à celles rencontrées in vivo ainsi que dans des fruits (raisins, kiwi, ...) et des gels d’agarose. Les antennes miniaturisées RF ont également été caractérisées in silico à l’aide de logiciel de simulation RF. L’ensemble de ces validations en amont permet de réduire le nombre d’animaux qui seront utilisés dans le projet et de s’assurer autant que possible de la pertinence de l’approche avant sa validation in vivo.

Réduction

En ce qui concerne l’exigence de réduction, la spectroscopie et l’imagerie par résonance magnétique (SRM et IRM) sont des techniques qui permettent de suivre longitudinalement l’évolution d’une pathologie ou les bénéfices d’une thérapie. De plus chaque animal peut être son propre témoin. Ceci permet de réduire fortement le nombre d’animaux nécessaire pour distinguer de façon statistiquement significative deux populations.

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement comprend l’installation dans les cages de cachettes, coton, frisures pour nidification en lanières de peuplier ou papier craft afin d’introduire de la nouveauté et briquette à ronger. L’hébergement se fait en groupe (3 rats par cage) durant la période d’acclimatation. Procédure 1 : L’état des animaux et leur niveau de souffrance seront évalués au niveau comportemental (posture anormale, isolement, réduction ou augmentation d’activité). L’administration d’analgésique (injection sous-cutanée Buprédine à 0,05 mg/kg) sera répétée dans le cas où l’animal montrerait des signes de souffrance (prostration, comportement, poils hérissés) aboutissant à un score inférieur à la moyenne calculée dans la fiche de suivi de l’animal. Les points limites pouvant entrainer l’arrêt de la procédure et la mise à mort de l’animal sont l’apparition de saignements trop importants au cours de la pose de la canule ou de l’introduction de l’antenne implantable, la perte de la résine et de la canule après le réveil de l’animal.Procédure 2 L’état des animaux et leur niveau de souffrance seront évalués quotidiennement au niveau comportemental (posture anormale, isolement, réduction ou augmentation d’activité). L’administration d’analgésique (injection sous-cutanée Buprédine à 0,05 mg/kg) sera répétée dans le cas où l’animal montrerait des signes de souffrance (prostration, comportement, poils hérissés) aboutissant à un score inférieur à la moyenne obtenue dans la fiche de suivi de l’animal. Les animaux seront pesés 2 ou 3 fois/ semaine jusqu’à la fin de l’étude. L’euthanasie de l’animal sera réalisée en cas de dépassement des points contrôles limites (perte de poids supérieur à 15 % et score obtenu dans la fiche de suivi de l’animal se maintenant à zéro). La taille des tumeurs sera mesurée à intervalle régulier (quelques jours) de façon non invasive par IRM. Une taille de tumeur supérieure à 5 mm sera considérée comme un point limite entrainant l’euthanasie de l’animal. Les autres points limites pouvant entrainer l’arrêt de la procédure et la mise à mort de l’animal sont l’apparition de saignements trop importants au cours de la pose de la canule ou de l’introduction de l’antenne implantable, la perte de la résine et de la canule après le réveil de l’animal.

Choix des espèces

Les rats sont les modèles animaux largement utilisés sur les plateformes d’imagerie IRM dites pré-cliniques. L’instrumentation et les protocoles sont spécifiques à cette espèce animale. Le rat type Wistar sera utilisé dans ce projet. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (entre 3 et 6 mois) afin de faciliter les procédures de chirurgie (pose de canule, implantation des antennes RF et croissance des tumeurs).

Une perte de poids de plus de 15 %, ou de plus de 10 % pendant plus de trois jours, constitue un point limite pour les 25 500 rongeurs de ce projet : 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les composés testés, froids ou radiomarqués, leur sont administrés par la bouche, le nez, la trachée, le muscle, la peau, l'abdomen, la veine porte, le cerveau ou la vessie, cette dernière voie après jusqu'à quatre heures de privation d'eau, ou par minipompe implantée par chirurgie. La phase in vivo peut durer jusqu'à 12 mois, avec des jeûnes jusqu'à 16 heures et un hébergement individuel sans enrichissement pour recueillir urines et fèces, afin de mesurer la distribution et l'élimination de composés que le résumé ne nomme pas. Le porteur déclare 10 220 rongeurs réutilisés, et réserve ce maintien en vie à ceux qui n'ont reçu qu'une administration unique de composé non radioactif et sont restés moins d'une semaine en procédure, les autres étant mis à mort pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie: intranasale, intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte d’1min environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ 1h); injection intraportale ou minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ 1h). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15min, anesthésie d’environ 1h). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’1h) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h,Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vis sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.

Devenir

Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales, intravésicales, intraportales, les prélèvements de liquide cérébrospinal et les poses et retraits de mini-pompes osmotiques ou d’un implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (buprénorphine au moins 30 minutes avant). Pour les pompes et implants, les animaux seront hébergés individuellement et suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie suturée (en général 3-4 jours) et des soins locaux seront apportés si nécessaire. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique (buprénorphine).

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.