Rats

648 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie une incision du caecum ou de l'estomac refermée par un polymère adhésif, pour valider des produits destinés à remplacer les sutures en chirurgie digestive. Le porteur annonce un risque d'infection bactérienne, des douleurs abdominales, une perte de poids et une léthargie après l'opération, les rats étant tués pour analyser la cicatrisation. Il présente ces travaux comme une étape de développement de ses propres polymères et affirme qu'il lui est "impossible" de les remplacer par des méthodes sans animaux.

Objectifs

Ce projet permettra de caractériser et de valider in vivo l'intérêt de nos polymères adhésifs biocompatibles pour la réparation tissulaire dans le cadre de chirurgies du système gastro-intestinal. L'objectif est d'évaluer les propriétés adhésives et mécaniques de nos polymères notamment leur conformité aux tissus après application locale au site de chirurgie. Les indications dans lesquelles nos polymères seront évalués sont les suivantes : (1) promotion d’étanchéité dans le cadre des anastomoses colorectales et (2) après gastrectomie. Cette évaluation sera réalisée sur du court à long terme, et permettra de sélectionner les candidats polymères les plus pertinents pour chacune des indications mentionnées ci-avant. Compte tenu de l'innovation de notre technologie, ces informations ne sont pas disponibles dans la littérature et sont essentielles au développement de nos produits.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider au niveau préclinique l’intérêt de nos polymères à (1) venir en support des méthodes de réparation déjà existantes afin de compléter leur action et d’éviter des effets secondaires tels que les fuites voire (2) remplacer les sutures couramment utilisées lors de ces chirurgies (et présentant des limitations) afin de réduire le traumatisme aux tissus et de faciliter la procédure chirurgicale. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient. Il nous est impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas d’animaux. Ce projet a donc pour but de mettre en évidence l’intérêt du développement de nos polymères adhésifs, dans un modèle rongeur adapté aux cas cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux procédures : 1) Après anesthésie et analgésie de l'animal, un défaut sera réalisé sur le caecum puis scellé avec une ou 2 sutures et l’application d’un polymère adhésif. La durée de la procédure sera d’environ 20 minutes par animal. 2) Après anesthésie et analgésie de l'animal, un défaut sera réalisé sur l’estomac puis scellé avec une ou 2 sutures et l’application d’un polymère adhésif. La durée de la procédure sera d’environ 20 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les risques anesthésiques sont les suivants : hypothermie et assèchement de la cornée. Une infection bactérienne est un effet indésirable potentiel résultant de la section du caecum ou de l’estomac. Suite à la chirurgie, les rats pourront présenter des douleurs abdominales. Les animaux pourraient également manifester des signes de perte de poids, malaise et léthargie associés à la procédure chirurgicale.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire car des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. L’absence de battements cardiaques et réflexes sera confirmée puis une dislocation cervicale sera réalisée selon les directives de la Structure chargée du Bien Etre des Animaux, le vétérinaire référent et l’inspecteur de la Direction Départementale de la Protection des Populations.

Remplacement

Les études ex vivo ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Par conséquent, ce projet a pour but de valider l’efficacité de nos polymères à la prévention de fuite dans le cadre de chirurgies du système gastro-intestinal.

Réduction

Le nombre d’animaux (648) a été rationalisé au maximum en tenant compte des tests préalables réalisés sur les polymères candidats à l’implantation in vivo, afin de réduire le nombre de polymères à tester : 1) Propriétés physico chimiques 2) Etude des capacités de polymérisation 3) Caractérisation ex vivo des propriétés mécaniques et d’adhésion Aussi, le nombre d’animaux par groupe (6) a été défini en se basant sur les analyses statistiques qui seront effectuées.

Raffinement

Le nombre d’animaux par cage (2 animaux) respectera la législation sur la protection des animaux de laboratoire. Les rongeurs disposeront à volonté d’eau et d’aliments jusqu’à 2-3h avant la chirurgie puis post-chirurgie. Les animaux seront soumis à un jeun 2-3h avant la chirurgie (uniquement la nourriture, l’eau restant disponible à volonté) pour minimiser le contenu dans le caecum et l’estomac. Tous les animaux seront hébergés en portoirs ventilés et enrichis avec des maisons, des bâtons, du papier, des balles en bois ou des os en plastique. La totalité des gestes expérimentaux sera pratiqué par du personnel qualifié. Les animaux recevront un traitement antalgique avant toute procédure chirurgicale qui se fera sous anesthésie générale. A la suite de la procédure chirurgicale, un traitement antalgique systémique sera administré, ainsi qu’un traitement antibiotique pour prévenir des infections. Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin d’évaluer de potentiels signes de mal-être. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. En cas d’atteinte des points limites (variation relative du poids corporel supérieure ou égale à 20 pour cent par rapport au poids maximum mesuré, persistante sur 2-3 semaines ou dégradation de l’état général de l’animal), l’euthanasie de l’animal sera effectuée. La lignée de rats impliquée sera Wistar, et le nombre maximum d’animaux utilisé sera de 648.

Choix des espèces

L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentiel à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. La taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison des porcs ou des brebis. De plus, les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour évaluer la réparation des défauts dans le système gastro-intestinal. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude. Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. Simultanément les animaux seront jeunes et donc auront une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement. Les animaux seront bagués sur l’oreille dès leur arrivée dans l’animalerie.

1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un cathéter posé dans la veine jugulaire, des administrations orales jusqu'à deux fois par jour et des prélèvements sanguins et urinaires répétés, pour mesurer la toxicité osseuse de composés développés par les clients du laboratoire. Le porteur annonce une inflammation transitoire aux sites d'implantation et d'injection ainsi qu'un stress lié à l'isolement en cage métabolique jusqu'à 24 heures, les rats étant tués pour prélever leurs os. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier et juge l'usage d'animaux "indispensable".

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’évaluer les atteintes osseuses potentielles qui pourraient survenir lors de traitements thérapeutiques. En effet, des études de pharmacovigilance ont montré que la fragilisation osseuse peut être induite par des médicaments, par carence ou pertes en calcium, phosphate et vitamine D, ou réduction de la minéralisation / densité minérale de l’os. La classe thérapeutique la plus fréquemment en cause est celle des corticoïdes mais d’autres médicaments sont aussi suspectés comme les antirétroviraux, des antiacides, des médicaments antiépileptiques, des antithrombotiques mais aussi des antidépresseurs, des neuroleptiques, et médicaments utilisés par exemple dans le traitement du cancer du sein. A noter aussi qu’un risque d’ostéoporose est évoqué pour les statines, et retrouvé significatif à forte dose. D’autre part, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques citées ci-dessus, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet afin d’évaluer sur l’animal les effets secondaires potentiels de composés thérapeutiques actuellement en développement chez nos clients. Les études permettront de définir les types de lésions osseuses qui pourraient être observées, et d’améliorer les schémas thérapeutiques d’administration des composés évalués afin de réduire et/ou abolir les effets délétères, voire même de stopper le développement de certains composés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la pharmacocinétique ainsi que sur la potentielle toxicité osseuse des composés étudiés. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie, et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Un cathéter connecté à un dispositif facilitant les prélèvements récurrents de sang sera posé dans la veine jugulaire de l’animal (45 min environ par animal). Les administrations orales de composés seront réalisées sur animaux vigiles (moins de 5 minutes par administration). Les fréquences d’administration (au maximum 2 fois par jour) dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les injections de composés seront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par injection). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles via le dispositif de prélèvement (moins de 3 min par prélèvement). Si des prélèvements à l’aorte abdominale sont effectués, ils ne se feront qu’en point final sous anesthésie avant euthanasie de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 minutes par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où l'urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.

Impact sur les animaux

Une possible réaction inflammatoire pourra apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ce cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus. Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Inflammation transitoire au niveau du site d’implantation de cathéter - Inflammation transitoire au niveau du site d’injection du traitement - Stress dû à l’isolement des animaux en cage métabolique pour une durée maximale de 24h

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer la toxicité systémique par numération sanguine et/ou évaluer les modifications éventuellement de biomarqueurs du remodelage osseux et du métabolisme phosphocalcique. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans la moelle épinière sous anesthésie et développe une hypersensibilité douloureuse de la face, l'allodynie, avant d'être anesthésié en profondeur et tué pour prélever ses tissus nerveux, dans une étude sur la migraine. Le porteur teste un triptan et un antagoniste du CGRP et prévoit la mise à mort des animaux perdant plus de 15 % de leur poids. Il juge le développement de nouvelles molécules "indispensable" et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne peut remplacer ce protocole.

Objectifs

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques. Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades.

Bénéfices attendus

A moyen terme, ce projet a pour but de mettre en évidence l'implication des astrocytes dans la chronicisation de la migraine et l'installation de l'allodynie mécanique. Si nous arrivons à identifier de nouveaux acteurs ainsi que leurs rôles, cela nous permettra de mieux comprendre ces pathologies. A plus long terme, ces études peuvent aider à développer de nouveaux traitements pour soulager les patients.

Procédures

Chaque animal aura une une injection intramédullaire (sous anesthésie gazeuse, 1fois 20 min), une injection intra péritonéale (vigile 1 fois 30s) et une perfusion (sous ananesthésie profonde 1fois 30min). Elles seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal.

Impact sur les animaux

Les résultats obtenus des travaux du laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » et les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer ses gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après l'injection virale et pour tester les différents traitements curatifs.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animauxmaximal par groupe: habituation, injections virale et systémique,comportement, stimulation et perfusion. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, lors d’injection intra médullaire, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Si un amaigrissement de plus de 15% du poids total, mesuré au début de l’expérimentation, est constaté ou s’il apparaît un comportement défini dans la liste de points limites, alors les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 3 à 8 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.

128 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles subissent une neurochirurgie qui installe un modèle de la maladie de Parkinson, des injections quotidiennes pendant quarante-six jours et huit injections d'un composé provoquant "malaise gastrique et dégoût" pour conditionner une aversion sexuelle, avant d'être tués pour analyse du cerveau. Les femelles subissent l'ablation des ovaires et la pose d'un implant hormonal, puis seront réutilisées dans des formations à l'expérimentation animale. Le porteur décrit des tests d'activité motrice et sexuelle et affirme qu'"il n'existe pas de méthodes alternatives" pour évaluer un comportement impulsif.

Objectifs

Les traitements symptomatiques de la maladie de Parkinson sont associés à plusieurs complications motrices et non motrices. Les troubles du contrôle des impulsions sont les effets secondaires neuropsychiatriques les plus courants, affectant plus de 20 % des patients, principalement sous traitement médicamenteux. Les troubles du contrôle des impulsions sont des addictions comportementales telles que l'hypersexualité, l'alimentation compulsive, les achats compulsifs ou le jeu pathologique qui entraînent de graves conséquences familiales, des coûts sociaux, économiques et juridiques qui affectent un grand nombre de patients dans le monde entier. L'hypersexualité est l'un des troubles du contrôle des impulsions les plus fréquents développés par les patients. Ce projet est basé sur l’hypothèse selon laquelle les troubles du contrôle des impulsions sont associés à des signatures moléculaires spécifiques qui peuvent être récupérées sous la forme de biomarqueurs dans le sang. Nous supposons en particulier que des profils spécifiques de certains marqueurs cellulaires permettront de distinguer des animaux parkinsoniens atteints de troubles de l'hypersexualité, troubles que l'on peut reproduire facilement expérimentalement chez le rat mâle.

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir une compréhension de la physiopathologie des troubles du comportement impulsif par le développement d’un modèle préclinique innovant, permettant l'identification des mécanismes moléculaires et des biomarqueurs grâce à des méthodes de dépistage spécifiques. Ce projet conduira à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la réponse pharmacologique et aux effets secondaires de la maladie de Parkinson et permettra l'identification de biomarqueurs spécifiques aux troubles du comportement impulsif qui devraient aider, à plus long terme, à identifier des sous-groupes critiques de patients.

Procédures

Les animaux mâles subissent une neurochirurgie, pour induire le modèle animal de la maladie de Parkinson, d'une durée de 45 minutes, anesthésie incluse. Ils subissent 3 prélèvement sanguins n’excédant pas 1 mL, chacune espacés de plus de 6 semaines, n’excédant pas plus de 10 minutes, anesthésie incluse. Ils subissent des injections quotidiennes (pendant 46 jours) dans la cavité abdominale d’un antiparkinsonien sur animal vigile, chacune n’excédant pas 10 secondes. Enfin, ils subissent 8 injections (chacune n’excédant pas 10 secondes sur animal vigile) dans l'abdomen (une tous les deux jours) d’un composé qui provoque malaise gastrique et dégoût pendant environ une heures. Les rats males seront soumis à 3 reprises à un test d’activité motrice s’établissant sur 4 sessions (2 par jour sur 2 jours consécutifs) d’évaluation de leurs capacités à avancer leurs pattes antérieures. Chaque session dure moins de 5 minutes. Les animaux femelles subissent une chirurgie abdominale et une chirurgie sous cutanée, les deux étant consécutives et l’ensemble n’excédant pas 40 minutes, anesthésie incluse. Elles subissent par la suite 12 injections sous-cutanées d’un composé qui favorisent les processus de la grossesse, espacées chacune d’au moins 48h. Mâles et femelles, seront soumis à 12 sessions comportementales permettant d’évaluer l’activité sexuelle des mâles et n’excédant pas une heure chacune.

Impact sur les animaux

Une souffrance légère liée à la répétition des injections est à envisager ainsi que les risques de formation d’un hématome, que ce soit chez les femelles comme chez les mâles. De plus les injections qui provoque chez lesmâles malaise gastrique et dégoût sont également susceptibles d’induire un état d’angoisse modérée de par l’induction de la situation conflictuelle dans lequel elles placent l’animal. Lors de la neurochirurgie (rats mâles) et de la chirurgie abdominale (rats femelles) et d’implantation des implants d’estradiol (rats femelles), les nuisances ou effets indésirables modérés pourront concerner la douleur associée aux points d’incision et aux points de contention au niveau des oreilles, et des douleurs post-opératoires. En post-chirurgical, il n’est pas à craindre de souffrance plus que modérée au cours du processus neurodégénératif progressif induit par un virus codant pour une toxine avant 9 semaines d’incubation, les animaux restant tout à fait capable de s’hydrater et de se nourrir. La littérature rapporte des déficits moteurs pouvant s’aggraver au-delà de 9 semaines, date à laquelle seront initiées les injections quotidiennes d'une substance qui bloquent l’apparition de ces déficits. Pour les animaux traités avec le diluant des points limites seront définis pour que les déficits moteurs n’induisent pas de souffrance. Enfin, une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue à 3 reprises, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie.

Devenir

Les animaux mâles seront mis à mort pour effectuer des analyses des tissus cérébraux. Les femelles seront réutilisées dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement, en concertation avec le vétérinaire référent.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation d’un comportement impulsif. De plus, notre approche méthodologique nous permet d’avoir accès à l’activité de différentes structures dans un réseau complexe au sein du cerveau. Les activités transcriptionnelles (activités concernant le passage de l'information contenue dans les cellules sous forme d'ADN en ARN) des neurones au sein des différentes structures cérébrales étudiées sont influencées aussi bien par les structures auxquelles ils appartiennent que par les interactions entre ces différentes structures et ne peuvent être modélisées ni par des approche ex-vivo, ni des approches mathématiques.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité́ des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une d'approche statistique. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux sera traité au cours de deux sessions distinctes pour n’avoir à suivre simultanément qu'un nombre restreint de mâles et de femelles. Ainsi, à l’issue de la première session, si les résultats sont suffisants pour mettre en évidence des différences significative des différents paramètres étudiés, il ne sera pas nécessaire de faire appel à une seconde session.

Raffinement

Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les rats mâles endormis puis maintenus sous anesthésie gazeuse permettant un recueil de sang par une des veines latérales de la queue avec des aiguille- fines. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les neurochirurgies chez les rats mâles sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le retrait des ovaires chez les femelles se fait sous anesthésie générale et sous analgésie (température maintenue constante et yeux également protégés de la dessication). Puis, après fermeture des incisions chirurgicales, afin de ne pas avoir à réendormir les animaux, ceux-ci reçoivent un implant hormonal sous-cutané placé au niveau du cou par une incision restreinte de 1 cm de long. Après fermeture des incisions chirurgicales, en post-opératoire, les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil puis remis avec leurs congénères et reçoivent 24h après une nouvelle injection d’antalgique. Les injections répétées - chez les mâles comme chez les femelles - sont réalisées avec des seringues microfines avec changement de seringue entre animaux et changement des points d’entrée des aiguilles pour atténuer les risques de douleur et de formation d’hématomes. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur avec de la chirurgie de classe modérée n’affectant que très progressivement l’autonomie des rats à s’hydrater et se nourrir et donc une faible perte de poids. L’avantage de ce modèle par injection virale est que ces déficits moteurs bilatéraux restent modérés tout au long du protocole. Le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau dee certaines structures cérébrales sur lesquelles portent cette étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés (motricité, sexualité) sont facilement appréhendables dans cette espèce. De plus le type de construction virale utilisé dans ce projet permettant d'induire progressivement des stades précoces de la maladie de Parkinson chez le rat est également bien caractérisé dans cette espèce et les troubles du contrôle de l’impulsivité semblent s’y exprimer de façon plus prépondérante que dans d’autres types de modèles lésionnels. Les animaux utilisés sont des animaux adultes de 8 semaines. Ce stade de développement est justifié, s’agissant d’étude portant sur le comportement sexuel des animaux, par la nécessité d’avoir des animaux présentant un développement des phases précoces de la maladie de Parkinson et ayant atteint leur pleine maturité sexuelle.

11520 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à deux chirurgies cérébrales pour induire une maladie à alpha-synucléine puis recevoir une thérapie génique, avec un suivi comportemental locomoteur, avant la mise à mort et l'étude histologique du cerveau. Le porteur indique que ces modèles neurodégénératifs n'entraînent "pas de symptôme marqué", les atteintes étant surtout moléculaires. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le développement des synucléinopathies et espère restaurer le "nettoyage" des neurones contre Parkinson.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP) ou l’atrophie multisystématisée (AMS) sont caractérisées par l’agrégation d'une protéine mutée dans différents types cellulaires. Ces agrégats, toxiques pour les cellules, provoquent après accumulation des symptômes moteurs tels qu’une rigidité musculaire, une difficulté/incapacité à initier le mouvement , mais aussi des symptômes non-moteurs comme un état dépressif ou des troubles digestifs. Actuellement, ces maladies neurodégénératives ne possèdent pas de traitement curatif, mais seulement des traitements symptomatiques ayant un effet limité, accompagné d’effets indésirables. Le but de ce projet est de développer un outil thérapeutique visant à restaurer la voie de nettoyage des neurones en permettant ainsi de dégrader les agrégats protéiques.

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson touche plus de 100.000 personnes en France, dont 80% sont âgées de plus de 65 ans. Au cours des années à venir nous allons observer une augmentation importante du nombre de cas en raison du vieillissement de la population et de l'amélioration de l'espérance de vie. De ce fait la découverte d’un traitement curatif (et non symptomatique) est un des grands axes de la recherche. Ce projet novateur ayant pour but de développer un traitement curatif a certains types de maladies neurodégénératives, grâce à des outils permettant de rétablir le fonctionnement des voies de dégradation de protéines agrégées de façon anormales par les neurones. Nous espérons, grâce à notre traitement rétablir l’activité de dégradation et de "nettoyage" dans les neurones et donc éviter la neurodégénérescence chez des modèles animaux de maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux subissent deux intervention chirurgicales au maximum, avec une durée de 30 minutes, qui correspondent à la création des modèles et le traitement. Une étude de comportement simple locomoteur, non invasif et non contraignant sera réalisée pendant ce projet, afin d'avoir un suivi de l'évolution du modèle et de l'impact du traitement.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent au maximum deux chirurgies d'une durée de 30 minutes maximum chacune, correspondant à l'induction du modèle et au traitement. Les nuisances peuvent être liées à la chirurgie : récupération post-anesthésie, hypothermie, déshydratation, infection de la plaie, mais sont bien encadrés par une analgésie et une anesthésie controlées et par un suivi des animaux postopératoire sur 3 jours minimum. De plus ces modèles neurodégénératifs n'entrainent pas de symptome marqué, en effet les désordres sont plutôt visibles à l'échelle moléculaire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau et ainsi de déterminer l'éfficacité du traitement.

Remplacement

Dans le respect du R de remplacer, dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement spatiotemporel des synucléinopathies dans des modèles in vitro. L’impact bénéfique potentiel sur l’accumulation d’α-synucléine et donc sur le fonctionnement cérébral et la survie neuronale ne peuvent être évalués que chez l’animal.

Réduction

Des études pilotes ont été effectuées au préalable pour confirmer l’activation des lysosomes après injection de plasmide TFEB, et pour confirmer l’absence de toxicité chez l'animal. Tests statistiques : toutes nos études sont réalisées avec un nombre d’animaux minimum mais suffisant pour pouvoir obtenir des résultats qui sont statistiquement représentatifs, et ainsi limiter la répétition des d’études.

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers ou les expérimentateurs afin de détecter tout inconfort ou souffrance en observant l’aspect physique, l’état du poil, la vigueur, la nutrition, l’hydratation et le comportement social des animaux. Chirurgie : une attention particulière est apportée pour un maintien de l'asepsie pendant la période opératoire. Les animaux sont anesthésiés (Isoflurane, induction 4% 1,5l d’air/min et maintien à 1% 0,4l d’air/min) pendant la chirurgie, ils animaux reçoivent un couverture analgésique une demi-heure avant l’intervention et après l’intervention ainsi que le lendemain . Un suivi post-opératoire est dans tous les cas réalisé grâce à une fiche de scorage qui évalue la perte de poids, la mobilité, les interactions avec les congénères, aspect du poil (0 mauvais, 1 moyen, 2 bon). Les points limites adaptés sont pour les deux espèces : une mobilité réduite voir difficile suite à la chirurgie, une attitude de repli, une allure du poil terne et mal nettoyé, difficulté à récupérer le poids initial, dans les jours suivant la chirurgie. Les animaux sont pesés de manière hebdomadaire pendant toute la durée de l’étude. Si malgré les soins concernant la chirurgie (plaie), les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, si une lésion cutanée s’étend et s’infecte, une décision d’euthanasie est prise par l'expérimentateur en accord avec le personnel zootechnique. Si un constat de stéréotypie est fait, des éléments d’enrichissement comme des roues sont proposés à l’animal. Si cela n’améliore pas son état au bout de 48h, il sera mis à mort selon la règlementation en fonction de l'espèce. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.

Choix des espèces

La souris permet de travailler les modèles de type pathologies humaines, une fois ces modèles bien établis , ils sont transposables au rat, espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat largement transférables à l'homme. De plus, cette espèce permet d’utiliser des animaux modifiés génétiquement. Pour toutes les cohortes, les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 6 semaines pour les rats et 8 semines pour les souris)