Rats
Comprendre l’effet thérapeutique de la stimulation d’une structure cérébrale corticale sur le risque de rechute à la prise de cocaïne afin d’améliorer la prise en charge des patients.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée est modérée pour 48 d'entre eux et sévère pour 192. On leur pose un cathéter veineux et, pour 192, des électrodes dans le cerveau, avant des séances quotidiennes d'auto-administration de cocaïne de six heures et des stimulations cérébrales, sous hébergement individuel. Le porteur décrit un état émotionnel négatif lié à l'addiction, poil hérissé, irritabilité et agressivité, ainsi qu'un stress d'isolement, et prévoit une mise à mort finale pour analyses. Il affirme que ces mécanismes ne s'étudient que sur un animal "entier" vivant, les retombées pour les patients traités par stimulation magnétique restant à venir.
Objectifs
L’addiction aux drogues pose, en France et dans le monde, un problème de santé publique majeur, dont les impacts sont multiples aux niveaux sanitaires, médicaux et sociaux. Malgré l’avancée des travaux de recherche pour comprendre les mécanismes neurobiologiques et comportementaux liés à l’addiction, des thérapies efficaces restent encore à être développées. Récemment, une méthode thérapeutique non invasive et très bien tolérée par les patients, la stimulation magnétique transcrânienne répétitive (rTMS) semble prometteuse car elle réduirait, chez certains patients, de façon persistante le désir et la consommation de certaines drogues. Cependant, à ce jour, les mécanismes de l'effet thérapeutique à long terme de cette stimulation ne sont pas complètement compris, ce qui est important pour améliorer l’efficacité de ce traitement prometteur. L’objectif principal de ce projet est donc de mimer chez le rat la stimulation transcrânienne utilisée chez l’Homme et de comprendre si les mécanismes de cette stimulation chez l’Homme passent par une structure cérébrale particulière, l’insula, dans un modèle d’addiction à la cocaïne. Notre hypothèse est que la réduction de la rechute à l’addiction à certaines drogues par la stimulation de l’insula serait due à la restauration de la communication entre des circuits neuronaux impliqués dans le désir irrépressible de consommer de la drogue. Nous mènerons donc une étude pour examiner les effets de la stimulation de l’insula sur la rechute dans des modèles animaux d’addiction et rechercherons les mécanismes neurobiologiques sous-jacents, afin d’améliorer les stimulations effectuées chez les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques et comportementaux impliqués dans l’addiction à la cocaïne et va apporter des informations cruciales sur le potentiel thérapeutique de la stimulation magnétique répétée de l’insula pour traiter l’addiction aux drogues, qui est une maladie très dommageable pour notre société. Comprendre les mécanismes de la stimulation de l’insula permettra d’améliorer chez le patient le patron de stimulation utilisé actuellement, et de déterminer la zone du cerveau à cibler préférentiellement chez l’Homme. Le bénéfice final de ce projet sera une meilleure prise en charge des patients atteints d’addiction lors de la phase d’abstinence.
Procédures
192 rats seront soumis à une chirurgie d’implantation d’électrodes dans le cerveau sous anesthésie générale de 1 heure afin de pouvoir être stimulés cérébralement. Tous les rats (240) seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir suivre les sessions d’auto-administration de drogue. Tous les rats (240) seront placés dans les cages d’auto-administration pour suivre des sessions d’auto-administration de drogue (10 sessions, 1 session par jour ; durée d’une session = 6h). 192 rats seront stimulés cérébralement par leur électrode (3 stimulations par semaine, pendant 4 semaines, 10 minutes par stimulation). 144 rats seront enregistrés électrophysiologiquement (3 heures sous anesthésie générale). 96 rats suivront un test dans les cages d’auto-administration (6 heures) pour évaluer leur comportement de recherche de drogue. Tous les rats (240) seront pesés 20 fois maximum (2 fois par semaine, 10 secondes par pesée). Toutes les femelles (120) seront soumis à un frottis vaginal (1 fois, l’acte dure quelques seconde).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - Chirurgies : inconfort transitoire au réveil - Electrode de stimulation : gêne occasionnée - Cathéter : légère gène - Auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains rats, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur mais pas envers ses congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques jours. - Stimulation cérébrale : gêne du câble de stimulation. - Période d’abstinence : peut causer un léger stress. - Isolement : Les animaux sont hébergés individuellement après la première chirurgie et jusqu’à la fin de la procédure ce qui peut causer un léger stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de procéder à des analyses moléculaires et histologiques.
Remplacement
Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'un processus psychobiologique, peut-être uniquement mené sur un animal vivant. En effet, nous étudions les bases comportementales et neurobiologiques impliquées dans l’addiction. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Un test de puissance préalable nous a permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques. Ainsi 24 animaux par lot, seront nécessaires à notre étude. Avec 10 lots, soit 240 animaux maximum.
Raffinement
Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, une pesée 2 fois par semaine, et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Après la première chirurgie et jusqu’à la fin de la manipulation, les animaux seront hébergés individuellement pour éviter la dégradation de leur cathéter et/ou de leur électrode de stimulation (240 rats, pendant 10 semaines maximum) mais un enrichissement supplémentaire (tunnel pour pouvoir se cacher) sera placé dans la cage d’hébergement.
Choix des espèces
Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Nous utiliserons des rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats adultes de 8 semaines ce qui est en conformité avec la majorité des expériences de comportement animal et la littérature, et ce qui limite les risques de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).
Biomarqueurs de toxicité dans les études précliniques exploratoires
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 500
Chiens : 40
Cochons : 80
Macaques à longue queue : 80
1200 animaux, dont 500 souris, 500 rats, 80 macaques crabiers, 80 porcs et 40 chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la grande majorité étant tuée et environ 38 non-rongeurs réutilisés ou adoptés. On leur induit des lésions par des produits chimiques administrés jusqu'à deux mois, avec prélèvements répétés, pour rechercher des biomarqueurs de toxicité. Le porteur décrit une baisse d'activité, une perte de poids et des atteintes d'organes, la plupart des animaux étant tués pour analyse anatomo-pathologique. Il présente le recours à l'animal comme "requis" pour transférer ces données à la clinique et estime à 10 à 15 % les non-rongeurs réutilisables.
Objectifs
Un médicament n’est mis sur le marché et rendu disponible aux patients qu’après une longue phase de Recherche et de Développement. Le défi majeur pour la recherche biomédicale est de découvrir de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Actuellement, de nouveaux besoins et enjeux apparaissent, notamment le développement et l’intégration de biomarqueurs au sein même des études chez l’animal de laboratoire afin de permettre une meilleure sélection des candidats médicaments, l’accélération du développement, l’amélioration du suivi personnalisé et du taux de réussite. Un biomarqueur est « une caractéristique biologique mesurable liée à un processus normal ou non. En médecine, il est utilisé pour le diagnostic, la réponse à un traitement ou la toxicité d’une molécule et est dosé préférentiellement dans le sang ou l’urine ». Ce projet utilise des modèles animaux de lésions/atteintes fonctionnelles chimio- ou génétiquement induites avec pour objectifs d’une part d’évaluer des biomarqueurs de toxicité précoce (trouver de nouveaux biomarqueurs plus précoces, plus spécifiques, plus sensibles et qualifier leur cinétique d’apparition), et d’autre part d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments (par exemple diminution de toxicité hépatique ou rénale) grâce au suivi de ces biomarqueurs. Il nécessite la mise en œuvre de modèles animaux rongeurs ou non-rongeurs mimant le processus complet le plus proche de l’Homme.
Bénéfices attendus
L’identification, la cinétique d’apparition et la validation de nouveaux biomarqueurs comme indicateurs de toxicité précoce permettra de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter plus précocement le développement de molécules ayant un profil toxicologique non acceptable au regard de l’indication thérapeutique. À plus long terme, les biomarqueurs les plus pertinents pourront être proposés comme outils futurs d’adaptation dans les essais cliniques (diagnostic, médecine personnalisée, etc.). L’évaluation d’efficacité de candidat-médicament sur des atteintes lésionnelles ou fonctionnelles établies, via le suivi de biomarqueurs permettra, à terme, de proposer des médicaments capables d’améliorer le confort des patients et leur observance au traitement.
Procédures
Pour induire une lésion ou une atteinte fonctionnelle modérée, un produit est administré aux animaux, par différentes voies (principalement orale et intraveineuse) de façon quotidienne ou hebdomadaire sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements associés à une contrainte légère de quelques minutes (en début et fin d’étude) sont nécessaires pour caractériser des biomarqueurs d’intérêt ; leur fréquence et volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie quand ils sont invasifs ( entre 15 et 30 minutes). Des mesures comme par exemple la température corporelle (avec une puce électronique), le poids ( 2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. La durée maximale des études sera de 2 mois.
Impact sur les animaux
Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ils correspondent aux conséquences de l’atteinte fonctionnelle et/ou lésionnelle ainsi que celles de l’administration des candidats médicaments pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une perte de poids, une modification de la température corporelle. Par ailleurs, les prélèvements nécessaires au suivi des biomarqueurs peuvent entraîner des nuisances de courte durée (ex : contention, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).
Devenir
Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse et que les atteintes/lésions sont réversibles que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire est requis pour avoir la possibilité d’identifier ou de valider des biomarqueurs présents dans les fluides biologiques ou certains tissus (ex : sang, salive, urines, fèces, liquide cérébro-spinal, peau, moelle osseuse) et de transférer les connaissances scientifiques acquises au cours de ces études aux études cliniques. La médecine translationnelle s’appuie sur les progrès de la recherche faite avec des modèles animaux pour développer de nouvelles techniques médicales pour le suivi des effets d’un médicament. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, tests in vitro (cellulaires et organoïdes) voire données recueillies chez les patients, ce qui permet de limiter le recours à l’animal de laboratoire.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Ce projet permet indirectement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans d’autres projets de Sécurité Préclinique grâce l’utilisation de ces biomarqueurs.
Raffinement
Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. La contrainte des prélèvements / administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et la distribution de récompenses alimentaires (renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et d’appliquer des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support/analgésie) mis en place par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce pour les études précliniques de toxicologie générale est défini par les lignes directrices internationales (ex ICH, OCDE) définissant qu’elles doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rats, souris) et chez le non-rongeur (mini-porcs, chiens ou primates non humains). C’est sur ces mêmes espèces que seront réalisées les études d’évaluation ou de validation de biomarqueurs de toxicité afin de pouvoir mettre en évidence un lien entre la toxicité observée et la variation du ou des biomarqueurs. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes pour évaluer de manière satisfaisante le profil des biomarqueurs.
Formation pratiques aux techniques d’administration, de prélèvements sanguins, et de perfusion chez la souris et le rat
- Formation professionnelle
Rats : 60
750 rongeurs, 690 souris et 60 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner des manipulateurs aux gestes techniques, contention, injections par de multiples voies, prélèvements sanguins répétés et perfusion cardiaque terminale, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur signale qu'un geste mal réalisé par un débutant peut provoquer une infection, une nécrose de la queue, une automutilation ou une détresse respiratoire. Il présente cette formation comme "indispensable" au bien-être des animaux non-humains et indique utiliser autant que possible des animaux de réforme ou surnuméraires.
Objectifs
Pour toute les expérimentations menées chez l’animale, la clé de voute du bien être animale, repose sur la formation des manipulateurs. Plus un geste sera maitrisé, moins il sera traumatisant pour l’animal. Aujourd’hui, la réglementation française en matière d'utilisation d'animaux à des fins scientifiques de par l'arrêté du 1er février 2013 oblige à ce que tout personnel des établissements utilisateurs (EU), titulaire d’un diplôme d’expérimentation animal, soit formé et déclaré compétent pour les gestes à réaliser sur les animaux. La responsabilité de la formation aux gestes est reléguée aux établissements utilisateurs, et doit être effectuée par des manipulateurs (concepteur, applicateur ou éleveur) confirmés et aux compétences reconnues. Ces tuteurs sont autorisés à transmettre leur connaissance uniquement sous le couvert d’une autorisation de projet utilisant des Animaux à des Fins Scientifiques. L'objectif est donc de former les utilisateurs aux gestes qu’ils devront effectuer dans le cadre de leur travail chez la souris et/ou le rat. Les animaux utilisés dans le cadre de ces formations seront autant que possible des animaux de réforme et/ou des animaux surnuméraires. Les utilisateurs pourront être formés aux gestes de bases tel que la préhension, la contention de l'animal mais également à l'administration de substances et le prélèvement de sang sur animal vigil ou anesthésié.
Bénéfices attendus
La formation pratique des utilisateurs est indispensable et indissociable du bien être animal. Seule la maitrise des gestes techniques assure que la finalité de ce dernier est été assuré sans remettre en cause le bienêtre de l’animal. L’apprentissage des gestes est réalisé avec un tuteur technique dont la parfaite maitrise du geste et la pédagogie est reconnue par ses pères et la structure du bien-être animal de l'EU. La formation continue au sein de l'EU permet de maintenir une veille des pratiques expérimentales et des évolution éthiques tout en assurant un niveau d’excellence des pratiques et compétences des utilisateurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à une préhension et contention qui ne durera pas plus de 5 minutes le temps de réalisé les injections (durée 1 minute). Ils pourront être soumis à des prélèvements sanguins sur animal vigile qui ne dureront pas plus de 2 à 3 minutes. Ils seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 1 à 2 minutes. Chaque animal ne pourra subir qu'un type d'injection ou 1 prélèvement sanguins au cours de chaque session de formation. La fréquence des différentes interventions est définies telle que: I) Apprentissage des différentes techniques de préhension et de contention : Les animaux (souris et/ou rat) seront manipulés autant de fois que nécessaire jusqu’à la parfaite maitrise des gestes sous la forme de courtes séances (10 à 30 minutes en fonction du nombre d’animaux disponible dépendant des autres gestes à acquérir par la suite), 1 à 2 fois par jour maximum. II) Formation aux administrations SC, IP et PO, un maximum de 1 administrations sera réalisé chaque jour pour un maximum de 20 administrations. Lorsque 2 ou 3 de ces voies doivent être maitrisées, elles seront réalisées alternativement. III) Formation aux administrations IV : les administrations seront réalisées dans la veine caudale tous les 3 jours au minimum (typiquement lundi puis jeudi) pour un maximum de 6 administrations par animal. IV) Formation aux administrations IN ou IT : 1 administration suivie de la mise à mort de l’animal. V) Formation aux administrations ID : 2 administrations ID suivie de la mise à mort de l’animal. VI) Formation au micro-prélèvements de sang dans la veine saphène : Le prélèvement sera réalisé sur les pattes postérieures à 24h d’intervalle minimum et pourra être répété 1x par semaine pour un maximum de 6 prélèvements par animal. VII) - Formation au micro-prélèvements de sang dans la caudale : un maximum de 8 prélèvements espacés au minimum de 2h chacun sur une période d’un minimum de 2 jours. VIII) Formation au prélèvement de sang terminal suivi perfusion intracardiaque: 1 prélèvement de sang entraine la mort de l’animal puis la perfusion est réalisée. IX) Formation à la dislocation cervicale : réalisée 1 fois. Les animaux ayant été utilisé pour la formation aux différentes techniques de préhension et de contention seront ensuite utilisés pour la formations aux administrations et/ou prélèvements de sang, perfusion requise et pour la mise à mort par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
La préhension et la contention peuvent provoquer un stress ponctuel pour l'animal. Les administrations et les prélèvements sanguins provoquent un inconfort transitoire et un stress modéré des animaux. Lors de la formation une mauvaise réalisation des gestes par les débutants peut cependant induire des nuisances supplémentaires. Pour les prélèvements de sang, une blessure trop profonde et invasive peut conduire à une infection, une nécrose de la queue ou à une automutilation de l'animal. Lors des administrations orales, une fausse route est possible (étouffement avec reflux induisant une détresse respiratoire aiguë). Les injections intraveineuses peuvent conduire à la formation d’œdème en cas de rupture de la veine caudale. Les injections intrapéritonéales et sous cutanées peuvent entrainer la formation d’œdèmes et/ou un endurcissement de la zone d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la formation pour la formation aux administrations intranasales, intratrachéales, intradermiques, aux prélèvement de sang terminal et à la perfusion intracardiaque ou à la mise à mort par dislocation cervicale
Remplacement
La formation aux gestes techniques en expérimentation animale ne peut être réalisée que sur animal vivant ayant toutes ces capacités à s’échapper, et manifester ou sanctionner tout signe de mal être et d’inconfort. L’utilisation de mannequins et de vidéo servira à expliquer le principe de chaque geste, les attentes et les difficultés afin de rendre la pratique plus sereine et respectueuse des animaux. Ces alternatives ne peuvent cependant pas produire les réactions d’un animal vivant pour l’entraînement aux méthodes d’administration et de prélèvement. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons la souris et/ou le rat, car ce sont les espèces animales concernées par ces procédures. L’apprentissage sera effectué autant que possible sur des animaux de réforme et/ou surnuméraire en provenance de notre élevage et/ou de fournisseurs externes, sous le contrôle permanent et assidu du tuteur. Nous ferons notre maximum pour qu’aucun animal n’ai été élevé dans le seul but de la formation.
Réduction
Les gestes techniques sont réalisés avec comme objectif premier de nuire au minimum au bien-être des animaux et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. Cela n’est rendu possible que pas la parfaite connaissance et maitrise de ces gestes par les expérimentateurs. Afin de garantir la maitrise et l’excellence de nos expérimentateurs, il est indispensable que l’apprenant puissent apprendre et répéter le/les gestes utiles autant de fois que nécessaire jusqu’à ce que sa compétence puisse être reconnue et validée par le tuteur. Le nombre d'animaux/procédure sera estimé par le tuteur, en fonction du niveau des apprenants et du ou des gestes réalisés, sous le contrôle de la SBEA. Plusieurs gestes pourront être réalisés sur le même animal afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour exemple, lorsque 2 ou 3 voies d’administration doivent être maitrisées, elles seront réalisées alternativement chez le même animal suivant la formation à la préhension et à la contention. Ces mêmes animaux peuvent ensuite être utilisés pour la formation au prélèvement de sang et à la perfusion terminale ou à la dislocation cervicale. De fait, notre expérience montre qu’un nombre moyen de 15 animaux/apprenant est réaliste. L’apprentissage sera effectué autant que possible sur des animaux de réforme ou surnuméraire en provenance de notre élevage et/ou de fournisseurs externes. Aucune analyse statistique ne sera réalisée dans le cadre de la formation.
Raffinement
La formation est réalisée avec pour objectif de garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. Lorsque cela sera nécessaire, pour des raisons liées aux gestes réalisés (administration intranasale, intratrachéale, intradermique, ponction dans la veine cave ou intracardiaque et perfusion intracardiaque) ou dans le but d’assurer l’absence de souffrance de l’animal lors des premières applications pratiques (dislocation cervicale chez la souris), les animaux seront anesthésiés. Les animaux sont maintenus en groupe sociaux dans des cages enrichies d’un tunnel de change, de ouate, de bâtonnet à ronger et de tubes en carton. La gêne occasionnée par la manipulation, la contention des animaux et les administrations est ponctuelle, réversible et fera l’objet d’une surveillance de l’animal, en présence du tuteur, pour visualiser tout signe de mal être imprévu qui impliquerait de soustraire l’animal à ses souffrances.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les 2 espèces présentes au sein de notre établissement utilisateur. Leur choix est donc dicté par la nécessité de former les manipulateurs pour la/les espèce(s) concernée(s) pour les études menées dans l’établissement. Souhaitant utiliser des animaux de réforme ou des animaux surnuméraires, l’âge des animaux n’est pas défini à l’avance. Sauf absolue nécessité requise par les objectifs scientifiques des futures études à mener par l’utilisateur, les animaux seront adultes (> 6 semaines).
Exposition aux pesticides par voie alimentaire chez le rat
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une dose unique de pesticides par gavage ou dans une pâte alimentaire, puis sont tués 24 heures après pour prélever sang et organes et y doser les pesticides. Le porteur indique que la dose retenue est la plus forte "n'induisant pas d'effet" et que le gavage peut perforer l'œsophage. Il reconnaît l'existence de modèles in silico mais affirme qu'aucun ne couvre les pesticides étudiés, l'objet immédiat étant de valider une méthode d'exposition par l'alimentation.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste dans un premier temps à valider une méthode d’exposition alimentaire chez le rat sans utiliser la méthode de gavage. Pour cela il va falloir tester une méthode d’exposition efficace permettant d’exposer un cocktail de pesticide à des concentrations souhaitées. Dans un second temps mettre au point une technique de détection des pesticides et de leurs métabolites dans les principaux organes de détoxification des rats (foie, rein, tissus adipeux) afin de vérifier la quantité de pesticides présente dans l’organisme. Réalisation des études histologiques sur les effets des pesticides chez les rats concernant les variation du poids corporel, les variations du poids des organes (rein, foie,…) et les variations de la consommation alimentaire . Enfin évaluer l’impact de l’exposition périnatale au cocktail de pesticides à faible dose sur les organes de détoxification chez le rat adulte.
Bénéfices attendus
Le projet pourra faire progresser les connaissances scientifiques en mettant en place une méthode d’exposition aussi efficace mais plus naturelle physiologiquement que le gavage. De plus, ce projet permettra de mettre au point, sur un petit groupe d'animaux, les techniques d’analyse et de détection des pesticides et de leurs métabolites notamment dans les principaux organes de détoxification chez le rat. Si les différentes étapes sont validées, nous pourrons évaluer les effets physiologiques de l'exposition à ce cocktail de pesticides
Procédures
Les animaux seront exposés à un ou deux pesticides par la méthode de gavage ou par l'ingestion d'une pâte. Ils recevront une unique dose soit par gavage (le geste dure quelques secondes maximum une minute sur animal vigile) soit par voie alimentaire (l'ingestion durera quelques secondes sur animal vigile). Les animaux seront mis à mort 24h après. Une fois l'animal déclaré mort, le sang et différents organes d'intérêt seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une unique dose de pesticides à la plus forte dose n’induisant pas d’effet. Ainsi, à cette dose, aucun effet notable des pesticides n'est attendu. La méthode de gavage peut entraîner des effets indésirables: la perforation de l'oesophage et une réaction de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le sang et les organes afin d'effectuer les dosages des pesticides.
Remplacement
Pour évaluer l'imprégnation des organes à des substances chimiques comme les pesticides, il existe des modèles in silico. Toutefois, il n'existe pas de modèle pour les pesticides étudiés que ça soit par la méthode dite de gavage ou la méthode d'exposition par voie alimentaire.
Réduction
Dans le domaine de la toxicologie, 4 animaux minimum par groupe sont nécessaires pour évaluer l'imprégnation des organes à des substances chimiques. Dans ce projet, 5 animaux par groupe seront étudiés afin de s'assurer d'avoir 4 animaux à la fin de l'expérimentation pour pallier à l'éventuelle situation qu'un animal présenterait des effets pouvant avoir un impact sur les résultats finaux (animal exclu de l'étude). Une analyse statistique sera réalisé pour comparer les animaux exposés par voie alimentaire et ceux exposés par gavage.
Raffinement
Pour assurer le raffinement des animaux dans ce projet, ils seront quotidiennement observés selon des critères bien précis qui permettront de déterminer des points limites afin de prendre en charge une souffrance éventuelle des animaux. Les animaux seront hébergés plusieurs par cage avec la présence de dispositifs d'enrichissements pour limiter un éventuel stress (cylindres en carton et lanières de papier kraft). Un fond sonore sera également présent afin de couvrir d’éventuels bruits extérieurs, brefs et bruyants, sources de stress pour les animaux. L'objectif de ce projet est de mettre au point une nouvelle méthode d'exposition aux pesticides par le biais de l'alimentation afin de se soustraire de la méthode de gavage utilisée pour ce type d'exposition. Ainsi, ce projet permettra de valider cette méthode qui pourra être appliquée dans le futur pour des projets ayant pour objectif d'étudier les effets de ces pesticides sur l'organisme.
Choix des espèces
Le modèle rat est un modèle de référence dans le domaine de la toxicologie. En effet, il est un bon indicateur pour prédire les effets toxicologiques éventuellement observés chez l'Homme. Ainsi, ce modèle permet de définir les valeurs de référence à respecter pour éviter d'éventuels effets chez l'Homme. Les animaux étudiés seront des jeunes adultes (8 semaines d'âge) afin d'avoir des organes ayant un poids suffisant pour réaliser les dosages qui permettront d'évaluer l'imprégnation de l'organisme aux pesticides. En toxicologie, les valeurs de référence à respecter sont définies pour les adultes.
VOIES D’AMELIORATION DE LA PRODUCTION DE LAIT MATERNEL PAR SUPPLEMENTATION NUTRITIONNELLE PENDANT LA GESTATION DANS UN MODELE RONGEUR (RAT)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les rates reçoivent une supplémentation nutritionnelle pendant la gestation, une injection d'eau marquée, un prélèvement de lait sous anesthésie et des prélèvements de sang, leurs petits des prélèvements d'urine, un test de tolérance au glucose et un prélèvement de sang, avant une mise à mort par ponction cardiaque pour prélever la glande mammaire. Le porteur teste des acides aminés censés augmenter la production de lait maternel, une éventuelle étude chez la femme renvoyée au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de la mise en place de la lactation.
Objectifs
L’Organisation Mondiale de la Santé recommande l’allaitement exclusif jusqu’à 6 mois. Le taux d’allaitement exclusif, en France, de l’ordre de 65% à la naissance, chute à 35% dès la fin du premier mois. La raison invoquée est évidemment le retour des mères au travail ; toutefois, la perception d’une production insuffisante de lait maternel est souvent citée mais repose soit sur une impression subjective, soit sur une mesure indirecte et imprécise de la production de lait, qui consiste à peser les enfants, avant et après tétée. Nous avons mis au point une méthode plus précise, basée sur la méthode d’enrichissement isotopique. Cette méthode requiert l’administration à la mère d’une dose d’eau marquée au deutérium, isotope stable de l’hydrogène, puis de suivre la diffusion de ce traceur chez le petit allaité. L’eau du lait maternel étant la seule source d’eau ingérée par le petit, on peut en déduire le flux de lait entre la mère et le petit. Nous avons utilisé cette méthode pour quantifier la production de lait maternel chez un modèle de petite taille (rongeur, rat), largement utilisé pour la recherche périnatale du fait de son cycle court de reproduction. Dans l’idée de tester des stratégies pour améliorer la lactation par des interventions nutritionnelles chez des femmes allaitantes, nous allons utiliser cette méthode pour explorer, sur un modèle animal rongeur, des molécules « galactologues » susceptibles d’améliorer la production de lait maternel. Ces molécules seront testées pendant la gestation, qui est la période de croissance in utero du fœtus et aussi la période de préparation de la glande mammaire à la lactation. C’est une période de vie qui mérite d’être mieux étudiée avec un objectif d’améliorer la lactation. Les molécules galactologues qui nous intéressent sont deux acides aminés, arginine et citrulline, qui participent au contrôle de la lactation. L’arginine, est un acide aminé semi-essentiel, seul précurseur endogène de l’oxyde nitrique (NO). L’arginine supplémentée pendant la gestation et la lactation augmente le flux de lait de 20% chez la rate allaitant une portée de 12 ratons sous régime normo-protéique alors que l’effet est nul lorsque l’arginine est supplémentée pendant la lactation seule. La citrulline est un acide aminé non essentiel qui échappe à l'absorption hépatique, n'est pas incorporée dans les protéines, et est absorbée par les reins où elle est transformée en arginine.
Bénéfices attendus
La supplémentation du régime alimentaire de la mère sera testée pendant la gestation de façon à étudier cette période de vie. La période de gestation, en particulier le dernier trimestre chez la femme, est d’abord la phase de croissance in utero du fœtus, mais elle correspond également à la période où les glandes mammaires se préparent à la lactation, avec l’initiation de leurs mécanismes physiologiques. Nous avons donc décidé de la considérer pour étudier ses effets potentiels sur la lactation. Les bénéfices attendus sont une meilleure initiation de la lactation, dès les premiers jours après la naissance, et au final, une meilleure production de lait maternel, tout au long de la lactation. Le meilleur indicateur en termes de bénéfice serait, à terme, une amélioration du taux d’allaitement. Si les résultats de cette supplémentation s’avéraient positifs sur ce modèle de rate, nous pourrions aller vers une étude clinique chez la femme pendant la grossesse. Si les bénéfices en termes de lactation sont positifs chez la rate, rien ne prouve qu’il en serait de même chez la femme et seule une étude clinique permettrait de le prouver. Supplémenter le régime maternel avec un acide aminé, uniquement en fin de gestation, serait envisageable puisque les doses en arginine et citrulline sont celles déjà testées chez l’homme adulte, sans que des effets indésirables n’aient été observés. La prise en considération de la vulnérablité accrue de la femme en période de grossesse serait évidemment à considérer.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle durant la gestation (15 jours), à une injection d’eau deutérée en intra-veineuse pendant la lactation (10 min/femelle), à 1 prélèvement manuel de lait (30 minutes), et à des prélèvements de sang (2 min/animal). Leur descendance sera soumise à des prélèvements d’urine pendant la lactation (2 min/petit) et à un test de tolérance orale au glucose (120 minutes) et des prélèvements de sang à la veine caudale à 150 jours de vie (2 min/animal).
Impact sur les animaux
Pour les animaux, l’évaluation de la douleur sera faite à l’aide d’observations physiologiques (poids), comportementales (consommation de nourriture, fuite ou défense de l’animal à la manipulation, activité) et en fonction de l’apparence de l’animal (poil, posture). Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Les animaux seront observés tous les jours y compris le Week-end. De la douleur et/ou du stress peuvent être ressentis par l’animal, pendant l’injection d’eau deutérée (mère), et les prélèvements de sang (mères et ratons). Du stress peut être ressenti par l’animal pendant le prélèvement de lait (mère), et le prélèvement d’urine et le gavage du glucose lors du test de tolérance orale (ratons).
Devenir
Si aucun évènement n’a justifié la mise à mort prématurée des animaux, ils seront mis à mort aux temps de prélèvements de tissus préalablement établis dans les procédures expérimentales. Pour la procédure 1, les rates sont suivies jusqu’à l’involution (J21), temps auquel elles sont mises à mort, notamment pour un prélèvement de glande mammaire. Les ratons à J21 sont séparés en 2 : les ratons non sevrés (8 sur 12 par portée) sont mis à mort à ce même temps, pour un prélèvement de sang intracardiaque, les ratons sevrés (4 sur 12 par portée) sont suivis jusqu’à 150 jours, temps auquel ils sont mis à mort. Pour la procédure 2, les mères sont suivies jusqu’à J18 (date de fin de mesure du flux de lait par méthode d’enrichissement à l’eau deutérée), temps auquel elles sont mises à mort, notamment pour un prélèvement de glande mammaire. Tous les ratons (toute la portée) sont également mis à mort à ce temps car aucun suivi n’a été prévu à long terme: Un prélèvement de sang intracardiaque sera alors effectué sur ces animaux. Tout animal sera exclu du protocole et mis à mort si un comportement anormal de l’animal (prostration, poil hérissé, refus d’alimentation, courbe de prise de poids anormale) est observé.
Remplacement
Il s’agit d’une étude in vivo visant à évaluer des stratégies nutritionnelles sur la production de lait maternel. Il n’existe donc pas de modèle in vitro permettant le remplacement de l’étude animale. Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place de la lactation, pendant la phase de gestation.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au minimum. Il prend en compte la nécessité d’avoir au moins 6 mères différentes par groupe expérimental pour des raisons de calcul statistique et de garder 2 ratons mâles et 2 ratons femelles par mère pour tenir compte d’un effet sexe et d’un effet « portée ». Si un galactologue ne montre pas d’effet significatif sur la production de lait ou la croissance de la portée par rapport au contrôle dans le protocole 1, la procédure 2 ne sera pas réalisée pour ce galactologue.
Raffinement
Des mesures sont mises en place lors des différents prélèvements de sang, avec une analgésie locale de lidocaïne 2% qui sera appliqué 15 min avant l’incision. Pendant le prélèvement de lait, les femelles seront gardées sous anesthésie avec induction en boite (mélange isoflurane 4 à 5%/L d’oxygène), puis maintien au masque (mélange isoflurane 2.5 à 3%/L d’oxygène). Les rattes sont placées sur un tapis chauffant pendant pendant toute la durée du prélèvement jusqu’à leur réveil. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel agréé et seront pesés 3 fois par semaine ce qui permettra de surveiller une éventuelle perte de poids et de vérifier leur état général. Les rats sont hébergés dans des portoirs ventilés avec différents enrichissements de milieu (frisottis, tunnels, morceau de bois) afin de réduire leur stress. Les points limites de cette procédure qui conduiront à la mise à mort de l’animal seront les suivants : Pour les mères : - anomalies détectées lors de l’observation générale de l’animal : posture (dos vouté, ventre rétracté) ou masque (yeux plissés, museau gonflé) suggérant une douleur sévère ; Pour les petits : - incapacité à téter ; absence prolongée d’interaction avec la mère et l’environnement ou de réponse aux stimulations ; dégradation de l’état du poil ; perte de poids 2 jours consécutifs Pour les mères et les petits : - anomalies détectées à l’examen clinique : baisse significative du poids corporel (plus de 20% persistant pendant 72 heures) ou arrêt de la croissance pour les petits ; déshydratation sévère ; signes de défaillance des organes (détresse respiratoire, dilatation du ventre…).
Choix des espèces
L'avantage du modèle rat sur le modèle porcin utilisé dans certaines références bibliographiques est la petite taille des animaux (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures) et la rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Les mères seront commandées gestantes auprès du fournisseur (J1). Les rates seront utilisées pendant la gestation et la lactation puisque la gestation est la période au cours de laquelle la supplémentation du régime alimentaire sera testée et la lactation est la période de mesure du flux de lait. La descendance sera utilisée pendant l’ensemble de la période de lactation. Afin de déterminer l’impact des galactologues sur le métabolisme de la descendance à long terme, 2 mâles et 2 femelles par mère seront sevrés et suivis jusqu’à l’âge adulte (5 mois maximum)
Caractérisation du mécanisme et du rôle de la fixation dans le cycle de vie d’une bactérie commensale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 432
1 344 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par gavage une bactérie commensale de l'intestin, puis des prélèvements de fèces, avant une mise à mort pour prélever leurs tissus intestinaux, aucun ne pouvant être réutilisé en raison du risque de contamination. Le porteur étudie comment cette bactérie s'attache à l'intestin et stimule l'immunité, en vue d'une plateforme de vaccins et d'un probiotique, des applications renvoyées au long terme. Il affirme que la culture in vitro ne reproduit pas les interactions d'un organisme complexe et retient le modèle murin.
Objectifs
La Bactérie Filamenteuse Segmentée (SFB, segmented filamentous bacteria) est une bactérie commensale commune de l'intestin. Contrairement à la plupart des autres commensaux, qui résident généralement dans la lumière intestinale, SFB se fixe intimement aux cellules de l’intestin d'une manière spécifique de l'espèce. En raison de cet attachement, SFB stimule puissamment le système immunitaire de l'hôte. Comme l'attachement à l’intestin est une étape clé de son potentiel de stimulation immunitaire, nous visons à mieux comprendre cette partie du cycle de vie en analysant les détails structurels et moléculaires de SFB lorsqu'il est cultivé dans un hôte où il peut se fixer et dans un hôte où il lui est impossible de s'attacher. Il y a deux objectifs principaux à ce projet : 1. Mise en évidence des caractéristiques structurelles de SFB dans des conditions d'attachement et de non-attachement. Les différences structurelles fourniront des informations importantes sur la manière dont SFB peut interagir avec son hôte. 2. Comprendre comment la motilité et la reconnaissance de ses composants par le système immunitaire inné peuvent impacter le potentiel immunostimulateur de SFB.
Bénéfices attendus
La compréhension de l’attachement de SFB à son hôte aura des conséquences translationnelles directes. En effet, ces connaissances nous permettrons de modifier la spécificité d’hôte et d’utiliser SFB de souris chez l’homme pour concevoir une nouvelle plate-forme d'administration de vaccins. Ce projet nous permettra également de mieux comprendre l'impact de la colonisation du SFB sur d'autres commensaux et pathogènes intestinaux. En effet, nous pensons que SFB a co-évolué avec son hôte afin d’obtenir de l'énergie en échange d'une résistance à la colonisation : SFB façonne la composition du microbiote et en même temps renforce la barrière intestinale et les défenses immunitaires. Ces connaissances constituent la base d'une application translationnelle de SFB pour à la fois améliorer la santé intestinale à l'avenir en tant que probiotique et comme outil de vaccination. Il est important de savoir comment des facteurs bactériens et des facteurs de l'hôte sont impliqués dans le puissant potentiel immunostimulant de SFB. Ces données nous amènerons à comprendre comment SFB est capable de modifier l'environnement immunitaire homéostatique chez l'hôte pour à la fois le protéger mais aussi exacerber des phénotypes pathogéniques. Ce n'est qu'avec une meilleure idée des détails moléculaires de ces mécanismes que des études thérapeutiques pourrons être conçues pour stimuler ou entraver les effets immunologiques de SFB sur l'hôte.
Procédures
Lors de la première procédure, les animaux subiront une inoculation de SFB par gavage (introduction d’une suspension bactérienne concentrée dans l'estomac à l'aide d'une sonde gastrique) au jour 0, ce qui prend environ 1 minute. Au début et au fin de l’expérience (8, 14 ou 21 jours) des prélèvements de fèces seront réalisés sur animaux vigiles, ce qui prend environ 5 minutes. Lors de la deuxième procédure, les mères souris subiront une inoculation de SFB par gavage et sur leur ventre avec une solution bactérienne concentrée au jour 0 (2 semaines après la naissance de ses petits). Des fèces seront prélevés sur les souris mères vigiles à J0 (semaine 2 des nouveau-nés) de la procédure et une ou deux semaines après en fonction du point final. Un prélèvement de fèces prend environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
La colonisation par les SFB est sans complication chez l’animal. Le seul risque est lié au gavage qui peut provoquer l’introduction de liquide dans les poumons de l'animal. Pour s'assurer du bien-être des animaux, ils seront surveillés pendant 10 minutes après la procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car le risque de contamination par transferts répétés de souris est trop important. A l’issue de la première procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les SFB intestinaux pour analyse. A l’issue de la deuxième procédure expérimentale les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les tissus intestinaux pour analyse.
Remplacement
SFB est une espèce commensale spécifique qui se cultive très difficilement, ce qui limite l’utilisation de système in vitro. Notre laboratoire a réussi à mettre au point un protocole de culture in vitro pour les SFB. Cependant cette technique est difficile et limitée dans le temps, et ne nous permet pas de modéliser fidèlement les interactions microbiennes pouvant avoir lieu dans un organisme complexe tel que l’Homme. Afin de pouvoir atteindre nos différents objectifs, nous devons donc utiliser des organismes tels que le rongeur pour reproduire le plus fidèlement possible les interactions multiples observés chez l’Homme. Par ailleurs, pour comprendre l’interaction complexe entre l'hôte et les SFB, des modèles de souris in vivo génétiquement modifiés sont nécessaires pour l’étude tissulaire du système immunitaire. L'utilisation de rats est nécessaire pour pouvoir étudier SFB dans des conditions in vivo où il s'attache et ne s'attache pas afin de décrypter les facteurs impliqués dans l'attachement Lors de nos différentes procédures expérimentales nous utiliserons un modèle animal qui nous permettra d’observer et d’étudier les différentes réactions immunitaires induites par les SFB dans un organisme ayant un système immunitaire mature et pouvant être contrôlé. Ce modèle animal nous permettra également d’étudier et de caractériser les interactions physiques et moléculaires des SFB avec leur hôte, notamment au niveau de l’épithélium intestinal. Ce modèle nous permettra également d’étudier la réponse immunitaire induite par les SFB chez des hôtes ayant des caractéristiques immunitaires et tissulaires différentes. Cela nous permettra d’étudier plus précisément les différents mécanismes immunitaires mis en jeu lors d’une colonisation bactérienne.
Réduction
Afin de respecter le principe de réduction dans la conception de nos expérimentations, limité au maximum le nombre de procédure expérimentale tout en permettant d’atteindre nos objectifs, chaque procédure expérimentale nous permettra d’atteindre un des objectifs spécifiques précédemment cités. Nous nous sommes assurés de la non redondance de nos expérimentations afin d’exclure toute répétition d’étude antérieures. Ainsi nous garantissons lors de notre projet l’obtention de résultats originaux. Nous nous attachons à partager et réutiliser les tissus et prélèvements pour des analyses multiples. Afin de garantir l’obtention de résultat concluant tout en utilisant le moins d’animaux possible, chaque expérimentation a fait l’objet d’une réflexion approfondie en amont. Nous avons fait appel à un biostatisticien afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire tout en nous permettant d’atteindre nos objectifs scientifiques. Nous utiliserons lors de nos procédures expérimentales des animaux ayant des caractéristiques similaires nous permettant de diminuer la variabilité entre individu. Nos protocoles expérimentaux sont parfaitement au point pour limiter au maximum la variabilité technique.
Raffinement
Dans un principe de raffinement, et afin de limiter l’impact de la vie en captivité, les souris et les rats seront hébergées dans des cages correctement alimentées en nourriture et en eau pour garantir leurs besoins physiologiques. Pour garantir les besoins comportementaux de base des souris, les cages seront enrichies avec des cylindres de coton, des bâtons à ronger et un tunnel. Les souris et les rats seront hébergées en groupe. Si cela est justifié par le comportement agressif ou pour permettre la récupération d’une souris après une manipulation technique, une souris pourra être isolée pour une durée ne dépassant pas 3 semaines. Un complément alimentaire pourra être rajouté pour accélérer la récupération de la souris. Nous avons également favorisé aux maximum les procédures non invasives, et limité à l’essentiel les procédures invasives. Les procédures invasives décrites ci-dessous seront réalisées par des personnels compétents et limité au maximum dans le temps. Dans ce projet, nous ne nous attendons pas à avoir d’altération du bien-être des animaux. Toutefois, le bien-être des animaux sera évalué avec une grille de score et si à un moment quelconque de l'expérience, nous observons que l'animal a un score clinique de 2 ou plus, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Nous avons choisi de réaliser nos expérimentations sur des modèles murins. Ces modèles présentent plusieurs avantages. D’un point de vue technique l’utilisation d’un modèle murin nous permet d’utiliser des infrastructures déjà existantes et respectant la législation en termes d’expérimentation animale. La reproduction et la maturation rapide du modèle murin nous permettra de rapidement obtenir des individus pour nos expérimentations. De plus, le modèle murin nous permet de bénéficier d’un nombre important de modèle génétiquement modifié et humanisé nous permettant de mener à bien nos investigations scientifiques. D’un point de vue anatomique le modèle murin présente de grandes similitudes avec l’Homme. Ces similitudes nous permettrons de modéliser le plus fidèlement les mécanismes observer chez l’Homme et fond du modèle murins un modèle idéal pour l’étude des interactions hôte-microbiote. L'utilisation de rats est nécessaire dans un contexte très limité pour pouvoir traiter l'adhérence spécifique à l'espèce de SFB, ce qui n'est pas possible en utilisant un autre système modèle. Pour la première et deuxième procédure, des souris et des rats mâles et femelles âgées de 8 à 12 semaines, seront utilisés. Pour cette étude nous avons choisi de travailler avec des souris et des rats adultes dont le système immunitaire est pleinement développé. De plus, les procédures de manipulation telles que le gavage sont plus faciles à réaliser chez les souris et les rats adultes. Pour la troisième procédure, nous visons à déterminer l'activation immunitaire induite par SFB chez les jeunes souris avant et après le sevrage. Pour cela, nous avons conçu notre procédure pour minimiser la détresse des animaux. Nous ne ferons donc un gavage à la mère que la deuxième semaine après la mise bas et répandrons également la bactérie sur le ventre de la mère souris pour faciliter la transmission aux petits. Nous avons choisi de ne pas nourrir de force les jeunes souris (dans leur deuxième semaine d'âge) mais plutôt de les nourrir d'une petite quantité de solution bactérienne sans aucune procédure invasive pour maximiser le succès de la colonisation et de la reproductibilité.
Colite : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur l’inflammation du colon induite par administration d’agents chimiques ou de bactéries, par injection d’anticorps, ou par transfert de cellules chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 2000
Une diarrhée parfois hémorragique, des pertes de poids marquées, jusqu'à 22 semaines de colite pour les lignées qui la développent spontanément : 8 000 souris et 2 000 rats, soit 10 000 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. La colite est provoquée par du dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, par du TNBS administré par voie rectale après douze à seize heures de jeûne, par une bactérie, ou chez des souris immunodéficientes par un anticorps ou un transfert de cellules immunitaires, afin de tester des composés anti-inflammatoires. Le porteur retient les rongeurs parce que les études de toxicité de toute nouvelle molécule doivent porter au moins sur une espèce de rongeur. La mise à mort a pour but, selon le résumé, la récupération de "la peau et de grands volumes de sang", sans mention du côlon.
Objectifs
La colite inflammatoire se traduit par une diarrhée chronique consécutive à l’inflammation des parois de l’intestin. Elle peut être provoquée par des bactéries, des parasites, la prise de médicaments, le traitement par radiothérapie, la rectocolite hémorragique ou la maladie de Crohn. La rectocolite hémorragique est caractérisée par une inflammation de la muqueuse et sous-muqueuse du rectum et du colon. La maladie de Crohn entraîne plus de complications, car l’inflammation peut toucher le tube digestif entier, de la bouche jusqu’à l’anus, et créer une obstruction partielle de l’intestin. La colite post-radiothérapie s’observe surtout après irradiation dans la zone abdominale et pelvienne dans le cas de traitement anti-cancéreux. Les parasites et bactéries provoquent des colites spontanément résolutives, mais certains d’entre eux peuvent produire des lésions qui ressemblent à une maladie inflammatoire primitive. Ce projet a pour but de tester in vivo des composés chimiques ou biologiques dont le potentiel anti-inflammatoire aura été déterminé au préalable dans des tests in vitro. Pour cela, il est nécessaire de disposer d’un modèle rongeur où il est possible de créer un état inflammatoire du colon tel qu’on peut l’observer chez l’homme. Actuellement, l’arsenal thérapeutique disponible, notamment les anti-inflammatoires, ne permet pas de soigner correctement ces pathologies lourdes, et de multiples interventions chirurgicales sont nécessaires pour retirer au fur et à mesure les portions lésées de l’intestin. Malgré leur efficacité, les anti-TNF doivent être utilisés avec précaution dans ces pathologies car ils augmentent la survenue de maladies infectieuses. Il existe clairement un besoin thérapeutique pour soigner les colites inflammatoires. Pour réaliser ce projet, un travail important est réalisé au préalable in vitro sur des cellules humaines, ceci dans le but de sélectionner les meilleures molécules à progresser. Cependant, étant donnée la complexité des mécanismes impliqués dans les pathologies inflammatoires du colon, il est difficile de prédire le potentiel thérapeutique d’une molécule uniquement sur la base de résultats in vitro. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les différents aspects de ces maladies, afin de pouvoir évaluer in vivo les meilleurs composés identifiés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur plusieurs maladies inflammatoires digestives : maladie de Crohn, rectocolite hémorragique, colite ulcéreuse... A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour laquelle les options sont pour le moment limitées et imparfaites.
Procédures
Une colite pourra être induite par l’administration de Dextran sulfate sodium (DSS) dans l’eau de boisson des animaux soit pendant 7 jours, combiné ou non à des anticorps (2 injections par semaine, 5 minutes par injection). Ces études dureront au maximum 4 semaines. Il est aussi possible d’administrer le DSS dans l’eau de boisson trois fois 5 jours, avec 5 jours sans DSS entre les cycles. Ces études dureront au maximum 8 semaines. Le Trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) pourra aussi être administré 1 ou 2 fois par voie intra-rectale (sous anesthésie générale, acte d’1h), après 12 à 16h à jeun. Ces études dureront 2 semaines au maximum. Des bactéries Citrobacter Rodentium (administration durant 5 minutes) pourront être administrées. Ces études dureront au maximum 3 semaines. Chez des souris immunodéficientes, le modèle aigu de colite (sur 8 jours) est induit par administration d’un anticorps (injection unique, prenant 5 minutes). En utilisant les mêmes souris immunodéficientes, un modèle chronique de colite est inductible par injection de cellules immunitaires humaines ou murines (injection prenant 5 minutes). Les études dureront au maximum 16 semaines. Des modèles de souris développant spontanément une colite peuvent aussi être utilisés. Ces études dureront au maximum 22 semaines. Les animaux seront pesés deux fois par semaine avant induction, puis une fois par jour à partir de l’induction ou de l’apparition des signes cliniques dans les modèles spontanés (5 minutes). Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie : intranasale et intratrachéale (anesthésie, 1h), intramusculaire et intradermique (anesthésie, avec analgésie, 1h), orale sur animaux vigiles (1 minute), sous cutanée et intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (anesthésié 1 heure). Des prélèvements de sang ou d’urine ou de fécès pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie). Des biopsies de peau pourront éventuellement être réalisées, sous anesthésie générale avec analgésie (1h30). Des endoscopies digestives pourront être réalisées, après de 8h de mise à jeun, sous anesthésie générale (1h environ). Les animaux pourront aussi être mis à jeun avant et pendant l’administration puis la digestion de Dextran Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) afin de mesurer la perméabilité digestive (mise à jeun totale de 8h).
Impact sur les animaux
Dans ces modèles de maladies inflammatoires digestives, de la diarrhée, potentiellement hémorragique, est attendue. Des pertes de poids marquées sont attendues. Les animaux pourront recevoir des traitements par toutes voies et avec toutes les fréquences d’administrations possibles, dans le respect des recommandations vétérinaires. Des prélèvements de sang pourront être effectués dans le respect des recommandations de voies et de volume. Pour induire la colite, les animaux pourront recevoir du TNBS par voie intrarectale, une à deux fois, après mise à jeun 12 à 16H. Des endoscopies pourraient être réalisées, sous anesthésie générale, avec mise à jeun de 12h. Dans le cas où du Dextran FITC serait administré, les animaux seront mis à jeun 12h maximum.
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de la peau et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. Dans tous ces modèles, il a été démontré que 8 à 11 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres, sauf dans les modèles spontanés sur souris transgéniques dans lesquels 10 à 12 animaux seront nécessaires. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévu pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.
Raffinement
La diarrhée et le sang dans les selles seront suivis quotidiennement à partir de l’induction. Dans les modèles spontanés, ils seront suivis deux fois par semaine jusqu’à apparition des signes cliniques puis une fois par jour. Le poids des animaux sera suivi deux fois par semaine jusqu’à l’induction puis une fois par jour. Dans les modèles spontanés, le poids sera suivi deux fois par semaine avant apparition de signes cliniques / pertes de poids puis une fois par jour dès l’induction. Les actes douloureux seront réalisés avec analgésie. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
-L’administration du DSS ou du TNBS peut être réalisée sur des souris ou des rats, et est très bien documentée dans la littérature. -Pour créer un modèle de colite d’origine auto-immune, il faut utiliser des souris immuno-déficientes qui ne possèdent pas de lymphocytes T et B matures. -Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées à minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles d’inflammation digestive d’intérêt sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Conception d’un revêtement capable de pacifier la réponse inflammatoire secondaire à l’implantation de stents aortiques 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
171 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée par chirurgie abdominale un anévrysme de l'aorte, puis on leur implante une endoprothèse à revêtement anti-inflammatoire, avec prélèvements sanguins et imagerie, avant une mise à mort à 7 ou 120 jours pour analyser les tissus. Le porteur conçoit un revêtement censé améliorer l'intégration des stents aortiques chez l'humain, un bénéfice qu'il qualifie de "translationnel majeur". Il affirme qu'aucune simulation fiable d'anévrysme n'existe et juge l'étude animale "indispensable".
Objectifs
Actuellement, les anévrysmes de l'aorte abdominale sont traités par implantation de stents aortiques. Il existe cependant des complications nécessitant de nouvelles opérations liées à un phénomène de rejet de ces stents. En effet, ils ne sont pas complétement intégrés dans le tissu du patient. L’objectif de l’étude est de concevoir un revêtement applicable sur ces stents aortiques pour améliorer leur intégration et donc diminuer le risque de rejet. Cette étude est une étude expérimentale chez l'animal (rat) dont les résultats pourraient permettre de transposer la technique chez l'homme.
Bénéfices attendus
Un anévrysme est une déformation pathologique d'un segment vasculaire. Le risque d'un anévrysme est sa fragilisation et sa rupture, entrainant une hémorragie souvent grave. Chez l’homme, les anévrysmes de l’aorte abdominale (AAA) sont traités avec des endoprothèses (stents aortiques). Ce traitement est toutefois grevé d’un nombre significatif de fuite et de migrations d’endoprothèses au cours du suivi. Ces complications pourraient être liées à un défaut d’intégration de l’endoprothèse L’objectif du projet est de développer une endoprothèse fonctionnalisée avec un revetement permettant sa meilleure intégration dans le tissu aortique. Le bénéfice translationnel est majeur avec une potentielle diminution des complications évolutives du traitement endovasculaire des AAA chez l’homme.
Procédures
Les animaux recevront de l’aspirine tout au long de la procédure pour éviter la formation de caillots (thromboses). Les animaux auront une implantation d’endoprothèses comportant des revetements anti-inflammatoires. Ces endoprothèses seront implantées chez des rats dont l’aorte est saine (pour étudier la biocompatibilité de ces endoprothèses) ou chez des rats chez qui des anévrysmes auront été créés préalablement 3 semaines plus tot pour mimer la pathologie humaine. Ces procédures d’implantation se feront par incision au niveau de l’abdomen sous anesthésie générale et antalgiques et durent 30 minutes. La procédure de création d'anévrysme est également faite par une incision au niveau de l'abdomen sous anesthésie générale et antalgiques et dure 1h. Afin de mesurer l’inflammation, des examens de sang (prélèvement veineux au niveau de la joue) et d’imagerie (echographie abdominale, TEPscanner) seront réalisés sous anesthésie générale. Ces examens d'imagerie seront réalisés dans un autre établissement utilisateur et serviront à mesurer objectivement l'inflammation et donc à comparer les groupes d'étude. Dans l'axe I, les deux examens d'imagerie (echographie et TEPscanner) auront lieu 1 semaine après implantation des endoprothèses. Pour l'axe II, ces examens d'imagerie auront lieu à 1 et 4 semaines après implantation. Concernant les prélévements sanguins, dans l'axe I il aura lieu après euthanasie. Pour l'axe II il auront lieu à 1 semaine après implantation des endoprothèses (sous anesthésie générale) et après l'euthanasie à 3 mois après implantation des endoprothèses.
Impact sur les animaux
Les effets nuisibles attendus sont la présence d'un inconfort ou d'une douleur modérée de courte durée après les procédures chirurgicales. D'autres effets peuvent survenir comme une perte de poids, une deshydratation, une diminution de la mobilité ou encore la survenue de caillots sanguins (thrombose).
Devenir
Dans l'étude I, les animaux sont euthanasiés 7 jours après implantation des endoprothèses pour analyse des tissus (étude microscopique de l'intégration des endoprothèses). Dans l'étude II, les animaux sont euthanasiés 120 jours après implantation des endoprothèses pour analyse des tissus (étude microscopique de l'intégration des endoprothèses).
Remplacement
Il n’est actuellement pas possible de simuler de facon précise l’action d'un revetement anti-inflammatoire dans un tissu aortique. Il n’existe pas non plus de simulation fiable d’anévrysmes de l’aorte abdominale (AAA). L'étude chez l'animale reste indispensable. Toutefois, des expérimentations préliminaires ont permis une séléction précise du revetement anti-inflammatoire à tester chez l'animal et d’établir un protocole robuste.
Réduction
Nous avons volontairement choisi d'utiliser des examens d'imagerie non douloureuses et reproductibles dans le temps (échographie abdominale). Cela permet de suivre sur la durée les mêmes animaux sans les euthanasier. Nous avons également calculé préalablement à l'expérimentation le nombre d'animaux à inclure dans l'étude. Cela permet d'obtenir des résultats statistiques robustes tout en évitant d'inclure trop d'animaux.
Raffinement
-Les conditions d’hébergement seront optimisées au maximum : limitation des transports au strict nécessaire, enrichissement de l'environnement (mise en place de coton pour comportement de nidification, mise à disposition de baton à ronger), respect du rythme jour/nuit -Nous veillerons à réaliser un transport doux en limitant les mouvements brusques pour réaliser les procédures d'imagerie sur le site dédié. -Nous avons prédéfinis la liste d'élements de surveillance du bien-etre des animaux: tous les animaux seront surveillés quotidiennement à l'aide d'une grille standardisée de surveillance. Les animaux seront inspectés (poids, présence d'un inconfort/douleur, état de la cicatrice) et des soins adaptés comprenant des anti-douleurs seront administrés. Si une trop souffrance est constatée (présence de points limites), l'animal sera immédiatement euthanasié. -Nous utiliserons une procédure d’imagerie non invasive : l’echographie abdominale a été préférée à l’angiographie invasive. -Nous aurons recours à l’anesthésie et à l’analgésie pour toutes les procédures. - Concernant le transport entre site d'hébergement et site d'imagerie, une acclimatation avec transport la veille sur le site d'imagerie aura lieu avec manipulations douces.
Choix des espèces
-Le modèle animal (rat) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet (implantation d’endoprothèses dans l’aorte saine et dans des anévrysmes). Les dimensions de l’aorte du rat Wistar permettent son analyse en imagerie (echographie et TEP scanner). Les rats seront utilisés à un stade adulte car la population humaine présentant des anévrysmes de l'aorte abdominale est adulte et agée. Les animaux utilisés seront des males car il existe une nette prédominance masculine dans la population humaine présentant des anévrysmes de l'aorte abdominale.
Offre de prestations de modèles de pharmacologie préclinique chez le rongeur (rat, souris) et le cobaye des désordres de l’audition : pertes auditives et acouphènes
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 12000
Cochons d'Inde : 5120
22 430 souris, rats et cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la quasi-totalité tués à l'issue et 275 réutilisés. On leur inflige des pertes auditives et des acouphènes par traumatisme sonore, par des médicaments ototoxiques comme le cisplatine ou par vieillissement accéléré, avec des administrations à travers le tympan, une chirurgie de l'oreille interne et des tests d'audition sous anesthésie répétés jusqu'à 180 jours. Le porteur décrit une "offre de prestations" commerciale de modèles précliniques pour des clients cherchant des traitements. Il affirme qu'aucune méthode substitutive validée ne mesure l'activité auditive.
Objectifs
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, les déficiences auditives (perte auditive et acouphènes) toucheraient aujourd’hui 15% de la population mondiale. L'impact sociétal est majeur, et peut entraîner chez les malades, isolement social et dépression. Ce projet permet de vérifier l’efficacité de candidats médicaments grâce aux modèles précliniques de perte d’audition et d’acouphènes. Les acouphènes sont des sensations auditives (sifflement, grésillement, bourdonnement) qui ne sont pas causées par un bruit extérieur. Elles apparaissent à la suite de l’exposition à un bruit de forte intensité (ou comme effet secondaire de certains médicaments) et peuvent être permanentes. A ce jour, il n’y a pas de médicament dans le traitement de la perte d’audition. Ceci justifie le besoin important de développer la recherche dans ce domaine. C’est dans ce contexte que s’inscrit notre projet qui consiste à générer chez le rongeur (rat, souris) et le cobaye une perte d’audition et/ou des acouphènes pour vérifier l’efficacité des principes actifs. Les pertes auditives et les acouphènes seront induits chez les animaux via les mêmes mécanismes que ceux retrouvés chez l’homme. Les mécanismes sont les effets secondaires de certains médicaments, les traumatismes sonores (bruit intense pendant une longue durée) et le vieillissement. Nous proposons un panel de modèles afin de tester l’efficacité de nouveaux traitements pour soigner les troubles de l’audition. Les cellules de l’oreille interne permettant de percevoir les sons n’ont pas la capacité de se régénérer et certains phénomènes conduisent à leur destruction ou à d’autres atteintes du système auditif. Les troubles auditifs vont être crées chez l’animal de trois façons différentes : administration de molécules, exposition à un bruit puissant et utilisation de modèles de souris présentant des pertes auditives précoces liées au vieillissement. Sur ces animaux des traitements seront testés pour évaluer les potentiels protecteurs et/ou régénérateurs. En particulier des mesures de l’audition seront réalisées sur des animaux anesthésiés à l’aide de techniques similaires à celles utilisées chez l’Homme. Nous espérons grâce à ce projet permettre la poursuite du développement des traitements ayant démontré une efficacité sur les animaux présentant des troubles auditifs. Toutes les procédures sont réalisées par du personnel formé et compétent et conformément aux recommandations internes.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de permettre la poursuite d’un programme de développement pour les candidats médicaments qui auront démontrés une efficacité dans un des modèles précliniques proposé par notre société. Et donc potentiellement des solutions thérapeutiques innovantes et efficace pour les patients souffrant de perte d’audition ou d’acouphènes.
Procédures
Administration de composés à tester ou de produit de référence : administrations de composés sur animaux vigiles en suivant les bonnes pratiques vétérinaires qui pourront être quotidiennes pendant 90 jours au maximum. Une administration unique par perfusion vigile ou sous anesthésie générale. Jusqu’à 10 administrations de composés par voie transtympanique sous anesthésie générale sur une période de 180 jours maximum. Une chirurgie unique sous anesthésie générale pour l’administration de composé directement dans l’oreille interne. Prélèvements sanguins sur des animaux vigiles ou anesthésiés dans la limite de 7,5% du volume de sang total suivi d’une période de récupération d’une semaine Mesures d’audition : tests d’audition réalisés sous anesthésie générale 3 fois par semaine pendant 180 jours au maximum. Tests comportementaux chez des animaux vigiles pour détecter la présence d’acouphènes 3 fois par semaine pendant 180 jours au maximum.
Impact sur les animaux
Dans nos différents modèles les effets indésirables prévus peuvent être : Stress : l‘isolement des animaux en hébergement individuel pour les animaux implantés avec un cathéter vasculaire pour lequel il y aurait un risque d’arrachement par des congénères. Peur/douleur : l’administration de composés par voie systémique suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires, l’administration de composé à travers le tympan sous anesthésie générale. Douleurs post-opératoires : pour les techniques d’administrations nécessitant un abord chirurgical qui sont réalisées sous anesthésie avec traitement antalgique pré et post opératoire. Maladie : des pertes d’audition et/ou des acouphènes, une toxicité systémique pour les modèles d’exposition au Cisplatine et aux aminoglycosides.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car les tissus et fluides de l’oreille interne sont prélevés afin de réaliser des analyses. Le prélèvement des tissus et fluides de l’oreille interne requiert l’euthanasie des animaux.Les animaux n’ayant pas satisfaits aux critères d’inclusion sont réutilisés dans les études de pharmacocinétique .
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour mesurer l’activité auditive et pour développer des modèles pathologiques de trauma acoustique, d’acouphènes et de vieillissement de l’appareil auditif. Les atteintes des cellules ne peuvent pas être étudiées via la culture cellulaire ou les modèles informatiques car nous ne pouvons pas reproduire la complexité des mécanismes conduisant aux troubles de l’audition. Néanmoins nous réalisons une veille bibliographique active afin de suivre les modèles de remplacement qui sont susceptibles d’être développés à l’avenir.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé, selon des méthodes de biostatistique, en tenant compte de la variabilité des modèles et des méthodes d’induction des troubles auditifs. Ce nombre d’animaux nous permettra d’avoir des résultats fiables sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. La réutilisation d’animaux (pour la formation et le maintien des compétences) s’effectue dans le cadre de nos procédures internes et après approbation par un vétérinaire.
Raffinement
Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Mais aussi la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal.
Choix des espèces
En amont une évaluation est faite avec chaque client sur le choix des modèles les plus pertinents. Le rat est l’espèce couramment utilisée en expérimentation animale et plus particulièrement dans l’étude des acouphènes. Le cobaye est également utilisé dans le cadre de nos études de perte d’audition liées à un trauma acoustique et pour les études de pharmacocinétique. D’une part, cette espèce permet le prélèvement d’un volume de périlymphe plus important pour analyser le passage des principes actifs dans l’oreille interne. D’autre part, la structure de l’oreille du cobaye permet d’administrer plus facilement les produits localement. La souris est aussi utilisée car elle peut être génétiquement modifiée ou mutante, permettant d'accéder à un vieillissement accéléré associé à une perte d'audition. Les animaux utilisés sont des adultes avec une oreille interne complétement formée et fonctionnelle à l’exception d'une procédure qui implique l’utilisation d’animaux âgés de 4 semaines (modèle de prévention dans lequel l’administration du principe actif doit s’effectuer avant l’apparition des signes de dégénérescence de l’appareil auditif).
Réalisation des travaux pratiques de la « Formation spécifique destinée aux personnes appliquant des procédures expérimentales sur rongeurs et lagomorphes »
- Formation professionnelle
Rats : 180
1 800 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour la recherche mais pour des travaux pratiques de formation. Des stagiaires débutants s'exercent sur animal vigile au gavage, aux injections et au prélèvement sanguin, chaque animal subissant jusqu'à deux tentatives par geste, les exercices non maîtrisés étant pratiqués sur cadavres. Le porteur présente ces séances de deux heures comme une obligation réglementaire et emploie des animaux de "surplus d'élevage" destinés à être tués. Il affirme que les réactions de l'animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes substitutives et juge le remplacement "non envisageable".
Objectifs
Conformément à la réglementation, les personnes chargées de réaliser les protocoles scientifiques et d’appliquer les procédures expérimentales sur les animaux doivent suivre, dans l’année suivant leur prise de poste, une formation spécifique. L'organisme de formation spécialisé dans le domaine de l’animal de laboratoire, dispense chaque année environ 3 sessions de cette formation spécifique d’une durée totale de 45h (volume horaire réglementaire), intégrant des cours théoriques (38h), des travaux dirigés (5h) et des travaux pratiques (2h). La séance de travaux pratiques permet aux participants d’acquérir quelques gestes techniques basiques. Le projet consiste donc à réaliser une séance de 2h de travaux pratiques sur animaux, lors de chaque session de formation réglementaire en expérimentation animale destinée aux personnes appliquant les procédures expérimentales sur animaux. Le principe est d’enseigner aux stagiaires, en petits groupes de 6 stagiaires maximum pour 1 encadrant : - Les bonnes pratiques d’approche de l’animal, en maîtrisant toute appréhension du stagiaire et tout stress pour l’animal - Les bons gestes pour la contention, dans le respect de l’animal - Quelques techniques simples d’administration de substances et de prélèvement sanguin
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont le bon niveau de formation des personnes travaillant au quotidien sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.
Procédures
Au cours de la séance de 2h de travaux pratiques, quelques techniques simples d’administration de substances et de prélèvement sanguin peuvent être réalisées, selon le niveau de maîtrise des participants : ces gestes ne seront réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires et validée par l’encadrant. Les gestes qui peuvent alors être appris sont : - le gavage par voie orale (VO), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) d'une durée de 10 minutes maximum - l’injection intra-péritonéale (IP), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) d'une durée de 10 minutes maximum - l’injection sous-cutanée (SC), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) d'une durée de 10 minutes maximum - le prélèvement sanguin (PS) à la veine mandibulaire, dans la limite de 10% du volume sanguin total d'une durée de 10 minutes maximum. Chaque animal pourra faire l’objet au maximum d’une administration (gavage ou injection) et d’un prélèvement sanguin. Ainsi, au maximum, pour les 3 animaux dédiés à un participants, il peut y avoir : - Animal 1 : gavage VO + PS - Animal 2 : injection IP + PS - Animal 3 : injection SC + PS En cas d’échec lors d’une administration ou d’un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l’encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles pour les animaux sont : - le stress lié à une préhension et contention d’un manipulateur non expérimenté - la souffrance pouvant être liée à une administration de produit ou prise de sang incorrectement réalisées La durée de ces effets est au maximum de 2h, durée de la seance de travaux pratiques. Si un animal présente des signes de stress ou souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire, voir points limites)
Devenir
Les animaux euthanasiés sont utilisés pour réaliser les gestes techniques n’ayant pas pu être pratiqués sur animal vigile, lorsque la contention n’est pas suffisament maîtrisée.
Remplacement
Diverses méthodes ont été mises en œuvre au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, les travaux dirigés d’anatomie sont exclusivement réalisés à l’aide de planches anatomiques et d’un puzzle 3D inerte. Les méthodes d’identification par pose de bague auriculaire et emporte-pièce sont enseignées sur des morceaux de carton. Un mannequin ou une peluche sont utilisés pour les démonstrations de contention. Néanmoins, pour l’apprentissage de l’approche de l’animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l’animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente et pour permettre aux participants d’aborder les animaux dans les conditions les plus proches de leur réalité quotidienne. La réglementation et la Commission Nationale de l’Expérimentation Animale imposent d’ailleurs l’utilisation d’animaux vivants pour cette partie pédagogique de l’enseignement dans les formations initiales en expérimentation animales. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour ces travaux pratiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus d’élevage, qu’il est prévu d’euthanasier dans la semaine, issus majoritairement soit de l’élevage de l’établissement d’accueil, soit éventuellement d’un éleveur agréé. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire. Néanmoins, afin de limiter le nombre de gestes appliqués à chaque animal (au maximum : contention, 1 administration et 1 prélèvement sanguin), 3 animaux par participant sont nécessaires. Afin de limiter églement le nombre de participants, nos formations ne sont dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.
Raffinement
En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commençant les travaux pratiques par une approche douce : en présentant simplement, un à un, leur main dans la cage des animaux, les stagiaires prennent tout le temps nécessaire pour maîtriser leur propre appréhension et habituer les animaux à leur présence. Une grande importance est donnée à l’observation des animaux, la détection et la prise en compte de tout signe de stress de l’animal afin de préserver son bien-être. Pour la contention, les différentes méthodes montrées sont parmi les moins stressantes pour l’animal, en utilisant par exemple pour les souris un tube de plexiglas transparent ou les 2 mains en « bol ». Les notions d’entrainement des animaux, de bientraitance, de raffinement des techniques sont enseignées. Pour des raisons éthiques, les gestes techniques (administration et prélèvement sanguin) ne sont réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires, avec validation de l’encadrant. Lorsque la contention n’est pas validée, les gestes sont uniquement appliqués sur cadavres. Le nombre de geste technique appliqué à chaque animal est limité : chaque animal fait l’objet au maximum d’une administration (gavage ou injection) et d’un prélèvement sanguin. En cas d’échec lors d’une administration ou d’un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l’encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum) Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques.
Choix des espèces
La formation réglementaire dispensée comprend un module général (13h) et un module spécifique des rongeurs et lagomorphes (32h). Les animaux utilisés pour cette formation sont donc spécifiquement des rongeurs ou lagomorphes. Les participants travaillant au quotidien sur rongeurs, ce qui correspond à la grande majorité de nos participants puisque les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en recherche, sont orientés vers des travaux pratiques réalisés exclusivement sur rongeurs (en grande majorité des souris), tels que ceux que nous souhaitons organiser à l’établissement d'accueil. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au delà, leur âge n’a pas d’importance pour ce projet.
Evaluation du potentiel anxiolytique/anxiogénique de candidats-médicaments avec le test du labyrinthe en croix surélevé chez le rat et la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 4500
6 300 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tués à l'issue pour prélever des tissus, l'autre réutilisée dans d'autres études. Pour accentuer l'anxiété avant le test du labyrinthe en croix surélevé, chaque animal peut être isolé jusqu'à quinze jours et privé d'enrichissement, puis reçoit un composé et des prélèvements sanguins. Le porteur teste l'effet anxiolytique ou anxiogène de candidats médicaments, des retombées thérapeutiques renvoyées au long terme et au passage chez l'humain. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit et que le rat et la souris restent "un passage obligatoire".
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer un potentiel effet anxiolytique (diminution de l’anxiété) ou anxiogénique (augmentation de l’anxiété) d’un candidat-médicament chez le rat ou la souris avec le test du labyrinthe en croix surélevé. Les rongeurs ont une tendance naturelle à éviter les environnements lumineux et ouverts et à rechercher la sécurité des endroits exigus et sombres. Le test du labyrinthe en croix surélevé consiste à placer les rongeurs dans un labyrinthe surélevé par rapport au sol d’environ 60 cm et constitué de 4 bras en forme de croix (2 bras fermés avec des parois hautes et opaques et 2 bras ouverts sans parois) pendant 5 minutes. Les rongeurs vont avoir tendance à se réfugier dans les bras fermés (plus sombres et exigus, donc plus sécurisants) et à passer peu de temps dans les bras ouverts, dans lesquels leur curiosité naturelle les pousse à explorer. Le niveau d’anxiété des animaux est évalué par le temps passé et le nombre d’entrées effectuées dans les bras ouverts pendant les 5 minutes du test.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter différentes pathologies telles que les troubles anxieux ou le stress post-traumatique. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat et souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée et d’évaluer ses éventuels effets secondaires sur le stress avant son passage en phase I chez l’humain. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.
Procédures
Au maximum, l’animal pourra être isolé socialement jusqu’à 15 jours avant l’expérience afin d’augmenter son état d’anxiété. Un composé pourra lui être administré une ou plusieurs fois avant le test (~2 minutes par administration). Il pourra subir des prélèvements de sang vigile ou anesthésié selon les recommandations éthiques en vigueur (~2 minutes par prélèvement). Le test de comportement dure au maximum 5 minutes.
Impact sur les animaux
Au maximum, l’animal pourra être isolé socialement jusqu’à 15 jours avant l’expérience afin d’augmenter son état d’anxiété et permettre une meilleure évaluation d’un composé anxiolytique. Dans ce cadre, il pourrait être privé d’enrichissement afin de maintenir un état d’anxiété suffisant pour les tests. L’administration et les prélèvements de sang seront effectués par un personnel entraîné et la douleur associée sera réduite à son minimum et sera l’équivalent d’une piqûre.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont gardés en vie et peuvent être réutilisés dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire. Sinon, les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des prélèvements de tissus (organes, sang, etc…).
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet pratiqué sur l’animal ne peut être remplacé par d’autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution n’existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez les rongeurs car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l’état de type anxieux. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures les moins invasives possibles, le suivi d’éventuels signes cliniques, la détermination des points limites et le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. Les effets potentiellement indésirables des candidats-médicaments qui seront testés dans ce modèle feront l’objet d’échange avec les inventeurs du médicament et les responsables du bien-être animal afin d’adapter les outils d’observations des animaux pour permettre la mise en place de traitements des potentiels signes cliniques. L’administration et les prélèvements de sang seront effectués par un personnel entraîné et la douleur associée sera réduite à son minimum et sera l’équivalent d’une piqûre.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d’un produit sur l’état de type anxieux. Dans ce projet, seuls les animaux adultes seront utilisés car il n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Etude d’efficacité et de tolérabilité en modèles rongeurs de candidats médicaments ciblés à la tumeur pour le traitement du cancer chez l’homme
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 120
3 460 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales, des injections répétées d'anticorps conjugués à un médicament, un suivi tumoral trois fois par semaine et des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant une mise à mort pour prélever organes et tumeurs. Le porteur teste des candidats médicaments contre le mélanome, des retombées pour les patients renvoyées au conditionnel et au stade préclinique. Il affirme que les études de stabilité et de toxicité ne peuvent se faire que sur l'animal vivant et conclut au recours aux modèles murins.
Objectifs
Plusieurs traitements reposant sur la chimiothérapie, des thérapies ciblées ou des immunothérapies sont disponibles pour le traitement de nombreux cancers. Cependant, les réponses à ceux-ci peuvent être variables, en fonction non seulement des patients mais aussi des indications, conduisant dans la majorité des cas à des rechutes. C’est pourquoi le développement de nouvelles alternatives thérapeutiques est primordial. Les ADC pour « anticorps conjugués à un médicament » constituent une de ces alternatives. Un ADC permet de délivrer un agent de chimiothérapie de manière spécifique et ciblée au niveau de la tumeur grâce à un anticorps qui reconnait une cible exprimée à la surface des cellules tumorales. Nous avons montré qu’un ADC prototype, combinant un anticorps dirigé contre une cible exprimée préférentiellement sur des cellules de mélanome, à un agent de chimiothérapie, pouvait avoir une efficacité in vitro par l’induction de la mort de cellules cancéreuses, et in vivo par la réduction et l’inhibition de la croissance tumorale dans des modèles de mélanome chez la souris. Ce projet engage plusieurs objectifs : 1) sélectionner l’ADC candidat en évaluant différentes technologies d’ADC que ce soit via la molécule de chimiothérapie fixée sur l’anticorps ou via le lien chimique permettant de l’y fixer et de la délivrer de façon optimale au niveau de la tumeur. Cette évaluation permettra i) de mesurer l’efficacité de l’ADC seul, c’est-à-dire sa capacité à induire la diminution ou l’inhibition de la croissance tumorale, ii) d’étudier la toxicité de l’ADC dans les modèles murins (souris ou rat) et enfin iii) de mesurer la stabilité de l’ADC dans le plasma en étudiant la libération non contrôlée de la chimiothérapie. 2) mesurer la synergie relevant de la combinaison de l’ADC avec les traitements standard du mélanome, les ICI (Inhibiteurs de point de contrôle immunitaire). En effet, il a été constaté dans la littérature que certaines chimiothérapies délivrées par les ADC pouvaient induire une réponse immunitaire capable d’optimiser la réponse anti-tumorale. Cette réponse immunitaire pourrait contribuer à la réussite du traitement de l’ADC en monothérapie mais aussi améliorer et optimiser les résultats des traitements par les ICIs. C’est pourquoi les différentes technologies évaluées pourront être testées seules ou combinées avec les standards actuels de traitement du mélanome, afin d’améliorer le bénéfice thérapeutique pour les patients en rechute.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait apporter des bénéfices sur plusieurs plans. Sur le plan scientifique, il devrait confirmer la puissance du rationnel de la cible identifiée dans le traitement du mélanome, qui amène la preuve de concept préclinique d’un candidat ADC ayant un fort potentiel de stratégie de développement et devrait permettre par ailleurs, d’ouvrir la voie pour d’autres indications d’intérêt pour lesquelles cette cible est aussi présente. Sur le plan technologique, ce projet crée un axe de développement d’ADC de construction à haut DAR (Ratio de chimiothérapie par anticorps), une grande première dans le mélanome, permis par les avancées technologiques que ce soit au niveau des chimiothérapies ou des liens chimiques actuellement développés. Sur le plan clinique, ce projet devrait permettre d’une part de montrer qu’une chimiothérapie peut fonctionner dans le mélanome si elle est vectorisée par une bonne cible, le mélanome étant connu jusqu’à présent pour être une tumeur difficilement traitable par chimiothérapie. D’autre part, ce projet devrait contribuer à confirmer que les meilleures combinaisons avec les ICI demeurent la chimiothérapie surtout si ces derniers représentent traitement standard du mélanome et si une synergie d’action entre ADC et ICI est démontrée.
Procédures
Lors des différentes procédures, les animaux pourront être soumis aux interventions suivantes : •L’injection de cellules tumorales afin de permettre le développement de la tumeur pour évaluer l’efficacité antitumorale des ADC ou de la combinaison des ADC avec les ICI actuellement utilisées comme standard de thérapie en oncologie. Cette intervention ne durera que quelques minutes à partir du moment où les animaux auront été anesthésiés. •La deuxième intervention concerne l’injection des ADC et/ou des ICI entrant dans le processus de traitement des tumeurs, afin d’évaluer leur efficacité. Chaque ICI sera injectée 4 fois à 3 jours d’intervalle sur la durée de l’étude. Chaque ADC sera injecté jusqu’à 3 fois avec un maximum de 7 à 10 jours d’intervalle. Chaque injection prendra au maximum 5 minutes et sera réalisée après l’anesthésie et l’analgésie des animaux. •La troisième intervention concerne la mesure du volume tumoral ainsi que le suivi du poids des animaux qui auront lieu 3 fois par semaine. Le temps d’intervention sera limité à un maximum de 5 minutes par mesure afin de limiter l’anxiété des animaux. •La quatrième intervention concerne les prélèvements sanguins, qui auront lieu notamment pour les études de stabilité des différentes technologies ADC ou encore pour suivre la toxicité des ceux-ci lors de leur injection. Les prélèvements auront lieux au moins deux fois sur chaque animal. L’espèce utilisée sera adaptée aux analyses qui seront réalisées. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie gazeuse et n’excèderont pas 5 minutes après endormissement de l’animal.
Impact sur les animaux
La réception des animaux peut engendrer un stress qui pourrait compromettre le bon déroulement des différentes procédures réalisées. C’est pourquoi après réception une période d’acclimatation est prévue afin de réduire ce stress. Les différentes procédures qui seront réalisées sur les animaux après cette période d’acclimatation pourront générer différents types d’effets indésirables : •Lors de l’injection des cellules, un stress des animaux pourrait être observé ainsi que des douleurs au site d’injection. De plus, le développement des tumeurs pourrait conduire à une perte de poids ainsi que des douleurs qui pourraient être délétères pour l’animal. •Lors des injections des ADC de l’anxiété ou des douleurs pourront être observées. •Pour certaines études, des prélèvements sanguins pourront être réalisés, engendrant un stress lors de la manipulation. Les effets indésirables majeurs de ces études seront donc un stress lié à la manipulation fréquente des animaux, des douleurs ainsi qu’une éventuelle cachexie liée au développement tumoral pouvant conduire à une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés au cours des différentes procédures. Lors de l’euthanasie des animaux, les organes ou les tumeurs pourront être prélevés afin de réaliser des études histologiques dans le but de valider l’expression de la cible ou pour rechercher des signes de toxicités.
Remplacement
Les études préliminaires réalisées avec un ADC prototype ont permis de démontrer in vitro, que celui-ci est capable de se lier à des cellules tumorales de mélanome ou d’autres cancers exprimant la cible à leur surface. Il est aussi capable d’induire la mort cellulaire de ces mêmes cellules. In vivo l’efficacité anti-tumorale de celui-ci a pu être démontrée dans des modèles de mélanome induits chez la souris, via l’inhibition et la régression de la croissance tumorale. Les modèles utilisés pour valider l’efficacité de l’ADC prototype sont des modèles imparfaits. En effet, les modèles in vitro, ne permettent pas de prendre en compte la stabilité du composé tandis que les modèles in vivo reposent sur l’utilisation de modèles murins dont le système immunitaire est déficient. Ainsi, les études de stabilité des différents ADC testés ne peuvent être réalisées que in vivo afin d’évaluer l’impact de leur circulation dans l’organisme. Il en est de même pour les études de tolérabilité du composé, à savoir si celui-ci induit des toxicités. En effet, seule l’administration dans des modèles animaux peut montrer une modification de comportement, une libération d’enzymes hépatiques ou une perte de poids liée à une toxicité du composé. Concernant l’étude du traitement des ADC seuls ou en combinaison avec les ICI, l’utilisation d’animaux ayant un système immunitaire compétent permettra d’étudier les mécanismes d’action permettant d’obtenir une réponse anti-tumorale durable.
Réduction
Des premiers tests avec un ADC prototype ont permis de démontrer in vitro une activité cytotoxique et in vivo une activité anti-tumorale avec une inhibition et une régression de la croissance tumorale sur des modèles de mélanome chez la souris. Avant toute étude in vivo et pour chaque technologie évaluée, une étude préliminaire in vitro sera conduite afin de confirmer la liaison de l’ADC à sa cible exprimée sur les cellules tumorales et de confirmer son activité cytotoxique sur ces mêmes cellules. Ainsi, seules les technologies démontrant une efficacité anti-tumorale in vitro seront testées in vivo. De plus, pour chaque lignée cellulaire utilisée in vivo une étude de tumorigénicité sera réalisée sur un nombre de 10 animaux afin de confirmer la prise tumorale ainsi que l’hétérogénéité de la croissance tumorale. Les études réalisées avec l’ADC prototype ont permis d’établir que 10 souris au maximum seraient nécessaires par groupe afin de générer une courbe de croissance tumorale, une courbe de survie mais aussi des données statistiques pour comparer les différentes technologies ADC ou les différentes combinaisons de traitement. Le nombre d’animaux par groupe pourra ainsi être réduit en fonction de la variabilité intra et inter-groupe observée dans les études de tumorigénicité et dans les études préliminaires.
Raffinement
Les différentes procédures entraînent plusieurs nuisances sur les animaux comme du stress, des douleurs et des pertes de poids. Tous ces paramètres ont été pris en compte afin de les réduire. Pour limiter le stress des animaux, une période d’acclimatation est prévue avant le démarrage des études. Un enrichissement adapté à l’espèce utilisée (souris ou rat) est aussi ajouté dans chaque cage. Toutes procédures induisant des douleurs et du stress seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie locale. Le suivie de la croissance tumorale et du poids des animaux sera monitoré 3 fois par semaine afin de procéder à une supplémentation en nourriture ou à l’euthanasie des animaux en cas de pertes de poids non contrôlées même sous supplémentation ou de croissance tumorale trop importante ou gênant les déplacements de l’animal. De plus, en fonction du comportement des animaux pouvant traduire des signes de douleurs, tels que la prostration de l’animal ou des gémissements, les animaux seront euthanasiés. Une grille de score a été mise en place afin de suivre les animaux sur différents critères, regroupant leur comportement, les effets liés au développement tumoral et aux traitements, afin de pouvoir adapter leur suivi et définir quand il est nécessaire de les euthanasier.
Choix des espèces
Au cours des différentes études menées pour la sélection de l’ADC candidat et de la définition des conditions de traitements à utiliser, plusieurs espèces seront utilisées : • La comparaison des différentes technologies ADC pour la sélection du candidat thérapeutique sera réalisée dans des souris immunodéficientes. Ces souris ont été choisies car elles sont classiquement utilisées dans les études d’efficacité des médicaments expérimentaux évalués en oncologie. Les lignées cellulaires utilisées pour la génération des tumeurs sont des lignées humaines, par conséquent leur système immunitaire déficient n’entraîne pas de rejet de ces cellules tumorales implantées et n’interfère donc pas avec les résultats d’efficacité liée à l’activité cytotoxique anti tumorale de l’ADC. • Pour les études de stabilité et de tolérabilité des ADC, le choix de l’espèce murine utilisée sera dicté par les études in vitro réalisées à la suite de l’injection des ADC. Des souris immunocompétentes seront utilisées, car ce sont des modèles classiquement utilisés pour ces études et qui permettront de faire le lien avec les études d’efficacité réalisées en souris. Les rats pourraient être préférés aux souris afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés dans les études du fait de la disponibilité de plus grande quantité de sang pour les analyses. Les rats sont aussi couramment utilisés pour les études de stabilités des composés. • Les études de combithérapie associant les ADC avec des ICI seront quant à elles réalisées dans des souris immunocompétentes afin d’étudier les mécanismes immunitaires mis en jeu lors de la réponse anti-tumorale de l’ADC, seul ou en combinaison. Pour toutes les études, les souris ou les rats utilisés seront des femelles âgées de 6 à 8 semaines, âge considéré comme l’âge adulte, puisque les traitements étudiés ont pour but de traiter des tumeurs chez l’adulte ayant un système immunitaire mature. De plus, nous n’attendons pas de différence de résultat entre des souris mâles ou femelles. C’est pourquoi des souris femelles seront utilisées pour faciliter l’organisation des cages et limiter les bagarres entre individus pouvant générer du stress risquant de nuire à l’interprétation de l’étude.