Rats

1 200 souris et 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée, avec jusqu'à deux chirurgies, radiothérapie, imagerie et prélèvements sanguins, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité, se nécroser ou métastaser jusqu'aux poumons. Il affirme que l'animal est un passage obligatoire avant l'humain, les bénéfices étant renvoyés au long terme.

Objectifs

Les cancers du sein sont les cancers les plus fréquents chez la femme. Ils représentent une pathologie très hétérogène. Ainsi, deux patients ayant le même diagnostic initial pourront présenter des réponses aux traitements conventionnels très différentes. Un seul type de modèle ne peut donc représenter l’ensemble de ces pathologies. Ce projet vise à évaluer les propriétés anti-tumorales de différentes approches thérapeutiques incluant notamment des candidats médicaments, la radiothérapie ou encore l'utilisation de dispositifs médicaux dans des modèles de tumeurs mammaires obtenues par greffe de cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du sein. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé ou le dispositif médical testé est actif dans un modèle expérimental de tumeurs mammaires ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

En fonction de l'étude, les animaux pourront subir au maximum 2 chirurgies de 5 à 15 min chacune, sous anesthésie générale, pour l'implantation d'un dispositif médical et l'exérèse chirurgicale de la tumeur mammaire. Ils seront également anesthésiés au moins une fois, généralement par anesthésie gazeuse, pour l'implantation des cellules tumorales. Ils pourront également être anesthésiés plusieurs autres fois au cours de l'étude pendant quelques minutes, généralement par anesthésie gazeuse, afin de procéder à des traitements comme la radiothérapie et/ou à des suivis par imagerie. Dans le cas de radiothérapie, les animaux seront traités généralement pendant 5 jours consécutifs. Les suivis par imagerie se feront eux généralement 1 fois tous les 7 à 15 jours pendant environ 2 mois. Les animaux pourront également subir plusieurs prélèvements de sang dans le respect des recommandations éthiques (volumes prélevés, fréquences et temps de récupération).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur mammaire peut entrainer un inconfort voire une réduction de la mobilité des animaux. Les tumeurs peuvent également développer une nécrose. Des métastases, en particulier au niveau des poumons, peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Par ailleurs, les effets potentiellement indésirables du/des produits testé(s) font l’objet d’échange avec nos promoteurs et les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Mise à mort de l'ensemble des animaux à la fin de l'étude pour réaliser des prélèvements d'organes et/ou des observations macroscopiques.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les tumeurs mammaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6-10 animaux/groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • le suivi d’éventuel signes cliniques, • la détermination des points limites, • le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. • un protocole analgésique adapté pour les chirurgies et la période post-opératoire ainsi qu'un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans les modèles animaux de tumeurs mammaires obtenues par greffe de matériel biologique d’origine tumorale. Les animaux utilisés sont des animaux adultes âgés de 6 à 10 semaines au moment de l’implantation des cellules tumorales. La prise tumorale est connue pour être moins bonne chez des individus plus âgés.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intramusculaires répétées de deux candidats myorelaxants, avec prélèvements sanguins, puis sont tués pour analyse du muscle. Le porteur n'attend aucun signe clinique et situe les nuisances dans le stress de contention et la douleur des injections. Il affirme que les modèles cellulaires sont débattus et ne reproduisent pas le système immunitaire, l'étude vérifiant l'absence de réaction immunitaire à ces molécules d'un développeur privé.

Objectifs

Après avoir démontré le bénéfice d’efficacité des produits (FTP-501 et FTP-101) face aux produits de référence utilisés en clinique lors de projets précédents, ce projet expérimental s’intéresse au potentiel immunogène de ces candidats. Cette étude a pour objectif de confirmer la non-présence d’Anticorps Anti-Drug (ADA) suite aux injections des différents composés. Ces molécules pourraient a priori provoquer une réaction immunitaire suite aux injections, diminuant ainsi l’efficacité du traitement et sa tolérance. Il est donc important de vérifier qu’une telle réaction est limitée ou inexistante.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont un impact sociétal important. La dystonie est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé nos 2 premiers Lead (FTP-501 et FTP-101) quasiment au terme de leur développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Ce projet permettra de vérifier qu’aucune réaction immunitaire ne se manifeste suite aux injections et que les produits sont bien tolérés quelle que soit la dose injectée, et bien tolérés après des injections répétées.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 3 injections, durée 30 secondes/injection/animal = 1 min 30 sec - Pesée des animaux = 7 pesées / animal => 30 secondes / pesée = 3 minutes 30 sec / animal - Prélèvements de sang = 7 maximum par animal, durée 2 minutes = 14 minutes / animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans nos études précédentes et la littérature. En effet lors de nos précédents projets, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à une seule injection n’a été observé. Nous n’attendons pas ici de réactions suite aux multiples injections. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection, une douleur liée aux injections i.m. et les multiples prélèvements de sang (6 maximum).

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. Un prélèvement pour analyse histologique du muscle injecté sera réalisé.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). De plus, nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe (impossible à reproduire dans sa globalité in vitro) et nécessite des expérimentations in vivo.

Réduction

Pour la réduction, la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été déterminé avec le logiciel G-Power. Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 10 animaux par groupe (5 mâles et 5 femelles). Cependant, si les résultats sont dépendants du sexe, les groupes d’analyse seront de 5 animaux. Cette taille de groupe nous permet néanmoins d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages en plastique transparent de 1800cm2 au sol et comportant une plateforme. Les cages seront ventilées individuellement, placés dans une pièce sous air conditionné, avec un cycle jour/nuit de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Ils seront maintenus en groupe de 2 ou 3 rats par cage. Ils disposeront de matériel de nidification (litière en chips de cellulose) puis d’enrichissement : les rats ont un tunnel rouge ainsi qu’un bâton de bois à ronger. Les animaux seont surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur entraîné, et via une approche limitant le stress et la douleur, tout en ne dépassant pas les limites de volume prélevables chez un rat.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes interne. Nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe et nécessite des expérimentations in vivo. De plus, nous avons choisi le rat d’une part, par continuité avec nos études précédentes et notre expérience sur ce modèle et d’autre part, car il s’agit d’un modèle de choix pour des études de toxicité de composé. Nous utiliserons des rats Sprague Dawley âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 18 semaines maximum en fin d’expérimentation (600g pour les mâles). Des jeunes adultes sont choisis ici pour le bon fonctionnement de leur système immunitaire.

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains sont tués comme donneurs de peau, les autres reçoivent une greffe cutanée sous anesthésie puis portent un pansement pendant sept jours qui réduit leur mobilité. Tous sont tués pour des prélèvements de tissus. Le projet étudie l'effet d'une déficience en CD45 sur le rejet de greffe, le porteur affirmant qu'aucune expérience in vitro ne rend compte des mécanismes immunitaires en jeu.

Objectifs

La transplantation représente un moyen thérapeutique efficace pour palier au dysfonctionnement de certains organes. Cependant, en l'absence de traitement du receveur, le greffon est rejeté par le système iimunitaire de l'hôte. Aujourd'hui le rejet de greffe est contrôlé par l'utilisation d'immunosuppresseurs pharmacologiques. Cependant, ces drogues ont des effets secondaires importants et ne sont pas toujours suffisantes pour prévenir le rejet. C'est pourquoi il est nécessaire de trouver des traitements alternatifs à ces immunosuppresseurs. Notre équipe a montré que l'utilisation d'un anticorps ciblant et déplétant la molécule CD45 normalement exprimée à la surface de sous populations de lymphocytes T, permettait d'induire une tolérance d'une greffe cardiaque chez le rat. L'objectif de ce projet est d'analyser plus profondément le rôle intrinsèque de la molécule CD45RC dans la fonction de ces sous-populations de lymphocytes T, dans le contexte de greffe de peau chez le rat. Pour cela, nous avons à disposition un modèle de rat déficient pour la molécule CD45RC qui a été généré par la plateforme Transgenèse rat du CR2TI.

Bénéfices attendus

Prolongation de la survie du greffon chez les rats déficients pour la molécule CD45RC

Procédures

- Prélevement de greffons sur animaux donneurs euthanasiés - Greffe de peau sur animaux receveurs anesthésiés (1/animal) - Retrait des pansements au bout de 7 jours sur animaux receveurs anesthésiés - Suivi du bien etre de l'animal et du greffon quotidiennement - Injection dose analgésique en post-opératoire - Prélevements post-mortem sur animaux receveurs euthanasiés

Impact sur les animaux

Douleur et stress engendré par la chirurgie. Mobilite réduite lié à la pause d'un pansement pendant 7jours.

Devenir

Euthanasie des animaux à la fin de l'expérimentation pour effectuer des prélevements de tissus post-mortem.

Remplacement

A ce jour, aucune expérience in vitro ou modélisation informatique ne permet de rendre compte de l'ensemble des mecanismes immunitaires qui rentrent en jeu dans un modèle complexe comme le modèle de greffe de peau. La nature de cette étude ne permet donc pas de s’affranchir de l’utilisation d’animaux et il n'ya pas d'alternatives non animales à la greffe de peau

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Concernant les donneurs de peau, 1 animal est suffisant pour greffer 5 receveurs. Nous estimons que 5 receveurs par groupe est le nombre minimal requis pour obtenir des résultats significatifs. L'approche statistique adoptée est la suivante : Deux expériences indépendantes seront menées comprenant 5 animaux receveurs par groupe. En cas de résultats significatifs, de nouvelles expériences pourront être menées pour confirmer les premieres observations (3 au maximum). Dans le cas contraire, le protocole sera arrêté.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement pour observer leur comportement général (mobilité, prise alimentaire, toilettage, posture, pilo-érection) suite à la chirurgie et pour surveiller le maintien du pansement avant son retrait à J7. Si un signe clinique sévère est observé (amaigrissement important, prostration, posture voutée), l’animal sera sacrifié pour des raisons éthiques. Pour réduire la douleur et la souffrance animale liées à la chirurgie, les animaux reçoivent au moment de la greffe de la kétamine, nécessaire à l'anesthésie des animaux et qui présente une action analgésique. De même une dose de buprénorphine (0.05mg/kg) pourra être administrée en post-opératoire (injection sous-cutanée) pour soulager la douleur. Afin de réduire le stress, différents types d'enrichissement (briquettes de bois, tunnel en carton) sont placés dans les cages et les rats seront à 2-3 par cage pour éviter leur isolement.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi car nous disposons de cette lignée de rats déficients pour la molécule CD45RC. Les rats utilisés auront entre 12 et 16 semaines. Les animaux donneurs ne doivent pas etre trop jeunes pour disposer d'assez de greffons à partir d'un meme animal. Les animaux receveurs seront utilisés dans une tranche d'age relativement proche de celles des animaux donneurs.

246 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie créant un défaut osseux dans le crâne, avec deux défauts par animal, pour y implanter un biomatériau. Ils sont ensuite tués pour prélever la voûte crânienne et évaluer la repousse osseuse. Le projet teste un hydrogel destiné à traiter la péri-implantite dentaire, le porteur affirmant qu'il n'existe pas de solution de remplacement pour l'étude du tissu osseux.

Objectifs

La pose d’implants dentaires est un traitement courant en dentisterie et se répand de plus en plus parmi les praticiens au fil des années. Cependant, en raison de l’exposition permanente aux agents infectieux, la péri-implantite touche aujourd’hui 20% des patients implantés. Si elle n’est pas traitée, elle peut conduire à la perte totale de l’implant et des complications systémiques. La péri-implantite se définit par la formation d’un biofilm bactérien à la surface de l’implant qui entraine une forte inflammation des tissus environnants conduisant à une perte osseuse massive. Les traitements utilisés aujourd’hui par les praticiens (antibiotiques à larges spectres, désinfection de l’implant) ne montrent pas d’efficacité à long terme et peuvent engendrer une résistance bactérienne. Pour pallier à l’utilisation des antibiotiques, un intérêt grandissant est porté aux agents antibactériens inorganiques tels que les nanoparticules, ions métalliques ou polyphénols. Ainsi, l’objectif de notre projet est de développer un matériau innovant en combinant deux hydrogels aux propriétés distinctes. Dans un premier temps, un mélange d’hydrogel, de granules de céramique biphasées (BCP) et de nanoparticules d’hydroxyapatite dopées avec un cation pourra adhérer à l’implant et présentera des propriétés antibactériennes, ostéoconductrices et pro-régénératives. Dans un second temps, une membrane composée d’un mélange d’hydrogel et de chitosan présentant une dégradation lente, sera positionnée afin d’empêcher la croissance des tissus épithéliaux autour de l’implant. L’hydrogel et la membrane ont déjà été étudiés au laboratoire. L’hydrogel a été montré comme cytocompatible in vitro et biocompatible in vivo dans un modèle d’injection en sous-cutané chez la souris. La membrane a quant à elle été montrée comme biocompatible et agissant comme une barrière à l’invasion des cellules du tissu gingival dans un modèle ex-vivo d’explants de cellules gingivales humaines dans le cadre de la parodontite. Cette étude in vivo sera menée chez le rat en deux contextes : une procédure en site orthotopique (implantation des composites dans des défauts osseux de calvaria) afin de juger l’effet du composite sur la repousse osseuse et une seconde procédure en site orthotopique (implantation des membranes dans des défauts osseux de calvaria) afin de juger l’effet de la membrane sur la croissance des tissus épithéliaux autour de l’implant.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider in vivo l’effet ostéogénique d’un composite d’HA-Si + BCP + cation dans le cadre de la péri-implantite. Cette étude pourrait participer à l’élaboration d’un nouveau traitement de la péri-implantite qui serait utilisable en une seule fois, pratique pour les cliniciens et efficace au long court, en terme de régénération osseuse et effet antibactérien. Ce traitement permettrait donc aux patients de retrouver une bonne qualité de vie d’éviter l’apparition de complications systémiques de la péri-implantite.

Procédures

Les animaux seront soumis à l’implantation d’un biomatériau chargé en cation au niveau d’un défaut osseux critique de calvaria de rats réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.

Impact sur les animaux

Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique (5mm) de calvaria chez le rongeur. Par conséquent, ce modèle d’étude sur le rat consanguin Lewis a été étudié depuis plusieurs années, validé et publié. Les effets indésirables attendus peuvent être une difficulté de récupération de l’animal suite à l’anesthésie (stress, perte de poids, comportement anormal), l’apparition de douleurs au site d’implantation, une gêne fonctionnelle due à une réaction inflammatoire ou une mauvaise cicatrisation.

Devenir

En fin d’expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés grâce au dispositif d’euthanasie qui respecte respecter une phase d’endormissement suivie de l’euthanasie (durée totale 8 minutes), permettant ainsi une phase progressive d’endormissement sans douleur pour les animaux. Les calvarias seront ensuite prélevés et préparées pour réaliser des analyses au laboratoire qui permettront l’évaluation la repousse osseuse.

Remplacement

L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux fonctionnalisés en termes de biocompatibilité et d’ostéoconduction. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux. Des études in vitro de cytocompatibilité des composites et d’étude de leur effet ostéogénique ont été réalisées et ont permis le choix de deux formulations, qu’il est maintenant nécessaire de tester in vivo sur le petit animal.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, le biomatériau utilisé a été sélectionné en amont et déjà testé pour sa biocompatibilité et sa capacité d’ostéoconduction in vitro. et in vivo. Pour les deux procédures réalisées en site orthotopique, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rats, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. Par ailleurs l’étude de la bibliographie nous a permis de déterminer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude. Pour la phase d’analyse, les tests statistiques utilisés dépendront de la distribution des données.

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à son sacrifice en fin d’étude. - Pour la chirurgie, une anesthésie générale et l’admission d’analgésiques sont prévus. -Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Une grille de score, des points critiques et un arbre décisionnel adaptés sont mis en place et les animaux seront observés tous les jours par les opérateurs et équipe d’animaliers. En cas d’apparition de symptômes, et si persistance malgré le traitement antalgique adapté, l’animal sera sorti de l’expérimentation et mis à mort dans les plus brefs délais.

Choix des espèces

Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats mâles âgées de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.

8 500 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 3 000 souris et 5 500 rats. Ils reçoivent chaque jour une substance par gavage pendant des périodes allant jusqu'à quatre-vingt-dix jours, avec prélèvements de sang et d'urine, puis sont tués pour analyse des organes. Le projet évalue la toxicité de composés dans le cadre d'études réglementaires. Le porteur indique que les essais in vitro et in silico ne renseignent ni sur les effets à long terme ni sur la gravité, et présente le rat et la souris comme les espèces les plus appropriées.

Objectifs

Ce projet comprend une série d’études permettant d’évaluer la toxicité, et de fournir des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai par voie orale pendant une période courte ou moyenne. En effet l’exposition à un composé est souvent multiple (doses répétées) et peut produire des effets immédiats ou plus tardifs (par accumulation de la substance d’essai ou par sa biotransformation par exemple). Le projet est utilisé pour fournir des informations sur le potentiel toxique d’un produit lors de son développement. Ces études d’une durée inférieure ou égale à 90 jours permettent de définir les doses qui pourront être utilisées dans des études chroniques sans induire d’effets sévères.

Bénéfices attendus

Les bénéfices et objectifs de ces études sont de déterminer et d’évaluer le potentiel toxique d’un composé pour chercher des effets ou constater l’absence d’effets toxiques, déterminer la concentration sans effet nocif observé, identifier des organes cibles et évaluer les changements biologiques provoqués par l'administration du produit, évaluer la concentration plasmatique du produit et de ses métabolites, et de certains biomarqueurs (tyrosine par exemple), évaluer le profil de bioaccumulation du produit dans certains organes, apporter des informations sur la sélection des doses pour les études ultérieures. Il permet également d'obtenir des informations importantes sur le mode d'action de la molécule. Les études les plus précoces permettent de mettre en évidence le profil toxicologique du produit et de pouvoir arrêter le développement de molécules qui pourraient présenter des alertes importantes et ainsi éviter des études plus longues avec plus d'animaux. Les études de 90 jours sont des études réglementaires demandées par les autorités.

Procédures

Un seul prélèvement d'urine en cage à diurèse pendant un maximum de 16h par étude. Un Gavage journalier tout au long de l'étude à l'aide de sondes souples adaptées à la taille et à l’âge des animaux. Des pPrélèvements sanguins d’un volume réduit sur la première journée (en général 4) et un volume plus important en une seule fois sur la dernière journée. Les volumes des prélèvements sanguins ne dépasseront pas les limites calculées en fonction du volume de sang circulant en laissant respectivement 1, 2 ou 3 semaines de récupération en cas de prélèvements multiples ou 15% en cas de prélèvement unique ) soit un maximum de 1.2ml par semaine pour un rat de 250g ou 100µl pour une souris de 25g.

Impact sur les animaux

Les effets toxiques attendus sur les animaux sont modérés car des études préliminaires de tolérabilité et de choix de doses ont déjà été réalisées. Certains signes de toxicité peuvent néanmoins apparaitre en cours d'études. Afin de les mettre en évidence, les animaux sont observés quotidiennement y compris le week-end et au moins une fois par semaine ils font l'objet d'une observation clinique détaillée, leur poids, consommation alimentaire sont mesurés. Deux types de points limites ont été définis et sont détaillés dans les procédures internes : les signes cliniques nécessitant la surveillance rapprochée des animaux et les signes cliniques sévères ou critères majeurs nécessitant une action immédiate et justifiant à eux seuls l’euthanasie de l’animal (critères d’arrêt). La présence d’un seul de ces critères d’arrêt nécessite de prévenir immédiatement le directeur d’étude et doit conduire à l’euthanasie de l'animal. En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d'une période de 24h pour l’analyse des concentrations de la substance à tester. Les prélèvements peuvent être faits via la veine caudale ou la veine saphène. Ces derniers peuvent induire de petits hématomes, qui disparaissent rapidement. Lors des prises d'urine les animaux sont isolés une nuit. Pour certains prélèvements les rats peuvent être soumis à un jeune de 16h maximum.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin d'étude pour évaluer l’effet de la molécule sur les organes en particulier grâce aux analyses histologiques. Les animaux excédentaires exclus de l'étude après randomisation peuvent être gardés en vie et être replacés ou seront intégrés dans le processus de formation du personnel aux gestes techniques.

Remplacement

De nombreux essais in silico et in vitro sont utilisés pour identifier/confirmer des mécanismes d’action préalablement au recours aux études animales. Mais ils ne peuvent prendre en compte l’intégralité des mécanismes conduisant ou pas à l’apparition d’effets toxiques et ils ne peuvent pas donner d’informations concernant les effets à long terme ni la gravité des effets qui suit l'exposition au produit. De même, pour comprendre le mode d'action d'une toxicité spécifique, un enchaînement d’évènements biologiques au niveau moléculaire et tissulaire doit être identifié et caractérisé.

Réduction

Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux. L'utilisation du microsampling permet de mesurer sur un nombre restreint d'animaux des taux de biomarqueurs et la concentration plasmatique en matière active. Le nombre d'animaux est justifié par les recommandations des guidelines internationales, ils doivent permettre une analyse statistique suffisante. Les tests statistiques utilisés ont été définis par un statisticien interne ou par un consultant externe spécialisé en analyse statistique et correspondent aux tests classiquement utilisés et acceptés en toxicologie.

Raffinement

Dans ces études, les animaux sont hébergés en groupe (ou individuellement, temporairement ou si nécessaire dans le cas des études inférieure à 90 jours) avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends. Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance ou leur bien-être. La consommation de nourriture est également mesurée à intervalle régulier. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes de reformation régulière. Des points limites ont été identifiés qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal qui sera demandée par le directeur d’étude. En cas de problème un vétérinaire est présent sur le site pour assurer un traitement. En cours d’étude si besoin des prélèvements sanguins seront réalisés en fonction des recommandations du NC3R National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research). A la fin de chaque étude, un résumé est réalisé et une évaluation du bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal et le comité d’éthique.

Choix des espèces

Les études sur les animaux décrites précédemment ont été validées chez le rongeur (mâle et femelle) et font l’objet de lignes directrices internationales. Il y a par conséquent, suffisamment de données pour indiquer que le rat et la souris sont les espèces les plus appropriées pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel. Les données générées chez ces espèces peuvent être extrapolées à l’homme. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent en général de jeunes adultes conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire. Pour les études non réglementaires des animaux jeunes ou adultes de 6 à 13 semaines sont utilisés.

1 070 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposés dès l'adolescence à l'alcool et à des cannabinoïdes, ils sont soumis à des sessions de consommation d'alcool puis à une craniotomie pour implanter une électrode mesurant la dopamine. Le projet étudie la comorbidité entre schizophrénie et troubles de la consommation d'alcool sur un modèle induit dès la période embryonnaire. Le porteur affirme que ces mécanismes psychiatriques complexes ne sont pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact d'expositions précoces aux drogues sur les troubles de la consommation d'alcool à l'âge adulte dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'acool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agent cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission dopaminergique. En effet la dérégulation de ce système de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la conosmmation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie.

Bénéfices attendus

L'exposition précoce à l'alcool durant l'adolescence est nécessaire pour l'observation à l'âge adulte d'une consommation exagérée d'alcool. Nous n'avons pour le moment aucune information concernant la co-exposition avec des agents cannabinoides, drogues très fréquemment consommée par les adolescents et les jeunes adultes atteints de schizophrénie ou non. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact d'une exposition précoce à des drogues couremment utilisées sur les systèmes dopaminergiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des sessions de consommation d'alcool volontaire soit dans la cage de stabulation (24 heures 1 jour sur 2 pendant 8 à 15 semaines), soit dans des cages d'auto-administration opérante (sessions de 15 minutes, 5 jours par semaine sur une période de 4-5 mois). A l'âge adulte une partie des animaux seront soumis à une craniotomie (30 à 40 minutes) dont l'objectif est d'implanter une micro-électrode d'enregistrement de la libération de dopamine, neurotransmetteur crucial aussi bien dans les troubles observés dans la schizophrénie que dans les troubles de la consommation de drogues.

Impact sur les animaux

Douleurs post-opératoires de palier 1 l'âge adulte suite à l'implantation des canules par craniotomie. Durée prévue : 2-3 jours

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de cette procédure pour nous permettre de collecter les cerveaux pour des analyses histologiques, biochimiques ou génétiques nécessaires pour finalser le projet.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base d'expériences précédentes utilisant un autre modèle animal de schizophrénie et en prenant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet. De plus nous réaliserons les expériences aussi bien sur les mâles que sur les femelles pour ne pas avoir à éliminer les animaux surnuméraires mais également, dans le but d'une réduction, ne pas à avoir à refaire tout ce projet ultérieurement uniquement sur les femelles (et donc euthanasier les ratons mâles surnuméraires à ce moment).

Raffinement

Tout au long du projet les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites adaptés à chaque procédure expérimentale ont été établis avec une prise en charge de la douleur et de la souffrance potentielles adaptée à chaque procédure. Les animaux seront stabulés dans des cages enrichies grâce à une buchette en bois et un tunnel en carton.

Choix des espèces

Le modèle MAM est un modèle décrit chez le rat et nous développons ce projet dans le cadre d'une collaboration multicentrique qui a très largement décrit ce modèle en France. Pour poursuivre nos études en commun, nous devons utiliser le même modèle que nos collaborateurs. Le rat est un modèle idéal pour l'étude de la comorbidité troubles de la consommation d'alcool/schizophrénie en particulier en ce qui concerne certaines études comportementales comme l'auto-administration d'alcool qu'il est plus difficile d'observer chez les souris. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. La mise en place du modèle MAM se déroule au cours de la période embryonnaire et les animaux issus des cette première procédure seront utilisés jusqu'à l'âge adulte. Tous les petits seront soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle pré-exposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de streptozotocine dans les deux ventricules cérébraux sous anesthésie, puis passent une batterie de tests comportementaux évaluant activité motrice, anxiété et mémoire, avant que leur cerveau soit prélevé. Le projet compare deux souches de rats pour étudier la résilience cognitive face à la maladie d'Alzheimer. Le porteur affirme qu'aucun remplacement in vitro ou in silico n'est possible et que la mémoire ne peut s'évaluer que dans un organisme entier.

Objectifs

En vieillissant, il apparait que les patients atteints de la maladie d’Alzheimer et présentant des lésions cérébrales constituées de peptide amyloïde représentent une population très hétérogène. En effet, certains malades souffriront de troubles de la mémoire tandis que d’autres présenteront des performances mnésiques préservées, ce que l’on appelle la résilience cognitive. Une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans cette résilience cognitive permettrait d’identifier de nouvelles stratégies d’intérêt pour lutter contre la maladie d’Alzheimer. Notre projet vise donc à étudier, chez l’animal, les mécanismes cérébraux protecteurs impliqués dans la résilience cognitive face à la maladie d’Alzheimer. Notre objectif est de reproduire une situation pathologique mimant cette maladie chez deux souches de rats (Wistar et LOU/c/jall) afin d’étudier les mécanismes cérébraux protecteurs associés à la résilience cognitive. Le modèle de maladie d’Alzheimer choisi consiste en une injection, dans chaque ventricule cérébral, de streptozotocine chez le rat adulte. Ce modèle entraine une augmentation des concentrations en peptide bêta-amyloïde et en protéine tau phosphorylée dans l’hippocampe, deux marqueurs caractéristiques de la maladie d’Alzheimer. De plus, ce modèle présente une neurodégénérescence associée à l’apparition de déficits cognitifs. Ce modèle permettra d’étudier les mécanismes neuroprotecteurs impliqués dans la résilience cognitive. La maladie d’Alzheimer sera ainsi induite chez les rats de souches Wistar et LOU/c/jall (notées WIS et LOU), dont on suppose qu’elles vont présenter des niveaux de résilience cognitive faible et élevé, respectivement. Par rapport au rat WIS, le rat LOU a déjà été décrit comme présentant un vieillissement réussi et, d’après des études préliminaires, présente des performances de mémoire préservées suite à l’administration intra-cérébrale de peptide amyloïde, mimant de façon très imparfaite la maladie d’Alzheimer. Ces études nous ont amené à proposer le rat LOU comme modèle de résilience cognitive. Notre projet vise à confirmer cette hypothèse en reproduisant, par utilisation du modèle d’injection de streptozotocine, une situation neuronale pathologique plus représentative de la maladie d’Alzheimer. Après caractérisation de la résilience cognitive par une batterie de tests comportementaux, des analyses post-mortem seront réalisées pour identifier les substrats neuronaux protecteurs sous-jacents.

Bénéfices attendus

Grâce à l’utilisation de deux souches de rat dont on suppose qu’elles vont présenter des niveaux de résilience cognitive différents face à une situation mimant la maladie d’Alzheimer, cette étude permettra d’étudier les mécanismes et les processus cérébraux permettant de lutter, sur un plan cognitif, contre la maladie d’Alzheimer. Des études de corrélations entre les performances cognitives, les lésions histopathologiques et certains marqueurs de plasticité synaptique et cérébrale seront réalisées. L’identification des processus cérébraux protecteurs permettra de mettre en lumière de nouvelles stratégies à visée thérapeutique pour lutter contre le déclin cognitif associé à la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Tous les rats (n=192) subiront une injection intra-cérébro-ventriculaire bilatérale de streptozotocine ou de liquide céphalo-rachidien artificiel au cours d’une chirurgie cérébrale menée sous analgésie et anesthésie profonde. Les deux injections cérébrales (une par ventricule) seront réalisées au cours d’une seule opération chirurgicale d’une durée de 30 minutes par animal. L’analgésie sera induite par injection sous-cutanée de buprénorphine 30 min avant l’anesthésie (avant l’acte chirurgical), et renouvelée 6 heures après la procédure chirurgicale. Cette dernière injection réalisée sur animaux vigiles requiert une contention de l’animal et durera environ 1 minute par rat. L'anesthésie se fera par une induction à 5% d'isoflurane puis maintien à 2% d'isoflurane en mélange O2/N2O 30%/70%. Après une période de récupération d’un mois, les animaux seront exposés à une batterie de tests comportementaux visant à évaluer l’activité motrice, le comportement de type anxieux et les performances de mémoire des animaux en situation libre. Ces tests dureront 3 semaines. Certains rats recevront également une injection (n=32 rats) ou deux injections (une injection par jour pendant deux jours ; n=32 rats), par voie intrapéritonéale, d’un agent intercalant de l’ADN permettant de marquer les neurones en formation (étude de la prolifération et de la survie neuronale par injection de BrdU). Chaque injection intra-péritonéale, qui nécessite une contention de l’animal, durera environ une minute par rat.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux provoqués par l’induction de la maladie d’Alzheimer suite à l’administration intra-cérébro-ventriculaire de streptozotocine. D’après les données préexistantes issues de la littérature, une diminution des intéractions sociales et des performances de mémoire, ainsi qu’une élévation du comportement de type anxieux sont attendues, à l’image des symptômes cognitifs observés chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer. Nous nous attendons à observer ces effets qui représentent justement les altérations comportementales étudiées dans notre projet. D’après la littérature, ce protocole d’injection de streptozotocine ne modifie en revanche pas le poids corporel, ni l’activité motrice et exploratoire spontanée des rats traités.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure présentée dans ce projet, tous les animaux seront mis à mort (n=192). Les cerveaux de tous les animaux seront prélevés afin d’étudier les conséquences cérébrales de l’injection de streptozotocine. Ces prélèvements permettront de réaliser des études de corrélation entre le niveau de résilience cognitive des animaux (études comportementales) et leur atteinte cérébrale (études post-mortem).

Remplacement

Ce projet vise à favoriser le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de pathologies neurologiques telles que la maladie d’Alzheimer. Or la recherche de nouveaux médicaments nécessite (scientifiquement et règlementairement) l’utilisation d’espèces animales. De plus, l’évaluation des performances de mémoire ne peut être réalisée que sur un organisme capable d’effectuer une tâche cognitive. L’objectif final est de pouvoir tester de nouveaux candidat-médicaments dans le nouveau modèle animal développé. Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou "in silico" (modèles mathématiques, bio-informatique) ne peut être réalisé. De plus, l’objectif de notre projet est de caractériser différents niveaux de résilience cognitive suite à l’induction d’une situation mimant la maladie d’Alzheimer. Ceci sera réalisé chez le modèle LOU/c/Jall, connu pour représenter un modèle supposé de résilience cognitive élevée. L’existence d’un tel modèle de vieillissement réussi chez d’autres espèces telles que la souris n’a encore jamais été décrite, justifiant ainsi l’utilisation de cette souche de rat, et de la comparer au rat Wistar, dont le rat LOU/c/Jall dérive génétiquement.

Réduction

Un total de 192 rats est envisagé, soient 96 rats Wistar et 96 rats LOU/c/Jall. D’après l’expertise de l’équipe, des groupes de n=16 sont nécessaires pour assurer la puissance des analyses statistiques tout en raffinant notre nombre d’animaux utilisés. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables (Tests ANOVA à un ou deux facteur(s), selon les conditions d’expérimentation réalisées, suivis d’un test post-hoc tel que le test de Tukey ou de Bonferroni). De plus, les études comportementales et cérébrales seront réalisées chez les mêmes animaux pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, souffrance et angoisse infligées, les animaux seront maintenus dans des conditions d’hébergement optimales et stables : température, cycle de lumière, hygrométrie. Ils seront surveillés quotidiennement par un personnel qualifié et une attention particulière sera apportée à l’apparence physique externe des animaux, aux variations éventuelles de poids ainsi qu’aux changements de comportements. Les injections intra-cérébro-ventriculaires (streptozotocine) et intra-péritonéales (Buprénorphine, BrdU) seront réalisées exclusivement par un personnel qualifié. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Afin de réduire la douleur et la détresse de nos animaux, nous avons choisi un point limite précoce et compatible avec les objectifs scientifiques de notre recherche.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le rat (Rattus Norvegicus). Le rat est très utilisé en pharmacologie car il présente des caractéristiques biologiques en nombreux points comparables à l’Homme. Son comportement est bien décrit et il est possible d’en mesurer les modifications. Par ailleurs, le modèle de maladie d’Alzheimer que nous souhaitons reproduire est basé sur l’injection de streptozotocine, déjà décrit et mis au point dans la littérature chez le rat Wistar. Enfin, nous souhaitons évaluer l’influence du niveau de réserve cognitive sur la résilience suite à l’induction de la maladie d’Alzheimer. Ceci sera réalisé chez le rat LOU/c/Jall, connu pour présenter un vieillissement réussi et donc représentant un modèle supposé de résilience cognitive élevée. L’existence d’un tel modèle de vieillissement réussi chez d’autres espèces telles que la souris n’a encore jamais été décrite, justifiant ainsi l’utilisation de cette souche de rat, et de la comparer au rat Wistar, dont le rat LOU/c/Jall dérive génétiquement. Sur la base de la littérature, des rats adultes (2 mois d’âge) seront utilisés dans ce projet. C’est en effet à cet âge que le modèle d’injection à la streptozotocine est décrit et connu pour induire des déficits comportementaux chez le rat Wistar.