Rats

187 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit un diabète par streptozotocine, puis on implante par chirurgie cathéters, pompes et dispositifs de délivrance d'insuline, avec de nombreuses mesures de glycémie et prises de sang. Le porteur signale perte de poids, douleurs post-opératoires, risques d'infection et stress liés aux injections répétées. Le projet vise à valider la voie extrapéritonéale d'administration de l'insuline, et le porteur affirme que ces effets sur plusieurs organes ne peuvent être modélisés in vitro.

Objectifs

L’insuline sécrétée par les îlots de Langerhans du pancréas est la principale hormone permettant de réduire le taux de sucre dans le sang (appelée glycémie). Dans le cas du diabète de type 1 et dans certains stades avancés du diabète de type 2, sa sécrétion est trop faible pour obtenir une régulation correcte de la glycémie. De l’insuline est alors administrée aux patients pour palier à ce manque, par injection sous la peau (appelée voie sous-cutanée), ou dans certains cas directement dans l’abdomen (voie intrapéritonéale). Cependant, ces deux voies d’administration présentent des inconvénients notamment liés à diminution de l’efficacité de l’insuline, pour la sous-cutanée, et à des problèmes d’infection et d’adhésion tissulaire pour l’intrapéritonéal. La voie extra-péritonéale, correspondant à l’espace entre le péritoine (une fine membrane au qui recouvre les organes et qui comporte de nombreux vaisseaux sanguins) et les muscles abdominaux, semble être une alternative intéressante, en permettant un passage rapide de l’insuline dans le sang, tout en étant à distance des organes. Cependant, aucune étude n’a pour le moment été réalisée sur l’administration de l’insuline en continu en extra-péritonéal. Cette étude a donc pour objectif de montrer, chez le rat diabétique, les bénéfices d’une administration extra-péritonéale d’insuline par rapport aux voies sous-cutanée et intra-péritonéale.

Bénéfices attendus

Les seules données disponibles à ce jour sur la délivrance extrapéritonéale d’insuline concernent des injections uniques, afin d’évaluer une efficacité à court terme. Ce projet complèterait ces données en permettant d’évaluer les effets d’une adiministration chronique d’insuline en extrapéritonéale. Cela permettra ainsi d’étudier à la fois la régulation de la glycémie mais également d’autres marqeurs comme le niveau de stress oxydant ainsi que la réaction des tissus au site extrapéritonéal à un contact prolongé avec de l’insuline. Le principal bénéfice attendu est de démontrer que la voie extrapéritonéale peut constituer une réelle alternative aux voies sous-cutanée et intrapéritonéale, pour l’administration d’insuline aux patients diabétiques de type 1.

Procédures

[Gestes techniques réalisés : 1- Mesure de glycémie sur une goutte de sang (volume 6µL) sur animal vigile – Durée

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - perte de poids en lien avec l’état diabétique - des douleurs suite aux chirurgies réalisées pour la mise en place des cathéters, des pompes et du dispositif de délivrance d’insuline - risque d’infection suite aux implantations (pompe péristaltique, cathéter, dispositif de délivrance) - Un inconfort lié au positionnement de la pompe en sous-cutanée sur le dos de l’animal. - un stress en lien avec la répétition des injections d’insuline dans les cathéters ou les mesures de glycémies et prises de sang au cours du suivi

Devenir

La justification du sort des animaux est commune aux 3 procédures. Les 3 procédures de ce projet nécessité l’utilisation d’animaux avec un niveau de diabète suffisament conséquents pour observer les effets d’insuline administrée selon différentes voies ou avec différents systèmes d’administration. Par conséquent les animaux avec une glycémie trop basse sont écartés de l’étude. Ayant reçu une injection de streptozotocine, qui agit sur différents organes en plus de détruites les cellules béta des îlots pancréatiques, ils ne peuvent être utilisés pour d’autres projets sans risque d’amener un biais expérimental. Ils sont donc mis à mort. Ensuite, la finalité de chacune des procédures est d’étudier l’impact sur les tissus d’une délivrance d’insuline répétée (procédure 1) ou continue via des cathéters (procédure 2) ou un dispositif de délivrance diffuse (procédure 3). Cela nécessite des prélèvements de différents tissus qui nécessitent la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les effets de l’administration chronique de l’insuline en extrapéritonéal mettant en jeu plusieurs tissus et organes, elle ne peut être modélisée in vitro. Ces deux paramètres sont évalués par des suivi de glycémie et des prises de sang qui ne sont pas réalisables in vitro.

Réduction

L’effectif des différents groupes prend en compte les sources de variabilité importantes de l’étude, telles que l’induction du diabète, les implantations de cathéter, pompes péristaltiques et de dispositifs de délivrance. Cela permettra d’avoir, selon l’expérience acquise par le laboratoire, suffisamment d’animaux pour réaliser des analyses statistiques sur les différents marqueurs étudiés (glycémie, poids, insulinémie). La plupart des groupes expérimentaux de ce projet combinent au moins deux des sources de variabilité cité plus haut, c’est pour cette raison que les effectifs ont été fixés à 12 animaux par groupe. Pour les animaux contrôles, sur lesquels aucune chirurgie n’est pratiquée, la variabilité est moins importante et l’effectif des groupes est réduit à 8 animaux. Le test statistique utilisé sera l’ANOVA pour des données ayant une distribution suivant une loi normale ou Kruskal-Wallis dans le cas contraire. Les groupes composés d’animaux diabétiques et non diabétiques sont répétés dans les deux phases du projet impliquant l’implantation de pompes péristaltiques. Cela obéit à une logique de rigueur scientifique, qui invite à ce que les cages hébergent des animaux des différents groupes, pour une meilleure représentativité des contrôles.

Raffinement

Le raffinement intervient au niveau Il intervient au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress. Pour l’ensemble des 3 procédures, où interviennent des chirurgies pour l’implantation des cathéters (procédure 1), de pompes péristaltiques (procédure 2 et 3) et de dispositif de délivrance (procédure 3) le raffinement intervient lors de l’anesthésie, réalisée au gaz pour un réveil plus rapide et de la prise en charge post-opératoire par l’administration d’un anti-inflammatoire et anti-douleur. Afin de réduire les risques d’infection, les chirurgies sont réalisées sous hotte à flux laminaire, avec l’utilisation d’un protocole de désinfection de la peau spécifique, ainsi que des champs opératoires stériles et une désinfection des instruments par chaleur humide. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. En accord avec cette grille d’évaluation, des points limites prédictifs ont été déterminés afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales en cours d’étude, tels qu’une persistance de l’état diabétique (perte de poids, hyperglycémie) malgré l’administration d’insuline, une infection post-opératoire non traitable.

Choix des espèces

Le choix du rat est d’abord justifié par de fortes similitudes avec l’Homme sur le plan métabolique, au niveau de la régulation de la glycémie. Ce choix est également motivé par la capacité des rats à bien supporter les chirurgies, et par la possibilité d’accéder à la même voie d’administration de l’insuline que chez l’Homme (sous-cutanée, intra-péritonéale, extra-péritonéale) Enfin, nous avons également choisi d’utiliser le rat pour les premières études précliniques, pour limiter autant que possible le nombre de gros animaux (porcs et primates) nécessaires pour les études suivantes. Les rats Wistar seront de jeunes adultes, âgés de 7 semaines, coïncidant avec un poids de 200g environ. C’est à ce poids que le protocole d’induction du diabète présente le meilleur taux de succès. En effet, avec des âges/poids inférieurs la mortalité est plus élevée, tandis qu’à des âges/poids supérieurs le taux de réussite diminue. De plus, à cet âge, le système immunitaire est suffisamment mature pour que les animaux puissent subir des chirurgies sans risques accrus d’infections.

144 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis pendant six mois à des régimes incluant des arrêts de nourriture de trois jours, à des tests de tolérance au glucose avec ponctions répétées de la queue et à des IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter dans la veine caudale, pour évaluer les effets du jeûne sur le cœur. Le porteur indique que les ponctions et la pose du cathéter peuvent provoquer stress, douleur et risque d'infection. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'existe et que l'expérimentation animale est "nécessaire" pour valider son hypothèse de cardioprotection.

Objectifs

Le jeûne est une méthode d’alimentation consistant à ingérer peu ou aucune nourriture sur une période allant de 12h à plusieurs semaines chez l’Homme. Cette coutume ancestrale est pratiquée par de nombreuses religions et, plus récemment, a reçu une attention croissante pour d’autres raisons de santé, économique et écologique. On distingue le jeûne intermittent, qui consiste à se priver de nourriture pendant une période de 14h sur une journée, le jeûne intermittent prolongé (3 – 5 jours) et le jeûne thérapeutique (1 à 3 semaines). En France, jeûner n’est pas proposé dans un cadre médicalisé. Pourtant, il a été prouvé que le jeûne retarde les processus liés à l’âge (stress oxydant, inflammation…), protège le cerveau des maladies neurodégénératives et diminue la croissance tumorale. Le jeûne intermittent prévient et réverse tous les aspects du syndrome métabolique chez le rongeur et chez l’Homme. En cardiologie, des études précliniques sur des rats mâles ont démontré une diminution de la fibrose myocardique liée à l’âge en prévenant l’inflammation et en maintenant les antioxydants. De plus, le jeûne intermittent diminue l’apoptose et l’inflammation puis prévient le remodelage du myocarde sur modèles d’infarctus du myocarde. Plusieurs jours de jeûne améliorent la diffusion de l’oxygène du capillaire à la mitochondrie de myocarde murin suggérant une amélioration de l’énergie cellulaire. Les objectifs de cette étude sont de caractériser les effets du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique sur le cœur de rat et de déterminer si ces derniers sont protecteurs lors d’un stress aigu induit par un épisode d’ischémie-reperfusion et dans un modèle de cardiomyopathie prédiabétique (induit par un régime riche en graisse et en sucre). Plus précisément, nous souhaitons caractériser le profil cardiométabolique du jeûne, notamment le métabolisme énergétique et le profil lipidique myocardiques. Notre hypothèse est que les changements physiologiques et métaboliques induits par le jeûne intermittent et/ou thérapeutique seraient cardioprotecteurs. Enfin, nous souhaitons déterminer s’il y a un effet du genre et comparer les mécanismes du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux caractériser les effets des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la fonction cardiaque, le métabolisme énergétique et le remodelage du profil lipidique. Nous souhaitons savoir si ces méthodes sont cardioprotectrices envers un stress aigu (ischémie/reperfusion) et chronique (modèle de prédiabètes induit par le régime riche en graisse et en sucre). Enfin, nous évaluerons l’effet du genre de ces régimes.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents régimes décrits ci-après : régime normal pendant 6 mois ; régime normal pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux pendant 3 mois ; - régime normal pendant 3 mois avec deux arrêts de la nourriture pendant 3 jours (à 4.5 et à 6 mois) ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux avec le même régime pendant 3 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois avec 2 arrêts de la nourriture pendant 3 jours à 4.5 et 6 mois. Tous les animaux seront soumis à trois tests de tolérance au glucose sur animaux vigiles. Celui-ci comprend une injection intrapéritonéale et 6 prélèvements de gouttes de sang dans la queue de l’animal (mesure de glycémie). Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois. Tous les animaux seront soumis à trois examens d’imagerie IRM avec insertion d’un cathéter dans la veine caudale sous anesthésie générale. Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois.

Impact sur les animaux

La procédure sur la mise en place des régimes peut entrainer un léger stress chez les animaux mais ne doit pas entrainer d'effet indésirable notable et a déjà fait l’objet de nombreuses publications au niveau international. L'eau quant à elle restera à disposition ad libitum. Le test de tolérance au glucose fait l’objet d’injection en intrapéritonéale et de ponctions répétées au bout de la queue de l’animal pour mesure de la glycémie pouvant générer un stress pour l’animal et un risque d’infection. Les animaux réagissent et cicatrisent bien, notre groupe a l’habitude de travailler avec ces mesures et fera le nécessaire pour surveiller tout évènement indésirable (stress, infection). Les anesthésies et les examens d’imagerie in vivo par IRM sont également des nuisances pour les animaux mais l’imagerie reste l’exploration la moins invasive de nos jours. Enfin, la pose d’un cathéter se fera sous anesthésie pou diminuer le stress de l’animal, cela peut augmenter la douleur après réveil ainsi que le risque d’infection que nous surveillerons quotidiennement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (après l'IRM à 9 mois) pour pouvoir prélever le cœur et réaliser des expériences ex vivo en cœur isolé afin de caractériser le métabolisme énergétique et le profil lipidique cardiaque par spectroscopie par résonance magnétique.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la physiologie et le métabolisme cardiaque. De plus, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider notre hypothèse de cardioprotection de ces régimes face à des stress aigu et chronique selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie/ spectroscopie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.

Réduction

Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, l'étude in vivo permettra de réaliser un suivi longitudinal de l’animal sans sacrifice et l'étude ex vivo sera réalisée sur le même animal. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Nous souhaitons obtenir un effectif final de n=10 par groupe et nous envisageons 20% de perte de données (problème technique d’imagerie et de spectroscopie, problème de prélèvement du cœur pour l’expérience ex-vivo). Nous prévoyons donc 10 + 2 (20% de perte) = 12 rats par groupes. L’effectif de 10 animaux par groupe est déterminé à l’aide d’une analyse statistique (Statistica) prévoyant, pour un risque alpha de 5% et un risque béta de 10%, une amélioration de 25% de la fonction cardiaque dans nos modèles animaux pathologiques pour revenir à des valeurs physiologiques observées chez des animaux contrôles.

Raffinement

Les rats seront acclimatés pendant 14 jours avant le début de l'étude. La procédure sur la mise en place des régimes ne doit pas entrainer d'effets indésirables. Les durées et fréquences sont déterminées en fonction des données de la littérature (1 jour sur 2 pour le jeûne intermittent et 3 jours de jeûne thérapeutique). L'eau sera mise à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tout au long des régimes et du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. Un animalier ou un chercheur contrôlera le bien-être des animaux tous les jours. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée, une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la Vétédine. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. Pour la procédure d'IRM in vivo, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (Vetflurane 2%) et d’oxygène (1L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sera assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Durant les anesthésies, les yeux seront hydratés (Ocrygel) et la température maintenue à 37°C par couverture chauffante et monitoring par sonde rectale. Durant l'IRM, une injection d'adénosine (poudre chez Sigma Aldrich) à 0.33 mg/kg/min diluée en solution de chlorure de Sodiul à 0.9% à usage vétérinaire (B.Braun) sera réalisée via un cathéter disposé dans la veine caudale, le volume maximal est de 3 ml pendant 10 minutes maximun. La respiration et l'ECG seront surveillés pendant toute la durée de l'examen. Le comportement des animaux sera étroitement surveillé et une grille d'évaluation de la douleur sera remplie et le point limite déterminé en fonction des principes de Morton et Griffiths. Enfin, pour la procédure ex vivo sur le coeur isolé perfusé, nous réaliserons une euthanasie par injection d'euthasol (140mk/mg, IP) avant de prélever le cœur afin de ne pas faire souffrir l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de rat soumis à ces régimes a été choisi car des études des jeûnes ont été réalisé sur cette espèce. De plus, nous souhaitons comparer nos résultats de cardioprotection avec ce qui a déjà été fait dans le laboratoire dans un souci de respect des 3R. Nous souhaitons également tester la cardioprotection des jeûnes sur le modèle de rat nourri avec un régime HFS qui permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le coeur. Le modèle HFS a été récemment décrit par notre équipe pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale.

40 rats et 80 rats roussards du Soudan (Arvicanthis) vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent l'implantation chirurgicale d'une électrode dans le cerveau et un protocole de décalage horaire, une partie une restriction d'accès à l'eau et l'administration de fluoxétine, puis des stimulations électriques répétées, l'euthanasie servant à vérifier le site d'implantation. Le porteur étudie le fonctionnement de l'horloge biologique chez une espèce diurne. Il affirme que ces bases neurales ne peuvent être reproduites in vitro ni in silico et nécessitent l'animal vivant.

Objectifs

L'horloge principale est responsable de la régulation de tous les rythmes du corps et permet à l'organisme de s'adapter et d'anticiper les changements environnementaux. La perturbation des cycles externes peut nuire à notre santé. Des études récentes chez l'homme indiquent que la perturbation de l’horloge, tels que ceux causés par l'exposition à la lumière artificielle de nuit, par le jet lag ou par le travail posté, augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires, des troubles du sommeil, de la dépression et maladies métabolique. L'activité électrique de l'horloge biologique est la première étape de la formation de son signal de sortie qui détermine la libération de signaux capable de synchroniser toutes les fonctions rythmiques du corps, y compris l’activité comportementale. Il n’est pas clair quel est l’effet de l’activité électrique de l’horloge sur l’activité comportamentale, et si en stimulant l'activité électrique de l'horloge centrale on peut renforcer l'amplitude du rythme de l'activité comportementale, qui au contraire diminue avec l'âge. Ainsi, le premier objective est de définir l’effet de l’activité électrique de l'horloge sur l’activité comportementale chez une espèce diurne (Arvicanthis) et chez une espèce nocturne (rat) ; et de tester chez des Arvicanthis âgée si la stimulation de l’activité électrique de l’horloge peut augmenter l'amplitude du rythme d'activité comportementale. Un des signaux qui influence l'horloge biologique est la sérotonine qui peut modifier l'activité de l'horloge. Ainsi, le second objective de ce projet est de tester si une augmentation de sérotonine, peut accélérer la resynchronisation de l’activité comportementale de l’animale a un nouveau cycle de lumière /obscurité décalé de 6h.

Bénéfices attendus

Dans la société moderne, les rythmes sont perturbés et de plus en plus de preuves montrent que cela est nocif pour la santé. Les mécanismes de fonctionnement de l’horloge ne sont pas clairs chez les espèces diurnes, interdisant le développement de thérapies pour l'amélioration des fonctions diurnes, y compris humaines. Ce projet améliorera notre compréhension du fonctionnement de l’horloge centrale chez une espèce diurne. Cela fournira des informations utiles pour développer des stratégies efficaces pour améliorer les fonctions de l'horloge chez l'homme jeune et âgé. Plus précisément ce projet : 1. Fournira des informations sur la relation entre l'activité électrique et l'activité locomotrice chez les animaux diurnes, et les éventuelles différences avec les animaux nocturnes. Ces informations peuvent aussi être utilisées pour améliorer les conditions des patients qui présentent des pathologies associées à des troubles circadiens (troubles journaliers comme dans différents troubles de l'humeur, y compris la dépression). 2. Fournira des informations sur comment la signalisation sérotoninergique interagit avec la lumière pour déphaser l'horloge biologique chez une espèce diurne. Ces résultats pourraient permettre le développement de stratégies pour aider à combattre la désynchronisation circadienne chez les travailleurs postés et lors de décalage horaire.

Procédures

16 animaux seront soumis à un protocole de décalage horaire, dont 10 seront soumis à une restriction temporelle d'eau (accès à l'eau 6h par jour), pour un total de 16 jours (4 jours de restriction temporelle d'eau suivis de 5 jours d'accès à l'eau ad libitum). Cette restriction temporelle d’eau est nécessaire pour l'administration de fluoxétine-qui entraîne une augmentation des niveaux de sérotonine-(6 jours au total) à des moments précis de la journée. 6 animaux seront soumis au même protocole (décalage horaire) mais auront toujours accès à l'eau. Ces Arvicanthis seront soumis à une chirurgie de 1 heure 1 mois après la fin du protocole de décalage horaire (durée totale 47 jours). Tous les animaux (120) seront soumis à une chirurgie de 1h qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation de la zone de la zone d'intérêt. 40 jeunes (2-5 mois) Arvicanthis (dont 16 issues du protocole de décalage horaire) et 40 jeunes (2-5 mois) rats, recevront 4 stimulations électriques par jour (durée 2h), pendant 6 jours dans 3 conditions de lumière (2 jours en 12h lumière : 12h d'obscurité, 2 jours en obscurité constante, 2 jours en lumière constante). 40 Arvicanthis âgées (>12 mois) recevront une stimulation électrique par jour (durée 2h-4h), pendant 3 jours (1 jour en 12h de lumière : 12h d'obscurité, 1 jour en obscurité constante, 1 jour en lumière constante).

Impact sur les animaux

La restriction temporelle d’accès à l’eau (6h) est nécessaire pour administrer la fluoxétine à un moment donné du temps journalier. Cependant, cela pourrait entraîner une déshydratation (dont l’importance sera évaluée dans une manipe pilote). Si une diminution de la prise d’eau est constatée, cela pourrait entrainer une diminution de la prise alimentaire et une conséquente perte de poids, entrainant un stress de l’animal. Dans une expérience précédente dans notre groupe de recherche, les Arvicanthis ont été traités pendant 5 jours avec la fluoxétine. Aucun effet délétère n'a été observé sur le bien être des animaux pendant et après le traitement à la fluoxétine. La chirurgie stéréotaxique, qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation, peut entraîner une perte modérée de poids. Compte tenu que la chirurgie comporte une incision cutanée au niveau du crâne, une infection ou une inflammation des plaies cutanées ne peut pas être exclu. La restriction temporelle d’accès à l’eau (6h) est nécessaire pour administrer la fluoxétine à un moment donné du temps journalier. Cependant, cela pourrait entraîner une déshydratation (dont l’importance sera évaluée dans une manipe pilote). Si une diminution de la prise d’eau est constatée, cela pourrait entrainer une diminution de la prise alimentaire et une conséquente perte de poids, entrainant un stress de l’animal. Dans une expérience précédente dans notre groupe de recherche, les Arvicanthis ont été traités pendant 5 jours avec la fluoxétine. Aucun effet délétère n'a été observé sur le bien être des animaux pendant et après le traitement à la fluoxétine. La chirurgie stéréotaxique, qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation, peut entraîner une perte modérée de poids. Compte tenu que la chirurgie comporte une incision cutanée au niveau du crâne, une infection ou une inflammation des plaies cutanées ne peut pas être exclu.

Devenir

Tous les animaux (80 Arvicanthis, 40 rats) seront mis à mort à la fin du projet. L'euthanasie est nécessaire à la vérification du site d'implantation de l'électrode de stimulation.

Remplacement

La compréhension des bases neurales de la diurnalité, qui implique au vu des connaissances actuelles un circuit de plusieurs structures cérébrales interconnectées, dont le schéma ne peut actuellement être reproduit avec une approche in vitro ou in silico, nécessite une approche in vivo chez l'animal vivant pour atteindre l'objectif.

Réduction

Notre approche longitudinale (enregistrement en continu d’un même animal dans différentes conditions expérimentales, animal utilisé comme son propre controle) permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés et de réduire la variabilité inter- individuelle. Le nombre d’animaux utilisés nous permettra d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Les résultats seront exploités avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les Arvicanthis seront gardés en cages ouvertes individuelles pour enregistrement rythmes journaliers, car les animaux adultes sont agressifs entre eux. Les animaux gardent des contacts olfactifs et auditifs avec les congénères dans la même pièce. Les cages sont enrichies avec un bâton à ronger. Les cages d'enregistrement in vivo sont équipées d'un joint tournant permettant à l'animal de rester libre de ses mouvements. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L'état de santé des animaux sera évalué au cours de l'étude et des points limites spécifiques ont été établis permettant d'interrompre les procédures et soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Rats: Pour comprendre la physiologie de l'horloge chez les animaux diurnes, nous devons aussi étudier les différences avec ll'horloge chez les nocturnes. La comparaison entre nocturne et diurne apporte des informations supplémentaires sur ce qui est différent entre les deux espèces. Cela permet d'améliorer les stratégies biomédicales actuellement en place, qui sont basées sur des informations provenant d'animaux nocturnes. Le choix de cette espèce nocturne est principalement basé sur le fait que le rythme de l'activité électrique de l'horloge biologique chez le rat a déjà été caractérisé. Ceci est nécessaire pour appliquer correctement notre protocole de stimulation Arvicanthis: Comprendre les bases neuronales de la diurnalité nécessite l'étude des animaux diurnes. La disponibilité du Rat roussard du Soudan (Arvicanthis ansorgei), un rongeur diurne élevé au Chronobiotron, est une opportunité unique d'atteindre cet objectif. Rats et Arvicanthis jeunes adulte (2-5 mois), pour étudier un système circadien mature et non-sénescent. Arvicanthis âgés (> 12 mois), pour tester l'effet de la stimulation électrique sur des animaux présentant un rythme faible d'activité comportementale.

7 200 souris, 1 200 rats et 1 600 hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever le sang et les organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette société de prestation les expose à des composés vaccinaux ou pharmacologiques par une à cinq injections sous anesthésie, afin de mesurer la réponse immunitaire induite. Le porteur indique attendre des pertes de poids et des douleurs transitoires au point d'injection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité observée in vivo, l'évaluation chez l'animal étant présentée comme "nécessaire" pour sélectionner les candidats médicaments.

Objectifs

Notre société développe et propose des modèles de recherche, adaptés aux études visant à mesurer l’efficacité et l’innocuité de candidats thérapeutiques et vaccinaux. La réponse du système immunitaire est une composante importante de notre organisme à considérer dans le développement de nouveaux vaccins ou de nouveaux composés pharmacologiques, en particulier d’origine biotechnologique. En pratique, ces études consistent à injecter, dans la plupart des cas à plusieurs reprises à une ou plusieurs semaines d’intervalle, un produit à potentiel immunogène, dans le but d’évaluer la réponse immunitaire induite (dans le sang et les tissus lymphoïdes). Ce programme de recherche s’intéresse à mieux caractériser cette composante chez le rongeur, et plus particulièrement l’immunogénicité de nouvelles formulations ou composés (adjuvants, vaccins, protéines thérapeutiques, etc.). Pour cela, un composé induisant potentiellement une réponse immune sera injecté aux animaux. Afin d’évaluer et de caractériser cette réponse immune, des prélèvements, sanguins notamment, seront ensuite réalisés tout au long de l’étude afin de suivre, par exemple, l’émergence d’anticorps dirigés contre l’antigène injecté dans le sérum, ou l’activation cellulaire associée spécifiquement au composé d’intérêt. Dans cette procédure, aucun challenge infectieux ne sera réalisé sur les animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif de pathologies existantes ou dont l’immunogénicité doit être testée. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées.

Procédures

Les animaux (rats, souris ou hamsters) immunocompétents ou partiellement immunodéficients (à un niveau de déficit n’induisant pas de risque infectieux significativement supérieur pour l’animal) transgéniques ou non, humanisés ou non, seront exposés à des composés de différente nature (entité chimique de type vecteur ou adjjuvant vaccinal, biologique, et/oubiotechnologique (nucléique et protéique), etc.) Les animaux recevront en général 1 à 5 injections administrations du produit potentiellement immunogène avec au minimum une semaine d’intervalle entre les injections mais potentiellement plusieurs mois. Cette procédure aura lieu sous anesthésie générale qui durera environ une heure. Afin d’évaluer de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale,soit sous anesthésie générale d’environ une heure, intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, oralesoit sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon). Les volumes administrés respecteront les recommandations. Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au minimum 2 fois par semaine. Le site d’injection sera observé sur les quelques jours suivant l’administration pour surveiller l’absence de réactions dans la zone, et l’état général des animaux sera vérifié. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés au cours de la vie de l’animal pour le suivi des réponses immunitaires ou d’autres paramètres biologiques. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera environ une heure. La fréquence et le volume de ces prélèvements sera conforme aux recommandations vétérinaires pour la voie utilisée. Ces recommandations incluent une potentielle réhydratation sous cutanée des animaux en cas de prélèvements répétés / à volume important. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés. Un prélèvement de sang terminal en intracardiaque pourra être réalisé sous anesthésie générale profonde puis des prélèvements d’organes pourront etre effectués après euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous pouvons nous attendre à des pertes de poids et des douleurs transitoires au site d’injection et dans la zone (ganglion drainant).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour récupération de grandes quantités de sang et d’organes lymphoïdes afin de vérifier la réponse immunitaire induit par les vaccinations.

Remplacement

Des modèles in vitro permettent d’étudier certains processus de l’immunité et sont utilisés pour présélectionner les composés les plus intéressants mais aucun ne reproduit la complexité observée in vivo. C’est pourquoi l’évaluation chez l’animal des propriétés immunogènes des candidats médicaments chimiques ou biologiques est nécessaire, pour sélectionner le meilleur composé pouvant être amené dans les études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Entre 3 et 50 animaux seront inclus par groupe. Seuls des rats, souris et hamsters seront utilisés dans le cadre de ce projet. Ces espèces sont utilisées pour tester les effets de composés sur le système immunitaire.

Raffinement

Les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible. Les volumes et fréquences d’administration et de prélèvement sont conformes aux bonnes pratiques et toutes les techniques sont réalisées par du personnel formé et compétent. Enfin, les prélèvements d’organes/tissus sont réalisés après euthanasie. Dans tous les cas, les animaux sont observés régulièrement et des mesures sont mises en œuvre pour arrêter, minimiser ou diminuer la souffrance et/ ou détresse de l’animal en cas d’apparition de signe clinique indésirable.

Choix des espèces

Les études à l’aide des petits rongeurs, notamment les souris, sont depuis longtemps la première étape de l’exploration du rôle physiopathologique du système immunitaire ou de l’efficacité de tout nouvel immunomodulateur, qu’il soit d’origine chimique ou biotechnologie. Selon le type de profil immunologique ou le type de prélèvement nécessaire, le rat et le hamster pourront également être utilisés. L’excellente connaissance du système immunitaire des rongeurs, conduisant souvent à une meilleure connaissance du même système chez l’Homme, permet d’explorer de nouvelles pistes immuno-pharmacologiques. Les animaux pourront être partiellement immunodéficients (à un niveau de déficit n’induisant pas de risque infectieux significativement supérieur pour l’animal), puisque cela s’avère d’un fort intérêt pour certaines approches expérimentales pathologiques e.g. maladies infectieuses. Par ailleurs, les rats, les souris et les hamsters autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement. Seuls les animaux sevrés seront utilisés. Les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles, c’est-à-dire un système immunitaire établi, d’après la littérature sur le sujet.

3 860 souris et 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever la rate et la tumeur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent une immunisation sous la peau et, pour une partie, une implantation de cellules tumorales, le porteur les mettant à mort dès que la tumeur s'ulcère, se nécrose ou dépasse un volume fixé. Il indique tester un adjuvant à base de mélanine pour un futur vaccin contre le glioblastome, tout en affirmant que la souris est l'espèce "la plus adaptée" et que le modèle de gliome implantable n'existe que chez le rat. Les retombées cliniques sont renvoyées après sélection d'un candidat et poursuite du développement pharmaceutique.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. L’induction d’une immunité contre un antigène cible par vaccination à l’aide d’adjuvants classiques (tels que ceux utilisés dans les vaccins anti-infectieux) permet d’obtenir facilement des anticorps circulants. Ces anticorps sont cependant peu efficaces pour lutter contre les tumeurs. L’obtention de lymphocytes T capables de tuer les cellules cancéreuses est plus difficile car les adjuvants disponibles actuellement donnent généralement des réponses faibles ne permettant pas d’induire une réponse antitumorale satisfaisante. Nous avons récemment découvert que la mélanine synthétique utilisée en tant qu’adjuvant vaccinal permettait de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène peptidique donné (i.e. un fragment de protéine surexprimée ou bien anormalement exprimée par les cellules cancéreuses et présenté à leur surface). Notre but est de poursuivre le développement de notre adjuvant afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Des peptides cibles issus de protéines exprimées dans les glioblastomes humains seront sélectionnés, puis validés par des tests in vitro. La capacité de ces peptides associés à notre adjuvant à base de mélanine à induire une réponse immunitaire et à contrôler la croissance tumorale, sera évaluée in vivo chez la Souris ou le Rat. L’étude chez l’animal est indispensable pour mesurer une réponse immunitaire par lymphocyte et la Souris constitue l’espèce la plus adaptée pour les études immunologiques. Comme il n'existe pas de modèle de gliome implantable en sous-cutané chez la Souris, les effets anti-tumoraux de nos formulations seront évalués chez le Rat, pour lesquels un tel modèle existe.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la sélection d’un candidat vaccin pour le traitement du glioblastome, dont nous poursuivrons le développement pharmaceutique avant d’initier les essais cliniques chez l’Homme. A l'issue de ce projet nous aurons : 1- Sélectionné deux peptides-candidats issus de protéines surexprimées ou anormalement exprimées par les gliomes humains 2- Déterminé la formulation (ratio peptide/mélanine, temps de contact) permettant d'obtenir une réponse imunitaire optimale pour chacun des deux peptides 3- Réalisé les études de stabilité de notre adjuvant à base de mélanine synthétique sur 3 ans

Procédures

Les immunisations seront réalisées par injection sous la peau sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une ou deux injections (à deux semaines d'intervalle) seront réalisées par animal. Les implantations de cellules tumorales sous la peau seront réalisées sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une seule implantation sera effectuée par animal.

Impact sur les animaux

L’injection du vaccin est susceptible de provoquer une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection, ce qui fera l'objet d'une surveillance quotidienne. Il est cependant à noter qu'aucune des expériences menées à ce jour n'a mis en évidence de tels effets indésirables. Dans les expériences impliquant l’implantation d’une tumeur sous la peau, un effet indésirable potentiel est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place et il sera procédé à leur mise à mort en cas d'ulcération ou de nécrose de la tumeur ou bien dès que celle-ci atteindra un volume déterminé à l’avance et adapté à l’espèce.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chacune des procédures afin de pouvoir obtenir le matériel biologique (rate, tumeur) nécessaire à l'évaluation de la réponse immunitaire.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués (interactions cellules présentatrices des antigènes-lymphocytes, interactions cellules immunitaires-tumeur (y compris microenvironnement tumoral)). Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et ainsi de limiter la multiplication des expériences. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs préparations vaccinales ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 3980 animaux seront utilisés dans ce projet, 3860 souris et 120 rats.

Raffinement

Les expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes. Toutes les injections sont effectuées sous anesthésie générale. Les vaccins sont formulés de façon à être bien tolérés et à ne pas induire de douleur ou de réaction indésirable au point d’injection. Chez les animaux porteurs de tumeurs, la croissance tumorale est mesurée tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

Souris : La souris est le modèle de choix pour l'étude de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souches utilisées dans ce projet est bien caractérisé et de nombreux outils immunologiques sont disponibles (bases de données et outils de prédiction in silico, réactifs et méthodes permettant d’étudier et de mesurer l’intensité la réponse immunitaire). Il existe un modèle de souris transgéniques dont le système immunitaire est capable de reconnaitre les antigènes tumoraux humains, que nous pourrons utiliser pour valider notre candidat vaccin avant passage aux essais cliniques chez l’Homme. Rat : Il n’existe pas de modèle de glioblastome implantable en sous-cutané chez la Souris. En revanche, il existe un modèle reconnu chez le Rat, que nous allons utiliser dans ce projet. Les animaux seront agés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

200 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection de manganèse à travers le tympan puis une IRM d'une heure et demie, pour mettre au point une imagerie des acouphènes servant à tester des candidats médicaments. Le porteur signale un inconfort de l'oreille après l'injection et indique que les animaux sont tués juste après l'IRM parce que le manganèse, toxique à forte dose, est incompatible avec leur maintien en vie. Il affirme qu'aucune méthode alternative validée ne permet de mesurer les acouphènes chez l'animal.

Objectifs

Développer des techniques IRM comme marqueur des acouphènes chez le rongeur en vue de développer et tester des médicaments traitant ce trouble.

Bénéfices attendus

Consolidation scientifique de cette technique d’imagerie pour évaluer l’efficacité de candidat médicament sur les acouphènes.

Procédures

Tous les animaux vont subir une imagerie IRM pendant 1h30 maximum.

Impact sur les animaux

Inconfort au niveau de l'oreille après l'injection trans-tympanique du manganese.

Devenir

Les animaux sont tous euthanasiés en fin de procédure afin d'éviter les effets du marqueur nécessaire pour détecter les acouphènes (MnCl2). Une forte dose de MN2+ peut produire de signes cliniques qui représentent des points limites, donc l'incompatibilité avec le maintien des animaux au-delà de l'acquisition IRM.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour mesurer la présence d'acouphènes chez l'animal et l'activité cérébrale in-vitro. Il reste nécessaire de vérifier l’efficacité des principes actifs avant de poursuivre le développement chez l'Homme.

Réduction

Le développement d’une technique IRM du sodium permettra à l’avenir de garder les animaux dans le temps. Cette technique sera complètement non invasive et permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés en les gardant pour qu’ils puissent être leurs propres contrôles dans le temps.

Raffinement

Nous avons choisi d'utiliser l'IRM comme methode quantitative de mesure des acouphènes afin d'éviter une approche par électrophysiologie neurochirurgicale avec l'implantation d'électrodes dans le cortex auditif. Cette méthode, moins invasive, ne nécessite pas un point limite associé à la technique de'IRM en elle même. Les animaux sont euthanasiés directement après la mesure IRM sans réveil après l'IRM. L'approche de l'anesthésie sous isoflurane, nous permet de conserver une anesthésie constante et régulière pour éviter le stress d'un réveil de l'animal. Nous conservons les animaux sur un plateau chauffant à température nécessaire pour éviter l'hypothermie de l'animal.

Choix des espèces

Le modéle des acouphénes chez le rat et la souris est validé dans la litérature. Selon les données préliminaires de pharmacologie obtenues sur le traitement des acouphénes, le choix de l'espace s'orientera vers la souris ou le rat. Les animaux utilisés sont des adultes avec une oreille interne complètement formée et fonctionnelle. Cela implique l’utilisation d’animaux âgés au minimum de 4 semaines.