Rats
Régulation de l’expression du gène Sez6 par l’ARN non codant miR-3594-5p
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une neurochirurgie d'environ trois quarts d'heure pour injecter un microARN dans le striatum, une région cérébrale liée au comportement compulsif, avant d'être tué le lendemain par perfusion de formaldéhyde dans le cœur sous anesthésie. Le projet cherche à confirmer, chez le rat, un mécanisme de régulation génétique déjà observé en culture cellulaire dans le contexte de l'addiction à l'héroïne. Le porteur affirme que seul le modèle in vivo permet cette vérification, l'étude neurobiologique invasive étant impossible chez l'humain.
Objectifs
Le but de ce projet est d’évaluer si miR-3594-5p est capable d’inhiber l’expression du gène Sez6 dans les neurones du striatum. L’expression d’un gène peut être définie comme l’ensemble des processus par lesquels l’information héréditaire stockée dans un gène est lue pour aboutir à la fabrication de molécules qui auront un rôle dans le fonctionnement de la cellule, comme les protéines ou les ARNs. miR-3594-5p est une petite molécule d’ARN appelé microARN qui ne produit pas de protéine mais qui est capable de réguler l’expression de différents gènes. Le striatum est une région cérébrale clée car elle joue un rôle critique dans le développement de comportement compulsif. Des travaux antérieurs ont démontré que les rats ayant développé une consommation compulsive et excessive d'héroïne, et non les individus ayant développé une consommation contrôlée et limitée de drogue, présentaient un niveau d'expression plus élevé de miR-3594-5p dans le striatum. L’augmentation du taux de cette molécule est associée à une diminution de l'expression du gène Sez6, gène impliqué dans la régulation des connexions entre les neurones, dans cette même région cérébrale. Il a déjà été mis en évidence que cette molécule est capable d’interagir directement avec le gène Sez6 dans un modèle de culture cellulaire. Il nous reste à déterminer la fonction de cette molécule dans le striatum de rat. Pour cela, nous devons démontrer que cette molécule interagit bien avec Sez6 dans les neurones du striatum de rat et inhibe bien son expression dans ces mêmes neurones.
Bénéfices attendus
Cette procédure confirmera les résultats antérieurs obtenus grâce au modèle de culture cellulaire et les étendra à un organisme vivant entier et intégré. Elle confirmera le rôle fonctionnel de régulation du miR-3594-5p dans le striatum de rat. Elle fournira une information unique sur le rôle de cette molécule dans l’inhibition spécifique de l’expression du gène Sez6 dans les neurones striataux. Les résultats issus de cette expérience seront très importants pour conforter les résultats déjà obtenus.
Procédures
Chacun des 48 animaux sera soumis à une neuro-chirurgie afin d'injecter le miR-3594-5p ou les molécules contrôles dans le striatum. Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 45 min. La procédure expérimentale relève de la classe modérée et est très brève puisqu’elle se termine un jour après la neuro-chirurgie.
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à une procédure très brève dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les seules nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la neuro-chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). Les rats ne seront soumis qu’à une seule procédure n’excédant pas une journée. L’étape de réveil de l’animal est cependant nécessaire avant sa mise à mort pour laisser une fenêtre de temps nécessaire à la molécule pour inhiber le gène Sez6.
Devenir
A la fin des expériences, il est nécessaire de vérifier l'emplacement des infusions de la molécule dans le cerveau et de mesurer le degré d’inhibition de l’expression du gène Sez6. Ceci nécessite une fixation du tissu cérébral par perfusion intracardiaque d’un agent fixant (formaldéhyde) de tous les animaux. Cette procédure est réalisée sous analgésie (carprofène, 15 min avant) et anesthésie profonde (mélange de kétamine et de xylazine) afin de supprimer ou de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux.
Remplacement
Des études précédentes ont démontré que miR-3594-5p se fixait sur l’ARNm de Sez6 dans un modèle de culture cellulaire (modèle in vitro). Malheureusement ce modèle ne permet pas de déterminer le rôle fonctionnel et physiologique de cette interaction dans le striatum de rat. Seul le modèle in vivo (rat de laboratoire, Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles) peut nous permettre d’évaluer si miR-3594-5p inhibe bien l’expression du gène Sez6 dans les conditions biologiques et intégrées du striatum. Il est encore impossible in vitro de reproduire la complexité d’un milieu biologique intégré tel que le cerveau. Ce recours à l’animal se justifie car l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme est impossible, rendant inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce. De plus, le phénomène que nous étudions ne peut être récapitulé sur des modèles mathématiques valides et réalistes.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Un effectif final de 14 rats par groupes est un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet scientifique proposé. Nous devons en effet avoir un nombre suffisant d’animaux en fin d’expérience pour détecter des différences significatives entre nos trois groupes expérimentaux à l’aide des tests statistiques appropriés. Le pourcentage d’attrition moyen est estimé à 10 pour cent en fin d’expérience (injection de la molécule mal placée 5 pour cent ; dégradation de santé 5 pour cent), l’effectif initial par groupe devra donc être de 16 rats. Le plan expérimental complet impliquera donc un lot de 48 rats pour le test de 3 conditions différentes (injection de la molécule, injection du contrôle négatif, injection du contrôle positif).
Raffinement
Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages afin d’éviter le stress de l’isolement social. De plus, ces cages sont enrichies grâce à des tunnels de jeu et des os à ronger afin de limiter l’ennui et le manque de stimulation. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie (carprofène, 15min avant le début de la chirurgie) et anesthésie gazeuse (isoflurane), sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 45 min et 1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection sous-cutanée de sérum physiologique, pour favoriser la réhydratation. Il est ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil (c'est à dire remise sur pattes et locomotion) avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal est relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère pendant les 24 heures restantes avant la fin de la procédure expérimentale. Pendant toute la procédure expérimentale, les animaux sont sous surveillance afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Lorsque le point limite est franchi, l’animal est mis à mort dans les plus brefs délais. Nous mettrons à mort l'animal par asphyxie au CO2. Pour s’assurer d’une mort effective, chaque animal restera sous surveillance pendant 1 heure après l'arrêt cardiaque. Les manifestations éventuelles d'inconfort, de stress ou de douleur sont donc suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes, pesée régulière (3 fois par semaine avant la chirurgie)) et évaluées selon une grille d’évaluation des points limites. Si une perte de poids corporel supérieure à 20 pour cent est observée en 48 heures, l'animal sera alors mis à mort, sachant que dans tous les cas, il y a aussi d’autres points limites qui sont atteints. Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis. En effet, cette espèce est suffisamment proche de l’homme (même classe d’animaux vertébrés des Mammifères) pour servir de modèle animal valide des phénomènes de régulation des gènes par les microARNs par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple les invertébrés). En même temps, elle est suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (comme les primates non-humains). Des espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes de régulation génétiques par les microARNs mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.
Etude de pharmacocinétique d’une molécule administrée chez le rat ou la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
Rats : 3300
7 500 souris et 3 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une molécule par diverses voies, avec prélèvements répétés de sang, d'urines et de fèces, une partie des rats subissant la pose d'un cathéter sur le canal biliaire et un séjour en cage métabolique, avant des prélèvements terminaux d'organes. Le projet mesure le comportement pharmacocinétique de composés candidats. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro fiable et que le recours aux animaux est "indispensable".
Objectifs
Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Ils vont permettre de décrire les différentes phases que va subir le composé quand il entre dans l’organisme du rongeur par différentes voies. Le rongeur a été choisi dans ce projet car c’est un modèle de choix du fait de la bonne disponibilité de la littérature, d’études rétrospectives en pharmacocinétique, de sa facilité d’utilisation et de son anatomie et sa physiologie bien connues.
Bénéfices attendus
La connaissance des propriétés pharmacocinétique d’un produit chez l’animal avant le design des études de pharmacologie permet d’utiliser le meilleur traitement (dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. A terme, les résultats précliniques de ce projet permettront de mieux comprendre la pharmacocinétique de nos composés afin de de développer en clinique des composés prometteurs ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.
Procédures
Procédure 1 : Etude de pharmacocinétique d'une durée de 24 heures pour un composé pharmaceutique administré chez le rat ou la souris avec prélèvements de sang, urines, fèces et tissus. Un maximum de 4 prélèvements de sang pour la souris et de 7 prélèvements pour le rat seront effectués sur ces 24h. Procédure 2 : Etude d’excrétion d’une molécule administrée chez le rat avec prélèvement de la bile via un cathéter au niveau du canal cholédoque, urines, fèces. Les sécrétions biliaires et urinaires seront collectées en continu sur une période de 24 heures en cage métabolique apre sune période d'acclimation de 15 heures. la procédure en elle même dure 39 heures.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux recevront des molécules issues de notre recherche. Les nuisances attendues : stress en cage métabolique ou suite de chirugie pour pose de pompe osmotique en s.c.. : mis en place d'un suivi analgésique et d'une observation réguliere des animaux.
Devenir
Tous les animaux des ces procédures seront mis à mort à la fin de l'étude afin de permettre la réalisation de prélévements terminaux (sang et organes).
Remplacement
Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé.
Réduction
Dans un but de diminution du nombre d’animaux et d’augmentation de l’information, le nombre d’animaux de l’étude est basé sur notre expérience. Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux qui permet d’obtenir des résultats avec une variabilité acceptable. Ainsi en screening, 2 animaux sont utilisés pour la voie intra veineuse et 3 animaux pour la voie orale pour décrire la pharmacocinétique des produits sur 24h. L’étude pharmacocinétique est réalisée par prélèvements multiples.
Raffinement
Animaux qui entrent dans l’étude : suivi régulier du comportement. Nous utilisons les Guides d'évaluation du Bien-Etre pour évaluer l'inconfort ou la souffrance de nos animaux. Nous avons défini des critères d'alarme et d'interruption adaptés à la procédure. Le nombre de groupes dans chaque expérience est optimisé en fonction des temps de prélèvements nécessaires, notamment de la durée de l’étude. Pour obtenir plus d’informations les échantillons utilisés pour le dosage du produit administré peuvent aussi être utilisés pour la bioanalyse des métabolites.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Nos modèles ont été sélectionnés et seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur, afin de limiter l’utilisation de gros animaux pour les études précoces de recherche. Le rat et la souris sont choisis pour ces études parce que ces espèces sont aussi très représentées dans les modèles pharmacologiques et dans les études de toxicologie. L’étude des corrélations entre les données vitro et les données vivo obtenues chez le rat et la souris permettent de mieux définir la prédiction de la pharmacocinétique chez l’homme avant les premières études cliniques. Les rats et les souris utilisés dans ce projet seront des adultes afin que leur métabolisme soit mature (pas de forme pédiatrique dans nos aires thérapeutiques)
Développement de nouveaux radiotraceurs de la neuroinflammation par imagerie en tomographie par émission de positons chez le rat
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Équipés sous anesthésie de cathéters veineux et artériels, des rats reçoivent des radiotraceurs, des médicaments ou des inhibiteurs d'enzymes et passent des séances d'imagerie TEP d'une heure, avant d'être tués par exsanguination sous anesthésie profonde pour l'analyse de leur cerveau. 900 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue de chaque procédure, et certains reçoivent leurs injections éveillés, immobilisés quelques minutes dans un tube de contention. Une partie d'entre eux sont des rats transgéniques suivis à différents stades d'une maladie d'Alzheimer, ou des rats injectés d'un vecteur viral, sur lesquels l'équipe veut valider de nouveaux traceurs de la neuroinflammation. Le porteur indique que les rats auront "entre 4 semaines et 6 mois", puis que les rats transgéniques et leurs témoins seront utilisés "à l'âge de 6, 12 et 18 mois".
Objectifs
La tomographie par émission de positons (TEP) est une technique d’imagerie médicale non invasive utilisée à l’hôpital pour le diagnostic qui utilise essentiellement le fluorodésoxyglucose marqué au fluor-18. Le développement de nouveaux radiotraceurs plus spécifiques donne accès à une imagerie moléculaire de hautes sensibilité et spécificité pour le diagnostic et la thérapie et pour une meilleure compréhension des maladies, notamment celles du système nerveux central. L’objectif de ce projet est de caractériser et de valider chez le rongeur de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie TEP en évaluant leur interaction avec des cibles impliquées dans différentes maladies neurodégénératives associées à la neuroinflammation Trois types de caractérisations seront effectuées au cours du projet : - les caractérisations pharmacologiques in vitro aident au choix du radiotraceur et permettent d’optimiser sa structure chimique ; - les caractérisations ex vivo permettent d’étudier la biodistribution tissulaire du radiotraceur et ses métabolites. Lors de cette étape, nous développerons de nouvelles méthodes analytiques originales pour localiser et quantifier les nouveaux radiotraceurs et leurs principaux métabolites dans le cerveau, en amont des étapes de radiomarquage pour maximiser le transfert en clinique et diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Cette première étape de validation nécessitant des animaux est limitante et cruciale dans la sélection des meilleurs candidats ; - l’évaluation préclinique in vivo nécessite ensuite l’administration du radiotraceur chez l’animal afin d’étudier son métabolisme et sa pharmacocinétique plasmatique ainsi que sa spécificité et sélectivité pour la cible d’intérêt par imagerie TEP et de déterminer les paramètres pharmacocinétiques caractéristiques de cette interaction. Cette étape in vivo est indispensable et nous permet d’obtenir les données nécessaires pour l’utilisation ultérieure du radiotraceur chez l’homme (transversalité).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie de la neuroinflammation associée à différentes maladies neurodégénératives à travers des cibles cérébrales impliqués dans le métabolisme des stéroïdes du cerveau comme le cholestérol. En effet, la modification de ces cibles pharmacologiques a été associée à des pathologies comme les maladies d’Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, la sclérose en plaques ou encore l’épilepsie. A court terme, la sélection et la validation de nouveaux radiotraceurs évalués en préclinique (sur les animaux) permettront de tester des molécules plus spécifiques chez l’homme dans des protocoles de recherche. A long terme, le développement et l’utilisation en routine clinique de traceursspécifiques de la neuroinflammation pourraient permettre le diagnostic, le suivi et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques dans des maladies neurodégénératives pour lesquelles il n’existe que très peu ou pas de traitement efficace, en particulier dans la maladie d’Alzheimer. Ces marqueurs permettront également d’optimiser les traitements en matière de dose et de limitation des effets toxiques potentiels. Cela implique l’étude et la compréhension de l’action des traitements et de leur devenir dans l’organisme.
Procédures
Dans ce projet, les interventions sur les animaux seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane afin de limiter au maximum douleur, souffrance et angoisse. Elles comprennent la pose de cathéters veineux/artériels (environ 15 min) pour les prélèvements sanguins, les injections de produits (durée
Impact sur les animaux
Les radiotraceurs développés dans ce projet seront administrés à doses extrêmement faibles, ce qui limite voire élimine tout risque de toxicité. Concernant les autres molécules utilisée, les doses chez l’animal sont généralement connues dans la littérature, notamment chez les rongeurs, en terme d’efficacité et d’effet secondaires. Ainsi aux doses prévues dans cette étude, aucune toxicité n’est attendue. Cependant, des effets indésirables ou nuisances possibles comme du stress, changement de comportement, douleur éventuelle peuvent provenir des manipulations (en particulier lors de l’injection d’une durée maximale de 5 min ou lors de la phase de réveil d’une durée maximale de 60 min avant l’euthanasie) oudes pathologies induites (animaux AD en particulier).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter le cerveau (et autres organes) pour des analyses ex vivo (radio-HPLC, spectrométrie de masse, immunohistochimie, autoradiographie…).
Remplacement
Nous mettons en œuvre de nombreuses approches in vitro pour les premières caractérisations des radiotraceurs et la sélection des meilleurs candidats. Ces expériences sur membranes, homogénats tissulaires, cellules, protéines recombinantes nous permettent d’estimer leur affinité et leur sélectivité pour une cible d’intérêt et de détecter leurs principaux métabolites et les enzymes responsables de ces biotransformations. Cette étape nous permet aussi de modifier éventuellement la structure des composés pour les rendre plus stables in vivo en diminuant le niveau de métabolisme. En parallèle, des études in silico peuvent également être mises en œuvre pour sélectionner les composés les plus enclins à interagir avec une cible d’intérêt (récepteur/enzyme). Cependant l’étude in vivo sur les rongeurs s’avère indispensable par la suite car les approches in vitro ne sont pas suffisamment quantitativement prédictives de l’affinité/spécificité in vivo et du taux de métabolisme in vivo. L’extrapolation in vitro-in vivo nécessite la mise en place de modèles mathématiques complexes qui ne sont pas adaptés à tous les paramètres pharmacologiques. Par ailleurs, les paramètres d’absorption, de distribution et de pharmacocinétique du radiotraceur dans le sang et les organes doivent être mesurés dans l’organisme de l’animal. Cette étape préclinique est essentielle à l’évaluation du meilleur candidat pour un passage chez l’homme (transversalité).
Réduction
Dans cette étude, le nombre d’animaux prévu a été déterminé d’après des études antérieures réalisées au laboratoire et des articles bibliographiques. Pour les études de biodistribution et de métabolisme, des groupes de 120 animaux ont été prévus, correspondant à l’analyse de 3 animaux/temps (nombre minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs,). Pour les études d’imagerie, les groupes de 6 animaux permettent d’obtenir des résultats significatifs compte tenu des variations interindividuelles observées chez le rat. L’ensemble des études in vitro permettant de caractériser pharmacologiquement les radiotraceurs et de ne sélectionner que quelques candidats présentant des propriétés adéquates pour l’imagerie nous permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux. Parmi ces propriétés, nous vérifierons par des méthodes alternatives que la molécule peut entrer dans le cerveau, présente une haute affinité et sélectivité pour sa cible, peut être radiomarquée avec des isotopes compatibles avec l’imagerie et que son métabolisme n’est pas incompatible avec son développement. Nous développerons par ailleurs des méthodes analytiques de quantification des radiotraceurs et de leurs métabolites, les plus sensibles possibles pour utiliser des volumes de sang ou de tissus les plus faibles possibles et réduire ainsi le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés aux conditions d’hébergement pendant au moins 7 jours avant le début des expérimentations et seront entraînés à la manipulation avant le début du protocole ce qui permet de diminuer l’état de stress et d’améliorer leur bien-être. Ils seront hébergés par paire dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Lors de toutes les expériences in vivo et/ou ex vivo, biodistribution, métabolisme et imagerie, les animaux seront anesthésiés. Dans certains cas particuliers, afin d’éviter toute influence de l’anesthésique sur le métabolisme d’un radiotraceur ou une pollution du signal par l’anesthésique, les injections pourront être réalisées sur animaux vigiles placés dans un tube de contention. Dans ce cas, les animaux seront entraînés à la manipulation de manière à limiter la douleur et le stress le jour de l’expérimentation. Les animaux seront étroitement suivis tout au long de l’étude par du personnel expérimenté, permettant l’application des critères d’arrêt en amont afin d’empêcher toute souffrance animale. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.
Choix des espèces
Les rongeurs et en particulier le rat font partie des modèles animaux les plus décrits dans la littérature pour les études de biodistribution, de métabolisme et d’imagerie cérébrale. Il existe par ailleurs de nombreux modèles de maladies neurodégénératives décrits chez le rat (Alzheimer, Sclérose en plaques, Huntington, …) qui nous permettent de tester les meilleurs candidats sélectionnés sur des animaux pathologiques/génétiquement modifiés et d’étudier les modifications de leur interaction avec la cible d’intérêt. Les animaux utilisés dans ce projet auront entre 4 semaines et 6 mois selon les modèles de rats (sains ou pathologiques) et les procédures. Pour les études de métabolisme, des rats jeunes seront utilisés (environ 40 jours). En effet, une diminution du métabolisme avec l’âge a été observée et décrite dans la littérature. Pour les études d’imagerie, le cerveau doit être assez développé. Les rats transgéniques et contrôles seront utilisés à l’âge de 6, 12 et 18 mois afin d’investiguer la capacité des traceurs à détecter leur cible à un stade précoce (6 mois), moyen (12 mois) ou tardif (18 mois) du développement de la maladie d’Alzheimer. Pour le modèle de rat injecté par un vecteur viral l’imagerie sera réalisée entre 5 et 10 semaines après l’injection du vecteur afin de vérifier l’absence de vecteur viral et l’expression du récepteur humain. L’injection du vecteur viral étant réalisée à l’âge de 8 semaines, les rats auront entre 13 et 18 semaines lors de l’examen d’imagerie.
Etude de l’évolution de la captation d’un abcès septique chez le rat dans le cadre d’un examen TEP au [18F]-FDG (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un abcès septique est provoqué sous leur peau, puis leur glycémie est mesurée avant l'injection d'un sucre radioactif et un examen d'imagerie TEP, pour évaluer l'intérêt de ce traceur dans le suivi de l'inflammation. Le porteur indique que l'abcès peut évoluer vers une nécrose profonde des tissus ou une septicémie, et que les rats sont ensuite tués pour analyse des tissus. Il affirme qu'une évaluation objective d'une lésion infectieuse ne peut se faire que sur un modèle animal, et retient le rat Wistar comme modèle de référence.
Objectifs
Evaluer l'intérêt du [18]F-FDG (faux sucre radioactif utilisé en routine clinique chez les patients) dans le diagnostic, et l’analyse du processus de formation et de développement de l'infection et de l'inflammation dans un modèle expérimental d’abcès sous-cutané chez le rat.
Bénéfices attendus
Faire un schéma de l’évolution de l’inflammation aigue, subaiguë à chronique afin de déterminer l’intervention des cellules immunitaires dans l’évolution de l’abcès.
Procédures
Induction d'abcès sous-cutané (20 rats, 30 min maximum), mesure de la glycémie des animaux (20 rats, 15 à 30 sec, avant d'injecter le produit radioactif, examen d'imagerie (20 rats, 30min,1h après injection du produit radioactif).
Impact sur les animaux
Risque d’évolution de l’abcès vers une nécrose profonde des tissus adjacents, ou risque de souffrance liée à une septicémie. Ces 2 risques seront particulièrement surveillés tout au long de l’étude pour chaque rat, et des points limite précoces seront définis
Devenir
les animaux seront mis à mort pour faire des analyses en autohistoradiographie et immunohistologie
Remplacement
l'évaluation objective d’une lésion infectieuse avec un examen d’imagerie ne peut être réalisée que sur un modèle animal permettant par la suite d’analyser le mécanisme physiologique global, à l’image des examens chez l’Homme ce qui permettra de mieux coller à la réalité lors d’administration de traitements thérapeutique.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux a été réalisé en amont en prenant en compte un paramètre essentiel de réponse à l’induction de l’abcès. En effet, l’abcès fistule très précocement à J3 (5%), à J4 (20%), ou tardivement à J10 (5%), et ce malgré une reproductibilité du geste expérimental par le même opérateur.
Raffinement
Les animaux seront transportés dans des cages de transport dédiées, avec une litière enrichie avec du papier absorbant autoclavé et avec des bouillotes chauffantes pour éviter l’hypothermie si besoin. Les abcès, les examens de tomographie par émission de Positrons (TEP) et les mises à mort seront induits sous anesthésie générale pour éviter un stress inutile à l’animal. Pour éviter toute souffrance de l'animal la taille maximale des abcès ne dépassera pas 800 mm^3 à J2, bien inférieure aux tailles limites de tumeurs chez le rat qui sont de 1000 mm^3. Après induction de l’abcès, les animaux seront examinés de façon très soutenue durant les 48h en surveillant leur état général, en mesurant (i) leur poids, (ii) leur température, (iii) l’état du gonflement de l’abcès, les animaux recevront également un antalgique (buprénorphine), tous les 6, 8h ou 12h (si nécessaire) durant 48h. De plus, cette surveillance se poursuivra quotidiennement durant toute la période du l’étude pour chaque animal.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus utilisés dans le cadre de pathologies inflammatoires sont des modèles murins (souris et rats). Pour nos expérimentations, nous utilisons comme modèle le rat « WISTAR ». Cette souche est très largement décrite dans la littérature et son utilisation reste la plus appropriée à ce type de recherche (modèle de référence). En outre, cette souche de rat a été largement utilisée au sein de notre plateforme et permet de confronter nos résultats à des analyses antérieures effectuées sur rats sains. Les rats seront âgés de 9 semaines lors de l’initiation du protocole. Ce stade correspond à un état adulte pour lequel le système immunitaire est bien établi. En outre, le poids intermédiaire des animaux permettra d’imager des organes intéressants comme la rate ou le rachis qui interviennent dans la réponse immunitaire.
Système Nerveux Central- Tests sur les maladies neurodégénératives
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 860
1 276 souris et rats vont être utilisés dans des procédures pouvant atteindre un niveau de souffrance sévère, la plupart tués à l'issue et 120 rats réutilisés pour d'autres études. Des substances neurotoxiques leur sont injectées ou données dans l'alimentation pour provoquer une mort neuronale et des symptômes de maladie de Parkinson, Huntington, Alzheimer, sclérose en plaques ou AVC, suivies de chirurgies dans le cerveau et de tests comportementaux moteurs et mnésiques. Le porteur indique que ces modèles provoquent tremblements, déficits moteurs et parfois agressivité, et teste des substances censées améliorer les symptômes. Il reconnaît l'existence de cultures de neurones et de tranches cérébrales, mais conclut à la nécessité de modèles animaux plus complexes.
Objectifs
Le projet consiste à décrire les tests réalisés pour induire des effets neurotoxiques conduisant à la mort neuronale et à des symptômes moteurs ou non-moteurs chez l'animal
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurologiques. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer ou la sclérose en plaques. Des médicaments permettent de limiter les symptômes moteurs (L-Dopa) dans le cas de la maladie de Parkinson ou les troubles de la mémoire (Donepezil) dans le cas de la maladie d'Alzheimer. Les corticoïdes sont utilisés en première intention pour diminuer les poussées observées chez les patients atteints de sclérose en plaque. Les immuno-modulateurs et/ou immuno-suppresseurs permettent de limiter la fréquence des poussées. Pour les accidents vasculaires cérébraux, le caillot formé au niveau de l'artère cérébrale peut être dissout par l'administration d'Altéplase dans les premières heures suivant l'apparition des symptômes. Néanmoins, il n'existe pas de traitements neuroprotecteurs ou régénérateurs suite à un AVC. Les substances tests qui seront administrées dans le cadre de chacune de ces procédures seront étudiées soit pour leur capacité à améliorer les symptômes dans ces modèles, soit pour leur capacité à traiter la maladie.
Procédures
Les modèles de maladie de Parkinson et de Huntington sont induits par l’administration unique ou sur 5 jours (intrapéritonéale) d’une substance réactive ; chaque administration dure environ 1 à 2 secondes. Des tests comportementaux moteurs (durée max =60 minutes et entre 1 et 3 tests sur 1 à 5 jours) peuvent être réalisés avant euthanasie des animaux et prélèvement d'organes. Pour mimer la sclérose en plaque, les animaux sont nourris avec des aliments contenants la substance réactive sur une durée de 5 semaines. Des tests comportementaux moteurs peuvent être réalisés pendant ces 5 semaines (maximum de 3 tests sur 1 heure, 1 fois par semaine). A la fin des expériences, des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Certains modèles Parkinsoniens, des modèles de mort cellulaire ou d'accident vasculaire nécessitent une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Cette intervention dure entre 30 et 60 minutes. Les animaux sont ensuite évalués dans différents tests moteurs (durée maximum = 3 heures par jour, 1 à 2 séries de tests par semaine sur 4 à 5 semaines) ou non-moteurs (tests mnésiques réalisés quotidiennement pendant environ 1 h sur 4 à 5 semaines). Des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Pour chaque modèle, les animaux recevront une substance test de manière aigue ou de manière chronique au cours de l’expérience. Classiquement, les administrations par bolus durent de l’ordre de la seconde, mais des administrations par infusion peuvent durer jusqu’à plusieurs heures (1 à 2 heures) et seront dans ce cas réalisées via un cathéter implanté sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude (1 à 2 prélèvements avec au minimum une semaine d'intervalle, chaque prélèvement dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les modèles utilisés pour mimer certains aspects de la maladie de Parkinson peuvent induire des tremblements au niveau de la mâchoire ou des déficits moteurs légers à modérés. Les tremblements peuvent être également observés au niveau des membres inférieurs ou supérieurs de manière temporaire. Pour le modèle de sclérose en plaque, les déficits moteurs sont relativement légers. Dans les modèles de la maladie d'Alzheimer, les déficits attendus sont plutôt d’ordre mnésique. Dans certains modèles, les animaux peuvent être plus agressifs (ce comportement diminue dans le temps, environ 3 semaines après lésion). Le modèle d'accident vasculaire entraîne des déficits moteurs clairs (difficulté à marcher, à coordonner les mouvements). Pour tous ces modèles sur animal vivant, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées.
Devenir
Les rats ayant subi une procédure légère peuvent être réutilisés pour une nouvelle procédure. Une partie des rats ayant subi une procédure modérée peuvent être ré-utilisés pour une seconde étude (cas d'animaux lésés à la 6-OHDA par exemple). Pour les autres modèles, les animaux seront euthanasiés à la fin des expériences.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontré sur des modèles plus complexes (modèles animaux), permettant l'évaluation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux, par exemple.
Réduction
Dans ce projet, des modèles cellulaires sont utilisés pour pouvoir séléctionner les meilleurs candidats médicaments et pouvoir limiter les nombre d'animaux à tester sur des modèles plus complexes. Dans le cas des études chez l'animal vivant, les substances à tester ont déjà subi une phase de sélection afin de réduire le nombre d'animaux vivants testés.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Les rongeurs sont administrés avec une substance anti-inflammatoire le jour de la chirurgie et pendant 48 heures pour toutes les procédures incluant une chirurgie, à l'exception du modèle d'ischémie cérébrale. Une substance analgésique locale est également appliquée sur le crâne de l'animal pour limiter la douleur. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de l'oeil. Lors de la chirurgie, la surface du cerveau peut être endommagée lorsque le crâne est percé et induire une hémorragie. Si l'hémorragie ne cesse pas après l'application de tampons absorbants, l'animal sera euthanasié. Les animaux vont être pesés suite à la chirurgie pour évaluer leur récupération. Un rongeur montrant une perte de poids supérieure à 15%, le poil hérissé ou encore le manque de toilettage sera euthanasié. La chirurgie peut entrainer le gonflement de l'abdomen, lié à un ralentissement du transit intestinal/constipation. De l'huile naturelle (huile de maïs par exemple) peut être administrée pendant plusieurs jours, une à 2 fois par jour, pour limiter la douleur chez l'animal et éviter l'occlusion intestinale. Dans la plupart des modèles de neurodégénerescence, l'évaluation comportementale peut être complétée par des marquages histologique au niveau cérébral afin de raffiner le modèle. L'apparition d'effets secondaires liés à l'administration d'une substance d'essai peut être constaté ou potentialisé suite à l'administration de la substance réactive (exemple de crise épileptique spontanée induite par une substance). Les animaux seront immédiatement anesthésiés/euthanasiés pour raisons éthiques suite à l'observation de ce type de symptômes. Dans certains cas de modèles Parkinsoniens, les mouvements involontaire au niveau de la gueule de l'animal peuvent conduire à des mordillements de la patte controlatérale à la lésion et à une plaie. Cette dernière sera désinfectée avec une solution antiseptique si besoin. Les animaux peuvent perdre du poids pendant la période d'intoxication d'une substance réactive. Si la perte de poids est trop importante (supérieure à 15 %), l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Des tests de neurotoxicité ont été développés chez le rongeur et sont largement décrits dans la littérature comme méthodes prédictives pour évaluer l'efficacité de nouvelles substances pharmacologiques. Ces tests pharmacologiques sur rongeurs sont réalisés en amont des essais cliniques afin de sélectionner les candidats médicaments les plus efficaces et donc les plus prometteurs pour lutter contre les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période post-sevrage jusqu'à l'âge adulte.
Intérêt d’une thérapie matricielle pour contrer les dommages cérébraux et les déficits cognitifs induits par la radiothérapie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
220 rats sains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Leur cerveau entier est irradié, puis pendant six mois ils reçoivent chaque semaine une injection intraveineuse d'une molécule dite RGTA, avec quatre IRM et quatre batteries de tests comportementaux mesurant la fatigue, la locomotion, l'anxiété et la mémoire. Le porteur indique que l'irradiation provoque fatigue, perte de poids, sécrétions oculaires et érythèmes, qu'il présente comme transitoires. Il affirme qu'il est 'indispensable' de recourir à l'animal pour analyser ces phénomènes, en vue d'un éventuel passage chez l'humain.
Objectifs
Bien que la radiothérapie soit un traitement de référence pour traiter les tumeurs cérébrales, celle-ci peut induire des déficits cognitifs sévères qui altèrent grandement la qualité de vie des patients. L'irradiation cérébrale permet de contrôler la tumeur mais conduit également à des lésions du tissu cérébral sain qui aboutissent à un déclin cognitif, notamment des atteintes mnésiques. Actuellement,, il n’existe aucune prise en charge thérapeutique pour prévenir et/ou réparer les lésions cérébrales induites par la radiothérapie. Ainsi, ce projet vise à évaluer dans un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat adulte, l’intérêt d’une thérapie matricielle utilisant une molécule dénommée RGTA® (ReGeneraTing Agent). Les effets neuroprotecteurs et pro-cognitifs de cette molécule ont déjà été montrés dans différents modèles animaux de pathologies cérébrales. L’objectif de ce projet est double : 1/ mieux comprendre les mécanismes-clés des déficits cognitifs induits par la radiothérapie cérébrale et 2/ les limiter par une nouvelle thérapie matricielle. L’intérêt de la thérapie RGTA® pour contrer les lésions cérébrales et les déficits cognitifs induits par la RT cérébrale sera évalué dans un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat sain (non porteur de tumeurs cérébrales). Ce modèle animal a été développé au laboratoire et est bien caractérisé que ce soit en termes de décours temporel des altérations comportementales (fatigue/locomotion/cognition) ou des atteintes du tissu cérébral.
Bénéfices attendus
Cette étude préclinique doit permettre de 1/ de mieux comprendre les mécanismes responsables des troubles cognitifs observés après l'irradiation cérébrale et 2/ d’apporter des preuves expérimentales robustes pour évaluer l'intérêt du RGTA® en tant qu'agent neuroprotecteur, régénérateur et pro-cognitif dans le contexte des lésions cérébrales induites par la RT. A la fin du projet, les résultats seront accessibles sous la forme d’articles scientifiques. De plus, des biobanques de tissus cérébraux et de sang seront établies lors de ce projet et seront mises à disposition de la communauté scientifique. A long terme, une transposition à la clinique pourrait être envisagée pour atténuer le déclin cognitif des patients traités par RT et améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes procédures comme une irradiation de l’ensemble du cerveau qui durera 10 minutes. Les rats seront ensuite traités chaque semaine, pendant une durée de 6 mois, par la thérapie matricielle ou par son excipent (sérum physiologique), administrés par voie intraveineuse et durera au maximum 5 minutes par animal. Pour évaluer les effets du traitement, des IRM cérébrales d'une durée maximale de 45 minutes par animal seront réalisées et répétées 4 fois pendant l'étude. L'ensemble des animaux réaliseront également plusieurs tests comportementaux pour évaluer la fatigue, l'activité locomotrice, l'anxiété, la mémoire à court-terme et la mémoire à long-terme. Chaque animal réalisera 4 fois cette batterie de tests comportementaux (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois après irradiation cérébrale). L’ensemble des tests comportementaux seront échelonnés sur 2 semaines avec 1 seul test par jour et la durée de chaque test comportemental sera comprise entre 10 et 20 minutes.
Impact sur les animaux
A la suite de l'irradiation cérébrale, les animaux seront fatigués, présenteront une perte de poids et pourront présenter des signes de dégradation de leur état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, érythèmes cutanés sur la tête). Il est important de noter que ces effets indésirables sont transitoires et réversibles. De plus, l’ensemble de ces effets indésirables sont également retrouvés chez les patients traités par radiothérapie et le but de ce projet est d'évaluer l'intérêt du traitement RGTA® pour atténuer et réduire ces effets secondaires.
Devenir
A la fin de l'étude (6 mois après irradiation cérébrale), les animaux des différentes procédures seront mis à mort afin de mener des études post mortem sur le sang et le tissu cérébral.
Remplacement
Bien que des alternatives non-animales seront utilisées dans ce projet, il est indispensable d’avoir recours à l’expérimentation sur des animaux pour permettre une analyse intégrée des phénomènes complexes induits par l’irradiation cérébrale et d’évaluer l’intérêt de la thérapie matricielle utilisée dans ce projet. Ce projet permettra d'obtenir des preuves expérimentales suffisamment robustes pour in fine tester ce traitement chez l’Homme.
Réduction
Grâce à l'utilisation au préalable de tests statistiques appropriés et à l'utilisation de techniques d'investigation non invasives (imagerie IRM et tests comportementaux), le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une puissance des résultats sera réduit au minimum. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est estimé à 220 rats répartis en 4 groupes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en animalerie conventionnelle aux normes requises. Le personnel participant au projet est formé aux procédures en expérimentation animale. Des inspections du bien-être des animaux seront réalisées quotidiennement. De plus, toutes les mesures visant à réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux seront entreprises, notamment en appliquant une anesthésie et une analgésie appropriées. Concernant les effets indésirables liés à l’irradiation cérébrale qui peuvent affecter de façon transitoire l’état général des animaux, des mesures sont déjà mises en place dans l’équipe et connues par les personnes impliquées dans ce projet. De plus, une échelle d’évaluation de l’état général des animaux (score défini par plusieurs items visuels) a été mise en place dans l’équipe sur ce modèle animal pour surveiller finement l’état général des animaux. Enfin, des points limites spécifiques et de critères d'arrêt de souffrance seront utilisés afin de réduire toute souffrance ou douleur chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat possède un cerveau dont la taille est supérieure à la souris et qui est compatible avec les appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée ainsi qu’une imagerie IRM de haute résolution. D’autre part, plusieurs tests comportementaux visant à évaluer les déficits moteurs et cognitifs sont bien décrits chez le rat. Enfin, le modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat utilisé dans ce projet a été developpé par le laboratoire de recherche qui l'a d'ailleurs déjà très bien caractérisé en termes de dommages cérébraux et de modifications comportementales jusqu’à 6 mois après irradiation encéphalique. Ainsi, le laboratoire de recherche maîtise très bien ce modèle animal que ce soit dans le décours temporel de sa physiopathologie mais aussi en termes de prise en charge du bien-être animal. Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 5 mois (poids d’environ 350 g) lors de leur arrivée à l’animalerie. L’irradiation cérébrale sera réalisée sur des animaux âgés de 6 mois mais les rats arriveront à l’animalerie 1 mois avant afin de les acclimater dans leur nouvel environnement, de les habituer aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux. L’âge de 6 mois a été retenu puisqu’il correspond à l’âge adulte mature chez le rat et est équivalent à l’âge de 18 ans chez l’Homme. A ce stade de développement chez le rat, la substance blanche est complètement mature, ce qui représente un critère très important pour modéliser les atteintes cérébrales observées chez le patient adulte traité par radiothérapie.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements dans des modèles de dégénérescence de la rétine chez la souris ou le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 396
1 452 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection d'iodate de sodium détruit leur rétine pour reproduire une dégénérescence comme la DMLA, puis des molécules candidates leur sont administrées par diverses voies, avec des tests comportementaux mesurant la baisse d'acuité visuelle, avant prélèvement des yeux. Le porteur mène ce criblage pour développer des médicaments et renvoie l'usage chez l'humain à une éventualité. Il qualifie le recours à l'animal de 'stricte nécessité' et d''indispensable', affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit un 'organisme entier'.
Objectifs
Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie in vitro et/ou in vivo, de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de maladies ophtalmologiques avec la mise en place d’un modèle animal de dégénérescence de la rétine chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la baisse d’acuité visuelle et la dégénérescence rétinienne.
Bénéfices attendus
Ce projet se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de molécules thérapeutiques pouvant avoir un effet sur la dégénérescence de la rétine comme observée dans la DMLA ou la maladie de Stargardt. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de nouvelles molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.
Procédures
tous les animaux subiront une injection systémique de sodium iodate (sauf le groupe 1, sérum physiologique) pour induire la pathologie. l'injection sera unique et se fera par voie intra-péritonéale sur animal vigile. les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 1 mois après l'induction du modèle). selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale ou par voie topique, sur animal vigile. tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Des tests comportementaux pour mesurer l’acuité visuelle seront également réalisés : une fois avant le début des traitements mais après l’injection de sodium iodate afin de confirmer l’induction du modèle et/ou de procéder à l’allocation des groupes (durant la 1ère semaine), puis jusqu’à 1 fois par semaine pendant 4 semaines après l’injection de sodium iodate soit 4 fois maximum pour la durée d’une étude (voir figure en annexe). Le premier type de test dure 5 minutes maximum et chaque animal est testé jusqu’à 10 fois avec un intervalle de 5-10 minutes entre chaque test. Le deuxième type de test dure environ 5 secondes et le test est répété trois fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque répétition.
Impact sur les animaux
Du fait de l'induction du modèle, les animaux vont avoir une diminution de l'acuité visuelle (visible par les tests comportementaux mis en place) qui est liée à une dégénérescence de la rétine sans autre effet indésirable attendu aux doses administrées. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) ni aux tests comportementaux (procédure légère pour tester l’acuité visuelle).
Devenir
euthanasie pour récupérer différents organes, dont les yeux, pour analyses histologiques ou autre
Remplacement
Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ces modèles in vivo permettent de mesurer l’acuité visuelle en reproduisant la physiologie d’un organisme entier. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 6 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (kruskal-wallis test).
Raffinement
Les animaux seront sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement: les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Si les signes persistent au bout de 24h, l’animal sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié.
Choix des espèces
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir en ophtalmologie implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers notre modèle reproduisent au mieux la pathophysiologie de la dégénérescence de la rétine humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’acuité visuelle ou l’histologie de l’oeil, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.
Etude des mécanismes cellulaires de l’impulsivité
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis à une restriction alimentaire pendant une évaluation comportementale de l'impulsivité de trois mois, à une neurochirurgie, puis à des injections quotidiennes d'un traitement dopaminergique pendant vingt jours qui provoque une forte impulsivité, avant leur mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur justifie la mise à mort par le 'besoin' d'obtenir les tissus cérébraux, et rattache l'impulsivité à la vulnérabilité aux addictions. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne permet d'évaluer un comportement impulsif.
Objectifs
La perte de contrôle sur les comportements motivés qui se reflètent au travers d'une forte impulsivité, est à la base de la vulnérabilité à developper des addictions, qu'elles soient liées aux drogues ou à des comportements (jeu pathologique, boulimie, ...). Il n'existe pas à ce jour de traitements réellement spécifiques et efficaces contre ces troubles, et ce notamment car les mécanismes cérébraux qui sous-tendent ces comportements pathologiques sont encore peu connus. L'objectif de ce projet est donc d'identifier certains des mécanismes neuronaux qui conduisent au développement d'une forte impulsivité.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes neuronaux qui sous-tendent les comportements impulsifs est une première étape essentielle pour pouvoir ensuire développer des stratégies thérapeutiques pertinentes et efficaces contre les troubles psychiatriques associés, comme les addictions.
Procédures
Les animaux seront soumis à quatre types d'interventions différentes : une évaluation comportementale de l'impulsivité (3 mois), une procédure de neurochirurgie (une heure maximum par animal), une procédure d'injection intrapéritonéale d'un traitement dopaminergique (une fois par jour pendant 20 jours) et mise à mort par dose létale d’anesthésique pour perfusion intracardiaque et prélèvement de tissus cérébraux afin d'étudier les mécanismes neuronaux pouvant expliquer les comportements observés (injection intrapéritonéale de pentobarbital après anesthésie à l'isoflurane, durée de la procédure : 5 minutes pour l'anesthésie profonde).
Impact sur les animaux
Nous attendons des nuisances d'ordre modérée dûes à la restriction alimentaire contrôlée, nécessaire à la réalisation de la tâche comportementale, et à la procédure chirurgicale. Le traitement pharmacologique induit une forte impulsivité, mais nous n'attendons pas de part nos connaissances du produit, à des effets physiologiques indésirables, à la dose modérée utilisée et largement documentée.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux afin de mieux comprendre les mécanismes de ces comportements et du traitement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation d'un comportement impulsif.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une d'approche statistique.
Raffinement
Pour la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et analgésiés. Un anesthésique local sera également injecté au niveau du site opératoire en sous-cutanée, afin de prévenir le développement d'une potentielle douleur. Si nécessaire les heures ou jours suivant la chirurgie, un analgésique ou antalgique pourra être administré. En cas de signe d'alerte, l'alimentation sera supplémentée par une solution de Blédine, ainsi qu'une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l'animalerie. Des injections d'eau glucosée pourront également être réalisées. Afin de réduire les potentielles gênes induites par les injections répétées des aiguilles très fines seront utilisées. Les animaux seront habitués en amont à l'experimentateur ainsi qu'à la manipulation, et les aiguilles seront changées entre chaque injection, ainsi que le site d'injection chaque jour. Les animaux seront également stabulés selon la procédure mise en place par l'animalerie, afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Nous serons cependant obligés de les isolés par rapport à la procédure comportementale. Cependant, l'isolement sera limité par le fait que nous utilisons des cages avec grilles en portoir ouvert, proches les unes des autres. Ainsi, un certain nombre d'interactions sociales persistent, notamment par l'olfaction (essentielles) et l'audition.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des structures que nous allons étudier. De plus, le rat est couramment utilisé pour les études sur les comportements impulsifs. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes, ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois. Nous travaillerons également à la fois sur les mâles et les femelles pour prendre un compte un effet potentiel du sexe.
Induction de la satiété par électrostimulation du système sympathique chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
511 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue. Une partie est opérée puis tuée sans réveil, l'autre subit une chirurgie de moins d'une heure trente puis dix-huit séances d'une heure de mesure de la prise alimentaire après un jeûne nocturne, dont neuf avec électrostimulation de nerfs, dans des procédures pouvant atteindre un niveau de souffrance sévère. Le projet vise à mettre au point un dispositif implantable contre l'obésité. Le porteur indique que la chirurgie provoque probablement douleur et perte de poids pendant deux à trois jours et que les impulsions électriques peuvent causer un inconfort, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut remplacer l'animal, l'obésité devant être étudiée sur un 'organisme vivant'.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de développer un traitement par implantation d'un dispositif médical contre l’obésité qui consiste à électrostimuler des nerfs. Il a été démontré que les signaux acheminés par le système nerveux jouent un rôle important dans la prise alimentaire. Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité. En effet, les traitements les plus efficaces sont les approches chirurgicales lourdes comme la réduction de l’estomac, la technique du court-circuit des aliments (by-pass) ou encore la pose d’un anneau gastrique, visent à limiter le volume de l’estomac pour réduire les prises alimentaires. Cependant, ces traitements sont très invasifs et entraînent de nombreux effets indésirables (troubles digestifs, vomissement…) chez l’humain. Le développement d’un dispositif médical permettant par électrostimulation du système nerveux la régulation de la prise alimentaire pourrait être un outil très prometteur afin de lutter contre l’obésité. Pour cela nous allons tester l'électrostimulation de nerfs chez la rat en lien avec la satiété. Notre premier objectif sera donc de mettre en place le modèle expérimental sur animal anesthésié. Notre second objectif sera de déterminer les paramètres électriques les plus efficaces pour induire la satiété sur animal anesthésié. Et notre dernier objectif sera de tester ces paramètres sur un animal conscient et d'évaluer l'impact potentiel sur la prise alimentaire.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité. Les traitements les plus efficaces sont des traitements lourds (chirurgie bariatrique), engendrant de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements moins invasifs, plus efficaces et sans effet secondaire peuvent apporter des solutions plus satisfaisantes pour les patients souffrant d’obésité.
Procédures
Pour les procédures 1 et 2 : les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale (avec au préalable une mise à jeun). Les animaux ne seront pas réveillés et seront mis à mort à la fin de la procédure. Pour la procédure 3 : les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins d'une heure 30. Une semaine après la chirurgie, les animaux subiront 18 sessions d'une heure de quantification de prise alimentaire après un jeun nocture dont 9 avec électrostimulation des ganglions rachidiens et 9 sessions contrôles (sans électrostimulation). Chacunes des sessions sera séparée d'au moins un jour de récupération.
Impact sur les animaux
Deux des trois procédures de ce projet sont sans réveil, les nuisances seront donc inexistantes pour ces deux procédures sous réserve du respect des bonnes pratiques d'anesthésie. La dernière procédures sera réalisée sur des animaux ayant subi une chirurgie ce qui générera probablement une perte de poids et de la douleur pendant les 2 à 3 premiers jours chez les animaux suivant la chirurgie. Enfin, concernant cette troisième procédure, les impulsions électriques pourraient également induire un inconfort transitoire chez l'animal.
Devenir
Pour les procédures 1 et 2, il n’est pas envisagé de réveiller les animaux. Ils seront tous mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale pour des analyses histologique. Pour la procédure 3, tous les animaux seront également mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale pour une analyse anatomopathologique et histologique.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions posées dans ce projet. Le phénomène d’obésité ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et doit donc être étudié chez l’animal en intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un prérequis à la phase de développement clinique.
Réduction
Le nombre de rat a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables grâce à l’utilisation de tests statistiques.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (tubes en carton pour se cacher, briques de bois à grignoter). Une période d’acclimatation de 7 jours minimum, pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisée. Les chirurgies seront réalisées par du personnel ayant les compétences requises et les animaux seront sous anesthésie et analgésie, ce qui évitera toutes souffrances. Enfin, la mise à mort sera réalisée par surdosage de pentobarbital chez l'animal anesthésié. Des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux conscients et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés selon la fiche annexée à ce projet. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du responsable de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce rat (et plus précisement la souche Sprague–Dawley) sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux sympathique dans la prise alimentaire sur ce modèle. Des animaux adultes de 8 semaines d’âge seront utilisés.
Utilisation du modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris ou le rat pour l’évaluation de nouvelles molécules à utiliser à des fins préventives lors des transplantations rénales
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 1840
3 680 animaux non-humains, 1 840 souris et 1 840 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés à tester puis subissent une chirurgie de clampage de l'artère rénale d'environ 45 minutes, avec un risque d'hémorragie et une atteinte de la fonction rénale. La mise à mort permet d'analyser les organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité du syndrome d'ischémie-reperfusion et conclut à la nécessité d'expériences in vivo.
Objectifs
La transplantation d’organe est un traitement de choix de certaines maladies chroniques arrivées à un stade ultime ; elle concerne surtout les organes vitaux abdominaux ou thoraciques et notamment les reins. Le syndrome d'ischémie reperfusion (IR) est un phénomène incontournable en transplantation rénale. L’ischémie correspond à la phase où l’organe du donneur est isolé de la circulation sanguine et subit un défaut d’apport en nutriments et en oxygène, c’est-à-dire depuis le prélèvement chez le donneur jusqu’à la reprise du flux sanguin dans l’organe chez le receveur. La reperfusion de l’organe chez le receveur se traduit par une reprise de la circulation sanguine en lien avec le retour de l’apport en nutriments et en oxygène. Cette reperfusion est brutale ce qui génère énormément d’inflammation au niveau du greffon. À court terme, les conséquences délétères du syndrome d'IR se traduisent principalement par une reprise différée de la fonction rénale mais à plus long terme, on peut observer l’apparition d’une fibrose rénale voir la mort du greffon. Chez l'homme, la prévention du syndrome d'IR fait l'objet de recherches cliniques à travers le conditionnement du donneur, les molécules additives aux solutions de conservation, les modalités de perfusion du greffon rénal ou encore les molécules administrées chez le receveur. Les progrès engendrés par les traitements immunosuppresseurs expliquent, qu’aujourd’hui, l’IR est une cible thérapeutique majeure. Les modèles précliniques, en particulier murins, ont permis de nombreuses avancées dans la compréhension physiopathologique du phénomène d'IR. L’IR provoque des nécroses tissulaires dans le rein qui activent le système immunitaire en libérant des protéines importantes qui participent au processus inflammatoire et engendrent les lésions. Ces protéines peuvent être utilisées comme cibles pour neutraliser la cascade inflammatoire et par conséquent améliorer la reprise de fonction immédiate du rein. Cette stratégie pourrait se révéler bénéfique, sur le long terme, sur la survie des greffons qui représente un enjeu majeur en transplantation. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés issus de notre recherche dans un modèle d’IR chez la souris ou le rat afin de prévenir et de traiter le syndrome d’IR chez l’homme. Ces composés ayant par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur des cellules rénales humaines de patients.
Bénéfices attendus
Les traitements existants sont des cocktails d’immunosuppresseurs avec le risque de nombreux effets secondaires. L’identification d’un ou plusieurs candidat (s) médicament (s) agissant plus spécifiquement au niveau du greffon augmentera l’efficacité du traitement et permettra de diminuer les effets secondaires.
Procédures
1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 6 jours sous un volume de 5 à 10ml/kg en fonction de la voie d’administration 2/ Injection sous-cutanée d’un analgésiant 2 fois le jour de la chirurgie 3/ Chirurgie sous anesthésie gazeuse pendant environ 45 minutes, une fois dans l’étude 4/ Anesthésie gazeuse pour prélèvement sanguin, urinaire et mise à mort, une fois dans l’étude
Impact sur les animaux
Pendant la chirurgie sous anesthésie générale, il y a un risque d’hémorragie lié aux gestes chirurgicaux lors du clampage en lésant l’artère rénale. À la suite de la chirurgie, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une atteinte partielle de la fonction rénale, une mobilité réduite, ainsi qu’une perte de poids n’excédant pas 10% dans les 24 à 48h post-chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.
Remplacement
A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement de la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans le syndrome ischémique. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments.
Réduction
Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à l’heure arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Après la chirurgie, un enrichissement plus doux (igloo en carton) sera utilisé afin d’éviter tout accroc avec la cicatrice. La litière sera également remplacée par une litière plus douce et plus absorbante en fibre de cellulose pour éviter tout irritation de la cicatrice. Afin de palier l'inconfort lié aux procédures et obligatoirement lors des gestes de chirurgie, un programme d'anesthésie sera effectué par inhalation d’isoflurane (induction 3 à 5%, maintien 1 à 3%). Pour prévenir de la douleur, de la buprénorphine à 0.1 mg/kg en sous cutanée sera administrée 30 minutes avant et 4 heures après la chirurgie suivi d’un apport dans l’eau de boisson à 0.01 mg/ml pendant 48 heures. Pendant la chirurgie les animaux seront placés sur un tapis chauffant, une sonde rectale sera placée afin de mesurer leur température corporelle, le tapis régulera alors sa température pour maintenir le corps à 37°C. Pendant la phase de réveil, les animaux seront placés sur un tapis chauffant (37°C). Afin de faciliter la prise de nourriture, quelques croquettes humidifiées seront placées directement dans la cage. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques à ce modèle ont été établi conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal. Lors de la mise a mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane (induction et maintien de 3-5%).
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Le modèle utilisé sera mis au point, sur la base de la littérature existante. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.
Essai d’une thérapie cellulaire chez le rat avec des précurseurs de photorécepteurs édités génétiquement
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
295 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent sous anesthésie une injection sous-rétinienne de photorécepteurs issus de cellules souches humaines, puis des examens d'imagerie, des électrorétinogrammes et des tests comportementaux de la vision. La mise à mort permet des analyses de la rétine. Le porteur affirme que l'évaluation d'une récupération visuelle ne peut se faire qu'in vivo et décrit une piste thérapeutique pour des cécités aujourd'hui irréversibles.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’un canal ionique. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines, appelées cellules iPS. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une perte visuelle provoquée par une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules modifiées après transplantation. L’utilisation de cellules rendus artificiellement sensible à la lumière vise à contourner les difficultés rencontrées par différents groupes, et rapportées dans différentes études, d’obtenir une restauration fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire humaine de ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont obtenu un certain succès en termes de survie et d’intégration dans le tissus-hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d’édition du génome qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante. Les bénéfices attendus sont donc une restauration au moins partielle de la vue chez les animaux modèles aveugles. Ces résultats pourraient permettre à terme de proposer à des patients souffrant de cécité irréversible une thérapie visant à rendre au moins partiellement la vue ; les seuls traitement disponibles à l’heure actuelle permettent au mieux un ralentissement de la perte visuelle avant la cécité complète.
Procédures
Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection intraoculaire (sous la rétine) de cellules en suspension (2 groupes pour deux types de cellules différentes), ou de solution tampon (1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisé une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.
Devenir
A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (survie cellulaire ; différenciation et intégration aux tissus de l’hôte ; réponse à la lumière des cellules transplantées ; reconnexion avec les autres types cellulaire ).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 295 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30% (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.
Raffinement
Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec éléments d’enrichissement pour toute la durée du protocole ; nourriture et abreuvement à volonté. Les procédures prévoient une surveillance de leur état physique général (et particulièrement du système oculaire). Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue pour certains examens (imagerie, ERG) les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant ces différents actes. Le geste chirurgical, qui peut générer une nuisance ou une douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique puis un anti-inflammatoire non stéroïdien à durée d’action longue. Les signes de comportement anormal, signe de possible souffrance, seront également surveillés. Les points limites adaptés sont définis de manière adaptée aux procédures mises en œuvres et inclus une surveillance de l’état physique et comportemental de l’animal. L’observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal selon les méthodes adaptées et réglementaires.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.
Mise au point d’un modèle de choc septique induit par des lipopolysaccharides (LPS)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de lipopolysaccharides provoquant un choc septique, avec fièvre, confusion et apathie, avant un prélèvement de sang intracardiaque terminal. Le porteur indique qu'aucune couverture analgésique n'est mise en place, car elle modifierait le taux de cytokines mesuré. L'objectif est de mettre au point un modèle d'inflammation pour tester des candidats médicaments anti-inflammatoires.
Objectifs
Le but de ce projet est de mettre au point un modèle de choc septique au LPS (lipopolysaccharides) afin de mettre en évidence une activité anti-inflammatoire de molécules testés au moyen d’analyses de différentes cytokines (TNFalpha, IL-10).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettrait de mettre au point un modèle d’inflammation au LPS chez le rat avec pour but de déterminer le potentiel anti-inflammatoire d’une molécule spécifique par le biais de dosages de cytokines anti-inflammatoires.
Procédures
Les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p., aiguille 26G ou 25G; 10mL.kg, 5 secondes) de LPS. Puis ils seront anesthésiés (3 minutes) pour le prélèvement de sang (1 minute) puis euthanasiés. Dans les cas où nous testerons la référence anti-inflammatoire, les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p., aiguille 26G ou 25G; 10mL.kg, 5 secondes) en plus de l’injection de LPS.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p.; 10mL.kg, 5 secondes) de LPS. Lors du choc septique, les animaux seront fébriles (augmentation de la température corporelle), ils peuvent montrer des signes de confusions et d’apathie. Les animaux seront suivis (observation de 30 secondes) toutes les heures afin de surveiller leur état jusqu’au prélèvement. Puis ils seront anesthésiés (3 minutes) pour le prélèvement de sang (1 minute) puis euthanasiés. Dans les cas où nous testerons des références anti-inflammatoires, les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p.; 10mL.kg, 5 secondes) en plus de l’injection de LPS.
Devenir
Une grande quantité de sang doit être prélevée sur les animaux, il est donc indispensable qu’ils soient mis à mort après le prélèvement intracardiaque.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments anti-inflammatoires. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur l’inflammation, mais sans observation des potentiels effets secondaires. L’étude de potentiels traitements anti-inflammatoires doit donc être conduite dans un modèle restituant à la fois la composante comportementale et physiologique. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est basé sur les données publiées dans des articles réalisant le même modèle et les mêmes analyses. Cette estimation théorique sera confirmée lors des stades initiaux de développement du modèle (dès que l’approbation du projet permettra le début des expérimentations et la génération de données) par la réalisation d’une analyse statistique par la méthode des tirages aléatoires et d’un calcul de puissance via BiostaTGV. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat).
Raffinement
Dans le domaine de la pharmacologie préclinique, l’induction des modèles entraîne potentiellement l’apparition de symptômes douloureux et l’objectif des études réalisées ne permet pas la mise en place de dispositions spécifiques (e.g. couverture analgésique) aux risques d’impacter le niveau de cytokines. Le choix d’un modèle aigue (environ 4h) constitue un raffinement par rapport aux modèles chroniques qui augmentent la durée pendant laquelle les animaux sont exposés à des nuisances.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein d’ANS Biotech. Le rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) large caractérisation de ce modèle dans la littérature ; b) existence de cytokines identiques et mécanismes biologiques communs. Le jour de l’induction, les rats seront âgés de 6 semaines (Adolescent, jeune adulte) et pèseront entre 200 et 300 g. Ce stade est défini en suivant les caractéristiques décrites dans la littérature.