Rats
Exploration de l’implication des récepteurs cholinergiques dans les processus nociceptifs associés aux neuropathies périphériques chimio-induites – Explorations biologiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticancéreux (oxaliplatine, paclitaxel, bortézomib, vincristine) pour induire une neuropathie douloureuse, puis subissent chaque semaine des tests comportementaux de douleur (test du von Frey électronique, test d'immersion de la patte), avant un prélèvement terminal du système nerveux. Le porteur reconnaît que l'induction de la neuropathie est une nuisance qu'il qualifie d'"indispensable", et que les anticancéreux réduisent le gain de poids des animaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace encore l'animal vivant pour explorer la douleur, la retombée pour les patients restant renvoyée au conditionnel.
Objectifs
La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limité. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents au sein de notre équipe de recherche ont démontré l’efficacité analgésique du donépézil sur des modèles animaux de CIPN. L’effet analgésique du donépézil (inhibiteur de cholinestérase) implique l’activation des récepteurs muscariniques M2 (m2AChRs) au niveau spinal. Cependant, l’action anticholinestérasique du donépézil pourrait être responsable de l’activation d’autres récepteurs cholinergiques et le mécanisme analgésique des m2AChRs n’est pas totalement connu (à priori inhibition des cellules excitatrices et pronociceptives glutamatergiques). Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’implication du système cholinergique (m2AChRs) au niveau spinal et du système nerveux périphérique (ganglions spinaux - DRG) dans des modèles animaux de CIPN : mesure de l’expression génique et de la localisation des récepteurs cholinergiques au niveau spinal et des DRG, et exploration de l’effet analgésique d’agonistes spécifiques des m2AChRs.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques des CIPN. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). Nos précédents travaux ont démontré l’intérêt analgésiques du donépézil sur ces modèles animaux de CIPN, et ont permis la mise en place d’une étude clinique évaluant l’effet analgésique du donépézil chez des patients souffrant de neuropathie induite par l’oxaliplatine. Le projet proposé vise à préciser l’implication des m2AChRs comme nouvelle cible thérapeutique, et dont l’objectif à terme sera de développer des agonistes de ces m2AChRs pour le traitement des CIPN, et qui pourront être testé chez l’homme à moyen terme.
Procédures
Tous les animaux recevront des injections d'anticancéreux ou du véhicule. Le nombre d’injection et leur voie d’administration sera fonction du modèle animal : - Oxaliplatine : 2 injections par semaine (lundi et vendredi) pendant 4 semaines, voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) - Paclitaxel : 4 injections (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Bortézomib : 5 injections (J0, J1, J3, J4 et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Vincristine : 5 Injections (J0, J2, J4, J7 et J9), voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaire et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - Test du von Frey électronique : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats) - Test d’immersion de la patte : durée du test pour un animal 5 minutes (max)
Impact sur les animaux
L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux nécessitent un bon état général des animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera, in fine, de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies d’expression des récepteurs à l’acétylcholine dans une perspective thérapeutique.
Remplacement
Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais pour le moment ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexicité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est elle même pas encore élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer de nouvelles stratégies pharmacologiques et par le biais de tests comportementaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nosu devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.
Raffinement
Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.
Choix des espèces
Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche (Ferrier et al. J Neurosci 2015 ; Selvy et al. Biomed Pharmacother. 2022), ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de test comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.
Etude du couplage neuromécanique par imagerie ultrasonore
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
107 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, la plupart menées sous anesthésie sans réveil. Ils subissent une chirurgie puis environ trois heures d'imagerie cérébrale, et 15 d'entre eux reçoivent cinq injections destinées à induire des crises de migraine. Le porteur reconnaît qu'il "n'est pas possible" de soulager les animaux pendant ces crises, la douleur faisant l'objet de l'étude, et applique un test de sensibilité par pression d'un poil sur la face. Il affirme qu'étudier le cerveau "entier et fonctionnel" rend impossible tout recours à l'in vitro ou l'in silico.
Objectifs
Le cerveau, comme les autres organes, nécessite un apport en énergie pour maintenir son activité. Ainsi, lors de l’exécution d’une tâche, l’activation neuronale résultante s’accompagne d’une augmentation locale du flux sanguin, permettant un approvisionnement des neurones en oxygène et nutriments. Ce phénomène physiologique, appelé couplage neurovasculaire, est à la base de plusieurs techniques d’imagerie fonctionnelle. En plus d’une augmentation de la désoxygénation locale, puis de l’afflux sanguin induits par l’activité cérébrale au cours d’une tâche qui sont les éléments clés mesurés dans de nombreux types d’imagerie, cette activité cérébrale pourrait s’accompagner de changements locaux de dureté des tissus. Ce phénomène est appelé couplage neuromécanique, par analogie au couplage neurovasculaire. Le but de ce projet est : 1) de mettre au point une méthode permettant d’étudier l’existence de ce couplage neuromécanique dans le cerveau, puis 2) de l’appliquer à l’étude d’une pathologie vasculaire cérébrale : la migraine. Ces travaux seront réalisés chez le rat anesthésié. Dans la première partie du projet, nous souhaitons développer cette technique de mesure combinée de l’activité neuronale (par suivi du débit sanguin local) et de la dureté du tissu (élastographie). Cette première partie méthodologique définira et optimisera les éléments essentiels expérimentaux de ces expérimentations, c’est-à-dire les paramètres physiques d’imagerie à utiliser pour mesurer ces deux composantes de la réponse cérébrale, mais également les conditions expérimentales permettant une activation optimale. Ces travaux reposent sur une expertise reconnue de notre laboratoire dans l’étude fonctionnelle des zones cérébrales chez le rongeur. Ainsi, 4 grands types d’éléments clefs à optimiser ont été identifiés et chacun d’entre eux sera l’objet d’une étude sur deux types de stimulations. La deuxième partie de ce projet a pour but d’utiliser cette méthologie mise au point et de l’appliquer à l’étude du couplage neuromécanique dans un modèle animal de migraine chez le rat. Nous avons choisi le modèle le moins invalidant et le plus court possible. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérience d’imagerie. Cette séance d’imagerie durera environ 3h. Aucune douleur , ni souffrance n’est attendue du fait des mesures mises en place et de l’anesthésie de l’animal au cours de la procédure.
Bénéfices attendus
Le couplage neuromécanique est un sujet qui n’a jusqu’à présent pas fait l’objet de nombreuses recherches et dont l’existence reste encore controversée dans la littérature. Les quelques études faisant état de ce phénomène physiologique utilisent la technique d’élastographie par résonnance magnétique, qui est moins précise temporellement que la technique que nous souhaitons mettre en place et nécessite un plus grand nombre d’acquisitions pour obtenir un signal exploitable. Par conséquent, le projet décrit ici pourrait permettre une observation plus fine du phénomène, sur un plus grand nombre de mesures, et comprendre ainsi le lien fondamental entre activation neuronale et élasticité des vaisseaux. Si la thématique de cette étude est très fondamentale, ce projet est aussi translationnel. En effet, le couplage neuromécanique pourrait, à plus long terme, permettre de diagnostiquer certaines pathologies vasculaires, telles que la HHT (Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia), caractérisée par l’absence de capillaires entre les veines et les artères, ou encore CADASIL, une maladie génétique qui atteint les petits vaisseaux dans le cerveau. La mesure combinée des variations de flux sanguin et de la rigidité dans le cerveau pourrait permettre de discriminer ces pathologies et d’en établir un diagnostic plus complet et plus fiable en clinique.
Procédures
Sous anesthésie générale, les animaux subiront une opération chirurgicale, pendant environ 1h. Cette anesthésie sera ensuite maintenue pour réaliser les mesures d’imagerie (les acquisitions en imagerie dureront environ 3 heures). Au cours des expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. L’anesthésie prolongée des animaux pour ces séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront suivies au cours du temps grâce au suivi des fréquences cardique et respiratoire (Labchart). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’isoflurane pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal). Comme nous voulons étudier les mécanismes neuromécaniques cérébraux associés aux douleurs migraineuses, nous devrons induire ce modèle chez 15 animaux et pour cela, réaliser 5 injections intrapéritonéales (une par jour sur 5 jours). Il est possible que certaines de ces injections induisent une douleur aiguë orofaciale transitoire. La crise migraineuse elle-même aura lieu sous anesthésie à la 5ème injection. Les animaux du groupe contrôle recevront une injection de sérum physiologique avec la meme fréquence. Il ne nous est malheuresement pas possible de soulager les animaux pendant les crises migraineuses qui pourraient se mettre en place suite aux 4 premières injections d’ISDN. Cet effet devrait être modéré cependant car il a été montré qu’il fallait attendre la 5ème injection pour observer l’induction d’une crise migraineuse. Un suivi étroit de la sensibilité orofaciale des animaux sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal si la souffrance devenait incontrôlable). Ce test de sensibilité, qui dure moins d’une heure, sera réalisé avant le développement du modèle, puis au 4ème jour d’induction du modèle. Il implique de laisser les animaux libres de leurs mouvements, seuls dans une cage ouverte. Après une phase d’habituation, l’expérimentateur appliquera un poil calibré sur la face de l’animal afin de réaliser une pression douce de ce poil. Les animaux seront directement mis à mort à la fin de la séance d’imagerie.
Impact sur les animaux
- Au cours des expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. - Les seules nuisances envisagées sont celles causées par le modèle de migraine. Comme nous voulons étudier les mécanismes cérébraux associés aux douleurs migraineuses, il ne nous est pas possible de soulager les animaux pendant les crises migraineuses qui pourraient se mettre en place suite aux 4 premières injections de la molécule induisant la migraine. La douleur associée aux crises migraineuses se mettra en place progressivement suite aux injections de la molécule induisant la migraine et correspond à une douleur modérée. Un suivi étroit de la sensibilité orofaciale des animaux sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure). Les animaux seront directement mis à mort après la dernière séance d’imagerie. Notons que la plupart de nos analyses en imagerie se feront sur animal anesthésié, limitant ainsi la perception douloureuse de l’animal. Néanmois, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront suivies au cours du temps grâce au suivi des fréquences cardiaques et respiratoires (Labchart). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’isoflurane pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront mis à mort car ils auront subi une ouverture de leur boîte crânienne donc ne pourront pas être réveillés.
Remplacement
Notre étude s’intéresse aux propritétés hémodynamiques et mécaniques du cerveau en activité, entier et fonctionnel ; il est par conséquent impossible de réaliser ces manipulations ex vivo, in vitro ou in silico. Par ailleurs, les ultrasons n’ont jamais été utilisés pour étudier parallèlement le flux sanguin et la rigidité. Aucune donnée n’a donc été collectée à ce sujet, d’où la nécessité de réaliser les manipulations décrites dans ce projet
Réduction
Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à notre projet, nous avons utilisé un logiciel de statistiques. Le nombre d’animaux ainsi estimé est de N = 10 par groupe pour la première procédure. La mise au point réalisée en manipulation préliminaire permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé dans la suite du projet. Pour la seconde procédure, en tenant compte du fait que la différence d’effet entre nos deux groupes expérimentaux (rats migraineux et contrôles) n’est pas connue et, de plus, que 20% des animaux injectés avec le donneur de monoxyde d’azote étaient non-répondeurs, il sera nécessaire d’inclure N =12 animaux contrôles et N =15 animaux injectés avec le donneur de monoxyde d’azote. Au total, le nombre d’animaux nécessaire au projet est de 107.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Ils seront hébergés deux par deux dans une cage contenant un enrichissement (tube en carton, bois à ronger). Un suivi quotidien sera assuré, contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture (échelle de suivi de la douleur). Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental et aux procédures détaillées. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous définirons un score décisionnel en fonction des observations quotidiennes permettant de modifier la procédure en cours avec administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou de mettre à mort par administration d’une dose létale d’Euthasol sous anesthésie. Application d’Ocrygel sur les yeux au cours de la chirurgie pour éviter que les yeux ne se dessèchent. Pendant les acquisitions, monitoring des paramètres physiologiques (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température) pour surveiller le maintien du niveau d’anesthésie. Pendant toute la durée des actes sous anesthésie, les constantes vitales seront suivies : température corporelle, et fréquences cardiaque et respiratoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement la mise à mort de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’Euthasol.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude des bases physiologiques du cerveau car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionelle transposables à l’Homme. Du fait du développement et de la grande caractérisation morpho-fonctionnelle du cortex chez le rat et la souris, ces deux espèces de rongeurs sont – dans l’absolu – deux espèces de choix pour notre étude fonctionnelle neuromécanique. Cependant, la souris ayant une taille de cerveau significativement plus petite que celle du rat complique grandement la mise au point et l’application à court terme de la technique. En effet, une surface de cortex, ainsi que des distances de transmission de ces ondes de cisaillementvgf sont nécessaire afin de mesurer de façon reproductible ce mécanisme. Ainsi, bien que nous souhaitions à plus long terme étudier ce couplage chez la souris, ce premier projet utilise exclusivement des rats. Les mises au point seront plus faciles car le cortex étant plus grand, il y aura une plus grande place pour la propagation des ondes de cisaillement et leur mesure. Les animaux utilisés dans cette étude seront des rats adultes (7 semaines et plus) car leur cerveau est pleinement développé et d’un grand volume, adapté pour des acquisitions en imagerie.
Essais préliminaires d’un nouveau dispositif expérimental développé pour le traitement de plaies cutanées chez le rat femelle
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
6 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque rate est rasée sous anesthésie, équipée d'un harnais portant un dispositif à LED, puis soumise éveillée à des séances d'irradiation lumineuse de cinq heures sur deux jours, pour tester un dispositif de traitement des plaies cutanées breveté. Le porteur indique que l'irradiation ne devrait provoquer aucune douleur, qu'un érythème reste possible et que l'isolement en cage individuelle génère un stress limité à quarante-huit heures. Il affirme que le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n'est pas envisageable pour valider un dispositif destiné à l'humain.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de faire des essais préliminaires in vivo chez le rat de la mise en place, du maintien et de la tolérance locale d’un nouveau dispositif expérimental conçu pour le traitement des plaies cutanées chroniques, dispositif expérimental ayant fait l’objet d’un dépôt de brevet. Ce dispositif expérimental utilisera les effets thérapeutiques de la lumière visible pour empêcher le développement d’une infection de la plaie cutanée et pour favoriser le processus de cicatrisation. Ce tout premier essai sera mené chez le rat sans induction d’une plaie cutanée afin de s’assurer du maintien de la partie du dispositif expérimental appliquée directement sur le dos (système d'éclairage mince et flexible utilisant la technologie LED), sous anesthésie, laissé en place pendant plusieurs heures sur le rat vigile, du maintien de la connexion avec le module de contrôle placé en dehors de la cage d’habitation, et de la tolérance locale au niveau de la peau saine pendant l’irradiation lumineuse à l’aide du dispositif expérimental et sur 48 heures par la suite. Un ensemble de capteurs, intégrés dans la partie du dispositif expérimental appliquée directement sur le dos pour diffuser l’irradiation lumineuse, permettra de suivre en continu la température de la surface cutanée lors de l’irradiation lumineuse et de stopper immédiatement l’irradiation lumineuse en cas d’atteinte d’une température supérieure à 39°C, ainsi que des paramètres d’oxygénation du sang. Des irradiations longues ou séquentielles envisagées pour le traitement futur de plaies cutanées chroniques seront utilisées pour ces essais préliminaires. L’ensemble des données sera enregistré par le le module de contrôle et permettra d’optimiser si nécessaire le fonctionnement de ce nouveau dispositif expérimental.
Bénéfices attendus
La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. On distingue 4 stades dans le processus de cicatrisation : inflammation, revascularisation, réépithélialisation et remodelage. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales,les ulcères du pied chez le diabétique, les ulcères veineux… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer un nouveau dispositif expérimental qui pourrait, après des études d’efficacité à mener sur des modèles expérimentaux de plaies cutanées, être utilisé dans un avenir proche chez l’Homme, pour le traitement de plaies chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.
Procédures
Les 6 rats seront soumis à une anesthésie générale à l’isoflurane pour le rasage de la totalité de la surface du dos, la mise en place d’un harnais et la partie du dispositif expérimental diffusant la lumière (4x4 cm) positionnée dans le harnais qui sera ajusté à la taille du rat afin d’être au contact direct de la peau. Cela ne sera réalisé qu’une seule fois pour les 6 rats en 7-8 minutes environ. Ils seront ensuite tous les 6 soumis à un protocole d’irradiation lumineuse à l’état vigile sur 2 jours consécutifs, avec soit une irradiation pendant 5 heures le 1er jour et une irradiation séquentielle de 7 minutes 30 toutes les 15 minutes pendant 5 heures le 2ème jour pour 3 des 6 rats (groupe 1), soit à l’inverse une irradiation séquentielle de 7 minutes 30 toutes les 15 minutes pendant 5 heures le 1er jour et une irradiation pendant 5 heures le 2ème jour pour les 3 autres rats (groupe 2). Les rats seront donc libres de leurs mouvements dans leur cage pendant toute la durée des irradiations lumineuses effectuées. Les rats seront placés en cage individuelle pendant 2 jours pour la réalisation du protocole d’irradiation lumineuse, nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le harnais et surtout la partie de dispositif expérimental placé dans le harnais, puis ils seront replacés à 2 par cage pendant les 48 heures de suivi avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Aucune douleur ne sera générée par le rasage du dos des animaux puis par la mise en place du harnais, ainsi qu’en principe lors de l’irradiation lumineuse du tissu cutané et à la suite de celle-ci. L’apparition d’un érythème suite à l’irradiation lumineuse est toutefois possible. Un ensemble de capteurs intégrés dans la partie du dispositif expérimental diffusant l’irradiation lumineuse permettant de suivre en continu la température de la surface cutanée lors de l’irradiation lumineuse stopperait automatiquement et immédiatement l’irradiation lumineuse en cas d’atteinte d’une température supérieure à 39°C, évitant ainsi l’apparition d’un érythème. L’hébergement en cage individuelle des rats lors de la réalisation du protocole d’irradiation lunimeuse, nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le harnais et surtout la partie de dispositif expérimental placé dans le harnais, pourra engendrer un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité dans le temps (48 heures).
Devenir
Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 6 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort par injection intrapéritonéale d’une surdose de pentobarbital effectuée sous anesthésie gazeuse profonde à l’isoflurane (5,0%), et un prélèvement de peau correspondant à la zone irradiée par la lumière sera effectué pour réaliser des analyses histologiques et ainsi vérifier l’intégrité du tissu cutané irradié.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo et sur des temps prolongés pour valider un tel dispositif expérimental destiné à être utilisé chez l’Homme par la suite. L’ensemble des paramètres suivis ne peuvent être appréhendés qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de cette étude pilote mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs quant aux objectifs envisagés. L’ensemble des données générées sur un même animal permettra de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation du protocole d’irradiation lumineuse et après réalisation de celui-ci, plus particulièrement les observations de leur comportement. Aucun traitement antalgique ou analgésique n’est envisagé, les irradiations lumineuses ne devant engendrer aucune douleur. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré avant puis quotidiennement après réalisation du protocole d’irradiation lumineuse, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des modifications importantes du comportement sont observées pendant ou suite à l’irradiation lumineuse (convulsions, absence totale d’activité, vocalises,…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer le bien-être des animaux, et seront remplacées lors de chaque change de litière (au moins 2 fois par semaine).
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille et de celle du dispositif expérimental qui va être testé (4x4 cm pour la partie au contact direct de la peau), et également en raison de sa facilité de manipulation. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations, avec un poids de 175-200 g. Cela correspond au poids de rat nécessaire afin d’avoir une surface corporelle suffisante pour mettre en place le harnais et le dispositif expérimental d’irradiation lumineuse (4x4 cm pour la partie au contact direct de la peau), et cela correpond également au poids des rats qui seront utilisés pour réaliser les études d’efficacité sur la cicatrisation après induction de plaies cutanées.
Evaluation des effets anti-inflammatoires de 4 formulations sur l’inflammation générale chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cinquante d'entre eux reçoivent sans anesthésie une injection de parois bactériennes déclenchant une inflammation générale, suivie de traitements répétés, de prises de température rectale toutes les heures et d'une évaluation comportementale, pour tester quatre formulations anti-inflammatoires. Le porteur indique que l'inflammation induit une souffrance modérée et que la contention répétée génère un stress chez tous les animaux. Il affirme que le remplacement par des modèles in vitro n'est pas envisageable pour mesurer des paramètres physiologiques et comportementaux.
Objectifs
L’inflammation est une réaction de défense immunitaire stéréotypée du corps à une agression : infection, brûlure, allergie…. L'inflammation chronique est reconnue comme une réponse à de nombreuses transformations de l'environnement et du comportement modernes (sédentarité, malbouffe, pollution,…) et un facteur important dans le développement de maladies de civilisation telles que la résistance à l'insuline, l'obésité, les maladies cardiovasculaires, les maladies immunitaires, et même les troubles de l'humeur et du comportement. L’inflammation se manifeste par différentes phases successives au niveau des vaisseaux avec leur dilatation et une augmentation de leur perméabilité, et des cellules de l’organisme, notamment des globules blancs. Cela permet d’augmenter la circulation du sang afin d’éliminer les cellules mortes et les toxines responsables de cette inflammation, et d’apporter les éléments nécessaires à la guérison, notamment des globules blancs (lymphocytes) pour combattre les corps étrangers. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer les effets anti-inflammatoires de 4 formulations administrées de façon répétée sur l’inflammation générale induite chez le rat par des bactéries appelées lipopolysaccharides ou LPS. Les 4 formulations testées ont été sélectionnées sur la base d’études in vitro ayant démontré des propriétés anti-inflammatoires qu’il est nécessaire de confirmer in vivo sur un modèle animal avant d’envisager un développement chez l’Homme.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer les effets anti-inflammatoires de 4 formulations administrées de façon répétée sur l’inflammation générale induite chez le rat par des parois bactériennes. Les données physiologiques et comportementales générées par l’ensemble des paramètres mesurés au cours de l’expérimentation et les analyses qui seront effectuées sur le sang, ainsi que les analyses qui seront effectuées sur les organes prélevés, en fin d’expérimentation, permettront de sélectionner une ou plusieurs formulations afin de poursuivre leur développement et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettrait à terme de proposer de nouvelles solutions thérapeutiques pour le traitement de pathologies inflammatoires aiguës mais également chroniques.
Procédures
50 des 60 rats seront soumis à l’induction d’une inflammation générale par injection de parois bactérienne, les 10 rats restant recevant l’injection de placebo. L’induction de l'inflammation générale est effectuée 1 seule fois sans anesthésie, le geste étant très rapidement en quelques secondes. Les rats seront observés toutes les heures pendant les 24 heures de l’expérimentation. Les 60 rats seront traités avec chacune des 4 formulations anti-inflammatoires à évaluer, immédiatement après induction de l’inflammation générale puis 6 heures, 12 heures et 18 heures après celle-ci. Les injections seront effectuées sans anesthésie après placement des rats dans une boîte de contention spécifique adaptée à leur poids et leur taille, celles-ci étant effectuées en moins d’1 minute. Une prise de température corporelle au niveau rectal sera effectuée sur les 60 rats toutes les heures pendant 12 heures ainsi qu'à 18 heures et 24 heures après induction de l’inflammation générale. Les mesures seront faites sur animal vigile. A la fin de l’expérimentation une évaluation comportementale sera effectuée en plaçant chacun des 60 rats dans un dispositif expérimental spécifique pendant 5 minutes pour déterminer les effets de l’induction de l’inflammation générale et des traitements réalisés sur leur comportement locomoteur. Cette évaluation sera faire sur animal vigile. Enfin un prélèvement de sang sera réalisé sur les 60 rats, sous anesthésie générale, effectué une seule fois et en une minute environ avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
L’induction d’une inflammation générale affectant l’organisme entier va induire une souffrance modérée pour 50 des 60 rats utilisés pour ce projet, se traduisant par des modifications dans leur comportement et dans leurs paramètres physiologiques. La mise en cage de contention pour effectuer les traitements avec les 4 formulations à évaluer et la réalisation de celles-ci, ainsi que les mesures répétées de température corporelle, vont induire un stress pour la totalité des animaux. Le placement des animaux dans le dispositif expérimental pour la réalisation de l’évaluation comportementale à la fin de l’expérimentation pourra également générer un stress léger mais très limité dans le temps, la durée du test étant de seulement 5 minutes.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, après réalisation d’un prélèvement de sang, les rats seront mis à mort afin de permettre le prélèvement d’organes et de pouvoir ainsi réaliser un ensemble d’analyses permettant d’étudier les effets de l’inflammation générale induite et des traitements avec les 4 formulations évaluées sur ces organes.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules) ou ex vivo (organes isolés) pour évaluer les effets anti-inflammatoires de formulations au travers de paramètres physiologiques tels que la température corporelle et surtout de paramètres comportementaux. Les 4 formulations qui seront évaluées dans ce projet ont cependant été sélectionnées sur la base d’études in vitro ayant démontré des propriétés anti-inflammatoires qu’il est donc nécessaire de confirmer in vivo sur un modèle animal avant d’envisager un développement chez l’Homme.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir de résultats d’études antérieures et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour 6 groupes de traitement. Nous utiliserons donc des groupes de 10 rats.
Raffinement
Les administrations et les mesures de température corporelle ne pouvant pas être effectuées sous anesthésie afin de ne pas impacter la physiologie et le comportement des rats, et de ne pas intérférer avec l’interprétation des résultats de l’étude, les rats seront observés quotidiennement depuis leur arrivée jusqu’au démarrage des expérimentations, et toutes les heures pendant les 24 heures de l’expérimentation. Leur poids sera mesuré avant l’induction ou non de l’inflammation générale et 24 heures après. Si des modifications importantes du comportement sont observées suite à l’induction de l’inflammation générale ou les administrations des traitements, ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de la réponse à l’induction d’une inflammation générale, sa facilité de manipulation pour la réalisation d’injections en condition vigile et pour l’évaluation comportementale largement décrite dans la littérature scientifique sur cette espèce. Les animaux seront de jeunes rats âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge moyen de rats décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur ce modèle d’inflammation générale, et de rats utilisés lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats probants.
Effets récompensants des nouvelles drogues de synthèse
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
448 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit l'implantation chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, puis des sessions répétées d'auto-administration intraveineuse de nouvelles drogues de synthèse ou de cocaïne, pour évaluer le pouvoir addictif de ces substances. Le porteur indique que la prise chronique peut induire un état émotionnel négatif, avec poil hérissé, irritabilité et agressivité envers l'expérimentateur. Il affirme que ce type de recherche ne peut être mené que sur un animal vivant, l'étude du comportement exigeant des "réseaux neuronaux intacts et fonctionnels".
Objectifs
Ce projet a pour but principal de dépister et caractériser les effets récompensants de nouvelles substances psychostimulantes de synthèse. En effet, depuis vingt ans, l’usage de ces produits n’a pas cessé d’augmenter ainsi que le nombre de cas d’accidents liés à leur usage. Par exemple, à la fin de 2019, le « Observatoire Français des Drogues et des Tendances addictives pour l’Europe » (OFDT) avait recensé plus de 700 nouvelles substances psychostimulantes. Le problème majeur avec ces nouvelles substances est qu’elles miment l’effet des drogues psychostimulantes traditionnelles (ex. amphetamines) mais qu’elles ont des nouvelles structures chimiques qui ne sont pas connues et classifiées par la législation française et européenne et donc, qu’elles peuvent être librement achetées et utilisées. Ainsi, il existe un important décalage temporel entre l’apparition des intoxications et les fatalités liées à leur usage, et le moment où elles sont déclarées illégales et que leur vente et leur usage sont interdits. Le but principal de ce projet est d’identifier et caractériser précocement les nouvelles substances psychostimulantes de synthèse qui présentent un risque d’abus important afin d’informer le législateur sur les mesures à mettre en place le plus rapidement possible pour limiter les risques associés à leur usage. Ce projet fait partie d’un projet international financé par l’Union Européenne qui prévoit l’interaction étroite entre des spécialistes de différents domaines allant de la chimie en passant par les modèles d’addiction in vivo. Notre rôle dans le projet est de tester chez le rat le pouvoir addictogène de nouvelles substances psychostimulantes en utilisant l’auto-administration intraveineuse. Pour cela, nous allons tester les effets récompensants de 8 nouvelles substances psychostimulantes de synthèse sélectionnées par le consortium européen en fonction de leur risque d’abus prédit sur la base « théorique » d’une comparaison de la structure chimique des nouvelles substances psychostimulantes de synthèse avec celle des molécules connues.
Bénéfices attendus
Les nouvelles substances psychostimulantes de synthèse constituent un risque majeur pour la santé humaine. Ce projet permettra d'être en capacité d'anticiper les risques d'abus de ces nouvelles substances psychostimulantes de synthèse ce qui permettra aux autorités judiciaire et policière de mettre en place des contre-mesures pour limiter les dégâts induits par ces molécules. Ce projet, financé par l’Union Européenne, devrait permettre de coordonner les efforts de lutte contre ces nouvelles drogues.
Procédures
Tous les rats (448) seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir suivre les sessions d’auto-administration de drogue. 224 rats suivront 21 sessions d’auto-administration de nouvelle substance psychostimulante de synthèse (20 sessions de 2h et 1 session de 5h à raison d’1 session par jour). 224 rats suivront 20 sessions d’auto-administration de cocaïne (1 session de 2h par jour) et 15 sessions d’auto-administration de nouvelle substance psychostimulante de synthèse (12 sessions de 2h et 3 sessions de 5h à raison d’1 session par jour). Tous les rats (448) seront pesés 16 fois (2 fois par semaine, 10 secondes par pesée, pendant 8 semaines).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - cathéter : gène légère - auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « dépendant » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur, mais pas d’agressivité vis-à-vis des congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques semaines. - stress léger lié à l’isolement temporaire (2jours) des animaux au cours du projet
Devenir
Tous les animaux, à l’issue de tous les tests d’auto-administration, seront mis à mort pour le prélèvement de leur cerveau pour pouvoir étudier les mécanismes cérébraux des nouvelles substances psychostimulantes de synthèse.
Remplacement
Ce type de recherche, visant à comprendre les effets comportementaux des drogues d’abus, peut-être uniquement menée sur un animal vivant. En effet, l’étude du comportement nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques . Ainsi 14 animaux par lot seront nécessaires à notre étude, avec 32 lots, soit 448 animaux au maximum. Les cerveaux seront prélevés après la mise à mort à la fin des procédures afin de constituer une banque de tissus utilisable si besoin.
Raffinement
Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal. En cas d’apparition de signes de mal-être, et suivants des points limites établis, une prise en charge adaptée et sans délai sera appliquée et un traitement antalgique sera mis en place si nécessaire. Le bien-être animal est également assuré pendant la chirurgie par le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques. De plus, pendant la chirurgie l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger ou tunnel) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs expérimentés et compétents.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux car les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Les rats Sprague-Dawley sont les plus utilisés dans le domaine biomédical. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet (qui durera environ 3 mois) afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).
Etude des altérations des cellules du foie de rat au cours de leur isolement par perfusion.
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
54 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat est anesthésié pour l'incision de la paroi abdominale, puis mis à mort dans les cinq minutes pour prélever le foie et en isoler les cellules par perfusion. Le porteur présente le foie isolé de rat comme un modèle "alternatif" à l'expérimentation sur animaux vivants, tout en jugeant le recours aux rats "nécessaire" pour identifier des molécules améliorant le rendement cellulaire. Il retient le rat plutôt que la souris parce qu'un foie de rat fournit environ 700 millions de cellules contre 50 millions chez la souris.
Objectifs
Lorsque des échantillons de foie sont prélevés pour l'isolement des cellules ou pour la greffe, les cellules sont soumises à de nombreux stress dus notamment au manque d'oxygène et à la reperfusion du tissu. Les mécanismes à l'origine de ces lésions ont été mis en évidence dans des modèles de foie isolé perfusé de rat et montrent une atteinte encore plus importante des foies stéatosés. Ces lésions peuvent être réduites en utilisant des antioxydants et des anti-inflammatoires en prétraitement ou dans la solution de préservation du foie. Nous savons que d'importantes modifications du métabolisme ont lieu au cours de l'isolement des cellules du foie, cependant les différentes voies de stress présentes lors de l'ischémie-reperfusion n'ont pas été évaluées dans un contexte d'isolement des cellules. Les objectifs du projet sont d'évaluer l'effet du protocole de référence d'isolement des cellules de rat par perfusion sur le stress cellulaire et le métabolisme des cellules isolées dans un premier temps ; de cribler l'effet d'inhibiteurs de ces voies de stress sur la fonctionnalité des cellules après leur isolement ainsi que sur la résistance des cellules à la congélation ; puis d'évaluer la combinaison des molécules sélectionnées dans le liquide de perfusion. Cette étude servira de base pour proposer un milieu de préservation de foies humains avant isolement des cellules.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de comprendre les mécanismes qui jouent sur la qualité des cellules isolées de foie de rat et de sélectionner un cocktail de molécules candidates pour prétraiter des échantillons de foie humains. La validation du cocktail de préservation des cellules chez le rat permettra de répondre au problème du manque de disponibilité d'échantillons de foie humain tout en réduisant la variabilité des réponses due à la variabilité des échantillons. L'utilisation des molécules identifiées contribuera à améliorer le rendement et la qualité des cellules isolées des échantillons de foie humain et d'animaux pour répondre à la forte demande en cellules de foie humain.
Procédures
Tous les animaux (54) sont soumis à une anesthésie générale de courte durée pour permettre d’inciser la paroi abdominale et accéder au foie. La mort est induite pendant l’anesthésie dans les 5 minutes suivant l’incision, juste avant l’isolement des cellules par perfusion et les différents prélèvements.
Impact sur les animaux
Un protocole d'anesthésie générale adapté est mis en place pour supprimer la douleur associée à l’incision de la paroi abdominale pour accéder au foie.
Devenir
L'isolement des cellules implique le prélèvement du foie après mise à mort de l'animal sous anesthésie générale.
Remplacement
Le foie isolé et les cellules du foie de rat et humain sont des modèles alternatifs très utilisés en recherche fondamentale et pour l'évaluation réglementaire des médicaments en phase préclinique. Ces modèles permettent de remplacer le test des molécules sur les animaux vivants tout en permettant d’augmenter grandement le nombre de tests par échantillon. Les échantillons de foie humain disponibles pour la recherche sont rares et de qualité variable ce qui limite leur utilisation à des fins de criblage ; de plus l’isolement des cellules génère des altérations qui limitent les rendements cellulaires. Le recours à l’utilisation des rats pour étudier les mécanismes d’altération est donc nécessaire et permettra d’identifier des molécules permettant d’augmenter le rendement et la qualité des cellules isolées chez le rat pour une application future sur des échantillons de foie humain.
Réduction
La technique de perfusion de référence est maîtrisée par l'équipe et permet d'obtenir un grand nombre de cellules par animal pour réaliser des tests in vitro. Les animaux utilisés pour la formation aux gestes techniques (n=6) d'hépatectomie partielle au cours de la perfusion permettront aussi d'évaluer de façon préliminaire l'effet de l'hépatectomie sur l'isolement des cellules. 8 groupes de 6 animaux (n=48) seront utilisés pour réaliser deux cinétiques avec et sans cocktail de molécules ; ce nombre a été déterminé comme minimal pour permettre l'analyse statistique par des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des valeurs tout en prenant en compte le risque d'échec de la perfusion.
Raffinement
L'environnement des rats est enrichi (cage avec couvercle surélevé permettant aux animaux de se mettre debout ; bâtonnets de bois et carré de coton sont ajoutés dans la cage) et l'étude est organisée de manière à maintenir le contact social des rats au cours de leur hébergement. Si toutefois un animal présente des signes de maladie ou d'anxiété (absence de prise de poids au cours de l'hébergement, troubles du comportements, signes d'agressions), il est retiré de l'étude et mis à mort pour limiter sa souffrance. Le maintien d'une anesthésie générale tout au long de la procédure permet de supprimer la douleur causée par l’incision de la paroi abdominale. En cas de signes de douleur au cours de l'anesthésie (mouvement des membres ou de la peau), la procédure est suspendue et un tiers de dose d'anesthésique supplémentaire est administré. Si le rat présente toujours des signes de douleur 5 min après l'administration supplémentaire d'anesthésique, la procédure s'arrête et le rat est mis à mort pour limiter sa souffrance. Tous les prélèvements, la perfusion du foie et l'administration des molécules sont réalisés post-mortem pour n’occasionner aucune douleur.
Choix des espèces
L'optimisation des conditions d'isolement des cellules du foie est historiquement faite chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats avec la littérature. Le rat est un modèle classique d’étude du stress cellulaire au cours des lésions dues à l'arrêt de la circulation sanguine puis sa reprise (lésions d'ischémie-reperfusion). Les hépatocytes primaires (cellules principales du foie) de rat, notamment de rat Sprague Dawley, sont un modèle d’étude de référence en pharmacologie préclinique. Les perfusions de foie de rat permettent d’obtenir une quantité suffisante de cellules afin de réaliser des tests (environ 700 millions/Rat) contrairement à la souris (environ 50 millions/Souris). Les rats Sprague Dawley sont commandés à 5 semaines (180-200g) et utilisés à 6 semaines (200-230g), poids standard d'utilisation pour l'isolement des cellules du foie.
Analyse immunohistochimique de l’activation cellulaire dans le système trigéminal dans un modèle de migraine chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
112 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'un composé déclenchant la migraine, puis des stimulations cutanées mécaniques ou électriques sous anesthésie générale irréversible, pour mesurer l'activité de protéines dans le système trigéminal. Le porteur indique que la douleur provoquée constitue l'objet même du projet et qu'aucun antalgique ne peut donc être administré. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et juge l'étude in vivo "nécessaire" parce que l'intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux.
Objectifs
Le but de ce travail est de mesurer sur tissu (coupe d'encéphale), via une approche immunohistochimique, les variations d'expression des différentes protéines, notamment des marqueurs d'activité neuronale/cellulaire, induites par l'injection unique ou répétée d’ISDN, avec ou sans traitement préventif (SNC80), afin de mettre en evidence le rôle du recepteur delta opioide dans le traitement de la migraine. Nous profiterons de cette éxpérience pour valider un nouvel appareil de stimulation électrique, acquis très récemment, et qui doit remplacer la procédure de stimulation manuelle. L’avantage de cet appareil est l’automatisation ce qui nous permets de raffiner notre procédure (moins d’erreur humaine, meilleure reproductibilité, réduction des animaux)
Bénéfices attendus
Nous validons le paramettrage du nouveau stimulateur et nous connaitrons l’effet de la condition de migraine aigu et chronique sur l’activité au niveau du système trigeminal et la possible prevention de cet effet par d’un agoniste DOP
Procédures
Les interventions prévus dans ce projet sont des injections s.c. et i.p sur des animaux vigiles. Chaque animal reçoit au maximum 1 injection s.c. (durée d'intervention: 1min) et entre 2 à 6 injections i.p. (durée d'intervention: 1min, 1 injection / jour). Réalisation des stimulations cutanées sous anesthésie générale irréversible.
Impact sur les animaux
La douleur provoquée constitue la mesure et l'objet de ce projet, aucun antalgique ne peut donc être utilisé. L'allodynie ne se traduit pas par une fuite ou une agressivité lors de la manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort .
Remplacement
Il n’y a pas de méthode alternative permettant de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.
Réduction
Le nombre de groupes de rats et le nombre de rats par groupe sera réduit au maximum tout en préservant une puissance statistique significative. Le nombre de rats par groupe a été fixé à 6/8 en tenant compte du fait, qu’en moyenne et d'après les études précédentes, le groupe ISDN est un peu plus variable par rapport au groupe saline. Les résultats obtenus chez les groupes saline permettront d’une part de valider l’utilisation du stimulateur électrique au sein du laboratoire et d’autre part serviront de contrôles négatifs (témoin) pour comparer aux résultats obtenus avec le groupe ISDN. Nous avons choisis comme groupe temoin de l'effet de l'agoniste SNC810 le worst-case (injections repetée de saline).
Raffinement
Dans le respect du "R "de Raffiner, il est à noter que nos animaux sont sous anesthésie générale lors des stimulations mécanique ou électrique. Concernant la période avant anesthésie, les animaux sont hébergés dans des cages standards bénéficiant d'un enrichissement social et environnemental adapté avec visites quotidiennes. L'expérience du présent modèle de migraine montre que les animaux ne présentent jamais de problème liés aux injections et au développement de l'allodynie mécanique qui pourraient altérer leurs besoins physiologiques et bien être (motricité, postures, reactions aux stimuli lors de la manipulation...). Les manipulateurs sont experimentés pour executer les procedures decrits dans le present projet.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. Rats adultes (6-8 semaines) par raport à la prevalence de pathologie en étude (la migraine).
Etudes pharmacocinétiques de composés ou de dispositifs médicaux libérant des principes actifs chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1800
2 250 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent des injections de principes actifs, l'implantation de matériaux sous anesthésie et des prélèvements sanguins, avant d'être mis à mort et autopsiés pour prélever leurs organes, pour déterminer la cinétique et la biodistribution de composés ou de dispositifs médicaux. Le porteur, une société de recherche contractuelle, indique adapter les points limites aux effets toxiques signalés par ses clients. Il affirme que le passage chez l'animal reste "indispensable" car les tests in vitro ne renseignent pas sur l'absorption, la distribution ou l'élimination des composés.
Objectifs
L'objectif du présent projet est d'évaluer la bio-distribution et de déterminer la cinétique ADMET (Absorption, Distribution, Métabolisme, Elimination, et Toxicité) de principes actifs administrés chez des rongeurs. Les principes actifs seront recherchés au niveau systémique, urinaire, fécal, et dans différents organes. Selon les composés évalués, la nature des prélèvements sera modulée. En parallèle, une analyse histopathologique pourra être réalisée sur certains organes afin de confronter les résultats de la bio-distribution et de l'observation des lésions histologiques sur les organes étudiés. Ces études permettront d'améliorer les schémas thérapeutiques d'administration des composés et de définir les métabolites à rechercher pour les études de toxicologie réglementaires ultérieures. Les traitements seront appliqués selon les schémas thérapeutiques spécifiques aux principes actifs étudiés. De même, un produit de référence pourra être utilisé et choisi pour correspondre au mieux aux principes actifs étudiés. Il sera appliqué selon le schéma thérapeutique spécifique au produit de référence choisi. La durée des protocoles variera en fonction des procédures et des principes actifs étudiés allant de 4 jours à 6 mois. Les animaux pourront être sacrifiés à différents points de cinétiques en cours de protocole, selon la nature des principes actifs étudiés. A chaque sacrifice, une analyse macroscopique des cadavres et des organes à prélever sera réalisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : -Court terme : chaque étude incluse dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la cinétique ADMET des composés étudiées. -Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet permettra d’améliorer la prévention, la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement de maladies, de mauvais états de santé, ou d'autres anomalies ou de leurs effets chez l'homme et/ou les animaux.
Procédures
Les injections des composés en parentérale sont réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés par un mélange isoflurane/air ou suite à la pose de cathéter. La durée des injections varie de 2 à 12 minutes par animal. Les fréquences d’administration dépendent des modes d'action des composés testés. Les différentes injections seront réalisées sur un maximum de 2 mois. Les implantations des matériaux sont réalisées sur animaux anesthésiés par un mélange isoflurane/air. L'implantation dure de 15 à 30 minutes par animal. Un protocole analgésique est également appliqué en péri-opératoire avec de la buprénorhine (Buprecare®). Quelque soit la méthode d’implantation, une seule implantation est réalisée à J0. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés par un mélange isoflurane/air. Les prélèvements sanguins durent 4 à 10 minutes par animal. Certains types de prélèvements nécessite un protocole analgésique (Buprénorphine (Buprecare®). Pour des prélèvements répétés chez les rats, une pose de cathéter connecté à un dispositif chronique de prélèvement peut être réalisé. Les prélèvements sont donc réalisés sur animal vigile directement au niveau du dispositif chronique de prélèvement. Les prélèvements seront réalisés au maximum sur 2 mois. Un volume sanguin de 0,135mL pour une souris de 25g et 1,2mL pour un rat de 250g est prélevé au maximum pour des prélèvements répétés. Une période minimum d’une semaine de récupération est nécessaire à l’animal avant de procéder à un nouveau prélèvement. Les volumes maximaux de prélèvements sanguins seront, pour un prélèvement unique, un volume de 300μl pour une souris de 25g et de 2400μl pour un rat de 250g. Les prélèvements de l’aorte abdominale ne se fera qu’en point final avant sacrifice de l’animal. Les urines peuvent être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où le pool d'urine libéré pendant ce laps de temps sera collecté. Le prélèvement du liquide synovial est réalisé si cela n’affecte pas l’analyse histologique de l’articulation ciblée. Le prélèvement du liquide synovial intra-articulaire se fait sous anesthésie générale par inhalation d'un mélange d'air et d'isoflurane ou sur cadavre en point final.
Impact sur les animaux
Notre société est une société de recherche contractuelle qui mène des études pour l'industrie pharmaceutique, agroalimentaire et biotechnologique. Comptes tenus des prés requis nécessaires à la mise en œuvre d’études in-vivo, nous demandons à nos clients un maximum d’informations permettant d’adapter le design d’étude et les points limites spécifiques aux éventuelles effets toxiques des molécules à tester. Ainsi les effets indésirables attendus sont systématiquements demandés à nos clients avant toute mise en œuvre du projet.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifié, une autopsie minutieuse sera réalisée et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le principe actif et/ou évaluer la toxicité systémique par numération sanguine par exemple. Les organes seront également utilisés pour doser le principe actif et/ou pour réaliser des analyses histopathologiques.
Remplacement
Les principes actifs sont généralement, au préalable, testés in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin de vérifier les interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le Métabolisme, mais en aucun cas ne nous renseignent sur l'Absorption, la Distribution, ou l'Elimination de composés ainsi que leurs éventuelles interactions. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres pharmacocinétiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. D'autre part, les ICH exigent la validation de la pharmacocinétique chez les rongeurs.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux traitements, 15 animaux par groupe ont été prévu afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Pour chacune des procédures, un test statistique de Kruskall-Wallis suivit d'un test de Dunn sera réalisé.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’implantation des dispositifs médicaux, des traitements antalgiques pré et post implantation et dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repéré le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et en s’appuyant sur des grilles de bien-être animal adaptées) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.
Choix des espèces
Les rongeurs ont été choisi pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les paramètres ADMET étant fréquemment évalués chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats chez l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. D'autre part, les ICH exigent la validation de la pharmacocinétique chez les rongeurs. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.
Evaluation de potentiels effets cardiovasculaires de candidats médicaments sur les rongeurs anesthésiés (rats, cobayes et souris)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1350
Cochons d'Inde : 3030
5 730 souris, rats et cobayes vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils subissent une chirurgie puis des mesures de pression artérielle, de fréquence cardiaque et d'électrocardiogramme sous anesthésie, avec des prélèvements sanguins, pour évaluer les effets cardiovasculaires de candidats médicaments avant leur mise sur le marché. Le porteur présente cette évaluation comme un passage "obligatoire" des études réglementaires de pharmacologie de sécurité. Il affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne suffit à étudier les effets d'un composé sur la fonction cardiovasculaire de l'animal entier.
Objectifs
Le projet a pour objectif d'évaluer les potentiels effets secondaires d'un futur médicament sur le système cardiovasculaire chez le rongeur sous anesthésie. En effet, avant la mise sur le marché d'un nouveau médicament, l'évaluation de ses effets hémodynamiques (sur les pressions artérielle/ ventriculaire et la fréquence cardiaque) et électrophysiologiques (sur l'électrocardiogramme) est indispensable. Ce projet est réalisé dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité précliniques réglementaires.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le processus de mise sur le marché de nouveaux médicaments. L'évaluation de potentiels effets secondaires sur le système cardiovasculaire de l'animal est un passage important et obligatoire avant une administration chez l'Homme. Ainsi, ce projet permet de réaliser des études de pharmacologie de sécurité obligatoire et donc, de vérifier si des substances ont des effets secondaires sur les fonctions cardiovasculaires. Ainsi, les bénéfices attendus du projet sont le développement de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires cardiovasculaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'Homme.
Procédures
La procédure de ce projet décrit différents types d'interventions. Les animaux subiront une chirurgie, sous anesthésie générale, afin de pouvoir faire les mesures des paramètres cardiovasculaires (toujours sous anesthésie). Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant cette procédure, sous anesthésie également. Ainsi tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure (=procédure sans réveil). La durée totale d'une expérience n'excédera pas 4 heures. Les animaux seront traités avec le futur médicament soit avant la phase de chirugie, soit après.
Impact sur les animaux
La contention de l'animal vigile pour induire l'anesthésie ou administrer le produit peut engendrer un stress mineur à l'animal. Concernant la chirurgie, son protocole est maitrisé et la profondeur de l'anesthésie est suivie tout au long de l'expérience pour éviter toutes douleurs à l'animal (i.e monitoring de l'état de non conscience de l'animal). Dans tous les cas, l’impact négatif pour l’animal sera réduit au maximum depuis l'hébergement jusqu'à la fin de l'expérience.
Devenir
Les procédures décrites dans ce projet sont des procédures sans réveil. Ainsi tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérience.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat, le cobaye ou la souris car il n'existe pas de méthode de substitution in silico ou in vitro pour étudier les effets d'un candidat médicament sur la fonction cardiovasculaire des animaux. Ou si ces méthodes existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre à l'intégralité des objectifs scientifiques du projet. Or, avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier (l'animal) constitue un passage obligatoire pour l'évaluation des effets secondaires sur la fonction cardiovasculaire d'un candidat médicament. A ce jour, le rat, le cobaye et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Ce nombre (en général n=6-8/groupe) est calculé pour pouvoir réaliser une analyse statistique robuste.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, dont l'anesthésie qui sera si necessaire associée à un anti-douleur (type morphinique/opiacé) ou anti-inflammatoire (en cas d'instabilité des paramètres cardiovasculaires après chirurgie)• Un monitoring complet de l'anesthésie pour éviter la reprise de conscience • la formation du personnel • Le suivi d’éventuel signes cliniques • La détermination des points limites • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire • Des conditions d’hébergement (avant expérience) adaptées et optimisées pour améliorer le bien-être animal • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
Le rat, le cobaye et la souris sont les espèces animales couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur le système cardiovasculaire, de façon à limiter l'utilisation d'espèces animales plus grandes. Ce projet concerne des animaux adultes. Il n’a pas pour objectif d’étudier les effets d'un produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Intérêt de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) dans la détection du risque d’hydrocéphalie associé à l’administration intrathécale d’oligonucléotides chez le rat : implication dans le traitement des atteintes du système nerveux central
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
430 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte du kaolin ou du liquide cérébrospinal dans la grande citerne pour provoquer une hydrocéphalie, puis ils subissent des chirurgies intrathécales répétées, jusqu'à cinq IRM sous anesthésie et une perfusion intracardiaque terminale, pour évaluer la toxicité d'oligonucléotides antisens administrés dans le système nerveux central. Le porteur indique que le modèle kaolin peut entraîner des sécrétions nasales et orbitales de sang et une euthanasie dans les cinq jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité des mécanismes en jeu et qu'il est "indispensable" d'évaluer cette toxicité avant les études cliniques.
Objectifs
L'hydrocéphalie est une pathologie neurologique dans laquelle une quantité excessive de liquide cérébrospinal (LCS) s'accumule dans le cerveau (au niveau des ventricules, cavités naturelles de cet organe). Il se produit alors une dilatation et les tissus environnants sont compressés entravant le bon fonctionnement cérébral. Les causes d’hydrocéphalie sont multiples : elles peuvent être congénitales, infectieuses, hémorragiques tumorales ou médicamenteuses. L’hydrocéphalie est souvent diagnostiquée avec des tests d’imagerie tels que l’imagerie par résonance magnétique (IRM) qui est devenue l’examen de référence pour ce type de pathologie. En clinique, de nouvelles thérapies utilisant l’administration de molécules appelées oligonucléotides antisens (ASO) sont actuellement proposées. Il s’agit de petites molécules d’acide nucléique qui vont venir réprimer l’expression protéique d’un gène d’intérêt. Ces composés ne franchissent pas aisément la barrière hématoencéphalique; d’où la nécessité, dans le cadre du traitement des atteintes du système nerveux central, d’administrer les candidats-médicaments par voie intrathécale (dans l’espace où circule le LCS). Or, quelques cas d’hydrocéphalie ont été rapportés suite à des injections réalisées par voie intrathécale de ce genre de composés. Dans ce contexte, il apparaît important d’évaluer le profil sécurité des candidats-médicaments en préclinique sur ce point de vigilance. Dans ce contexte, nous proposons d’évaluer en IRM, chez le rat, le risque d’hydrocéphalie associé à l’injection intrathécale d’ASO amenés à être proposés au développement clinique chez l’humain, pour le traitement d’atteintes cérébrales spécifiques. Ce projet se décompose en deux parties. Dans un premier temps, nous chercherons à reproduire, chez le rat, un modèle d’hydrocéphalie déjà bien caractérisé de façon à optimiser l’acquisition et le traitement des données imagerie IRM pour la détection d’anomalies cérébrales associées à cette pathologie. Puis, nous chercherons ensuite à évaluer l’effet de différents ASO administrés par voie intrathécale sur les paramètres volumétriques tels que le volume des ventricules cérébraux, la taille globale du cerveau, et/ou déformations des différentes structures cérébrales. Ce projet permettra de sécuriser l’approche en développement clinique de ces produits qui pourraient être proposés comme traitement de maladies invalidantes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à terme de valider les méthodologies pour la sélection des meilleurs candidats médicaments nécessitant une injection par voie intrathécale pour le passage en développement clinique.
Procédures
• Imagerie IRM sur animal anesthésié : jusqu’à 5 sessions d’imagerie/animal espacées au moins d’une semaine d’intervalle sur une durée maximale de 5 mois. Durée maximale d’une session IRM/animal : 1 heure • Injection unique (CSF ou kaolin) au niveau de la grande citerne. La durée de la procédure n’excèdera pas 20min • Chirurgie intrathécale pour administration des ASO : 3 administrations à une semaine d’intervalle. C’est ce qu’on appelle le « bolus de charge » et qui sera la méthodologie préconisée chez l’humain. La procédure chirurgicale n’excèdera pas 30min • Prélèvements sanguins et de LCS chez animal anesthésié juste au moment du sacrifice (stade terminal sans réveil) • Perfusion intra-cardiaque PFA 4% pour permettre l’analyse histologique post-mortem des tissus cérébraux. La durée de la procédure n’excèdera pas 15min
Impact sur les animaux
Ce projet permettra justement de définir quels peuvent être les effets indésirables associés à l’administration répétée par voie intrathécale (dans l’espace où circule le liquide cérébrospinal) d’un traitement par oligonucléotides antisens (ASO) destiné à traiter des atteintes du système nerveux central ; voie d’administration préconisée chez l’humain. Effets indésirables liés à l’apparition d’une hydrocéphalie chez le rat. Possibilité de sécrétions nasales et orbitales de sang et de liquide clair dans les quelques jours suivant l’induction. Selon la littérature, ces évènements n’ont pas été rapportés dans le modèle kaolin (euthanasie dans les 5 jours suivants l’injection) que nous souhaitons évaluer en imagerie IRM. Effets indésirables liés à l’administration intrathécale de composés. Paralysie des membres postérieurs, inflammation locale au niveau du site d’injection, paralysie motricité vésicale ou digestive. L’administration des composés est réalisée en conditions d’aseptie optimale de façon à limiter la survenue d’effets indésirables associés à cette voie d’administration. Effets indésirables liés aux anesthésies successives Anesthésie gazeuse (isoflurane) durant les examens IRM et procédure chirurgicale. Aucun effet indésirable n’est attendu. Surveillance des paramètres physiologiques (température, respiration) durant toute la session d’acquisition des données imagerie ou chirurgie. Surveillance des animaux (en chambre thermostatée) jusqu’à leur réveil avant réintroduction dans leur cage.
Devenir
Pour chaque procédure les animaux doivent être euthanasiés pour analyse post-mortem (analyse immuno-histochimiques et dosages biochimiques) et corrélation avec les données d’imagerie acquises in vivo.
Remplacement
Il est indispensable de pouvoir évaluer la toxicité de candidats médicaments et définir la marge sécurité pour les futures études cliniques. Actuellement les études in vitro permettent de sélectionner une grande partie des composés et de restreindre drastiquement le nombre de produits qui seront testés in vivo. Cependant, il n’existe aucun modèle in vitro ou synthétique qui récapitulerait la complexité des mécanismes déclenchés par l’administration d’un candidat médicament dans un organisme ; Le recours à l’animal reste donc obligatoire et nécessaire pour envisager les études réglementaires qui permettront de poursuivre le développement du produit jusqu’à l’autorisation de mise sur le marché.
Réduction
Dans ce projet, le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour garder une puissance statistique raisonnable et s’assurer que les résultats puissent être exploitables en vue de la variabilité inter-individuelle. Généralement, un minimum de n=10 animaux/groupe est nécessaire quand nous cherchons à mesurer des paramètres en imagerie pour lesquels nous n’avons pas d’expérience au préalable. Le fait d’envisager un suivi continu en imagerie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les études en limitant l'euthanasie à différents temps.
Raffinement
Les composantes physiologiques seront surveillées durant les examens d’imagerie : respiration, température corporelle. Le réveil de l’animal se fera en chambre thermostatée avant sa réintroduction dans sa cage L’alimentation et l’eau de boisson seront disponibles à volonté Les procédures de chirurgie intrathécale seront accompagnées par des injections d’analgésiques (avant et après la chirurgie) Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt tout signe d’inconfort ou de douleur qui pourraient survenir, et administrer le soin correspondant
Choix des espèces
La réglementation impose que les études de toxicologie soient effectuées sur une espèce de rongeur au minimum. Dans ce projet, le choix du rat est privilégié du fait que l’injection intrathécale des composés est possible chez cette espèce, à la différence de la souris. Les volumes des prélèvements (sang, LCS) pour l’identification de biomarqueurs sont potentiellement également plus importants chez le rat que chez la souris; ce qui facilite les dosages sans à priori. L’évaluation de la tolérance chez le rat de l’administration intrathécale de candidats médicaments préalablement sélectionnés (criblage in vitro/études chez la souris) aidera aux choix des doses à évaluer sur une espèce non rongeur avant le début des essais cliniques où la voie d’administration intrathécale est celle qui sera préconisé chez l’humain. Dans ce projet, nous utiliserons des rats Wistar pour lesquels nous disposons déjà de données historiques concernant les analyses biochimiques et de formulation sanguine. Dans ce ce projet, nous utiliserons des rats jeunes ou adultes, conformément aux requis réglementaires
Étude pilote d’une stratégie de thérapie génique pour le traitement préclinique d’un modèle de rat myopathe
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
132 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Porteurs d'une dystrophie musculaire qui leur fait perdre progressivement de la masse corporelle, ils reçoivent des injections de vecteurs viraux, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie avant d'être mis à mort par injection létale de pentobarbital, pour tester une thérapie génique de la myopathie de Duchenne. Le porteur indique que la mort des cellules musculaires peut provoquer un processus inflammatoire douloureux, anticipé par de la buprénorphine. Il affirme que le rat mime la maladie humaine "beaucoup plus fidèlement" que la souris myopathe et conclut à la nécessité d'une validation in vivo.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) survient lorsque la mutation du gène de la dystrophine provoque un manque de protéine fonctionnelle, entraînant une faiblesse musculaire progressive profonde. La transmission de la maladie est liée au chromosome X, les garçons atteints de la maladie perdent graduellement la capacité de marcher, et la plupart deviennent dépendants du fauteuil roulant et de la ventilation artificielle au fil du temps. Cette maladie est à ce jour incurable et l’âge moyen de survie sans traitement est de 19 ans, l'insuffisance cardio-respiratoire étant la cause la plus fréquente de décès. La prise en charge symptomatique, pluridisciplinaire, vise à optimiser la qualité de vie des patients mais aussi leur espérance de vie. Les progrès thérapeutiques réalisés au cours des dernières décennies ont permis de transformer le pronostic. Plus de 90 % des enfants atteints de DMD vivent désormais jusqu’à l’âge adulte et certains atteignent aujourd’hui l’âge de 40 ans. Plusieurs nouvelles approches pour le traitement de la DMD sont en cours d'approbation et de développement. Une étape critique est d'abord de déterminer l'efficacité et la sécurité de ces traitements en utilisant un modèle animal de la maladie. La stratégie de thérapie utilisée dans ce projet vise à démontrer l'efficacité d'un vecteur viral de thérapie génique permettant de rétablie l'expression d'une dystrophine plus courte mais fonctionnelle qui pourra préserver ou restaurer la structure et la fonction des cellules musculaires touchées par la maladie.
Bénéfices attendus
Grâce à l'étude des effets de cette stratégie thérapeutique sur la structure du tissu musculaire, nous comptons déterminer le meilleur vecteur de thérapie génique et évaluer l'efficacité de ce type de thérapie sur le processus de reconstruction musculaire suite à la restauration de la dystrophine musculaire et sur l'évolution de la maladie. A court terme si une des stratégies se révèle avoir un effet thérapeutique positif, elle sera testée à l'aide d'une injection dans la circulation sanguine générale pour permettre une analyse des fonctions des muscles squelettiques et cardiaque à l'echelle de l'organisme entier. A plus long terme, on peut espérer un essai pré-clinique dans un modèle animal myopathe de plus grande taille et une transposition aux patients dans un essai clinique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles, ni aucune chirurgie ne sont prévus. L'injection des vecteurs viraux (procédure test du sérotype et procédures test de thérapie génique précoce et tardive), n'est pas douloureuse en soit mais peut produire une réaction inflammatoire prise en charge par antalgique. La mesure de force des muscles traités, critère d’évaluation de l’efficacité du traitement, nécessite une immobilisation et l'utilisation d'éléctrodes musculaires est rélaisée sous anesthésie injectable, 1 fois avant la mise à mort pour les animaux inclus dans les essais de thérapie précoce et tardive. Les animaux étant anesthésié et mis à mort immédiatement après la mesure de force, ils ne ressentent pas de douleur.
Impact sur les animaux
La mort des cellules musculaires peut induire un processus transistoire douloureux d'origine inflammatoire dont nous connaissons bien les conséquences que nous anticipons par des injections de buprénorphine. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. Nous connaissons bien l'évolution de la maladie, ce qui permet une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Les procédures 2 et 3 de ce projet incluent des animaux chez lesquels les nuisances musculaires de l'évolution spontanée de la maladie sont limitées et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers. Les vecteurs viraux utilisés ont été choisis pour optimiser l’efficacité de la thérapie génique et minimiser la réponse immunitaire.
Devenir
A l'issue des trois procédures expérimentales, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par une injection létale de pentobarbital.
Remplacement
Toutes les constructions incluses dans les vecteurs viraux et utilisées dans cette saisine ont été évaluées et validées in vitro sur cellules musculaires isolées à partir de rats DMD. Elles ont donc un potentiel thérapeutique qu'il faut maintenant évaluer in vivo lorsque les cellules musculaires sont dans leur environnement en interactions avec les autres types cellulaires présents dans un muscle en conditions pathologiques ce qui n'est possible que sur un animal vivant.
Réduction
Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec d'autres candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Il apparaît que pour chacun des lots, traiter 5 à 7 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution de la maladie. Le problème majeur auquel nous avons été confrontés est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Malgré nos soins, nous avons déploré l'absence de réveil chez quelques animaux. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique, on puisse traiter les données de 5 à 7 animaux arrivés au terme de la procédure. Au bilan, chacun des lots a pu être réduit à 6-8 animaux en fonction des analyses faites. Dans le cas présent, 6 animaux par lot seront suffisants. A des fins de réduction et de formation, les femelles sauvages issues de nos croisements, dont nous ne nous servons pas dans nos procédures d'élevage ou expérimentales, serviront lors de leur mise à mort à l'entrainement de nos étudiants au prélèvement post-mortem d'organes .
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début puis ce nombre est progressivement réduit jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. Dans le cadre du développement de la pathologie nous prêterons attention à l'apparatition des points limites tels que la perte de mobilité, la prostration, une lordose excessive, la dégradation du pelage, la vocalisation anormale (hors contention) ou des grimaces faciales. La cause de la douleur sera recherchée et des antalgiques pourront être prescrits, notamment sur les animaux DMD au delà de 8 mois, nous pourrons utiliser un anti-inflammatoire ou un opioïde après consultation du vétérinaire référent. La survenue de l'un des points ci-dessus associé à une perte de poids sur une semaine dépassant 20% du poids maximal atteint par l’animal et non compensée par la mise à disposition de nourriture humide et d’hydrogel en fond de cage entrainera la mise à mort compassionnelle de l'animal concerné. Lors de l'infection virale les animaux sont injectés une fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie (au démarrage de la procédure puis en fin de procédure) et une fois dans le muscle pour l'injection des vecteurs viraux (procédure test du sérotype et procédures test de thérapie génique précoce et tardive ). Ils sont préventivement injectés 3 fois par jours pendant 2-3 jours avec une molécule qui supprime la douleur, par voie sous-cutanée, en même temps que l'examen clinique pour éviter de les déranger inutilement. La mesure de force inclue également des antalgiques en plus de l'anesthésie générale garantissant que les animaux ne souffrent pas.
Choix des espèces
Le rat, une espèce de mammifère phylogénétiquement proche de l'homme, constitue un modèle apprécié. Les récents outils de manipulation du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris myopathe, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Dans cette saisine nous utiliserons, 1) des jeunes animaux sevrés reçus dans notre EU à l'âge de 3 semaines pour une semaine d'acclimatation puis inclus dans nos cohortes d'étude à partir de 4 semaines, pour les essais de vecteurs et la thérapie précoce, parce qu'ils correspondent au stade post-sevrage le plus précoce pour initier un traitement dans la phase asymptomatique de la maladie; 2) des animaux âgés de 6 mois pour l'essai de thérapie tardive parce qu'ils sont clairement symptomatiques. Si le traitement est efficace, il est attendu une diminution voir un arrêt de l'évolution de la maladie dans le muscle traité chez les animaux jeunes, et un ralentissement ou un arrêt voir une réversion du développement de la maladie dans le muscle traité chez les animaux âgés.
Etude des bases cellulaires de l‘oubli adaptatif chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
54 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent une craniotomie avec implantation d'électrodes intracérébrales sous anesthésie, puis une restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pendant toute une tâche de mémoire spatiale dans un labyrinthe radial, pour étudier les bases cellulaires de l'oubli adaptatif. Le porteur indique que tous les animaux sont mis à mort afin de vérifier l'emplacement des électrodes et de réaliser des marquages histologiques. Sur le remplacement, il affirme que cette tâche d'apprentissage exige l'"animal entier" et conclut qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut s'y substituer.
Objectifs
L’oubli adaptatif est un processus nécessaire à la vie quotidienne permettant d’oublier des informations non pertinente à un moment donné afin qu’elles n’interfèrent pas avec d’autres informations utiles. Cet oubli adaptatif est notamment indispensable au bon fonctionnement d’une mémoire à court terme appelée mémoire de travail que nous utilisons dans la vie quotidienne. Le principal objectif du projet est d’avoir une meilleure compréhension des bases cellulaires de l’oubli adaptatif se mettant en place (ou non) au cours de tâches de mémoire spatiale. Plus particulièrement il s’agira de caractériser les modifications individuelles d’activité de différents types de neurones dans différentes structures connues pour être impliquées dans la mémoire et l’oubli adaptatif. Cette caractérisation nous permettra également de mieux connaître les dynamiques (d’un point de vue localisation et temporalité) de réseaux soutenant la mise en mémoire ou l’oubli adaptatif d’informations spatiales. Un objectif annexe sera d’étudier l’effet particulier de ces mêmes tâches sur les cellules de lieux présentes dans l’hippocampe et de caractériser leurs interactions avec les réseaux évoqués précédemment.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux connaître les bases neuronales nécessaires à la mise en place de l’oubli adaptatif mais également comment les modifications supportant cet oubli évoluent dans le temps et l’espace. Notre hypotèse principale est qu’un mécanisme de dépotentialisation de la transmission entre deux neurones déjà connu (LTD pour long-term depression) serai le support de cet oubli adaptatif et permettrai de faire le « tri » entre les informations pertinentes à conserver en mémoire et celles inutiles qui créeraient des interférences. Or, de récentes études montrer qu’une dérégulation des gènes impliqués dans cette LTD pourrait être associée aux troubles du spectre autistique qui, certes, peuvent dans certains cas « booster » les capacités de mémorisation (diminution de l’oubli « normal »), mais aussi profondément perturber le comportement d’un individu. Déterminer les mécanismes moléculaires de cette LTD qui sous-tendrait l’oubli adaptatif et la gestion efficace des interférences en mémoire de travail parait donc aujourd’hui tout aussi essentiel que comprendre ceux régissant la consolidation des informations en mémoire à long terme. L’étude de ces mécanismes pourraient nous permettre à long terme de mieux comprendre et donc éventuellement traiter des pathologies liées à la perturbation de la transmission neuronale.
Procédures
Les principales interventions sur les animaux sont les suivantes : - Une chirurgie d’implantation d’électrodes, impliquant une craniotomie, réalisée sous anesthésie (1 chirurgie/animal, environ 4h prévues pour chaque intervention) - Une restriction alimentaire aboutissant à un maintien des animaux à 90% de leur poids normal au meme age. Cette restriction alimentaire est maintenue tout au long du protocole sauf en pré- et post-chirurgie. - La passation dans une tâche comportementale dans un labyrinthe radial. En phase d’habituation les animaux effectueront 1 session d’environ 1h/jour (le nombre de jours d’habituation varie en fonction de l’animal, entre 12 et 15). En phase de test, les animaux effectueront 1 session de 3h environ/jour x2 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie pour implanter des électrodes au sein des structures visées : gyrus denté, CA1 et cortex pariétal pour l’enregistrement et voie perforante et cortex cingulaire pour les stimulations, ainsi qu’une électrodes d‘electroencephalogramme et une d’electromyogramme en controlatéral. Les autres effets indésirables attendus sur les animaux découlent principalement de la restriction alimentaire qu’ils subiront tout le long de la procédure comportementale : les rats seront maintenus à 90% de leur poids durant la totalité de la procédure. Durant cette même procédure les animaux seront manipulés quotidiennement par l'expérimentateur. Le stress que cela pourrait générer sera toutefois minimisé par une habituation longue et adaptée selon les besoins de chaque animal. Pour des raisons de sécurité dues à la présence des électrodes et la restriction alimentaire, les animaux seront hébergés individuellement.
Devenir
Tous les animaux de cette étude seront mis a mort à l'issue du protocole. En effet des vérifications histologiques d’implantation des électrodes devront être effectuées avant de pouvoir inclure les enregistrements issus d’un animal dans nos données. Des marquages immunohistochimiques seront réalisés pour réaliser une comparaison avec de précédents résultats de l’équipe et pouvoir valider ce nouveau protocole.
Remplacement
La nature même de l’expérience ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elle repose sur une tâche d'apprentissage complexe que les animaux effectuent et ne peut donc pas être réalisée à partir de modèles in vitro ou in silico car nécessitant l’animal entier comme modèle expérimental. Par ailleurs, du fait du caractère invasif de la procédure (implantation d'électrodes intra-cérebrales), cette procédure ne peut pas non plus être conduite chez l'humain. On ne peut donc envisager pour l'instant une méthode alternative de modélisation qui ne nécessiterait pas l'utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum (n = 6 pour chaque groupe, soit 18 animaux). Le protocole utilisé étant nouveau., il sera nécessaire de refaire passer des animaux uniquement en comportement pour vérifier que le changement de paradigme ne modifie pas les résultats comportementaux attendus (n = 10 pour chaque groupe, soit 30 animaux). Ce nombre d’animaux est nécessaire car nous allons étudier différents apprentissages comportementaux ainsi que leur contrôles et de par la nature des tâches, un rat ne peut en effectuer plusieurs (les phénomènes de sur-apprentissage biaisant les performances comportementales). A ce nombre minimum s’ajoutent 6 animaux afin de prendre en compte les risques de mortalité liés aux chirurgies et à la perte des électrodes. Notre étude nécessitera donc 54 animaux au total (3 groupes de 6 animaux par groupe + 6 pour prendre en compte les risques de mortalité (chirurgie, implant, etc) + 3x10 pour un groupe de rats validant notre protocole comportemental). L’utilisation de microdescendeurs à haute densité permet de réduire le nombre d’animaux en permettant d’enregistrer plus de neurones et plus longtemps. Le fait d’étudier différentes structures chez un même animal et le fait que chaque animal sera son propre contrôle par rapport aux effets de l’habituation permet également de réduire le nombre de rats nécessaire à ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en binômes avant la mise en place de la restriction alimentaire. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés, toujours individuellement dans des cages rehaussées (+13cm) afin qu’ils puissent se déplacer sans que l'implant n’entrave leurs mouvements. Pour pallier au maximum à l’hébergement individuel, une fois l’isolement nécessaire les anciens binômes seront hébergés côte à côte dans des cages transparentes et ouvertes où ils pourront se voir, se sentir et communiquer. Chirurgie : durant la procédure chirurgicale l'anesthésie générale profonde sera assurée par l'association d'un agent volatil (isoflurane) et d'un dérivé morphinique (buprénorphine). La buprénorphine agira également comme un analgésique puissant pendant 6h après l'injection, couvrant donc la totalité de la durée de la chirugie et sera également associée à un AINS longue durée (carprophène, 24h d'action) et un analgésique local (lidocaïne) assurant ainsi une couverture analgésique optimale pendant la chirurgie. Durant la phase post-chirurgicale, l'animal aura accès à un complément alimentaire riche en eau et en nutriments (hydrogel) en plus de sa nourriture standard ad libitum pour faciliter sa rémission. Le suivi de l'état de l'animal dans la phase post-chirurgicale sera fait deux fois par jour durant toute la période de rémission (5 à 10 jours) et visera à évaluer le niveau de douleur et/ou de détresse du rat. Une prise en charge analgésique sera mise en place si nécessaire. Le degré sera adapté à l'état de l'animal pour faire disparaître toute manifestation de douleur ou de détresse. Nous mettons aussi en place des points limites stricts et spécifiques au projet pour evaluer toute détresse et y pallier. Tâches comportementales : la restriction alimentaire nécessaire à l’induction de la motivation dans notre tâche d’apprentissage ainsi que ses conséquences seront hautement contrôlées (de précédentes expériences de l’équipe montrent que la perte de poids modérée (maximum 10% de leur poids initial) est bien supportée par les rats). La procédure comportementale sera précédée d’une période d’habituation à l’expérimentateur, à la pièce et au matériel d’expérimentation, dans le but de faire disparaître tout stress lié à la manipulation des animaux ou l’agencement du labyrinthe. La durée de cette période d’habituation sera adaptée aux besoins de chaque animal.
Choix des espèces
Ce protocole nécessite un apprentissage de paradigmes comportementaux. Le rat est donc préféré à la souris quand cela est possible puisqu’il est moins facilement stressé et possède un répertoire comportemental plus riche. Il existe notamment une large littérature traitant des bonnes performances des rats dans des tâches d’orientation spatiale et de planification. La souche Dark Agouti possède une bonne vision ce qui est nécessaire pour nos tâches d'orientation spatiale dans un labyrinthe. Cette souche est également peu agressive et facilement manipulable. Les rats de souche Dark Agouti sont de plus consanguins ce qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle. Les animaux auront 10 semaines lors de leur réception et de leur intégration dans le protocole, ce qui correspond à de jeunes adultes ayant atteint leur maturité cérébrale et étant à leur pic de capacités cognitives, qui resteront inchangées tout au long de l’expérience.