Rats

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue et le cerveau prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus d'une lignée trisomique dont le porteur reconnaît le phénotype "dommageable", petite taille dans 80 % des cas et dermites à staphylocoque exigeant des antibiotiques chez la moitié d'entre eux, ils reçoivent pendant seize jours une molécule par voie intrapéritonéale puis passent le test de la piscine de Morris. Ce test d'apprentissage impose des séances de nage répétées, les animaux en difficulté ou épuisés étant retirés de l'étude. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour étudier les déficits cognitifs et propose comme candidat un médicament déjà utilisé contre l'alcoolisme.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 est la première cause de retard mental d’origine génétique. Le SD est lié à la présence d’une copie supplémentaire du chromosome 21 et touche 1 naissance sur 700. Il se caractérise par des déficiences intellectuelles : les personnes atteintes de SD ont des difficultés d’apprentissage et de mémorisation qui sont liées à des défauts dans le développement et le fonctionnement du cerveau. Cette anomalie chromosomique conduit à une surexpression des gènes du chromosome 21 humain, perturbant de nombreux systèmes physiologiques, morphologiques et biochimiques. Ces dérégulations se font de manière directe via l’augmentation de la production de protéines, ou indirecte à travers une multitude d’interactions de ces protéines sur l’ensemble du génome. Nous avons démontré le rôle du surdosage d'une protéine dans le modèle de rat SD, comme l'un des principaux moteurs du dysfonctionnement cognitif. Afin de mieux comprendre la conséquence du surdosage de cette protéine sur le fonctionnement cérébral dans notre modèle de rat SD et de développer une stratégie thérapeutique, notre projet est de tester une molécule qui est un médicament utilisé en clinique dans le traitement de l'alcoolisme, qui peut inhiber cette protéine dans un environnement cellulaire, et d’évaluer les capacités cognitives de notre modèle de rat SD.

Bénéfices attendus

La création et la caractérisation d’un modèle de rat portant la même mutation que l'humain, a permis de comprendre que la conséquence du surdosage d'une protéine est l'un des principaux moteurs du dysfonctionnement cognitif chez les patients trisomiques. Il n’existe à ce jour aucun traitement qui permet de restaurer les performances cognitives chez les patients. Toute molécule capable d’inhiber ou de réduire le surdosage de cette protéine sera potentiellement donc d’un grand bénéfice pour les patients.

Procédures

Nous allons réaliser les interventions suivantes : -Administration de composés par voie intra-péritonéale (moins d'une minute par rat) une fois par jour pendant 16 jours -test d'apprentissage dans la piscine de Morris : La durée du test est sur 7 jours : les 2 premiers jours 4 essais de 90s espacés d'1h sont réalisés chaque jour. Les 4 jours suivants, 2 essais de 90s, espacés de 2h, par jour. Le dernier jour, un seul essai de 90s. -Un prélèvement sanguin à la veine temporale superficielle (2 minutes par rat).

Impact sur les animaux

Le phénotype du notre modèle animal utilisé est considéré comme dommageable. En effet, les anomalies suivantes ont été observées : -Animaux de petite taille (80% des cas) -Dermites à Staphylococcus aureus nécessitant des traitements antibiotiques locaux (50%) voire des traitements antibiotiques généraux (20%). Concernant le SD, aucun phénotype délétère n’est observé chez ces rats dans leur environnement. Lors de l’injection par voie intrapéritonéale, une surveillance du site d'injection sera effectuée et un soin local pourra être appliqué en cas de lésion ou d'infection du site. Lors du test d'apprentissage (Piscine de Morris), les animaux présentant des problèmes de nage ou d'épuisement seront retirés de l'étude. Après les prélèvements sanguins, une surveillance de l'état des animaux, en s'assurant notamment qu'il n'y a pas de saignement au niveau de la zone de prélèvement.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés puis les cerveaux seront prélevés en vue d'analyses post-mortem (structures cérébrales).

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle pas d’alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. En effet, l’étude de déficits cognitifs nécessite un modèle vivant et suffisamment proche de l’Homme pour pouvoir être transposé à l’espèce humaine. Par ailleurs, il n’existe pas encore de modèle de cerveau in vitro ou autre permettant de réaliser de la recherche fondamentale dans ce domaine.

Réduction

Dans cette étude, nous comparerons trois groupes de rats: un groupe de rats contrôle négatif (sauvages + véhicule) ; un groupe de rats contrôle positif (mutant trisomique + véhicule) et le groupe d’intérêt (mutant trisomique + molécule à tester). Chaque groupe sera composé de 20 rats. En ce qui concerne le sexe, comme nous n’attendons pas à avoir un effet sexe, les 2 sexes seront utilisés (on veillera à avoir des groupes de mêmes proportions). Nous avons évalué le nombre de rats nécessaire pour pouvoir valider de façon statistique (test de Mann et Whitney) l’hypothèse que l’effet du traitement entre les groupes n’est pas nul. En fonction de ces paramètres, 20 rats par groupe seront nécessaires pour notre étude.

Raffinement

Du fait de leurs phénotypes dommageables, ces animaux font l’objet d’une attention particulière afin de pouvoir détecter le plus précocement possible tous problèmes pouvant altérer leur bien-être. Les animaux seront ainsi suivis quotidiennement tout au long de leur vie. Si un animal présente des signes de douleur ou de mal être, il sera présenté au vétérinaire puis, si un traitement est envisageable, il sera mis en place (on utilisera des anti-inflammatoires). A noter que le traitement utilisé devra être adapté au cas par cas en fonction des symptômes rencontrés. Si aucun traitement n’est envisageable, l’animal sera mis à mort. Par ailleurs, tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par 2 et disposeront d’un bâton à ronger comme enrichissement.

Choix des espèces

Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez cette espèce. De plus, les régions homologues du chromosome 21 humain sont retrouvées sur 2 chromosomes chez le rat contre 3 chez la souris. L’obtention d’un modèle de trisomie complète est donc plus simple à obtenir chez le rat. Le rat constitue ainsi un modèle de choix pour générer des modèles de maladies humaines pour le syndrome de down. Les rats seront adultes, agés de 15 à 16 semaines environ au début des tests. l'ensemble des tests sera réalisé sur une période de 3 semaines.

974 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection du parasite du paludisme puis subissent des prélèvements sanguins quotidiens pendant sept à dix jours, pour évaluer l'effet d'une mutation sur la résistance à la sulfadoxine. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une hyperparasitémie, une anémie et un neuropaludisme, et précise qu'aucun analgésique ne sera administré pour ne pas fausser les résultats. Il affirme que les tests in vitro se sont révélés non reproductibles et qualifie le modèle murin d'"indispensable".

Objectifs

La combinaison sulfadoxine/pyriméthamine est le traitement prophylactique recommandé pour la prévention du paludisme chez la femme enceinte et l’enfant de moins de 5 ans. Cependant, la résistance à cette combinaison thérapeutique est due à l’émergence de mutations sur les gènes dhfr et dhps de Plasmodium falciparum. La mutation I431V de DHPS chez P. falciparum fut identifiée pour la première fois au Nigéria en 2006 et des quintuples mutants de DHPS furent décrits en Afrique Centrale. Cette nouvelle mutation semble être une mutation émergente dans ces pays. A ce jour il n’existe aucune donnée phénotypique de ce génotype. Les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciparum n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. La forte homologie entre les enzymes DHPS de P. falciparum et de P. berghei fait du parasite murin un bon modèle d’études du niveau de résistance à la sulfadoxine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir les premières données phénotypiques dues à la nouvelle mutation I431V de DHPS décrite en Afrique Centrale. L’évaluation de l’effet de cette mutation sur la résistance à la sulfadoxine est primordiale et indispensable pour prédire de l’efficacité du traitement préventif intermittent par sulfadoxine/pyriméthamine utilisé chez les femmes enceintes et les enfants de moins de 5 ans. Ce travail sera une première étape qui permettra d’évaluer la nécessité de la mise en place d’études à grande échelle sur le terrain afin d’actualiser les recommandations mondiales.

Procédures

Injection par voie intra-péritonéale (1 injection, durée estimée 10 secondes). Induction d'une maladie expérimentale : paludisme pendant 7 à 10 jours. Prélèvement sanguin quotidien pendant 7 à 10 jours (durée estimée 10 secondes).

Impact sur les animaux

La souris peut développer une hyperparasitémie accompagnée d’anémie et/ou un neuropaludisme. La surveillance et le suivi quotidiens de la parasitémie permettront de s’affranchir de ces risques.

Devenir

Procédure 1 : Souris et rat euthanasiés au CO2 pour réalisation d'exsanguination. Procédures 2 et 3 : Mise à mort par dislocation cervicale avant apparition des signes de gravité du paludisme (hyperparasitémie et/ou neuropaludisme).

Remplacement

Pour étudier la résistance des parasites aux différents antipaludiques, des tests in vitro peuvent être réalisés. Cependant, les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciaprum menées au laboratoire n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. Ces variabilités techniques majeures sont décrites dans la littérature. Un modèle murin in vivo est donc indispensable pour obtenir des données phénotypiques des différents génotypes de DHPS.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée (test de Student). Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Dans un objectif de réduction, des rats seront utilisés à certaines étapes de la procédure 1 afin de recueillir la quantité de parasites nécessaire à l’expérimentation.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est aussi un facteur de variabilité expérimentale. Les animaux seront hébergés en cage de 2 rats ou de 5 souris, conformément aux recommandations de l'établissement utilisateur. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement de l’habitat. Aucun traitement analgésique ne pourra être administré sous peine d'interférer avec les paramètres étudiés. Nous effectuerons une surveillance quotidienne des souris (état général, prise de nourriture, toilette, mouvements), afin de détecter le plus précocement les signes de souffrance. L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des hôtes intermédiaires de Plasmodium berghei et constitue un modèle animal reconnu Des souris âgées de 6 semaines et des rats âgés de 9 semaines seront utilisés puisqu’ils auront terminé leur croissance.

8 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation intestinale leur est induite par un agent chimique, une bactérie ou des cellules, puis des composés leur sont administrés jusqu'à six semaines, parfois via une minipompe implantée sous la peau, pour évaluer des candidats médicaments contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur indique que les animaux développeront diarrhée, sang dans les selles et perte de poids. Il qualifie le recours au modèle animal d'"indispensable" pour une vue globale de la maladie que les modèles in vitro ne donneraient pas.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des troubles caractérisés par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, source de lésions destructrices. Ces maladies sont caractérisées par une forte migration de cellules inflammatoires de types granulocytes au niveau de la paroi du tube digestif. L’augmentation et la dérégulation du recrutement des granulocytes et leur sur-activation contribuent à la chronicité et à l’amplification de la maladie. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de MICI. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et approuvées in vitro. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de MICI.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat et la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Ces modèles seront induits par un agent chimique ou par le gavage d’une bactérie ou par l’injection de cellules inflammatoires une à deux fois par étude. Certains de ces modèles utiliseront des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable. Les composés seront administrés pendant 6 semaines maximum. Un prélévement sanguin sera également effectué une fois pendant l'étude pour suivre la pharmacocinétique des composés testés. Une minipompe pourra être implantée en sous cutané pour une administration continue pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques des MICI qui se caractérisent par une diahrrée, du sang dans les fèces et de la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro. L'utilisation de modèles animals est indispensable pour avoir une vue globale de la physiopathologie de la maladie ainsi que la pharmacocinétique des composées sur l'ensemble des organes ce que ne permet pas les modèles in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analgésie sera envisagé. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature

36 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie stéréotaxique au cerveau sous anesthésie, puis, vigiles et contenus, une stimulation des vibrisses avec perfusion de substrats marqués et prélèvement sanguin. Le porteur indique que l'anesthésie peut entraîner des troubles cardiorespiratoires, une déshydratation et une infection de la plaie. Il écarte les co-cultures de cellules parce qu'elles "s'affranchissent de la physiologie de l'organisme entier", et rattache l'intérêt du projet à des maladies comme Alzheimer au conditionnel.

Objectifs

Au cours des 20 dernières années des preuves se sont accumulées et montrent que le lactate provenant des astrocytes (cellules de soutien du système nerveux central) servirait de carburant énergétique pour les neurones. Les résultats les plus convaincants ont été obtenus par spectroscopie de résonance magnétique du carbone 13, montrant tout le potentiel de cette méthode pour les études métaboliques. Cependant, la majorité de ces études ont été réalisées soit in vitro, sur des cultures primaires, soit ex vivo sur des extraits de tissu cérébraux ; les résultats de ces études ne reflètent donc pas forcément les processus sur l'organisme entier. Il est désormais possible dans notre laboratoire d'éliminer ces inconvénients grâce à l'utilisation soit de la spectroscopie de résonance magnétique à haute résolution, qui permet d'obtenir directement sur un échantillon tissulaire un spectre de très haute résolution soit de la spectroscopie de résonance magnétique sur l'animal vivant, in vivo. La résonance magnétique nucléaire est une technique non invasive qui permet donc un suivi des animaux. L'objectif du projet est d'étudier in vivo le métabolisme énergétique cérébral de rongeurs, éveillés et stimulés, par spectroscopie de résonance magnétique du proton et du carbone 13 et d'obtenir une réponse claire sur l'utilisation préférentielle du glucose ou du lactate par les neurones lors de l'activation cérébrale. Une analyse ex vivo par spectroscopie à haute résolution permettra d'approfondir les voies métaboliques mises en jeu. Par ces techniques, nous pourrons montrer une préférence des neurones pour la consommation directe de glucose ou de lactate provenant des cellules de soutien du système nerveux, en réponse à la demande énergétique liée à l'activation cérébrale. Ainsi la comparaison des résultats obtenus entre zones activées/non activées pour des rats contrôles et également des rats ne pouvant plus métaboliser le glucose permettra de démontrer les voies métaboliques impliquées lors de l'activation cérébrale. Connaître le carburant énergétique (glucose ou lactate) des neurones, à l'échelle de l'organisme, pourrait permettre de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des maladies où le métabolisme énergétique cérébral est dérégulé (ex : maladie d'Alzheimer).

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes impliqués dans le métabolisme énergétique cérébrale et des interactions cellulaires qui en découlent est cruciale d'un point de vue fondamental, mais pourrait aussi avoir une implication dans la compréhension de certains processus pathologiques dans lesquels ce métabolisme énergétique est dérégulé (hypoxie-ischémie néonatale, AVC, Alzheimer, …).

Procédures

- chirurgie stéréotaxique : insertion d'une aiguille sans injection, puis retrait (témoin). Nombre : 1. Durée : 20 min. - contention, stimulation des vibrisses sur animaux vigiles et perfusion de substrats marqués + prélèvement sanguin (200 ml). Nombre : 1. Durée : 1 h.

Impact sur les animaux

Les modèles de KD utilisés dans ce projet sont bien connus des membres de l’équipe. La modification génétique n’entraîne pas de modifications au niveau pondéral, qualité du poil, appétit des animaux, activité et mobilité. Cependant, l'induction du modèle nécessite une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale à l'isoflurane. Durant la chirurgie, des changements du rythme cardiaque (200-400 bpm) ou du rythme respiratoire (30-60 bpm), mesurés grâce à un capteur placé sous l'animal, peuvent subvenir, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. De même, une anesthésie prolongée peut mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération, la plaie suturée peut s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser.

Devenir

A l'issue de la procédure correspondant à la fin de l'étude, les animaux seront mis à mort. Les stucures cérébrales seront rélevées et analysées.

Remplacement

Des modèles de co-culture (lignées de neurones et d'astrocytes, cellulels de soutien du système nerveux) existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure intégrative : décrypter le métabolisme énergétique cérébral. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de définir quelle est la source énergétique qui permet l’activation neuronale (glucose ou lactate). En effet, l'activité cérébrale est modulée par l'ensemble de l'organisme. Les données scientifiques obtenues à partir de cultutes de cellules ne reflètent donc pas forcément la réalité des processus et des mécanismes mis en jeu chez l'organisme. Il n'existe donc pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Nous utiliserons une technique d’analyse de pointe,spectroscopie de résonance magnétique à haute résolution, qui permet de travailler sur des petites quantités de tissu cérébral et permettent donc de limiter le nombre d’animaux.Pour la partie in vivo, l'utilisation de la résonance magnétique nucléaire qui est une technique non invasive est un atout car elle permet de pouvoir tester plusieurs fois les animaux sans que la procédure ne soit délétère. De plus, nos travaux précédant nous permettent de savoir qu'un nombre minimum de 12 rats par groupe permettra de lisser la variabilité interindividuelle et de mettre en évidence des différences significatives entre les individus dont le transporteur au glucose aura été réprimé et les autres groupes (tests statistiques).

Raffinement

Les modèles modifiés génétiquement utilisés dans ce projet sont bien connus des membres de l’équipe. La modification génétique n’entraîne pas de modifications au niveau pondéral, qualité du poil, appétit des animaux, activité et mobilité. Lors de la chirurgie, les rythmes cardiaques et respiratoires seront monitorés. Du gel oculaire sera appliqué pour éviter toute sècheresse oculaire. La récupération post-opératoire sera réalisée sous lampe chauffante jusqu’au réveil complet des animaux et une réhydratation systématique avec sérum physiologique sera réalisée. Après leur retour en cage collective, les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l’animal à s’alimenter, le comportement et sa vivacité et l’état du pelage seront vérifiés. Les animaux seront pesés 1 fois/semaine afin de détecter les pertes de poids . Un échange quotidien entre le zootechnicien et l’expérimentateur permettra une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée.

Choix des espèces

Le rat Wistar sont utilisés depuis plusieurs années pour les études du métabolisme dans notre laboratoire, ainsi nous disposons déjà de nombreux groupes témoins permettant les comparaisons et limitant ainsi le nombre d’animaux témoins à refaire. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, le métabolisme énergétique cérébral étant différent à des stades plus précoces.

1 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral est provoqué par occlusion puis reperfusion d'une artère cérébrale au moyen d'un filament, suivi d'une IRM et d'une série de tests comportementaux étalés sur trois semaines. Le porteur indique que le modèle reproduit des déficits sensorimoteurs et une désorientation au réveil, et applique des points limites en cas de perte de poids ou d'inactivité. Il présente le rat comme le modèle préférentiel de l'AVC et juge "indispensable" de tester chez l'animal cinq stratégies thérapeutiques financées par l'industrie.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant l’augmentation de la récupération fonctionnelle et de diminuer la lésion causée par l’occlusion artérielle. L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monofilament dans la carotide interne puis poussé jusqu’à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) provoquant ainsi une occlusion. Cet acte chirurgical durera 15 minutes. 45 minutes plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament et ainsi permettre une reperfusion. Cet acte chirurgical durera 10 minutes. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 8 minutes et suivront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+22 post AVC. Un total de 56 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. L’embolisation de l’ACM provoque une désorientation prononcée au moment du réveil post-chirurgical (phénomène de circling). Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l’ischémie-reperfusion. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse post chirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 10 rats par groupe (+ 30%) sauf pour les SHAM au nombre de 5 par groupe, ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les rats seront 2 par cage avec plusieurs enrichissements, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Le site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, à une désinfection et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil, de l'oxygène sera administré pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 2. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort. Enfin, une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivants l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par une ischémie-reperfusion. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines soit un poids d’environ 300 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.