Rats
Etude de l’évolution de la captation d’un abcès septique chez le rat dans le cadre d’un examen TEP au [18F]-FDG (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un abcès sous-cutané leur est provoqué puis suivi par imagerie TEP au FDG, avec un risque de nécrose des tissus voisins ou de septicémie surveillé par des points limites. L'objectif est de décrire l'évolution d'une infection et le rôle des cellules immunitaires. Le porteur affirme que l'évaluation d'une lésion infectieuse par imagerie ne peut se faire que sur un modèle animal reproduisant le mécanisme physiologique global.
Objectifs
Evaluer l'intérêt du [18]F-FDG (faux sucre radioactif utilisé en routine clinique chez les patients) dans le diagnostic, et l’analyse du processus de formation et de développement de l'infection et de l'inflammation dans un modèle expérimental d’abcès sous-cutané chez le rat.
Bénéfices attendus
Faire un schéma de l’évolution de l’inflammation aigue, subaiguë à chronique afin de déterminer l’intervention des cellules immunitaires dans l’évolution de l’abcès.
Procédures
Induction d'abcès sous-cutané (20 rats, 30 min maximum), mesure de la glycémie des animaux (20 rats, 15 à 30 sec, avant d'injecter le produit radioactif, examen d'imagerie (20 rats, 30min,1h après injection du produit radioactif).
Impact sur les animaux
Risque d’évolution de l’abcès vers une nécrose profonde des tissus adjacents, ou risque de souffrance liée à une septicémie. Ces 2 risques seront particulièrement surveillés tout au long de l’étude pour chaque rat, et des points limite précoces seront définis
Devenir
les animaux seront mis à mort pour faire des analyses en autohistoradiographie et immunohistologie
Remplacement
l'évaluation objective d’une lésion infectieuse avec un examen d’imagerie ne peut être réalisée que sur un modèle animal permettant par la suite d’analyser le mécanisme physiologique global, à l’image des examens chez l’Homme ce qui permettra de mieux coller à la réalité lors d’administration de traitements thérapeutique.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux a été réalisé en amont en prenant en compte un paramètre essentiel de réponse à l’induction de l’abcès. En effet, l’abcès fistule très précocement à J3 (5%), à J4 (20%), ou tardivement à J10 (5%), et ce malgré une reproductibilité du geste expérimental par le même opérateur.
Raffinement
Les animaux seront transportés dans des cages de transport dédiées, avec une litière enrichie avec du papier absorbant autoclavé et avec des bouillotes chauffantes pour éviter l’hypothermie si besoin. Les abcès, les examens de tomographie par émission de Positrons (TEP) et les mises à mort seront induits sous anesthésie générale pour éviter un stress inutile à l’animal. Pour éviter toute souffrance de l'animal la taille maximale des abcès ne dépassera pas 800 mm^3 à J2, bien inférieure aux tailles limites de tumeurs chez le rat qui sont de 1000 mm^3. Après induction de l’abcès, les animaux seront examinés de façon très soutenue durant les 48h en surveillant leur état général, en mesurant (i) leur poids, (ii) leur température, (iii) l’état du gonflement de l’abcès, les animaux recevront également un antalgique (buprénorphine), tous les 6, 8h ou 12h (si nécessaire) durant 48h. De plus, cette surveillance se poursuivra quotidiennement durant toute la période du l’étude pour chaque animal.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus utilisés dans le cadre de pathologies inflammatoires sont des modèles murins (souris et rats). Pour nos expérimentations, nous utilisons comme modèle le rat « WISTAR ». Cette souche est très largement décrite dans la littérature et son utilisation reste la plus appropriée à ce type de recherche (modèle de référence). En outre, cette souche de rat a été largement utilisée au sein de notre plateforme et permet de confronter nos résultats à des analyses antérieures effectuées sur rats sains. Les rats seront âgés de 9 semaines lors de l’initiation du protocole. Ce stade correspond à un état adulte pour lequel le système immunitaire est bien établi. En outre, le poids intermédiaire des animaux permettra d’imager des organes intéressants comme la rate ou le rachis qui interviennent dans la réponse immunitaire.
Evaluation de la fonctionnalité de substitut de peau greffé chez le rat Nude
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
20 rats, 10 mâles et 10 femelles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit sous anesthésie un prélèvement de peau sur toute l'épaisseur du dos puis une greffe de substitut cutané, avec des changements de pansement deux fois par semaine et un hébergement en cage individuelle. L'objectif est de transposer chez le rat un modèle déjà mené chez la souris, pour préparer des études destinées à des substituts cutanés pour grands brûlés et ulcères diabétiques. Le porteur affirme que le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n'est pas envisageable pour caractériser la greffe sur un temps prolongé.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de transposer un modèle de greffe classiquement utilisé chez la souris chez le rat et d’évaluer la fonctionnalité d’un substitut cutané précédemment évalué chez la souris , afin d’envisager d’utiliser par la suite ce modèle de rat greffé pour la réalisation d’études de biodistribution et de tumorigénicité. Ces études sont requises selon les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain et les lignes directrices de l’Agence Européenne du Médicament pour les médicaments à base de cellules souches. Le substitut cutané sera greffé après induction d’une plaie cutanée chez le rat. Cela nous permettra de comparer les résultats obtenus chez des rats mâles et femelles et également de comparer ces résultats avec ceux obtenus lors des études effectuées chez la souris avec un substitut cutané identique. Des analyses identiques à celles effectuées au cours des études menées chez la souris permettront de caractériser la fonctionnalité du substitut cutané évalué et de valider ou non le modèle de greffe chez le rat . Cette étude de faisabilité permettra également la réalisation du prélèvement d’organes et de leur analyse en vue de la préparation des études de biodistribution qui devront être menées à la suite. L’ensemble des résultats obtenus lors de cette étude chez le rat et de ceux obtenus lors des études menées chez la souris permettront de sécuriser la production des unités thérapeutiques de substituts cutanés qui seront utilisées chez les patients souffrant de brûlures sur une grande partie du corps ou de plaies chroniques ne cicatrisant pas ou très difficilement comme les ulcères du pied chez les personnes diabétiques.
Bénéfices attendus
Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée et subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. Les substituts cutanés sont envisagés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies. Les données générées par cette étude chez le rat et celles obtenues par ailleurs chez la souris permettront de sécuriser la production des unités thérapeutiques qui seront utilisées chez les patients.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour la réalisation de la greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau sur toute l’épaisseur de celle-ci sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates. Un traitement analgésique des rats greffés sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes cutanées seront protégées par la mise en place d’un pansement au-dessus du substitut cutané, d’un morceau de compresse stérile par-dessus, d’un pansement de couverture pour protéger la greffe et enfin de 2 bandes de sparadrap pour maintenir le tout en place. Les greffes cutanées seront observées régulièrement tout au long de l’expérimentation lors de chaque change de pansement effectué, 2 fois par sermaine. Un suivi quotidien des rats greffés sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats greffés en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les pansements et surtout le greffon cutané.
Impact sur les animaux
L'induction d'une plaie cutanée avant la réalisation de la greffe cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique pré- et post-opératoire. Les changes de pansements, effectués 2 fois par semaine, n’induiront pas de nuisance pour les rats, ceux-ci étant placés sous anesthésie gazeuse au préalable. L’hébergement en cage individuelle des rats greffés, nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les pansements et surtout le greffon cutané, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères.
Devenir
Procédure expérimentale 1 = Induction d’une plaie cutanée, greffe de substitut cutané et suivi de la greffe cutanée et des animaux : les 20 rats greffés, 10 mâles et 10 femelles, seront mis à mort à 2 temps différents après réalisation de la greffe cutanée, 2 semaines et 1 mois après, avec 5 rats par temps de prélèvement pour chacun des 2 sexes, pour réaliser un ensemble d’analyses.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes effectuées chez la souris et selon les recommandations des autorités de régulation sur les médicaments à base de cellules souches. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, lors de chaque change de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés , ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des briques de bois seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies chroniques à traiter chez l’Homme. Son utilisation est décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des rats âgés de 7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de rats décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).
Cathétérisation de la veine et artère fémorale chez le rat dans le cadre d’un développement de radiotraceur pour l’imagerie
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
120 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie d'environ 30 minutes pour poser des cathéters dans la veine et l'artère fémorales, suivie de 60 à 120 minutes d'imagerie, avec un risque d'hémorragie. L'objectif est de mettre au point un modèle mathématique de la cinétique de traceurs radioactifs pour l'imagerie TEP, en vue d'un passage ultérieur chez le primate puis chez l'humain. Le porteur affirme que ce type d'étude ne peut pas être remplacé par une méthode in vitro, l'objectif final étant d'utiliser les mêmes traceurs en clinique.
Objectifs
Le projet vise à réaliser des expérimentations permettant d’évaluer la fonction d’entrée artérielle chez le rat afin de mettre au point un modèle mathématique (cinétique plasmatique) de différents traceurs fluorés et ainsi permettre de quantifier les images Tomographie par Emission de Positons. La TEP (Tomographie par Emission de Positons) est une méthode d'imagerie scintigraphique médicale qui permet de mesurer en trois dimensions l'activité métabolique d'un organe grâce aux émissions produites par les positons issus de la désintégration d'un produit radioactif injecté au préalable. L’apparition des traceurs radioactifs à visée diagnostique constitue une avancée majeure en imagerie Tomographie par Emission de Positons (TEP) et accroît de façon significative les performances du diagnostic en clinique. L’imagerie TEP apporte des informations (qualitatives et quantitatives) fonctionnelles en plus des informations morphologiques.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons ainsi visualiser et quantifier en temps réel la fonction d’entrée artérielle chez le rat afin de mettre au point un modèle mathématique (cinétique plasmatique) des différents traceurs radioactifs afin de poursuivre ce projet vers la cinétique des traceurs chez le primate non humain et chez l’humain.
Procédures
Cette procédure durera environ 2h30, elle sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à une chirugie d'environ 30 minutes pour la mise en place des cathéters à la veine et l’artère fémorales. Les rats seront ensuite imagés pendant 60 à 120min.
Impact sur les animaux
Hémorragies après la chirurgie pendant l’imagerie. L’ensemble du plan expérimental étant sans réveil aucun autre critère ne sera être déterminant. Cependant toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce type d’étude ne peut être substitué par une méthode alternative in vitro ou sur cellules car l’objectif final est d’utiliser ces mêmes traceurs en imagerie clinique.
Réduction
Les effectifs ont été choisis sur la base d’étude précédemment menées au laboratoire sur l’évaluation de fonctions d’entrées artérielles et sur la base des images obtenues en imagerie TEP avec le traceur radioactif de la neuroinflammation. Tous les scans réalisés seront moyennés afin d’avoir un cerveau moyen de fixation du traceur radioactif des animaux témoins et des animaux ayant été injectés avec différents radiotraceurs développés par l’équipe. Communément aux études que nous avons déjà publiées, des analyses seront ensuite réalisées pour comparer les groupes d’animaux à l’aide d’un test statistique. Le nombre d’animaux est réduit d’environ 50% : le système dédié pour évaluer la cinétique du traceur permet d'obtenir des mesures toutes les secondes. Sans ce système, du sang devrait être prélevé toutes les secondes ce qui conduirait à une instabilité hémodynamique. Cette instabilité induirait une diminution de la perfusion du radiotraceur dans le sang et donc modifierait sa cinétique réelle. Ces facteurs font qu'il est difficile de répéter les prélèvements sanguins pour générer la fonction d’entrée artérielle chez un même animal. Il faudrait répéter le nombre d’expériences. Pour cette étude nous aurons besoin de 120 animaux pour l’ensemble du projet sur 5 ans.
Raffinement
Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle d’expérimention pour diminuer le stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les rats seront observés une à 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle. Les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane et placés sur le dos dans un masque à anesthésie sur un tapis chauffant. Une protection oculaire sera appliquée. Une dose d'analgésie sera induite en sous cutanée avant la chirurgie et un analgesique sera mis en application localement. Un bolus de réhydratation chauffé à 37°C sera injecté à l’animal en sous cutanée . De plus, les animaux seront hébergés par deux par cage en présence d’un enrichissement comprenant un tunnel en plastique et du papier absorbant. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthesie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce la plus adaptée pour cette étude notamment en raison de son gabarit permettant la pose du shunt artério-veineux. Pour cela, nous réalisons une cathéterisation sur la même patte, l'artère et la veine fémorale. Cette artère et cette veine sont reliées entre elles par une tubulure, cela correspond à un circuit en boucle fermée. Donc la circulation sanguine continue de se faire entre la veine et l'artère de la patte concernée mais la circulation sanguine ne se fait plus dans 'la partie de la patte" en dessous de la cathétérisation. Nous utiliserons des rats mâles de 8 semaines et des femelles 12 semaines. Les femelles de 12 semaines seront utilisées pour avoir le même poids que les mâles à 8 semaines.
Effets de composés chimiques ou biologiques sur des maladies dermatologiques induites chez les rongeurs (acné, psoriasis, prurit, dermatite atopique)
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 1500
Gerbilles de Mongolie : 1000
Traités chaque jour à l'imiquimod sur la peau ou injectés de cytokines pour provoquer un psoriasis, enduits d'allergènes pendant deux à sept semaines pour déclencher un eczéma, des rongeurs sont aussi tondus, épilés, et parfois porteurs de collerettes et logés seuls. 10 000 souris, 1 500 rats et 1 000 gerbilles de Mongolie, soit 12 500 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue pour prélever leur peau et de grands volumes de sang. Le porteur attend du psoriasis à l'imiquimod une perte de 15 à 25 % du poids en 72 heures, sans retour au poids initial, et de l'eczéma jusqu'à 20 %, pour tester des molécules candidates contre l'acné, le psoriasis, l'eczéma et les démangeaisons. Pour filmer leurs grattements, il prévoit un isolement sans eau ni nourriture de 2,5 heures dans la description des procédures, et de 4 h 30 dans celle des effets néfastes.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans un modèle de maladies dermatologiques chez le rat, la souris ou la gerbille : acné, psoriasis, dermatite atopique. Les différentes procédures de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques qui auront été présélectionnés in vitro sur des critères de puissance et d’efficacité En fonction de leurs propriétés pharmacocinétiques, ils pourront être testés en mode préventif ou thérapeutique .
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur plusieurs maladies dermatologiques : psoriasis, eczéma, acné, et sur un de leurs symptômes, le prurit. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour laquelle les options sont pour le moment limitées et imparfaites.
Procédures
Le psoriasis sera induit chez des rats/souris par application quotidienne (5 minutes) d’Imiquimod, ou par injections intradermiques quotidiennes de cytokines (sous anesthésie générale avec analgésie, 1 heure), pendant au maximum 15 jours. La dermatite atopique (eczéma) sera induite chez les rats/souris par applications topiques répétées de DNFB pendant 2 semaines ou d’OVA pendant 7 semaines (actes quotidiens de 5 minutes). Un score clinique sera établi deux fois par semaine par observation de la peau, et la quantification du nombre et de la durée des grattements sera déterminée à l’aide d’une caméra haute vitesse. Cette étape nécessitera l’isolement des animaux pendant 2,5 heures sans accès à la nourriture et à la boisson, une seule fois pendant l’étude. Les animaux seront pesés deux fois par semaine (5 minutes). Des démangeaisons pourront être déclenchées par administration intradermique à des souris/rats/gerbilles de substances pruritogènes sous anesthésie générale avec analgésie (1 heure). Ils seront pesés 2 fois dans la semaine d’étude (5 minutes). Pour les modèles d’atrophie des glandes sébacées, des composés seront administrés aux souris/rats pendant 4 à 24 semaines à une fréquence et par des voies variables. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine (5 minutes). Les applications topiques et intradermiques seront précédées par une tonte et une dépilation de la peau (acte d’environ 15 minutes). Les animaux porteront des collerettes et seront hébergés individuellement. Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie: intranasale et intratrachéale (anesthésie, 1h), intramusculaire et intradermique (anesthésie, avec analgésie, 1h), orale sur animaux vigiles (1 minute), sous cutanée (avec ou sans anesthésie et pansement occlusif, 5-30 minutes) et intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute), ou par mini pompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (anesthésié 1 heure). Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie). Des biopsies de peau pourront éventuellement être réalisées, sous anesthésie générale avec analgésie (1h30). Les études de psoriasis dureront au maximum 4 semaines, celles d’eczéma 6 semaines maximum, celles de prurit 1 semaine maximum, celles d’acné 24 semaines maximum et celles de pharmacocinétique uniquement 48h maximum.
Impact sur les animaux
Dans ces modèles de maladies dermatologiques, des lésions dermatologiques sont attendues. Dans le cas du modèle d’atrophie des glandes sébacées, les seules lésions et pertes de poids qui pourraient survenir proviendraient d’une toxicité des produits administrés. Dans le cas du modèle de psoriasis à l’Imiquimod, des lésions de type psoriasis sont attendues c’est-à-dire des plaques d’érythème. Une perte de poids de 15-25% du poids initiale est attendue dans les 72h suivant la première administration d’Imiquimod. Cette perte de stabilisation ensuite sans retour au poids initial. Dans le cas du modèle de psoriasis induit par injection de cytokines, les lésions de type psoriasis seront plus limitées et les animaux perdront peu de poids (
Devenir
Après les 4 procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de la peau et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionné dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
En cas de mesures simples de pharmacocinétique, il a été démontré que 3 animaux par groupe étaient suffisants. Dans le cas du modèle de prurit à la Substance P, nous avons démontré par le passé que 12 animaux par groupes sont nécessaires pour obtenir des différences significatives sur les paramètres d’intérêts. Dans les modèles d’eczéma induit par des allergènes, le nombre nécessaire a été évalué par le passé et dépend des paramètres évalués : il faut 12 animaux par groupe pour la mesure du nombre de grattements, 8 animaux par groupe pour comparer l’épaississement de l’épiderme et du derme, 10 pour la mesure d’infiltration de cellules inflammatoires par analyse histologique, 10 animaux par groupe pour comparer la mesure de l’expression de différents gènes dans la peau. Dans le cas de l’eczéma induit par S. aureus, il a été estimé sur la base de la littérature que 10 animaux par groupes seraient nécessaires. Ce nombre sera réévalué à l’issue des études pilotes. Dans le cas du modèle de psoriasis, il a été mis en évidence lors des études passées que 10 animaux par groupe sont nécessaires pour observer des différences statistiquement significatives.
Raffinement
Un scoring adapté au modèle sera réalisé au moins deux fois par semaine, sauf dans le cas du modèle de prurit (pas de lésions) et lors de l’induction du modèle d’eczéma à S aureus (pas de mesures lorsque le pansement est en place). La fréquence de retrait du pansement pourra être augmentée, afin de mieux comprendre la cinétique de la maladie, et la fréquence de retrait pourra être adaptée. Au préalable, des tests de réactions aux pansements et à leur retrait fréquent seront effectués (sous anesthésie). Les animaux seront pesés au moins 2 fois par semaine : 10-15% de perte de poids : pesée quotidienne, réhydratation sous cutanée (SC) une fois par jour. 15-25% : pesée quotidienne, réhydratation SC deux fois par jour. Le poids constituant un point limite sera adapté au modèle (voir procédures). Un gel nutritif ou de l’eau gélifiée dès 10% de perte de poids sur certains animaux. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les actes douloureux (injection IM ou ID, pose de mini pompe, biopsie) seront réalisés avec analgésie. Les actes peu stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (administrations IV, IP et topiques) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Lors d’administrations topique, le port d’une collerette avec hébergement individuel pourra être nécessaire. Une période d’acclimatation à son port sera réalisée et un enrichissement supplémentaire sera fourni. Un nettoyage quotidien des yeux avec une compresse imbibée de sérum physiologique stérile palliera au manque de toilettage imposé par le port de la collerette. Pour évaluer l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte (cf. procédures). Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les différents modèles dermatologiques d’intérêt sont bien décrits chez la souris et le rat. La gerbille est aussi bien décrite dans le cas des modèles de prurit. L’espèce la plus pertinente pour les études, en particulier sur la base des paramètres pharmacologiques de la substance à tester, sera choisie si le modèle est décrit chez plusieurs espèces. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles dermatologiques d’intérêt sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Étude des effets d’une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, sur le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique durant la gestation chez le rat Sprague Dawley.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Nourries pendant 9 à 17 semaines d'un régime riche en sucre et en graisses, des rates subissent jusqu'à la mise bas un gavage de glucose chaque semaine suivi de deux heures de mesures de glycémie, et une goutte de sang est prélevée à leur queue jusqu'à cinq jours par semaine, pour vérifier qu'elles sont devenues intolérantes au glucose. 636 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, afin d'étudier si l'O-GlcNAcylation, une modification des protéines, explique l'hypertrophie du cœur chez les enfants de mères diabétiques. Le porteur affirme pourtant qu'"aucune étude n'a démontré une modification délétère du phénotype des animaux nourris avec cette diète". Tous sont tués, au stade embryonnaire, à la naissance, à 12 ou à 60 jours, les nouveau-nés par décapitation et les petits de 12 jours par dislocation, une anesthésie n'étant prévue que pour les mères et les rats de 60 jours.
Objectifs
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. L’O-GlcNAcylation est une modification protéique qui est augmentée lors d’hyperglycémie et qui a été démontrée comme étant impliquée dans l’hypertrophie cardiomyocytaire. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation associée à l’hyperglycémie, pourrait être un facteur pathogénique de l’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication de l’O-GlcNAcylation dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique au cours de la grossesse (2) Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les atteintes du développement cardiaque induites par l’hyper O-GlcNAcylation.
Bénéfices attendus
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel et 2) identifier des cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent 1 unique procédure qui correspond à une alimentation standard ou riche en sucre et lipides sur une période de 9 à 17 semaines. Entre la 12ème semaine et jusqu’à la mise bas, 1 fois par semaine, des tests de tolérance au glucose oral ainsi que des mesures de glycémie seront réalisées afin de valider l’intolérance au glucose. Le test de tolérance au glucose orale consiste en un gavage oral de glucose et au suivi de la glycémie sur les 2 heures suivantes. Les mesures de glycémie sont réalisées grâce à un glucomètre avec prélèvement d’une goutte de sang à la queue des animaux. 1 goutte de sang sera prélevé quotidiennement pour un maximum de 5 jours par semaine. Le temps de prélèvement pour 1 goutte est d’environ 1 minute. L’étude de l’impact structurel et fonctionnel du diabète + ou - O-GlcNAcylation sera réalisée via une échocardiographie (Vevo 3100-Visual Sonic, MX201 10-22 MHz) et un électrocardiogramme (IOX EMAK technology®) sur les animaux J60 (Basé sur les précédentes études réalisées au sein l’équipe, le temps estimé de chaque examen est de environ 20 minutes). A la fin de cette période, les animaux sont sacrifiés afin de prélever les différents organes (cœur, aorte, rein, poumons, foie, sang). Le sacrifice et le prélèvement dure environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
L’alimentation riche en sucre et gras utilisée dans ce projet est une alimentation très bien décrite dans la littérature. A ce jour, aucune étude n’a démontré une modification délétère du phénotype des animaux nourris avec cette diète.
Devenir
A la fin de la procédure (procédure sans réveil), l’ensemble des animaux seront sacrifiés. Après sacrifice, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses.
Remplacement
Le développement cardiaque est un processus complexe et intégré faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque par des approches in vitro n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’hypertrophie cardiaque, le diabète gestationnel et l’O-GlcNAcylation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 636 animaux.
Raffinement
Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement dans des grandes cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Lors du sacrifice des animaux, et lorsque cela est possible (sacrifice des mères, des animaux à 60 jours), une couverture anesthésique (isoflurane ; induction : 5 pourcent, débit d’air : 1L par min ; maintien : 3 pourcent , débit d’air 0,6L par min) sera mise en place. Le sacrifice des animaux à 12 jours et à la naissance (J0) ne peut être réalisé respectivement que par dislocation et décapitation. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recourt et qui les maitrise.
Choix des espèces
Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien entre une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, et l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque, différents stades de développement sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux au stade embryonnaire E15,5 et E20,5 (soit 15,5 et 20,5 jours après l’accouplement) ; à la naissance (J0), à 12 et 60 jours post naissance (J12 et J60), permet d’obtenir une information complète sur l’impact de l’O-GlcNAcylation lors du développement cardiaque embryonnaire et post-natal.
Évaluation in vivo dans un modèle murin de l’intérêt nutritionnel d’un nouvel aliment fonctionnel contre le syndrome métabolique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
36 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent un régime obésogène pendant trois mois, un aliment fermenté administré chaque jour à la seringue, des prélèvements sanguins mensuels, un test de tolérance au glucose et des mesures de pression artérielle. L'objectif est de valider les effets santé d'un aliment fonctionnel destiné à une future commercialisation, visant les "nouveaux pays industrialisés". Le porteur affirme que la seule alternative serait l'humain, impossible tant que les preuves de concept ne sont pas obtenues chez l'animal, et décrit le rat comme un "modèle de choix".
Objectifs
Cette expérimentation animale s’inscrit dans un projet plus global qui a commencé par la conception d’un aliment végétal fermenté, présentant un potentiel probiotique et hypocholestérolémiant. Il a pour cible les populations des nouveaux pays industrialisés, où la prévalence du syndrome métabolique (association de 3 facteurs de risque parmi lesquels l’obésité, triglycérides sanguins élevés, hypertension, faible niveau de bon cholestérol et glycémie élevée) est en croissance exponentielle. Cette prévalence élevée favorise l’apparition de maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2 qui constituent un fléau économique et sanitaire. Cette expérimentation animale sur le modèle rat a ainsi pour objectif de valider les effets santé probiotique et hypocholestérolémiant de cet aliment et d’obtenir des preuves de concept en vue d’une étude clinique et de sa future commercialisation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet seront au profit de la santé humaine pour améliorer la prise en charge des patients atteints de syndrome métabolique mais aussi les personnes ayant des altérations du métabolisme du cholestérol. Les résultats de ce projet seront accessibles à moyen terme, via des publications scientifiques. Ils seront applicables à l’échelle laboratoire pour effectuer des changements de formulation, et à l’échelle industrielle si l’aliment est commercialisé dans le futur.
Procédures
Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, tous les mois : -4 prélèvements de 100µl . Deux fois, en plus des 100µl, 5 prélèvements de 10µl seront réalisés. Charge en glucose par voie orale à deux temps de l'expérimentation. Mesure de la pression artérielle au 4 temps de l'expérimentation (T0, T1, T2 et T3) qui dure 15 minutes à chaque fois et nécessite une contention. Une mesure de la capacité aérobie qui dure 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances de ce protocole sur les animaux sont légères et impliquent : prélèvements sanguins sur animaux vigiles, tous les mois : 4 prélèvements de 100µl . Deux fois, en plus des 100µl, 5 prélèvements de 10µl seront réalisés. Charge en glucose par voie orale à deux temps de l'expérimentation. Mesure de la pression artérielle au 4 temps de l'expérimentation (T0, T1, T2 et T3) qui dure 15 minutes à chaque fois et nécessite une contention. Une mesure de la capacité aérobie qui dure 15 minutes.
Devenir
Les animaux seront mis à mort puisque les organes doivent être récoltés pour mesurer l'atteinte métabolique.
Remplacement
La seule alternative non animale disponible pour ces analyses serait l’humain, mais elle ne peut pas être utilisée tant que les preuves de concept n’ont pas été étudiées sur les animaux. Le modèle animal utilisé dans cette étude (régime obésogène) reste un modèle de choix pour induire un syndrome métabolique avec des altérations similaires à celles observées chez l’Homme. De plus, avec ce modèle nous aurons la possibilité de vérifier les atteintes d’organes non accessibles chez l’homme comme le foie ou le tissu adipeux viscéral.
Réduction
Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé de la façon suivante. Dans le but de démontrer une amélioration de la tolérance au glucose mesurée après l'ingestion d'une solution de glucose, considérant un écart-type de 20%, un risque alpha=5% et une puissance de 95%, il est nécessaire d’inclure 9 animaux par groupe. Uniquement des animaux mâles seront inclus dans cette étude. Ainsi, nous avons besoin de : 9 rats mâles x 4 groupes = 36 animaux pour répondre à notre hypothèse. Seront analysés les effets du régime et de la supplémentation par une ANOVA à deux voies.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances causées aux animaux nous allons les surveiller quotidiennement puisque la supplémentation se fera quotidiennement à l’aide d’une seringue. Pour éviter des gavages répétés, nous avons testé sur des rats leur compliance vis-à-vis de la prise de cet aliment à l’aide d’une seringue. Nous avons prévu un volume maximal à délivrer de 1ml par jour pour éviter une prise trop importante pouvant avoir des effets délétères sur l’estomac. Nos essais montrent que les animaux viennent chercher la nourriture et qu’il n’y a pas de rejet sur la forme et sur le goût. La prise pendant 3 mois du régime riche en lipide a pour objectif d’induire un syndrome métabolique qui peut entraîner l’apparition de pathologies comme le diabète de type 2. Ainsi, nous surveillerons les animaux par un suivi du poids quotidien et tout animal non traité (groupes contrôles) qui perdrait plus de 20% de son poids serait euthanasié. De plus, tous les mois un prélèvement de sang au bout de la queue sera réalisé pour suivre les paramètres biologiques. Ces mesures nous permettront de détecter rapidement un animal malade et prendre des mesures adaptées à l’animal. Cependant, la durée (3 mois) des régimes n’induit normalement pas de diabète de type 2 dans ce laps de temps. Le test de tolérance au glucose va être la mesure la plus contraignante pour les animaux puisqu’il y a un gavage après 12 heures de jeune et des prélèvements itératifs. Pour minimiser les nuisances, le gavage sera réalisé par des zootechniciens qui ont une grande expérience de cette manipulation permettant de limiter le stress des animaux. A l’issue du gavage, les animaux seront étroitement surveillés pour vérifier qu’il n’y ait pas eu une fausse route. Cependant si à l’issu du test un animal présentait une hyperglycémie (>3g/l) une prise en charge adaptée sera réalisée avec une injection d’insuline et un suivi pendant 2 heures pour vérifier la normalisation de la glycémie. De plus, comme les animaux vont prendre du poids et pour favoriser leur sociabilisation, nous ne mettrons que 3 animaux par cage. Dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes en cartons pour se cacher et faire des nids. De même, ils auront à disposition des batônnets de peuplier afin de leur permettre de ronger quelque chose de dur puisque le régime riche en lipides rend les croquettes moins dures que leur nourriture habituelle.
Choix des espèces
Les rats possèdent 90 % de leurs gènes en commun avec les humains, permettant une extrapolation des résultats à l’humain et d’envisager une étude clinique. De plus, ils sont faciles à manipuler. Les rats Sprague-Dawley sont un modèle validé pour le syndrome métabolique après la prise de régime obésogène (riche en lipides et en sucre). Les animaux seront au stade jeunes adultes après sevrage (250g)
Effet du déoxynivalénol en cocktail avec le fer héminique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
384 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une alimentation contaminée par la mycotoxine déoxynivalénol et du fer héminique, avec pour certains une injection cancérigène d'azoxyméthane et des séjours de 24 heures en cage à métabolisme, avant d'être tués pour prélèvement d'organes. Le projet étudie l'effet combiné de ces contaminants alimentaires sur le cancer colorectal. Le porteur affirme qu'une étude in vitro ne rend pas compte de la complexité de l'organisme entier.
Objectifs
Les mycotoxines sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine déoxynivalénol (DON) se retrouve dans près de 50 % des céréales et les concentrations augmentent avec le changement climatique. Aujourd’hui, environ 80 % des individus sont exposés au DON, à des niveaux proches ou supérieurs à la Dose Journalière Tolérable. Nous faisons l’hypothèse que dans des conditions réalistes de multi-exposition, le DON exacerbe le potentiel toxique du fer héminique présent en grande concentration dans la viande rouge et la charcuterie et qui est associé au développement de plusieurs maladies chroniques, dont le cancer colorectal. Les objectifs de ce projet sont d'étudier et caractériser in vivo les effets “cocktails” du DON avec du fer héminique sur la génotoxicité au niveau des cellules épithéliales intestinales et sur l'initiation et la promotion de la carcinogenèse colorectale. L’hypothèse d’un effet exacerbateur de ce mélange auquel nous sommes exposés nécessite une évaluation toxicologique chez l’animal avec pour objectif de répondre à une question de santé publique.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, nous étudierons in vivo chez le rat l’effet d’une exposition à moyen (28 jours) et long terme (100 jours) au mélange DON/fer héminique. Ce projet permettra de mieux appréhender les questions de multi expositions liées à l’exposome chimique alimentaire auquel la population humaine est quotidiennement exposée. Les données expérimentales découlant des différentes procédures apporteront des réponses en terme de toxicité et génotoxicité de ce mélange dans un contexte d'exposition réaliste au DON et au fer héminique via l'alimentation. Cela permettra de répondre à une question de santé publique quant aux effets des co-expositions sur la santé digestive et le développement du cancer colorectal. Nous étudierons si l’exposition combinée aux différents cocktails impacte les marqueurs de génotoxicité dans les cellules épithéliales intestinales et coliques. D’autres marqueurs d’atteintes tissulaires (perméabilité intestinale, scores microscopiques, apoptose, prolifération cellulaire, …) d’inflammation (dosage de cytokines, activité myéloperoxydase…), et des marqueurs en lien avec la consommation de fer héminique et de DON dans les urines et les eaux fécales seront également mesurés. Les résultats attendus du projet sont importants sur le plan de la santé publique car les consommateurs sont exposés de façon chronique à ces contaminants en mélange. Si l'hypothèse d'une exacerbation de leurs effets individuels lorsqu'ils sont en mélange est confirmée, les données produites dans ce projet pourront être prises en compte dans les évaluations du risque d'exposition chez l'homme.
Procédures
L’objectif de ce projet porte sur des études nutritionnelles à moyen (28 jours) et long terme (100 jours). Les animaux sont hébergés par groupe de 3. Les féces seront prélevés à 2 reprises pour les procédures 1 et 2, en début et fin d'expérimentation. Pour les procédures 3 et 4, les féces seront prélevés à 3 reprises, en début, milieu et fin de procédure. Lors de l’injection d’azoxyméthane en intra-péritonéal, la solution est tamponnée pour éviter une douleur au point d’injection et dure moins d'une minute. Cette injection sera unique au cours de la procédure n°4. Dans les procédures 1 et 2, les animaux subissent un passage en cage à métabolisme pendant 24 h. Dans les procédures 3 et 4, les animaux subissent 3 passages en cage à métabolisme pendant 24 h. Préalablement une période d’adaptation de 3 h sera réalisée la veille du premier passage afin de diminuer le stress de l’animal. La mycotoxine déoxynivalénol ayant un pouvoir anorexigène, une perte de poids peut être observée à la dose de 10 mg/kg chez le rat. Les animaux seront pesés de manière bi-hebdomadaire et si une perte de poids supérieure à 15% est observée, l'animal sera alors sorti du protocole expérimental et euthanasié.
Impact sur les animaux
L’objectif de ce projet porte sur des études nutritionnelles à moyen (28 jours) et long terme (100 jours). Un suivi du bien-être animal sera effectué chaque jour et si l’un d’entre eux présente des signes de souffrance il sera examiné par le vétérinaire référent. Le prélèvement de féces sur animaux vigiles n'induit a priori pas de douleur. Cependant, un léger stress peut être provoqué par la préhension de l'animal avant le prélèvement. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur en charge de la procédure sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress. Pour les différentes procédures, les animaux sont gardés en cage à métabolisme individuelle pendant 24h. 3 heures seront nécessaires à l'habituation et adaptation des animaux avant une période de 24 heures nécessaire pour pouvoir récupérer les urines et fèces bien séparées. Pour limiter le stress d'isolement lors des passages en cages à métabolisme, chaque rat en cage à métabolisme pourra avoir un lien visuel avec au moins deux de ces congénères. Pour l'injection en intrapéritonéal de l'AOM, une douleur au point d'injection peut être engendrée, elle sera limitée par le fait que la solution est tamponnée avant l'injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation et des organes prélevés post-mortem pour analyses.
Remplacement
Une étude in vitro sur des cellules épithéliales intestinales montre des résultats quant aux effets du mélange DON-fer héminique sur plusieurs mécanismes cellulaires. Cependant les effets du mélange sur un seul type cellulaire ne permet pas d'appréhender la complexité d'un organisme dans sa totalité. Ainsi, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de la co-exposition mycotoxines/ fer héminique seul ou en mélange, de manière sub-chronique ou chronique sur la physiologie et santé du rat fisher 344 telles que, par exemple, l'observation d'une perte plus ou moins importante de poids ou une augmentation des atteintes dans l'intestin (inflammation et atteintes tissulaires). Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique ainsi que les interactions entre les différents composés sur la physiologie intestinale et leurs rôles dans l'inflammation et l'appration de dommages à l'ADN dans l'épithélium.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Pour ces études nutritionnelles, nos travaux montrent qu'un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour suivre les modulations de la prise de poids et de la perméabilité intestinales. Afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement relevants, nous prévoyons un nombre similaire d'animaux par groupe dans ce projet.
Raffinement
Les rats étant des animaux sociables, ils seront hébergés par 3 dans des cages transparentes afin de permettre le contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Le prélèvement de fèces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur. Cependant, pour diminuer le stress provoqué par la préhension des animaux avant le prélèvement, une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'étude. Un enrichissement sous forme d’un abri en inox sera mis à disposition des animaux Y compris lors de l'hébergement en cages à métabolisme. L'utilisation de cages à métabolisme est justifiée par la nécessité de récupérer des fèces et urines séparées. Les rats y séjourneront 3 jours au total après avoir y été habitués pendant 2 demi-journées. Le suivi de leur bien-être sera renforcé pendant cette période avec plusieurs visites fois par jour. L’utilisation d’une grille de suivi individuel permettra de repérer les signes de stress ou de souffrance (poil hérissé, perte de poids supérieure à 15%, prostration, comportement alimentaire perturbé…). Si l'expérimentateur juge que l'état de l'animal se détériore au-delà d'un point limite, la procédure s'arrêtera.
Choix des espèces
Depuis les années 80, l'étude de la relation entre l'alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi sur l’utilisation de modèles animaux. La lignée de rats F344 est un modèle largement utilisé pour étudier la modulation des biomarqueurs urinaires, fécaux et coliques associés à l'exposition au fer héminique. Dans cette étude, le choix d’utiliser des rats mâles a été fait pour éviter de possibles interactions avec le cycle hormonal chez la femelle notamment sur la réponse immunitaire inflammatoire. Les rats âgés de 4 à 8 semaines sont adultes et leur système digestif est pleinement fonctionnel. Les études précédentes portant sur l’exposition au fer héminique ou au DON ont été faites dans des conditions similaires.
Evaluation de l’extrait méthanolique de graines de Syzygium cumini pour la protection de la microcirculation coronaire dans un modèle de rat obèse (Zucker).
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 rats obèses Zucker vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent un gavage quotidien d'extrait de graines de Syzygium cumini ou de solvant, avec des poses de cathéter dans la veine caudale et des séances d'imagerie cardiaque, avant d'être tués au CO2 pour analyse. Le projet évalue une plante de la biodiversité réunionnaise pour protéger la microcirculation du cœur. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"indispensable", des essais in vitro ayant déjà servi à sélectionner l'extrait.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont responsables d’un tiers des décès dans le monde. La maladie ischémique, définie par un apport sanguin insuffisant au muscle cardiaque, représente la moitié des décès d’origine cardiovasculaire. Elle peut être d’origine macrovasculaire et impacter les gros vaisseaux via le développement de plaques d’athérome. De récentes avancées ont mis en évidence qu’une dysfonction coronarienne microvasculaire (DCM), à savoir une dysfonction des petits vaisseaux composant le système vasculaire cardiaque peut survenir aussi bien indépendamment que parallèlement à une obstruction des gros vaisseaux. La DCM conduit également à une ischémie myocardique, voire à un infarctus du myocarde. A ce jour, peu de traitements, ou de stratégies préventives sont connues contre cette pathologie. A l’île de La Réunion la population locale a souvent recours à la médecine traditionnelle pour prévenir ou traiter les maladies cardiovasculaires et les facteurs de risques qui y sont associés. L’objectif de cette étude est d’évaluer la pertinence de l’utilisation d’un extrait de plante issue de la biodiversité réunionnaise, pour la protection du réseau microvasculaire coronaire. Cette étude sera menée dans un modèle de rat obèse prédiabétique. Ce modèle a été au préalable étudié au laboratoire pour le développement de la dysfonction coronaire microvasculaire. Cette étude menée chez le rat zucker obèse permettrait la validation scientifique de l’utilisation de cette plante pour prévenir la dysfonction coronarienne microvasculaire. Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 24 rats seront utilisés. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. Tout au long des études in vivo, nous respecterons la règle des 3R en tenant compte du fait qu’aucune méthode alternative n’est disponible pour le remplacement. La glycémie et l’insulinémie des animaux seront surveillées une fois par mois, leur poids et leur prise de nourriture une fois par semaine. Le nombre d’animaux par cage (avec enrichissement du milieu de vie) sera adapté en fonction de leur poids. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être. La mise en place de points limites adaptés permettra de limiter la souffrance de ces animaux. Les injections seront réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra l’évaluation de l’extrait de Syzygium cumini sélectionné par des études préalables, pour la prévention de la dysfonction coronarienne microvasculaire.
Procédures
Les animaux seront tous soumis à un gavage quotidien, d'une durée maximum de 5 min par animal, soit d’extrait végétal (S. cumini) pour les animaux contrôles et obèses traités soit de solvant pour les animaux contrôles et obèses non traités. Le traitement sera administré durant l'apparition théorique de la pathologie vasculaire. La glycémie et l’insulinémie seront mesurées une fois par mois par pose de cathéter dans la veine caudale. Cette intervention durera 10 min au maximum par animal. Les mêmes animaux seront soumis à une imagerie échographique cardiaque une fois toutes les 3 semaines pendant 9 semaines et une fois toutes les 2 semaines pendant 8 semaines, afin d’évaluer les changements morphologiques et fonctionnels cardiovasculaires liés au développement de la maladie métabolique en étant traités ou non avec l’extrait de Syzygium cumini. Cette procédure dure au maximum 45 min. Lorsque les animaux seront âgés de 35 semaines, soit 15 semaines après le début des gavages, les animaux seront soumis à l’imagerie TEMP (Tomographie par Emission MonoPhotonique) pour la mesure de l’entropie de perfusion myocardique. Cette procédure dure moins de 45 min. En ce qui concerne la mesure de la réserve coronaire en échocardiographie et la mesure de l’entropie de perfusion myocardique en imagerie TEMP les animaux seront soumis à une injection d’agent pharmacologique permettant de mimer une situation d’effort. 3 semaines après l’imagerie TEMP les animaux seront mis à mort par inhalation au CO2.
Impact sur les animaux
Les protocoles d’imagerie (échocardiographie et imagerie nucléaire TEMP (Tomographie par Emission MonoPhotonique)) qui seront mis en œuvre dans cette étude n’entraîneront pas de douleur, souffrance ou angoisse. L’agent pharmacologique permettant de mimer une situation d’effort pour la mesure de la réserve coronaire et de l’entropie de perfusion myocardique a un effet transitoire. Il n’y a donc pas de nuisances ou effets indésirables attendus. Une solution composée d’extrait de plante issue de la biodiversité réunionnaise sera donnée aux rongeurs par voie orale. L’observation d’une prostration, d’un défaut de toilettage, de troubles moteurs, d’un trouble de la conscience, d’un dos vouté fera suspecter une toxicité de l’extrait et sera un point limite. Les animaux concernés seront alors mis à mort.
Devenir
Les animaux seront gardés vivants pour un suivi temporel de leurs fonctions et morphologies cardiovasculaire pendant 18 semaines (imagerie échocardiographique et nucléaire comprises). 3 semaines après l’imagerie TEMP (Tomographie par Emission MonoPhotonique), les animaux seront mis à mort pour des analyses ex vivo en l’absence de toute radioactivité résiduelle.
Remplacement
Les techniques ex vivo/in vitro permettant d’étudier la microcirculation coronaire sont peu nombreuses. Elles consistent soit à isoler des vaisseaux coronaires afin d’évaluer leur réactivité en présence ou non de composés pharmacologiques, soit à utiliser des lignées de cellules endothéliales ou musculaires. Ces méthodes nous ont permis d’effectuer une première évaluation de nos extraits, mais uniquement les modèles in vivo permettront de confirmer l’utilisation de l’extrait pour la protection du réseau coronaire microvasculaire et cela en raison de la combinaison de tous les aspects biologiques entrant en compte (e.g : voie métabolique). Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal.
Réduction
Au total 24 rats seront utilisés ici. Il y aura 6 animaux par groupe, il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu (n=6 par groupe expérimental). Les résultats expérimentaux seront analysés en utilisant des tests statistiques pour valeurs non appariés pour comparer les valeurs obtenues entre les quatre groupes. Une étude pilote menée sur des rats obèses a dans un premier temps été réalisée afin de vérifier l’utilisation de ce modèle animal pour la survenue d’une dysfonction coronaire microvasculaire. De plus, des études préliminaires sur différents extraits ont été réalisés ex vivo et in vitro afin de déterminer l’extrait qui aurait le meilleur potentiel pour protéger la microcirculation coronaire. Ces deux études ont permis de réduire le nombre d’extraits et de conditions à tester et donc le nombre d’animaux à utiliser.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être. Le poids des animaux ainsi que la prise de nourriture seront surveillés une fois par semaine. Le nombre d’animaux par cage sera adapté en fonction de leur poids. Ils disposeront d’enrichissement de leur milieu de vie (bâton en bois, tunnels, etc…). Une surveillance accrue de la consommation d’eau de boisson sera mise en place si les animaux deviennent hyperglycémiques. Les expérimentations prévues lors de cette étude sont des procédures non invasives (imagerie échocardiographie et imagerie nucléaire TEMP (Tomographie par Emission MonoPhotonique)). Lors de ces procédures, les animaux sont sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane. Les rats seront soumis à un gavage quotidien avec un extrait de plante issue de la biodiversité réunionnaise.Les études préliminaires menées sur cet extrait n’ont révélées aucune toxicité. Une surveillance quotidienne des animaux reste cependant nécessaire et des points limites ont été établis. Des scores seront calculés selon une grille d’évaluation (voir ci-dessous). Un score total supérieur ou égal à 3 sera considéré comme un point limite et l’animal sera mis à mort. Aucune anomalie n’a été observée lors de l’étude pilote menée précédemment au laboratoire De plus, l’effet de l’agent pharmacologique permettant de mimer la situation d’effort pour la quantification de la réserve coronaire est transitoire, mais une grille de surveillance sera toutefois ajoutée pour la surveillance respiratoire des rats. Cette grille comprendra donc la surveillance de l’apparence physique, du comportement, de la respiration et du changement de poids des animaux. Un score total supérieur ou égal à 3 sera considéré comme un point limite et l’animal sera mis à mort. I. Apparence physique Normale : 0 Manque de toilettage, poil ébouriffé : 1 Poil très ébouriffé, posture anormale : 2 II. Comportement Normal : 0 Changements mineurs : 1 Anormal, mobilité et activité réduites : 2 Animal très agité ou immobile, isolé, agressif : 3 III. Respiration Normal : 0 Essoufflement : 1 Hyperventilation : 2 Anormale, tremblement : 3 Les animaux seront mis à mort selon une méthode appropriée, à savoir par inhalation de CO2.
Choix des espèces
L’évaluation expérimentale in vivo du développement d’une pathologie telle que l’atteinte microvasculaire coronarienne est indispensable à la compréhension de la pathologie clinique. Les atteintes microvasculaires sont la conséquence de désordres métaboliques et physiologiques qui sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro et qui nécessitent l’utilisation d’un modèle animal. Le rat Zucker obèse possède spontanément deux allèles récessifs (fa/fa) pour le récepteur à la leptine (régulation des réserves de graisses et de la satiété). Ces rats sont hyperphagiques, hyperlipidémiques, hypercholestérolémiques, insulinorésistants sans être hyper-glycémiques. Ils sont très largement utilisés pour l’étude de pathologies métaboliques. L’étude préliminaire a permis de démontrer une atteinte microvasculaire à des stades tardifs. Il constitue donc un modèle pertinent pour le développement d’outils thérapeutiques/préventifs de la dysfonction coronaire microvasculaire. Le traitement sera administré durant l'apparition théorique de la pathologie vasculaire La caméra TEMP (Tomographie par Emission MonoPhotonique) utilisée et les sondes d’échographie étant destinées au petit animal, ce choix est particulièrement adapté aux caractéristiques techniques du matériel.
Analyse de la fonction musculaire : étude pré-clinique des effets de composés pharmacologiques sur le modèle du rat DMDmdx.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une mutation reproduisant la dystrophie musculaire de Duchenne, ils subissent des tests répétés de force et de locomotion sur animal vigile, puis un prélèvement sanguin à la jugulaire sous anesthésie, avant d'être tués pour l'analyse musculaire. Le projet teste des composés pharmacologiques et vise à remplacer le modèle chien, jugé plus lourd et coûteux. Le porteur affirme qu'aucun modèle non animal ne permet cette évaluation préclinique.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la plus fréquente des maladies musculaires (environ 1/3500 naissances males). Elle est causée par un défaut dans le gène de la dystrophine (sur chromosome X) à l’origine d’une dégénérescence progressive du tissu musculaire. La maladie touche tous les muscles de l’organisme, y compris le muscle cardiaque et le diaphragme. Chez les patients DMD, la marche est définitivement perdue avant l’âge de 15 ans et le décès survient généralement avant 30 ans. Il n’existe pas de traitement curatif à ce jour sur le marché. En attendant la validation et mise en place de thérapies curatives visant à ré-exprimer la dystrophine, la thérapie pharmacologique est une des approches envisageables pour pallier les processus physiopathologiques liés à l’absence de dystrophine. Avant le passage chez l’homme, l’efficacité thérapeutique des approches de thérapie est validée en préclinique sur des modèles animaux de la pathologie. Deux modèles animaux DMD, la souris mdx et le chien GRMD, sont couramment utilisés pour l’évaluation d’approches thérapeutiques mais présentent des limites : - La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD et présente un phénotype peu marqué. - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle de gros animal qui est coûteux et lourd à manipuler. Le modèle de rat DMDmdx, générée par un consortium de laboratoires en 2014, est un modèle intermédiaire : c’est un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations d’utilisation que le modèle canin., cette lignée de rat DMDmdx peut donc être utilisée pour réaliser les 1ères phases d’évaluation de l’efficacité de nouveaux produits thérapeutiques. Notre équipe développe un ensemble d’approches expérimentales afin d’évaluer l’efficacité de produits pharmacologiques pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. Ainsi, sur ce modèle de rat DMDmdx, nous envisageons de tester 10 produits en 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence au niveau pré-clinique les effets musculaires de composés d’intérêt sur le modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne. Aussi, ce projet conduit chez le rat DMDmdx permettra également de valider l'évaluation préclinique d'approches thérapeutiques de la DMD dans un modèle animal adapté. Ainsi, l'objectif est de réduire voire remplacer le chien GRMD, autre modèle de la pathologie humaine également utilisé, plus lourd et plus couteux à manipuler, pour cette évaluation préclinique.
Procédures
Au cours de la période de traitement les animaux seront soumis à des tests d'exploration fonctionnelle (force, locomotion, anxiété) non invasifs via la réalisation de différents exercices. Chacun de ces exercices durent entre 5 et 10 minutes maximum. Ces tests seront effectués 3 fois au cours de ce projet : avant la mise en place du traitement, (soit 4 semaines d'âge), au milieux (soit 3.5 mois d'âge) et à la fin de la période de traitement (soit 6 mois d'âge). En fin de période de traitement un prélèvement sanguin à la jugulaire sera effectué sur des animaux anesthésiés (durée: environ 30 min, de l'induction à la sédation à la remise de l'animal dans sa cage d'hébergement).
Impact sur les animaux
L'évolution de la maladie en elle-même peut entrainer un déclin de l'état de santé (difficultés locomotrices, d'alimentation voire respiratoires). Aussi, l’ensemble des tests d’évaluation de la fonction neuromotrice sera effectué sur animal vigile. Bien que validés, non invasifs, et précédés d'une période d'habituation, ces tests peuvent induire un stress chez les animaux.
Devenir
Ce projet vise à évaluer les effets de composés pharmacologiques sur la fonction musculaire de rats DMDmdx, modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne, via la réalisation de tests moteurs sur des animaux vigiles associés à des tests in vitro visant spécifiquement l'étude du tissu musculaire. A la fin de la procédure d'analyse des composés sur la fonction neuromotrice, réalisée à différents stades de développement des animaux et du traitement, l'ensemble des rats sera donc euthanasié afin de conduire cette analyse de la masse et fonction musculaire, afin de corréler les effets physiologiques et cellulaires (identification du lien entre effet et cible d’action)
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle alternatif non animal modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne pour évaluer au niveau pré-clinique les effets de traitement pharmacologiques sur la progression de la pathologie.
Réduction
Le nombre d’animaux estimés dans ce protocole est suffisant pour justifier d’une pertinence scientifique, et est réduit au maximum tout en tenant compte de la validité statistique, des contraintes du modèles et des approches expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. L'évolution de la maladie en elle-même pouvant entrainer un déclin de l'état de santé (difficultés locomotrices, d'alimentation voire respiratoires), l'état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne par le personnel animalier et responsable du projet pour estimer une éventuelle gêne ou douleur liées à l'expression clinique de la maladie. Si un seul signe clinique spécifique ou 3 signes notables sont détectés, alors le responsable du la structure chargée du bien être des animaux et le responsable de l’étude seront prévenus et l'animal sera sacrifié sans délais. Un prélèvement sanguin sera réalisé en fin de traitement. L’ensemble des tests d’évaluation, validés et non invasifs, sera effectué sur animal vigile. Afin de limiter au maximum le stress engendré par la manipulation, les mesures seront précédées par une période d’habituation à la salle d’expérimentation, aux dispositifs expérimentaux ainsi qu’à l’expérimentateur et un renforcement positif (récompense des animaux suite réalisation des essais) sera mise en place.
Choix des espèces
La lignée de rats DMDmdx possède, comme chez les patients atteints de dystophie musculaire de Duchenne (DMD) une mutation à l'origine d'une déficience en une protéine, la Dystrophine. Le phénotype sévère implique une atteinte des muscles squelettiques et cardiaque. Deux modèles animaux de la Dystrophie musculaire de Duchenne , la souris mdx et le chien GRMD, sont couramment utilisés pour l’évaluation d’approches thérapeutiques mais présentent des limites : - La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD et présente un phénotype peu marqué. - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle de gros animal qui est coûteux et lourd à manipuler. Le modèle de rat DMDmdx est un modèle intermédiaire : c’est un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations d’utilisation que le modèle canin. Rats d’âge compris entre 1 et 6 mois afin : - d’évaluer l’efficacité du traitement à différents stades de l’évolution de la maladie dont les premiers symptômes sont visibles chez le rat dès l’âge de 4 semaines. L'exploration des fonctions motrices sera effectuée à 3 stades : avant le traitement (environ 4 semaine d'âge), au milieux (environ 3.5 mois d'âge) et à la fin de la période de traitement (environ 6 mois d'âge). La procédure d'analayse des composés sur la masse et fonction musculaire in vitro des rats DMDmdx sera réaliser en fin de traitement soit à 6 mois d'age.
Cryoconservation de lignées de souris et de rats génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 592
5840 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles prépubères reçoivent deux injections hormonales pour provoquer une superovulation, puis sont tuées le lendemain pour récupérer leurs gamètes ou embryons, impossibles à prélever autrement. Le projet vise à congeler des lignées génétiquement modifiées afin de les conserver et d'éviter d'en produire en continu. Le porteur affirme qu'il n'est pas possible de modéliser in vitro un "organisme entier" et présente la cryoconservation comme un moyen de réduire globalement le nombre d'animaux non-humains.
Objectifs
Les lignées de souris ou de rats génétiquement modifiées constituent une ressource précieuse tant pour les différents projets scientifiques en cours que pour d’éventuels projets futurs. Pour éviter une perte accidentelle de ces lignées précieuses, parfois uniques et n’ayant pas d’équivalent ailleurs, mais également pour éviter de continuer à produire inutilement des animaux lorsque le(s) projet(s) scientifique(s) autorisé(s) utilisant ces lignées est(sont) fini(s), la plupart des lignées sont cryoconservées à -196°C sous azote liquide, sous forme de gamètes ou d’embryons congelés.
Bénéfices attendus
La cryoconservation de lignées permettra de sécuriser le patrimoine génétique (en cas de perte de lignées, de problème sanitaire), réduire la dérive génétique (accumulation au hasard de nouvelles mutations qui peuvent être fixées ou non et faire évoluer la lignée) et réduire globalement le nombre d’animaux dans les établissements d’expérimentation animale (une lignée qui n’est plus utilisée peut être congelée et décongelée le moment venu au lieu d’être maintenue à l’état respirant)..
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu’à 2 injections hormonales en intrapéritonéal, à 48h d’intervalle. Chaque acte dure moins d’une minute et se décompose en : sortir l’animal de la cage, le mettre en contention, réaliser l’injection intrapéritonéale et le remettre dans sa cage.
Impact sur les animaux
En vue d’obtenir une superovulation, de jeunes femelles prépubères reçoivent 2 injections d’hormones à 48h d’intervalle avant d’être accouplées, ou non, et mises à mort le lendemain. Seuls des animaux en bonne santé sont injectés, par du personnel compétent et formé. Le délai est très court entre injections et mise à mort. Cette procédure est en place depuis 5 ans et aucun cas d’effet indésirable sur les animaux n’a été observé et rapporté. Si les injections sont correctement réalisées la superovulation est efficace.
Devenir
Les animaux utilisés dans chaque procédure sont mis à mort en fin de procédure afin de récupérer leurs gamètes ou embryons. Ces gamètes ou embryons sont ensuite congelés. ll n’est pas possible de récupérer ces gamètes ou embryons sans mettre à mort l’animal.
Remplacement
Il n’est pas encore possible de modeler in vitro la complexité d’un organisme dans son entier. La création et l’utilisation de lignées génétiquement modifiées in vivo reste à l’heure actuelle nécessaire pour étudier les mécanismes et les interactions complexes qui se déroulent à l’échelle d’un organisme entier. La cryoconservation de ces lignées permet de les conserver de façon stable dans le temps, les échanger plus facilement entre instituts et de ne pas avoir à les produire à nouveau.
Réduction
Il est impossible de prévoir le nombre exact d’animaux qui seront utilisés pour chaque congélation car il y a une variabilité entre lignées. Nous nous basons sur >10 ans d’expérience pour utiliser le moins d’animaux possibles dans chaque cas de figure et le nombre de séances est arrêté dès que le but (nombre d’embryons, d’oocytes fixés…) est atteint. Le projet a été soumis à un biostatisticien qui a conclu qu’il n’y avait pas de test statistique utilisable pour prédire ce nombre. Les quantités d’animaux nécessaires pour mener à bien ce projet seront réduites au strict minimum. L’un des objectifs et bénéfices de la cryoconservation est d’arrêter le maintien à l’état respirant de lignées inutilisées et donc de globalement réduire le nombre d’animaux. En congélation d’embryons, en règle générale ~200 embryons/lignée sont nécessaires pour cryoconserver une lignée. Notre expérience montre qu'il faut en moyenne 5 séances de FIV et congélation pour obtenir le nombre suffisant d'embryons. Par séance 7 femelles sont utilisées. En congélation d’oocytes, là encore, il y a des variations en fonction des lignées. En moyenne, trois séances sont nécessaires et 7 femelles sont utilisées par séance. En test de décongélation de sperme 2 femelles sont utilisées pour tester chaque mâle congelé.
Raffinement
Toutes les cages sont pourvues de coton comme enrichissement. Les mâles utilisés pour cryoconservation de sperme sont stimulés par accouplement puis hébergés en cage isolés au maximum pendant 2 semaines avant mise à mort et congélation de leur sperme. Les mâles utilisés pour cryoconservation d’embryons sont hébergés en cage isolés et reçoivent toutes les semaines pendant 1 jour/nuit une femelle superovulée. Ils sont ensuite laissés seuls, au repos, jusqu’à la semaine suivante. Un enrichissement supplémentaire est fourni à ces animaux isolés, sous la forme de dôme/maisonnette en carton ajoutées dans chaque cage individuelle. Les animaux sont suivis de façon régulière, lors du suivi quotidien et/ou des diverses actions : injections des femelles, mise en accouplement avec les mâles, mise à mort des animaux. Si un animal présente des signes cliniques de mal-être (prostration, poil hérissé ou amaigrissement et body-score condition BC1) il sera mis à mort par exposition à une concentration croissante en CO2.
Choix des espèces
La plupart des projets de recherche fondamentale menés à l’Institut Pasteur utilisent la souris ou le rat comme modèles animaux. Le génome des rongeurs de laboratoire est facilement modifiable à façon et il existe plusieurs milliers de lignées de souris ou de rats génétiquement modifiées. La pertinence du choix de la souris ou du rat pour ces projets est justifiée dans les projets eux-mêmes. Les mâles reproducteurs (hors procédure) sont des adultes. Les femelles donneuses d’oocytes sont de jeunes adultes, généralement prépubères pour bien répondre au traitement hormonal de superovulation.
Evaluation in vivo par imagerie TEP d’un inhibiteur spécifique de DYRK1A : application à 2 modèles animaux sur-exprimant cette enzyme.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 15
25 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent l'injection d'un radiotraceur marqué au carbone 11 sous anesthésie, suivie d'une imagerie IRM et TEP, pour évaluer un marqueur de l'enzyme DYRK1A impliquée dans la maladie d'Alzheimer et la trisomie 21. Le porteur décrit une procédure peu douloureuse et prévoit une analgésie en cas de douleur, les animaux étant tués en fin d'étude pour des prélèvements. Il affirme que le devenir d'un radiotraceur dans un organisme vivant ne peut pas être étudié in vitro.
Objectifs
L’imagerie fonctionnelle TEP (Tomographie par Emission de Positons) est un outil clinique aujourd’hui indispensable pour le diagnostic de nombreuses pathologies. Le principe est d’injecter une molécule radioactive au patient afin de suivre sa distribution dans l’organisme grâce à la caméra. Le développement de nouveaux radiotraceurs est donc d’un intérêt majeur pour venir compléter la gamme d'outils diagnostiques dont disposent les médecins. La tyrosine kinase DYRK1A est connue pour être impliquée dans certaines maladies neurodégénératives, comme Alzheimer ou la trisomie 21. Le projet a pour but de développer un radiotraceur marqué au Carbone 11 (11C) à partir du composé prometteur EHT-1610, possédant une excellente affinité et sélectivité pour cette enzyme. Il n'existe pas de technique permettant d'étudier cette cible de façon spécifique et non invasive, bien que cela puisse être un outil pertinent afin de mieux comprendre son implication dans divers maladies. La synthèse du [11C]EHT-1610 est opérationnelle et le radiotraceur a été testé avec succès chez le rongeur sain. Ces travaux nécessitent maintenant d’être complétés par des études dans un cadre pathologique. Cette demande d'autorisation porte donc sur l'étude du comportement du radiotraceur chez 2 modèles murins transgéniques, un de rat et un de souris, présentant une surexpression de DYRK1A. La première étape consiste à étudier la distribution du composé chez le rat pathologique, afin de comparer ces résultats aux données dont nous disposons déjà pour le rat sain. Dans un second temps, nous sommes actuellement en train d’étudier la spécificité de la fixation du radiotraceur à DYRK1A chez le rat sain, par mise en compétition avec d’autres molécules connues ayant une affinité pour la cible, et nous souhaitons reproduire ces travaux chez les rats pathologiques. Il sera ainsi possible de comparer les niveaux de captation dans les différents organes entre les animaux sains et pathologiques, avec ou sans administration de compétiteur. Enfin, le comportement d’un radiotraceur pouvant être différent d’une espèce à l’autre, nous souhaitons étudier la distribution du radiotraceur chez la souris sur-exprimant la cible dans les mêmes conditions expérimentales. Nous disposerons alors d’un panel complet de tests permettant de valider l’intérêt de notre méthode d’imagerie.
Bénéfices attendus
La validation du [11C]EHT-1610 comme marqueur pour l’imagerie TEP permettra de mieux comprendre l’implication de DYRK1A dans les processus physiologiques et pathologiques et d’aider au traitement des maladies du système nerveux central.
Procédures
Injection d'un radiotraceur sous anesthésie générale suivi d'une imagerie IRM/TEP. Les rats sont imagés 2 à 3 fois (partie haute et basse du corps séparément puis, si les résultats sont concluants, une troisième fois en présence d’un compétiteur) et les souris 1 fois (et seulement si les résultats chez le rat sont concluants). Pour chaque session d'imagerie, l'animal est anesthésié environs 1h, incluant environs 10 min d'imagerie IRM et 30 min d'imagerie TEP auquel s'ajoute le temps de préparation de l'animal (mise en place de l'abord veineux et positionnement dans le berceau d'imagerie).
Impact sur les animaux
En théorie, faible. Les animaux sont manipulés sous anesthésie générale. Les seules nuisances attendues sont donc le stress à l’induction de l’anesthésie et au réveil et une éventuelle douleur au point d’injection (jamais observée jusqu’à aujourd’hui dans nos expériences ultérieures). Concernant l’étude de compétition, la littérature scientifique et nos résultats préliminaires avec l’EHT-1610 ne montrent pas de toxicité aigüe dans nos conditions expérimentales et les animaux seront mis à mort sans réveil afin de réaliser des prélèvements d’échantillons post-mortem.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de projet pour prélèvement d'échantillons biologiques post-mortem.
Remplacement
Pour comprendre le devenir d’un radiopharmaceutique dans un organisme vivant, les essais in vitro sont pour l’instant insuffisants (grande complexité des processus physiologiques) et l’évaluation ne peut se faire que sur l’animal vivant. L’EHT-1610 a cependant déjà fait l’objet de nombreuses études in vitro permettant d’attester de son excellente affinité en tant qu’antagoniste (IC50 = 0.36 nM et validation de la méthode de blocage de la fixation de l’ATP à l’enzyme par cristallographie) et sélectivité pour DYRK1A (en comparaison de 339 autres kinases), ce qui en fait déjà un candidat médicament prometteur.
Réduction
Avant de débuter cette étude sur des modèles pathologiques, des travaux préliminaires ont été réalisés chez le rongeur sain afin de vérifier la faisabilité technique de l'utilisation de la molécule radio-marquée en imagerie TEP. Les imageurs TEP précliniques, mis en service à partir des années 2000, permettent de valider un nouveau radiotraceur avec un nombre limité d’animaux, en réduisant fortement le besoin de recourir aux méthodes ex vivo. Le protocole étant peu invasif, un même animal pourra être réutilisé pour plusieurs sessions d'imagerie, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaire. Les études de compétition ne seront réalisées que si les résultats en amont sont concluants. La littérature scientifique et nos résultats préliminaires avec l’EHT-1610 ne montrent pas de toxicité aigüe dans nos conditions expérimentales. Les animaux seront commandés par petit groupe et le projet prendra fin lorsque nous disposerons de suffisamment de données, limitant ainsi le nombre total d’animaux.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés en animalerie conventionnelle respectant leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les caméras μTEP/μIRM ainsi que l'ensemble de l'environnement technique sont adaptés aux rongeurs, permettant ainsi d'étudier in vivo le devenir d'une molécule tout en respectant leurs besoins physiologiques. Afin de limiter leurs mouvements durant l'imagerie et de maintenir des conditions physiologiques correctes, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane dans un mélange O2/N2O) avec un monitoring de température et un suivi de la fréquence respiratoire. Les administrations se font sans recours à la chirurgie. Un radiotraceur devant, par définition, être formulé en solution injectable et administré à dose « traceuse », c'est à dire sans effets biologiques ou radiologiques, aucune douleur n'est attendue suite à son administration. Si, malgré ces précautions, une douleur est constaté, des antidouleurs seront administrés. Pour cela, nous surveillerons le comportement de l'animal durant les 24 heures suivants l’imagerie afin de contrôler l'absence de signes visibles de douleur (prostration, perte de poids, état anormal du poil ou des yeux, ...) ou de problème au niveau du point d'injection (démangeaisons, état anormal de la peau, ...). Pour le rat, il est prévu un traitement à la buprénorphine adapté, sur la base de 0,05 mg/kg sc 2 à 3x/jour, pendant 2 jours. La non-résolution de cette douleur est considérée comme un point limite et entrainera une mise à mort de l'animal. Les souris n’étant imagé qu’une seule fois, l’apparition d’une douleur entrainera une mise à mort anticipé comme prévu en fin de protocole. Lors de nos essais préliminaires, l’EHT-1610 était bien toléré lors de son utilisation comme compétiteur.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les 2 espèces de référence pour ce type d'étude et nous disposons de matériel et de protocoles expérimentaux bien adaptés aux rongeurs. La souris présente l'avantage de pouvoir être imagée en intégralité dans notre caméra TEP, ce qui est particulièrement intéressant pour étudier globalement la distribution d'un nouveau radiotraceur. La taille plus importante du rat permet d'imager des parties du corps plus petites, comme les structures cérébrales. Des différences de comportement du radiotraceur entre espèce sont aussi parfois observées, même entre rongeurs. Le suivi de l'évolution du modèle animal durant la vie des individus ne présente pas d'intérêt pour notre étude. En effet, le niveau d’expression de la cible reste stable au cours du temps. Nous nous focaliserons donc sur de jeunes adultes de façon à avoir des animaux en bonne santé (et limiter les risques d'incidents durant l’expérimentation) et d’un poids raisonnable (compatible avec le volume restreint du berceau de l’imageur).
Étude des effets cardiovasculaires de peptides de venins in vivo chez le rat WISTAR HAN adulte.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
260 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils subissent une chirurgie d'accès aux valeurs hémodynamiques puis un suivi de quatre heures pendant lequel des peptides de venins de serpents sont testés sur le système cardiovasculaire, avant le prélèvement des organes. Le porteur indique que certaines toxines peuvent perturber la respiration ou provoquer des convulsions, l'animal étant alors tué par injection létale. Il affirme que les réactions complexes de l'organisme ne peuvent pas être reproduites in vitro et qualifie le recours aux rats d'"indispensable".
Objectifs
Cette étude vise à identifier de nouveaux composés intéressants et de nouvelles approches thérapeutiques au niveau cardio-vasculaire in vivo. Les venins de serpents contiennent de nombreuses toxines ayant des propriétés physiologiques intéressantes. Au-delà de l’intérêt, de la connaissance de la composition et du mode d’action des venins, certaines protéines se sont révélées comme d'excellents outils pharmacologiques. De nombreux chercheurs se sont intéressés aux venins dans la perspective de développer de nouveaux médicaments. Les venins et les toxines sont des mélanges complexes de protéines avec parfois plusieurs centaines de peptides et de protéines dans un même venin qui ont chacune leur activité biologique propre. Le venin contient de nombreux composés ayant des propriétés physiologiques intéressantes. Les toxines produites par les espèces animales venimeuses peuvent servir de bases au développement de médicaments contre la douleur, le diabète ou les maladies cardiovasculaires. Dans une précédente étude, nous avons montré que certains peptides pouvaient avoir des effets hypotenseurs ex-vivo en ciblant les récepteurs muscariniques. Cette précédente étude n'avait pas pour objectif de comprendre les voies de signalisation impliquées dans la mise en place des effets hypotenseurs et n'a pas pu confirmer les effets in vivo à moyen terme. L'étude actuelle visera donc à comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine des effets des peptides et de caractériser leurs effets à moyen terme grâce à un protocole de monitoring comprenant des électrocardiogrammes et des mesures de pressions à long terme sur une durée de 4h sous anesthésie générale. Le but de notre projet est donc d’étudier et de valider les effets de différentes toxines provenant de peptides sur le système cardiovasculaire chez le rat WISTAR HAN adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra une meilleure compréhension physiopathologique du rôle de toxines provenant de venins et potentiellement à terme l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques au niveau cardio-vasculaire chez l’Homme. Les toxines de venins ont une forte affinité (grâce à l’action directe qu’elles ont sur les récepteurs, les enzymes ou les canaux ioniques de l’organisme) et une grande sélectivité (elles bloquent ou activent plus particulièrement un récepteur, permettant de limiter les effets secondaires), ce qui en font d’excellents candidats pour de futurs médicaments.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 intervention permettant d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques de l’animal grâce à une chirurgie de 10 min. Au bout de 4h, les rats seront mis à mort pour le prélèvement des organes.
Impact sur les animaux
Au cours du protocole, pour certaines toxines, nous pourrions avoir des modifications de la respiration des rats liées à la fixation sur des récepteurs cholinergiques. Si le rat venait à convulser, lutter, ou qu’un mouvement du diaphragme devenait important, avec des difficultés respiratoires sévères ou prolongées, le rat sera mis à mort par injection intrapéritonéale de dose létale (120 mg/kg) de pentobarbital sodique. Un saignement abondant non maitrisable soit une perte de plus de 20 % de la volémie de l’animal conduira à la mise à mort de celui-ci. L’animal sera suivi tout au long de la procédure et en fonction des points limites abordés précédemment, soit nous garderons l’animal en vie soit il sera mis à mort par injection intrapéritonéale de dose létale (120 mg/kg) de pentobarbital sodique. Le protocole se fera sous anesthésie générale pendant 4 heures sans réveil de l’animal.
Devenir
Après mise à mort de l’animal, divers prélèvements seront réalisés pour compléter l'étude. Des échantillons de mésentères, d’aorte, de cœur, de poumons, de reins, de foie seront prélevés immédiatement pour les études de réactivité vasculaire, de biologie moléculaire et de biochimie.
Remplacement
Nécessitant impérativement l'utilisation de modèles animaux, les réactions systémiques complexes de l'organisme ne peuvent pas être reproduites in vitro sur des modèles cellulaires, rendant l'utilisation d'animaux indispensables pour mieux comprendre les mécanismes associés et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire notre modèle et évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies. Des études in-vitro ont déjà été effectuées montrant la fixation des peptides sur leurs récepteurs.
Réduction
Les rats utilisés sont des Wistar mâles et femelles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations permettant de réaliser l’acquisition de plusieurs paramètres (pressions, ECG) sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les différentes procédures expérimentales de la première étape (mise au point) seront réalisées sur des effectifs réduits (n=8) afin de déterminer les conditions d’expérimentation optimales (tels que le temps de suivi des animaux pour l’étude des constantes hémodynamiques). Dans un second temps, lorsque les conditions d'expérimentation optimales auront été déterminées, les procédures seront réalisées sur un plus grand nombre d’animaux avec seulement les conditions sélectionnées dans la première étape. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés par 2, dans des cages avec enrichissement, sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Un respect strict des cycles jour/nuit sera observé. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie. L’analgésie des animaux est réalisée 20 à 30 minutes avant le début de la procédure. Afin de prévenir une éventuelle sécheresse oculaire liée à l’anesthésie prolongée, de la pommade ophtalmique contenant de la vitamine A est ajoutée sur les yeux au début de la procédure pour le bien-être de l’animal avant la pose d’un champ stérile. Toutefois au cours de la procédure, si l'un des peptides devait entrainer des effets indésirables détectables sous anesthésie, comme des difficultés respiratoires ou des convulsions, l'examen serait interrompu et le rat mis à mort par injection intrapéritonéale d’une dose létale d'anesthésique. Au cours de la chirurgie, un saignement abondant non maitrisable conduira à la mise à mort de celui-ci.
Choix des espèces
Ce modèle est actuellement le plus utilisé et le mieux décrit. C’est un modèle qui a une très bonne reproductibilité et qui en fait un modèle efficace pour cribler et valider l’efficacité des traitements. Nous avons la connaissance de ce modèle dans l’équipe et toute les procédures réalisées sont maîtrisées au sein de notre équipe et effectuées par une personne titulaire d’une formation à la chirurgie du rongeur. Les rats utilisés sont des Wistar Han âgés de 10-13 semaines, âge standard pour ces manipulations. Leurs tailles permettent de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont choisis pour avoir une puissance statistique suffisante pour conclure sur nos résultats grâce à notre connaissance du modèle et à de précédentes études menées dans notre équipe permettant de mettre en évidence ou non des différences entre les groupes. Nous réduisons ainsi le nombre d'animaux. Les rats Wistar Han utilisés dans ce projet auront entre 10 et 13 semaines soit un âge adulte. C’est un âge standard pour ce genre de manipulation. De plus, la bio collection réalisée en fin de procédure permettra de réaliser plusieurs expériences et donc de réduire le nombre d’animaux dans l’étude.